LAPORAN PRAKTIKUMILMU HIJAUAN MAKANAN TERNAKAcara Kultur Jaringan

Disusun oleh:Kelompok XXXVIIISigit Debi Pramono(PT/06215)Novan Tisnadji(PT/06337)Fiqie Hadiyanto(PT/06380)Tiffany(PT/06397) Shela Rahmadhani(PT/06417)

Asisten Pendamping: Muhammad Hidayat

LABORATORIUM HIJAUAN MAKANAN TERNAK DAN PASTURABAGIAN NUTRISI DAN MAKANAN TERNAKFAKULTAS PETERNAKANUNIVERSITAS GADJAH MADAYOGYAKARTA2014TINJAUAN PUSTAKAKultur Jaringan

Pengertian Kultur JaringanKultur jaringan merupakan salah satu cara perbanyakan tanaman secara vegetatif. Kultur jaringan merupakan teknik perbanyakan tanaman dengan cara mengisolasi bagian tanaman seperti daun, mata tunas, serta menumbuhkan bagian-bagian tersebut dalam media buatan secara aseptik yang kaya nutrisi dan zat pengatur tumbuh dalam wadah tertutup yang tembus cahaya sehingga bagian tanaman dapat memperbanyak diri dan bergenerasi menjadi tanaman lengkap. Prinsip utama dari teknik kultur jaringan adalah perbanyakan tanaman dengan menggunakan bagian vegetatif tanaman menggunakan media buatan yang dilakukan di tempat steril (Jumin, 1992).Semua bagian tanaman dapat digunakan sebagai eksplan tetapi sel-sel yang telah mengalami diferensiasi lebih lanjut sulit ditumbuhkan dibandingkan dengan sel-sel meristematik. Ukuran eksplan yang dikulturkan juga mempengaruhi keberhasilannya. Ukuran yang terlampau kecil akan mengurangi daya tahan tanaman ketika dikulturkan. Sementara bila terlalu besar akan sulit mendapatkan eksplan yang steril (Dinarti et al., 2007).Perkembangan ilmu kutur jaringan secara sejarah dikaitkan dengan penemuan sel dan munculnya teori sel. Lebih dari 250 tahun yang lalu Henri-Louis Duhamel du Monceau (1756) merintis eksperimen pemulihan luka pada tanaman dan menunjukkan pembentukan kalus yang terjadi secara spontan pada bagian yang dilukai pada tanaman elm. Kontribusi lebih lanjut terhadap kultur jaringan tanaman diberikan oleh doktrin sel atau teori sel yang menyatakan bahwa sel bersifat autonom dan mempunyai kemampuan totipotensi. Totipotensi merupakan kemampuan suatu sel tunggal untuk tumbuh, membelah, dan berdiferensiasi menjadi tanaman lengkap. Akivitas jaringan meristem dapat dikatifkan atau ditekan menurut pola diferensiasi yang dikendalikan oleh meknisme genetik dan atau lingkungan (Soetrisno et al., 2008).

Perkecambahan In VitroTahapan penting dalam proses kultur jarigan ialah kalus. Kalus merupakan sel yang memiliki massa yang aktif membelah dan tak terorgaisir yang biasanya muncul sebagai respon terhadap pelukaan jaringan dan organ yang telah mengalami deferensiasi (Prawiro, 1992). Menurut Genta (1997), menjelaskan dalam kultur jaringan semua tipe organ (akar, batang, daun, bunga,dll) dan jaringan dapat digunakan sebagai bahan eksplan untuk induksi kalus. Aktivitas proses pembelahan sel dan pembentukan organ dan embrio diperlukan hormon endogen kualitas hormon tersebut ditentukan tipe bahan awal misal umur tanaman dan posisi eksplan pada tanaman.Prinsip kerja dari kultur jaringan menggunakan prinsip totipotensi, berdasarkan prinsip ini, sebuah sel atau jaringan tumbuhan, yang diambil dari bagian manapun, akan dapat tumbuh menjadi tumbuhan sempurna kalau diletakkan dalam media yang cocok. Perbanyakan dengan sistem kultur jaringan harus dilakukan dalam keadaan steril (Widarto, 1996).

Medium Kultur JaringanKeberhasilan dalam penggunaan metode kultur jaringan sangat bergantung pada media yang digunakan. Media ini tidak hanya menyediakan unsur hara (makro dan mikro) tetapi juga karbohidrat (gula) sebagai sumber energi. Hasil yang lebih baik akan kita peroleh, bila ke dalam media tersebut ditambahkan vitamin, asam amino dan zat pengatur tumbuh. Umumnya media kultur jaringan tersusun atas komposisi hara makro, hara mikro, vitamin, gula, asam amino dan N-organik, persenyawaan kompleks alami (air kelapa, ekstrak ragi, jus tomat, dan lain-lain), buffer, arang aktif, zat pengatur tumbuh (terutama auksin dan sitokinin) dan bahan pemadat.Media kultur jaringan tersusun dari berbagai garam mineral asam amino, gula, vitamin, dan hormon tumbuhan. Mula-mula campuran media dibuat cair yaitu dengan menambahkan air suling (aquadest). Selanjutnya setelah jaringan berada dalam media cair dan digoncang-goncang dengan alat yang disebut shaker (meja penggojok) tunas-tunas akan muncul berupa tonjolan-tonjolan yang disebut procorn likabodies (Prawiro, 1990). Tahapan dalam pembuatan kultur jaringan ada 4, yaitu persiapan, inokulasi, pemeliharaan, dan aklimatisasi. Persiapan yang dilakukan meliputi sterilisasi alat, pembuatan medium, sterilisasi medium, perkecambahan tanaman dalam media kultur. Sterilisasi dilakukan dengan menggunakan autoklaf (Marlina, 2004).

Zat Pengatur TumbuhPenanaman eksplan dalam proses kultur jaringan yaitu dilakukan pada media MS yang mengandung garam-garam mineral, asam-asam amino, vitamin, sumber karbon dan energi (gula) dan zat pengatur tumbuh (ZPT) dengan komposisi tertentu. Ada beberapa jenis ZPT yang digunakan dalam kultur jaringan tanaman, seperti auksin (-napthaleneacetic acid (NAA), 2,4 dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D), Indole-3-acetic acid (IAA), IBA, dll.), dan sitokinin (benzyladenin (BA), kinetin (KI), dan zeatin (ZI). Respon tumbuhan terhadap ZPT yang ditambahkan ke dalam media berbeda-beda, tergantung pada jenis tanaman yang dikultur. Efisiensi dan efektifitas dari hormon pertumbuhan juga berbeda terhadap jenis tanaman yang berbeda. Seperti kinetin sangat efektif untuk kultur buku batang (Carimi, et al., 1995), sementara sitokinin konsentrasi rendah dapat memacu perkembangan tunas sedangkan konsentrasi tinggi merangsang penggandaan tunas (Nurwahyuni, 2004). Auksin pada konsentrasi rendah dapat memacu pertumbuhan akar dan pada konsentrasi tinggi dapat merangsang pertumbuhan kalus (Magoon dan Singh, 1995).Zat pengatur tumbuh didalam media sangat menentukan terhadap keberhasilan pertumbuhan dan perkembangan kultur. Perbanyakan tanaman dibutuhkan pemilihan perbandingan konsentrasi auksin, sitokinin dan suplemen yang tepat, karena hal ini akan menentukan dalam derajat keberhasilan pembentukan tanaman baru (Nurwahyuni dan Tjondronegoro, 1994).

Tahapan Kerja dalam Kultur JaringanTahapan dalam pembuatan kultur jaringan ada 4, yaitu persiapan, inokulasi, pemeliharaan, dan aklimatisasi. Persiapan yang dilakukan meliputi sterilisasi alat, pembuatan medium, sterilisasi medium, perkecambahan tanaman dalam media kultur. Sterilisasi dilakukan dengan menggunakan autoklaf. Prinsip utama dari teknik kultur jaringan adalah perbanyakan tanaman dengan menggunakan bagian vegetatif tanaman menggunakan media buatan yang dilakukan di tempat steril (Jumin, 1992).Menurut Soetrisno et al. (2008), kultur jaringan merupakan suatu proses yang sebagian kecil jaringan hidup (eksplan) diisolasi dari suatu organisme dan ditumbuhkan secara aseptis selama periode tertentu pada medium nutrien. Ukuran eksplan bervariasi, berkisar dari sebesar seedling dan organ (seperti pada kultur embrio dan ovulum) sampai sekecil sel tunggal dan protoplas. Teknik perbanyakan tanaman dengan cara teknik kultur in vitro disebut juga mikropropogasi karena potongan tanaman atau eksplan tersebut berukuran kecil.

Manfaat Kultur JaringanManfaat dari kultur in vitro ini antara lain menyediakan bibit tanaman yang sehat dalam jumlah banyak dalam waktu yang relatif singkat, dalam areal yang kecil, tidak tergantung pada musim dan memungkinkan manipulasi genetik (Yusnita, 2004). Metode kultur in vitro dikembangkan untuk membantu memperbanyak tanaman, khususnya untuk tanaman yang sulit dikembangbiakkan secara generatif. Bibit yang dihasilkan dari kultur jaringan mempunyai beberapa keunggulan, antara lain: mempunyai sifat yang identik dengan induknya, dapat diperbanyak dalam jumlah yang besar sehingga tidak terlalu membutuhkan tempat yang luas, mampu menghasilkan bibit dengan jumlah besar dalam waktu yang singkat, kesehatan dan mutu bibit lebih terjamin, kecepatan tumbuh bibit lebih cepat dibandingkan dengan perbanyakan konvensional (Harianto, 2009).Manfaat kultur jaringan bagi ternak sangat besar. Karena untuk menghasilkan ternak dengan produksi dan performan yang baik, dibutuhkan pakan dengan kualitas yang baik pula. Untuk menjaga kualitas tanaman pakan tetap baik, tidak cukup hanya mengandalkan metode pengembangan tanaman akan dengan metode yang biasa. Kultur jaringan muncul sebagai masalah dari tanaman pakan. Kultur jaringan mampu memproduksi tanaman pakan dalam jumlah yang banyak dan dengan kualitas yang sama baiknya. Sehingga kultur jaringan sangat menunjang kualitas dan jumlah tanaman pakan yang dihasilkan untuk menghasilkan ternak dengan produkksi dan performan yang baik (Marlina, 2004 ).

BAB IIMATERI DAN METODE

MateriAlat. Alat-alat yang digunakan dalam praktikum ini atara lain adalah botol kultur, pinset, skalpel, entkas, autoklaf, tabung reaksi, cawan petri, kertas saring, dan pipet steril.Bahan. Bahan-bahan yan digunakan dalam praktikum ini antara lain adalah meristem apikal dari akar tanaman kacang pajang (Vigna radiata), Medium murashige dan skoog (MS) dengan zat pengatur tumbuh auksin 2,4-D 2 mg/L dan kinetin, spirtus, alkohol 60%, bayclin, dan aquades steril.

MetodeTahapan dalam pembuatan kultur jaringan ada 4, yaitu persiapan, inokulasi, pemeliharaan, dan aklimatisasi. Persiapan yang dilakukan meliputi sterilisasi alat, pembuatan medium, sterilisasi medium, perkecambahan tanaman dalam media kultur. Sterilisasi dilakukan dengan menggunakan autoklaf. Autoklaf diisi dengan aquades agar tidak menimbulkan korosi, dilakukan dalam suhu 121oC dan tekanan 15 atm selama 15 menit. Inokulasi meliputi penanaman eksplan. Pemeliharaan dilakukan selama inokulasi pada temperatur 25 sampai 28oC. sedangkan aklimatisasi merupakan proses adaptasi. Jaringan meristem dari tunas tanaman kacang panjang (Vigna radiata) diambil dalam lingkungan yang steril, bagian meristem batang dipotong menggunakan pisau/skalpel dengan ukuran 2 mm sampai 3 mm, dilakukan inokulasi dalam botol yang berisi medium Murashige dan Skoog, diinkubasikan pada ruang kultur bersuhu 20oC dan pencahayaan menggunakan lampu 40 watt, kemudian diamati pembentukan akar, tunas dan kalusnya setiap hari dan ada tidaknya kontaminasi jamur, serta dicatat pertumbuhannya pada hari ke-7 dan ke-14. Ada 3 variabel yang diamati dalam praktikum ini, yaitu medium, eksplan, dan cahaya. Medium meliputi perbandingan konsentrasi hormon pertumbuhan auksin dan sitokinin. Eksplan meliputi bagian tanaman yang akan digunakan, yaitu akar, batang, dan daun. Cahaya meliputi perlakuan gelap terang. Praktikum ini menggunakan 16 macam medium yang beredaa berdasarkan konsentrasi pemberian hormon pertumbuhan auksin dan sitokinin, yaitu seperti pada tabel berikut:Tabel 1. Medium kultur jaringanAuksin (2,4 D)(M)

Sitokinin (kinetin)(M)0135

00,00,10,30,5

11,01,11,31,5

33,03,13,33,5

55,05,15,35,5

BAB IIIHASIL DAN PEMBAHASAN

Kultur jaringan merupakan salah satu cara perbanyakan tanaman secara vegetatif. Kultur jaringan merupakan teknik perbanyakan tanaman dengan cara mengisolasi bagian tanaman seperti daun, mata tunas, serta menumbuhkan bagian-bagian tersebut dalam media buatan secara aseptik yang kaya nutrisi dan zat pengatur tumbuh dalam wadah tertutup yang tembus cahaya sehingga bagian tanaman dapat memperbanyak diri dan bergenerasi menjadi tanaman lengkap. Jumin (1992), mengungkapkan bahwa prinsip utama dari teknik kultur jaringan adalah perbanyakan tanaman dengan menggunakan bagian vegetatif tanaman menggunakan media buatan yang dilakukan di tempat steril .Praktikum kultur jaringan bertujuan mengetahui teknik perkembangbiakan tanaman dengan metode aseptis. Tahapan dalam pembuatan kultur jaringan ada 4, yaitu persiapan, inokulasi, pemeliharaan, dan aklimatisasi. Persiapan yang dilakukan meliputi sterilisasi alat, pembuatan medium, sterilisasi medium, perkecambahan tanaman dalam media kultur. Sterilisasi dilakukan dengan menggunakan autoklaf. Autoklaf diisi dengan aquades agar tidak menimbulkan korosi, dilakukan dalam suhu 121oC dan tekanan 15 atm selama 15 menit. Inokulasi meliputi penanaman eksplan. Pemeliharaan dilakukan selama inokulasi pada temperatur 25-28oC. sedangkan aklimatisasi merupakan proses adaptasi. Tanaman yang di tanam secara kultur jaringan adalah kacang hijau. Biji kacang panjang (Vigna radiata) yang sebelumnya sudah digerminasi menggunakan petri disk dan kertas saring yang steril diinkubasi selama 2 sampai 3 hari, setelah itu jaringan meristemdari tunas tanaman kacang hijau dalam lingkungan yang steril dan ditanam pada medium.Prinsip utama dari teknik kultur jaringan adalah perbanyakan tanaman dengan menggunakan bagian vegetatif tanaman menggunakan media buatan yang dilakukan di tempat steril (Jumin, 1992).Menurut Soetrisno et al.. (2008), kultur jaringan merupakan suatu proses dimana sebagian kecil jaringan hidup (eksplan) diisolasi dari suatu organisme dan ditumbuhkan secara aseptis selama periode tertentu pada medium nutrien. Ukuran eksplan bervariasi, berkisar dari sebesar seedling dan organ (seperti pada kultur embrio dan ovulum) sampai sekecil sel tunggal dan protoplas. Teknik perbanyakan tanaman dengan cara teknik kultur in vitro disebut juga mikropropogasi karena potongan tanaman atau eksplan tersebut berukuran kecil. Berdasarkan hasil praktikum eksplan yang digunakan dalam praktikum adalah bagian tumbuhan yang telah di potong kecil kecil. Berdasarkan hasil perbandingan antara literatur dengan data yang didapatkan dalam praktikum, dapat diketahui bahwa tahapan kultur jaringan yang dilakukan dalam praktium sudah baik.Kontaminasi pada Medium dan EksplanBerdasarkan praktikum yang telah dilakukan, diperoleh data kontaminasi pada medium dan eksplan tertera pada tabel 2 sebagai berikut.Tabel 2. Kontaminasi pada medium dan eksplanMedium(auksin,sitokinin) Eksplan

AkarBatangDaun

GelapTerangGelapTerangGelapTerang

0,0 ------

1,0 ------

3,0------

5,0------

0,1------

1,1---+++--

3,1---+++--

5,1------

0,3------

1,3------

3,3------

5,3------

0,5-+++-+++--

1,5------

3,5------

5,5------

Ada tidaknya kontaminasi dilihat satu minggu setelah penanaman eksplan. Tabel diatas menunjukan adanya kontaminasi pada perlakuan terang menggunakan batang pada medium 1,1; 3,1; dan 0,5 dan kontaminasi pada perlakuan terang menggunakan akar pada medium 0,5. Hal itu dapat terjadi karena proses penanaman eksplan yang kurang terjaga kesterilannya sehingga terjadi kontaminasi. Eksplan yang terkontaminasi akan menunjukkan gejala seperti berwarna putih atau biru (disebabkan jamur) atau busuk (disebabkan bakteri). Menurut pendapat Smith (200) Eksplan atau kultur dapat terkontaminasi oleh berbagai mikrooganisme seperti jamur, bakteri, serangga atau virus. Organisme organisme tersebut secara universal terdapat pada jaringan tanaman. Banyak yang bersifat non-patogenik, artinya mereka tidak menyebabkan bahaya bagi tanaman inang pada kondisi normal. Kondisi kering dan adanya organisme competitor menyebabkan mereka dalam kondisi terkontrol. Tapi, kondisi in vitro yang disukai eksplan, yaitu mengandung sukrosa dan hara dalam konsentrasi tinggi, kelembaban tinggi dan suhu yang hangat, juga disukai mikroorganisme yang seringkali tumbuh dan berkembang sangat cepat, mengalahkan eksplan Menurut Lestari et al. (2001), serangan jamur dapat dipicu oleh pencucian bibit kultur yang kurang bersih dari media in vitro sebelum ditanam pada media berikutnya. Menurut Soetrisno et al. (2008), kontaminasi dapat dicegah dengan cara sterilisasi yang maksimal. Teknisi menggunakan masker dan sarung tangan, tidak menyentuh permukaan obyek steril yang terbuka (misalnya media atau penutup botol). Botol kultur dipegang pada dasarnya dan tangan dijauhkan dari tabung atau petri yang menerima cairan tersebut saat penuangan cairan steril. Area kerja harus dilap dengan kain yang telah direndam dengan alkohol 70% sebelum melakukan prosedur sterilisasi apapun.

Produksi KalusKalus merupakan sel yang memiliki massa yang aktif membelah dan tak terorgaisir yang biasanya muncul sebagai respon terhadap pelukaan jaringan dan organ yang telah mengalami deferensiasi (Prawiro,1992). Berdasarkan praktikum yang telah dilakukan, diperoleh data produksi kalus tertera pada tabel 3 sebagai berikut.

Tabel 3. Produksi kalusMedium(auksin,sitokinin) Eksplan

AkarBatangDaun

GelapTerangGelapTerangGelapTerang

0,0 +++-++++

1,0 +++++++++-+

3,0-+-+++-+

5,0++++++++++-+

0,1++++++++++++++

1,1++++---+

3,1++++++++--+++

5,1-+++++++++-+++

0,3++++++-++

1,3+++++++-+

3,3++++-+++++++

5,3+++++++++++++++

0,5--+--+

1,5-++++++++++

3,5++++++++++-++

5,5++++++++-+++

Pengamatan terhadap pertumbuhan kalus dilakukan 2 minggu setelah penanaman eksplan. Berdasarkan tabel diatas, dapat diketahui bahwa produksi kalus terbanyak dari eksplan akar pada perlakuan terang dengan medium 1,0; 0,1; 3,1; 5,1; 3,3; 5,3; 3,5 dan 5,5. Produksi kalus terbanyak dengan eksplan batang terdapat pada perlakuan terang dengan medium 1,0; 3,0; 5,0; 0,1; 5,1; 3,3; 5,3; 3,5 dan 5,5. Produksi kalus terbanyak dengan eksplan daun terdapat pada perlakuan terang dengan medium 0,1; 3,1; 5,1; 5,2;5,5.Berdasarkan tabel dapat dilihat bahwa umumnya untuk eksplan akar produksi kalus banyak pada perlakuan terang, sedangkan untuk eksplan batang banyak terbentuk pada perlakuan terang, dan untuk eksplan daun kalus banyak terbentuk pada perlakuan terang. Berdasarkan hasil untuk keseluruhan eksplan banyak terbentuk kalus dengan perlakuan terang, karena cahaya akan mempengaruhi pertumbuhan kalus. Hal ini sesuai dengan pendapat Mulyaningsih dan Aluh (2004), intensitas cahaya dan lama penyinaran akan membuat pertumbuhan kalus semakin tinggi .Menurut Reksohadiprojo (1995), faktor-faktor yang mempengaruhi dalam pembentukan kalus ialah komposisi medium nutrien dan faktor-faktor fisik seperti suhu dan kelembapan dan medium yang digunakan seperti pada praktikum ini yaitu medium MS (Murashige dan Skoog) atau modifikasinya. Menurut Soetrisno et al., (2008), ruang kultur baik untuk riset maupun aplikasi praktis, suhu dan cahayanya harus dapat dikontrol. Ruangan harus terisolasi dengan baik sehingga tidak terpengaruh oleh perubahan suhu eksternal. Pencahayaan biasanya diberikan oleh lampu fluorosens.Menurut Soetrisno et al., (2008), keberhasilan kultur jaringan in vitro tergantung pada banyak faktor, jika salah satu faktor tidak terpenuhi dapat menyebabkan kegagalan seluruh pekerjaan yang dilakukan atau setidaknya hasil yang diperoleh akan berbeda dengan yang diharapkan. Faktor-faktor tersebut berupa eksplan, media, dan lingkungan fisik kultur. Faktor-faktor yang mempengaruhi keberhasilan kultur jaringan antara lain genotip, umur tanaman, umur jaringan atau organ, keadaan fisiologis tanaman, keadaan kesehatan tanaman, kondisi pertumbuhan tanaman, posisi eksplan pada tanaman, ukuran eksplan, pelukaan, metode inokulasi, nurse effect, ruang kultur, dan cahaya, suhu, kelembaban, ketersediaan air, oksigen pada ruang inkubasi.

KESIMPULAN

Berdasarkan praktikum yang telah dilaksanakan, dapat disimpulkan bahwa proses perkembangbiakan secara kultur jaringan yang dilakukan cukup berhasil walaupun tedapat sedikit inokulasi yang terkontaminasi. Faktor-faktor yang mempengaruhi kontaminasi yaitu sterilisasi dan metode inokulasi. Pertumbuhan kalus paling baik pada rata rata tumbuh dengan perlakuan terang karena faktor cahya dan lama penyinaran akan membuat pertumbuhan kalus semakin cepat. Faktor-faktor yang mempengaruhi keberhasilan kultur jaringan antara lain genotip, umur tanaman, umur jaringan atau organ, keadaan fisiologis tanaman, keadaan kesehatan tanaman, kondisi pertumbuhan tanaman, posisi eksplan pada tanaman, ukuran eksplan, pelukaan, metode inokulasi, nurse effect, ruang kultur, dan cahaya, suhu, kelembaban, ketersediaan air, oksigen pada ruang inkubasi.

DAFTAR PUSTAKA

Carimi,F.; DePasquable, F. Dan Crescimanno, F.G., .1995. Somatic embryogenesis in Citrus from Styles Culture, Plant Science 105: 81-86

Genta. 1997. Budidaya Tanaman Pangan. Agritec. Surabaya.

Dinarti, D., A. Purwito, dan A.D. Susila. 2007. Optimasi Daya Regenerasi dan Multiplikasi Tunas In Vitro Bawang Merah untuk Mendukung Penyediaan Bibit Berkualitas. Jurnal Agronomi dan Hortikultura Faperta IPB.

Harianto,Wijaya,2009,Pengenalan teknik in vitro, Jakarta : Bumi AksaraJumin, H. B. 1992. Etiologi Tanaman Suatu Pendekatan Fisiologi. Rajawali Press. Jakarta.

Lestari, E.G., D. Sukmadjaya, I. Mariska, M. Kosmiatin, Y. Rusyadi, dan S. Rahayu. 2001. Perbanyakan In Vitro dan Pengujian Lanjutan pada Nomor-Nomor Harapan Panili dan Lada yang Tahan Penyakit. Prosiding Seminar Hasil Penelitian Rintisan dan Bioteknologi Tanaman, Bogor, 3031 Januari 2001. hlm. 109-119. Balai Penelitian Bioteknologi Tanaman Pangan. Bogor.

Maggon, R. dan Singh, B.d., 1995. Promotion of adventure bud regeneration by ABA in Combination with BAP in epicotyl and hypocotyl explants sweet orange (Citrus sinensis L. Osbeck), Scientia horticulturae 63: 123-128.

Marlina, Nina. 2004. Teknik Modifikasi Media Murashige dan Skoog (MS) untuk Konservasi In Vitro Mawar (Rossa spp.)

Mulyaningsih T & Aluh N. 2004. Faktor-faktor yang berpengaruh pada keberhasilan. Mikropropagasi. Unram.ac.id

Nurwahyuni,I. 1994. Perbanyakan tanaman kopi arabika (Cofea arabica L) secara kultur jaringan, komunikasi penelitian 11 (2):88-102.

Prawiro. 1990. Peningkatan Produksi Pertanian. Kedaong. Bandung.

Reksohadiprodjo, S. 1995. Produksi Hijauan Makanan Ternak Tropik Edisi Revisi BPFE. Universitas Gadjah Mada. Yogyakarta.Smith, R.H. 2000. Plant Tissue Culture : Techniques and Experiments. Academic press : London

Soetrisno, R. D., Bambang Suhartanto, Nafiatul Umami, dan Nilo Suseno. 2008. Bahan Ajar Pengantar Kultur Jaringan Tanaman Pakan. Fakultas Peternakan, Universitas Gadjah Mada. Yogyakarta.

Widarto.1996. Pengembangan Tanaman Secara Vegetatif. Dinas pertanian propinsi jawa timur. Surabaya.

Yunita. 2004. Kultur Jaringan Cara Memperbanyak Tanaman secara Efisien. Agromedia Pustaka. Jakarta.