Kuliah Kedua

Metoda Mempelajari mikroorganisme

Untuk apa dipelajari

• Mengetahui Jumlah Mikroorganisme. Pada Perairan mikroba yang sudah melebihi 10 6 sudah dikatakan tercemar

• Mengetahui Jenis-jenis mikroorganisme, apa saja yang ada, organisme menguntungkan atau merugikan?

Beberapa metoda yang bisa dilakukan

• plate count (spread plate, pour plate, spiral plate),

• membrane filtration, MPN, menghitung langsung dengan Petroff Hausser ataupun cara lainnya (misalnya aktivitas metabolik, turbidimetri, berat kering dll)

• Molekuler DNA 16 S

• Pada hasil akhir penghitungan bakteri pada cawan digunakan satuan CFU’s/volume atau berat. CFU’s adalah singkatan dari Coloni Forming Unit’s yang artinya unit-unit / satuan pembentuk koloni. Yang dimaksud satuan pembentuk koloni adalah sel tunggal atau sekumpulan sel yang jika ditumbuhkan dalam cawan akan membentuk satu koloni tunggal. Pada dasarnya sel tersebar homogen pada sampel,

• Perhitungan bakteri dengan metoda cawan

Faktor yg diperhatikan pada analisa sampel jumlah mikroorganismenya :

• Memperkirakan jumlah mikroorganisme yang ada dalam sampel per satuan volum.

• Memilih metode yang cocok sehingga dihasilkan data yang akurat.• Mengetahui jenis/golongan mikroorganisme yang akan dihitung, misalnya

bermaksud akan menghitung yeast, bakteri, atau bakteri genus tertentu saja.

• Menentukan media pertumbuhan yang cocok.• Benar-benar mengetahui perbedaan morfologi koloni antara bakteri, yeast

dan molds.• Mencari tahu standar/ batas ambang/ jumlah maksimum aman jika

sample yang dianalisa memerlukan referensi tersebut.• Memperkirakan jumlah sampel (volum/berat) yang perlu ditampung pada

saat pengambilan sampel yang disesuaikan dengan sample size dari metode teretentu.

• Seorang mikrobiologiwan sebaiknya mampu memprediksi jumlah sel mikroba dalam suatu sampel tertentu atau yang disebut dengan cell density sebelum menganalisanya. Densitas sel sangat tergantung dari jenis sample. Kemampuan mengira-ira ini dapat diperoleh dari pengalaman, membaca atau bahkan bagi yang “expert” didapat dari perasaan. Fungsi utama memperkirakan densitas sel ini adalah untuk menentukan perlu atau tidaknya dilakukan pengenceran atau untuk menentukan jumlah sampel yang akan dianalisa. Keputusan ini adalah sangat penting.

• Metoda Hitungan Cawan• hasil yang paling baik adalah antara 30-300

koloni per cawan , ada juga yang menyebutkan 25-250 koloni per cawan. Mengapa dipilih range jumlah koloni seperti itu ?... Hal ini ditujukan untuk meminimalisir kemungkinan-kemungkinan kesalahan dalam proses analisa, terutama statistical error.

• Untuk lebih jelasnya: • Jika didapat jumlah koloni kurang dari 30 maka:• solusi : memperbesar ukuran sampel.

• Jika didapat jumlah koloni lebih besar dari 300 maka :• Dimungkinkan ada sifat antagonisme antar spesies, misalnya

bakteri A menghambat bakteri B dengan mengeluarkan metabolit tertentu (antibiotik) sehingga bakteri B tidak tumbuh sedangkan keduanya berada diposisi yang berdekatan.

• Perebutan nutrisi/ kompetisi sangat tinggi yang lama-kelamaan menimbulkan keterbatasan nutrisi.

• Kemungkinan dua koloni bergabung menjadi satu lebih besar sehingga mengaburkan jumlah sebenarnya karena dua koloni yang bergabung tetap dihitung satu koloni.

• Memperbesar kemungkinan kesalahan (human error) dalam menghitung koloni

• Solusi : memperkecil ukuran sampel atau diencerkan.

• Kisaran 30-300 koloni ini dijadikan titik tumpu dalam menentukan semua faktor yang mempengaruhi hasil akhir ini, seperti berapa ukuran sampel yang harus dianalisa dan metode apakah yang cocok untuk sampel tersebut.

• Disarankan sebelum menghitung atau menganalisa yang sebenarnya, dilakukan perkiraan (analisa pendahuluan) terlebih dahulu dengan mencoba memplatingnya pada ukuran sampel atau pengenceran yang berbeda-beda.

• Berbagai metode umum untuk uji enumerasi bakteri yang ditanamkan dalam cawan petri antara lain:

• Plate count –dengan teknik penanaman spread plate dan pour plate

• Membrane filtration• Pemilihan metode yang benar tergantung

kepada : Kisaran Hitung

• Hitungan cawan adalah bila sel mikrobe yang masih hidup ditumbuhkan pada medium, maka mikrobe tersebut akan berkembangbiak dan membentuk koloni yang dapat dilihat langsung.

• Metode hitungan cawan dibedakan menjadi dua metode tuang dan metode permukaan.

• Metode tuang yaitu sejumlah sampel (1 ml atau 0,1 ml) dari pengenceran yang dikehendaki dimasukan dalam cawan petri, kemudian ditambah agar-agar cair steril ang telah didinginkan (47-500C) sebanyak 15-20 ml.dan digoyangkan supaya sampelnya menyebar.

• Pada pemupukan dengan metode permukaan, terlebih dahulu di buat agar cawan kemudian sebanyak 0,1 ml sampel yang telah diencerkan dipipet pada permukaan agar-agar tersebut. Kemudian diratakan denngan batang gelas melengkung yang steril. Jumlah koloni dalam sampel dapat dihitung sebagai berikut :

• Koloni per ml atau per gram = Jumlah hitungan x faktor pengenceran (1/pegenceran)

• Keuntungan metode hitungan cawan adalah:• 1. hanya sel mikroba yang hidup yang dapat dihitung• 2. beberapa jasad renik dapat dihitung sekaligus• 3. dapt digunakan untuk isolasi dan identifikasi mikroba, karena

kolni yang terabentuk mungkin berasal dari mikroba yang mempunyai penampakkan fisik.

• Kelemahan metode hitungan cawan adalah : • 1. hasil perhitungan tidak menunjukkan jumlah sel yang

sebenarnya, karena beberapa sel yang berdekatan mungkin membentuk koloni

• 2. medium dan kondisi inkubasi yang berbeda mungkin menghasilkan jumlah yang berbeda pula

• 3. mikroba yang ditumbuhkan harus dapat tumbuh pada medium padat dan membentuk koloni yang kompak, jelas, tidak menyebar

• 4. membutuhkan persiapan dan waktu inkubasi relatif lama sehingga pertumbuhan koloni dapat di hitung

Tugas

• Apa prinsip metoda hitungan cawan• Langkah-langkah Metode cawan?• Langkah-langkah metodaSpread plate dan Pour Plate

ditulis dengan kertas bukan di ketik.• Kenapa yang diakui jumlah koloni hanya 30 – 300• Apa prinsip hitungan MPN, langkah MPN, tabel

hitugan MPN• Apa prinsip perhitunganmikroskopis, langkah2nya,Apa

dan gambarkan objek gelas untukmenghitung dg mikrosopis

Most probable numbre

• Untuk metode MPN (Most probable numbre) digunakan medium cair dalam wadah berupa tabung reaksi, perhitungan di lakukan berdasarkan jumlah tabung yang positif yaitu tabung yang mengalami perubahan pada mediumnya baik itu berupa perubahan warna atau terbentuknya gelembung gas pada dasar tabung durham, sesuai dengan jenis bakteri yang akan di amati. Pada metode perhitungan MPN ini digunakan bentuk tiga seri pengenceran, yang pertama 10-1, 10-2, dan 10-3. Kemudian dari hasil perubahan tersebut dicari nilai MPNnya pada tabel nilai MPN

• Output metode MPN adalah nilai MPN. Nilai MPN adalah perkiraan jumlah unit tumbuh (growth unit) atau unit pembentuk-koloni (colony-forming unit) dalam sampel. Namun, pada umumnya, nilai MPN juga diartikan sebagai perkiraan jumlah individu bakteri. Satuan yang digunakan, umumnya per 100 mL/gram/\.

• Sampel ditumbuhkan pada seri tabung sebanyak 3 atau 5 buah tabung untuk setiap kelompok. Apabila dipakai 3 tabung maka disebut seri 3, dan jika dipakai 5 tabung maka disebut 5 seri. Media pada tabung adalah Lactose Broth

• Nilai MPN ditentukan dengan kombinasi jumlah tabung positif (asam dan gas) tiap serinya setelah diinkubasi

• Jumlah Perkiraan Terdekat (Metode MPN) • Uji Penduga • 1. Diinokulasikan 5 ml sampel ke dalam 5 tabung medium

LB seri ganda • 2. Diinokulasikan 5 ml sampel ke dalam 5 tabung medium

LB seri • tunggal • 3. Diinokulasikan 0,1 ml sampel ke dalam 5 tabung

medium LB seri tunggal • 4. Diinkubasikan semua tabung pada suhu 35oc selama

24 jam. Bila ada asam dan gas dinyatakan positif. • 5. Dicatat hasilnya dan dihitung dengan tabel MP• Lihat Tabel

Metode counting Cell

• Metode Counting Cell adalah metode perhitungan sel bakteri dengan cara menghitung langsung sampel yang menjadi objek perhitungan secara mikroskopis ( dibawah mikroskop).

• Langkah – langkah yang harus dilakukan dalam perhitungan bakteri dengan cara penghitungan langsung sel bakteri (Counting Cell) adalah :

• Permukaan counting cell dan kaca penutup dibersihkan dengan tissue.

• Lakukan persiapan pengenceran : • alarutan pengenceran disiapkan dan disusun

berderet • b.tulis pada tabung dengan urutan pengenceran

10-1 – 10-3 sesuai dengan perkiraan jumlah bakteri.

• c.suspensi dikocok baik-baik sampai kekeruhan rata. Lalu secara aseptik diambil 10 ml sampel (campuran sampel sudah ditambah dengan larutan fisologis NaCl 0,9%) dari tabung pengencer dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi ini merupakan pengenceran 10-1.

• d. Secara aseptik 1 ml sampel diambil dari pengenceran 10-1 dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang sudah berisi 9 ml larutan fisiologil sehingga menjadi pengenceran 10-2, demkian juga hal yang sama untuk pengenceran 10-3

• Secara aseptik sampel diambil dari pengenceran 10-1 sebanyak 1 ml dan diletakkan diatas permukaan countinf cell, dan ditutup dengan penutup, diusahakan agar permukaan hitung penuh olehsampel, sehingga jika ditutup tidak menimbulkan gelembung udara.

• counting cell diletakkan pad amikroskop , kemudiaan diamati dengan pembesaran objektif berkekuatan rendah dan di hitung jumlah sel yang terdapat dalam kotak-kotak counting cell (1000 kotak) x volme sampel (1ml) x faktor pengenceran sampel.

• Keuntunagn• Jumlah bakteri yang ada pada sampel dapat

terhitung dengan jumlah yang pasti.• Dengan pengamatan langsung bakteri dapat

dikelompokkan berdasarkan bentuk dan warna. • Kerugian• Memerlukan waktu yang lama dalam

menghitung bakteri karena dilakukan secara manual.

• Memerlukan ketelitian dalam mengelompokkan bakteri.

Cara Hitungan Mikroskopik

• Metode Petroff-Hausser• Dalam metode ini, perhitungan mikroskopik di lakukan

dengan pertolongan kotak-kotak skala, dimana di dalam setiap ukuran, skala yang seluas 1 mm2 terdapat 25 buah kotak besar dengan luas 0,04 mm2, dan setiap kotak besar terdiri dari 16 kotak-kotak kecil. Tinggi sampel yang terletak di antara kaca benda dan kaca penutup adalah 0,02 mm. jumlah sel dalam beberapa kotak besar dapat dihitung, kemudian di hitung jumlah sel rata-rata dalam kotak besar. Jumlah sel per sampel dapat di hitung sebagai berikut:

• Jumlah sel per ml sampel = jumlah sel per kotak besar x 25 kotak x 1 / 0,02 x 103Jumlah sel / cm3 (ml)

• Jumlah sel per ml sampel = jumlah sel per kotak besar x 25 x 50 x 103

• Jumlah sel per ml sampel = jumlah sel per kotak besar x 1,25 x 106

• Misalnya : Didapat jumlah mikrobe yang mau di hitung 12 sel mikrobe, maka jumlah sel per ml sampel adalah : 12 x 1,25 x 106 = 1,5 x 107 sel/ml.

• Keuntungan hitungan ini adalah metode yang cepat dan murah, tetapi mempunyai kelemahan sebagai berikut :

• sel-sel mikrobe yang telah mati tidak dapat di bedakan dari sel ang masih hidup. Karena itu keduanya terhitung.

• sel-sel yang berukuran kecil sukar dilihat dibawah mikroskap, sehingga kalau tidak teliti tidak terhitung.

• untuk mempertinggi ketelitian, jumlah sel didalam suspensi harus cukup tinggi, minimal untuk bakteri 10 6 sel/ml. hal ini disebabkan dalam setiap bidang pandang yang di amati harus terdapat sejumlah sel yang dapat dihitung.

• tidak dapt digunakan untuk menghitung sel mikrobe di dalam bahan yang banyak mengandung debris atau ekstrak makanan, kaena hal tersebut akan mengganggu dalam perhitungan sel.

Tehnik molekuler DNA !6 S

• Merupakan tehnik terbaru untuk menentukan spesies mikroorganisme

• Sekuen gen 16S rDNA dari mikroorganisme yang baru ditemukan dapat dibandingkan dengan pustaka sekuen 16S rDNA dari mikroorganisme lain melalui program pelacakan Database Basic Local Aligment Search Tool (BLAST)

Tahap analisis DNA

• Isolasi DNAhewan yang akan diteliti• Reaksi Polimerisasi Berantai Polimer

chain reaction (PCR)• Elektroforesis dan Pengamatan Hasil PCR• Purifikasi Gel Elektroforesis• Sekuensing dan Analisis BLAST• http://www/ncbi.nlm.nih.gov/.• Lihat Hasil

Tugas minggu depan

• Cri salah satu metoda dalam mikrobiologi, tuliskan langkah2 pekerjaanya,sebutkan keuntungan dan kerugiannya

• Buat 10 soal kuliah kedua, objekctif pilihan 4 a b c d