KROMATOGRAFI KOLOM KONVENSIONAL

KROMATOGRAFI KOLOM KONVENSIONAL

BAB IPENDAHULUAN A. Latar BelakangManfaat keanekaragaman hayati tersebut bagi manusia sangat beragam seperti sebagai obat, kosmetik, pengharum, penyegar, pewarna, dan penghasil senyawa organic yang jenisnya dan jumlahnya tak terhingga. Berbicara mengenai obat, sumber penggunaanya dapat ditelusiri dari budaya dan konsep kesehatan dari beberapa prinsip pandang. Di Indonesia sendiri, landasan ilmiah konsep pengobatan tradisional belum didokumentasikan secara sistematis, namun manfaatnya telah dirasakan terutama oleh masyarakat yang hidup jauh dari fasilitas modern. Analisis senyawa obat baik dalam bahan ruahan (bulk),dalam sediaan farmasi, maupun dalam cairan biologis dengan metode kromatografi dapat ditilik balik pada awal tahun 1920-an. Saat ini, metode kromatografi merupakan metode utama yang diguanakn untuk analisis obat dalam farmakope.Kromatografi merupakan teknik analisis yang paling sering digunakan dalam analisis sediaan farmasetik. Suatu pemahaman terhadap parameter-parameter yang berpengaruh terhadap kinerja kromatografi akan meningkatrkan system kromatografi sehingga dicapai suatu pemisahan yang baik.Kolom biasanya dikemas dengan partikel fase diam yang kecil. Fase gerak melewatinya dan membawa molekul-molekul sampel yang ada didalamnya. Beberapa molekul meninggalkan kolom terlebih dahulu dibandingkan molekul lainnya. Beberapa molekul ada yang meninggalkan kolom belakangan disebabkan karena mengalami beberapa pengalihan (diversi) selama perjalanannya.B. Rumusan masalahRumusan masalah dari percobaan ini adalah:1. Bagaimana cara mengetahui teknik pemisahan kromatografi kolom ?2. Berapa kapasitas resin (C) pada percobaan ini ?C. Maksud dan Tujuan praktikum1. MaksudAdapun maksud dari praktikum ini adalah untuk mengetahui dan memahami tentang identifikasi suatu zat yang berkhasiat dari fraksi daun Raja dengan menggunakan kromatografi kolom konvensional.2. TujuanAdapun tujuan dari praktikum ini adalah untuk mengisolasi suatu zat berkhasiat dari fraksi daun Raja berdasarkan kromatografi kolom konvensional.

BAB II TINJAUAN PUSTAKAA. Teori UmumIstilah kromatografi mula-mula ditemukan oleh Michael Tswett (1908), Seorang ahli botani Rusia. Nama kromatografi diambil dari bahasa Yunani (chromato= penulisan dangrafe= warna). Kromatografi berarti penulisan dengan warna. Kromatografi adalah cara pemisahan campuran yang didasarkan atas perbedaan distribusi dari komponen campuran tersebut diantara dua fase, yaitu fase diam (stationary) dan fasa bergerak (mobile). Fasa diam dapat berupa zat padat atau zat cair, sedangkan fasa bergerak dapat berupa zat cair atau gas (Estien, 2005).Dalam teknik kromatografi, sampel yang merupakan campuran dari berbagai macam komponen ditempatkan dalam situasi dinamis dalam sistem yang terdiri dari fase diam dan fase bergerak. Semua pemisahan pada kromatografi tergantung pada gerakan relatif dari masing-masing komponen diantara kedua fase tersebut. Senyawa atau komponen yang tertahan (terhambat) lebih lemah oleh fase diam akan bergerak lebih cepat daripada komponen yang tertahan lebih kuat. Perbedaan gerakan (mobilitas) antara komponen yang satu dengan lainnya disebabkan oleh perbedaan dalam adsorbs, partisi, kelarutan atau penguapan diantara kedua fase. Jika perbedaan-perbedaan ini cukup besar, maka akan terjadi pemisahan secara sempurna. (Ibnu, 2005).Kromatografi kolom adalah kromatografi yang menggunakan kolom sebagai alat untuk memisahkan komponen-komponen dalam campuran. Alat tersebut dapat berupa pipa gelas yang dilengkapi suatu kran dibagian bawah kolom untuk mengendalikan aliran zat cair. Ukuran kolom tergantung dari banyaknya zat yang akan dipindahkan. Secara umum perbandingan panjang dan diameter kolom sekitar 8:1, sedangkan jumlah penyerapnya adalah 25-30 kali berat bahan yang akan dipisahkan. Meskipun tersedia berbagai macam kolom dari bahan gelas, namun kadang-kadang buret juga dapat digunakan (Khopkar, 2010). Metode pemisahan kromatografi kolom memerlukan bahan kimia yang cukup banyak sebagai fasa diam dan fasa gerak, bergantung pada ukuran kolom gelas. Untuk melakukan pemisahan campuran dengan metode kromatografi kolom diperlukan waktu yang relatif lama, bisa berjam-jam hanya untuk memisahkan satu campuran. Selain itu, hasil pemisahan kurang jelas artinya kadang-kadang sukar mendapatkan pemisahan secara sempurna karena pita komponen yang satu bertumpang tindih dengan komponen lainnya. Masalah waktu yang lama disebabkan laju alir fasa gerak hanya dipengaruhi oleh gravitasi bumi. Ukuran diameter partikel yang cukup besar membuat luas permukaan fasa diam relatif kecil sehingga tempat untuk berinteraksi antara komponen-komponen dengan fasa diam menjadi terbatas. Apabila ukuran diameter partikel diperkecil supaya luas permukaan fasa diam bertambah maka menyebabkan semakin lambatnya aliran fasa gerak atau fasa gerak tidak mengalir sama sekali. Selain itu fasa diam yang sudah terpakai tidak dapat digunakan lagi untuk pemisahan campuran yang lain karena sukar meregenerasi fasa diam (Chadijah, 2012).Kromatografi kolom konvensional adalah metode kromatografi klasik yang sampai saat ini masih banyak digunakan. Kolom konvensional digunakan untuk memisahkan senyawa-senyawa dalam jumlah banyak. Prinsip dari kromatografi kolom jenis ini adalah kecendrungan komponen kimia untuk terdistribusi ke dalam fase diam atau fase gerak dengan proses elusi berdasarkan gaya grafitasi (Raymond et al, 2006).Pada kromatografi kolom, campuran yang akan dipisahkan diletakkan berupa pita pada bagian atas penjerat yang berada pada kolom kaca, logam atau bahkan plastic. Eluen (fase gerak) dibiarkan mengalir melalui fase diam dalam kolom dan hanya disebabkan oleh gaya gravitasi (Raymond et al, 2006).Keuntungan kromatografi kolom yaitu dapat digunakan untuk analisis dan aplikasi preparative, digunakan unruk menentukan jumlah komponen campuran digunakan untuk memisahkan dan purifikasi substansi. Kerugian kromatografi kolom yaitu untuk mempersiapkan kolom dibutuhkan kemampuan teknik dan manual, metode ini sangat membutuhkan waktu yang lama (time consuming) (Rohman, 2009).

BAB IIIPROSEDUR KERJAA. Alat dan BahanAdapun alat dan bahan yang digunakan pada praktikum ini adalah sebagai berikut:1. Alat Alat yang digunakan pada percobaan ini adalah batang pengaduk, botol coklat, chamber, corong, gelas kimia, gelas ukur, gunting, kolom, sendok tanduk, statif dan vial.2. Bahan Bahan yang digunakan pada percobaan ini adalah aluminium foil, etil asetat, kertas saring, klt, methanol, n-heksan, silica kasar, tissue, dan fraksi daun Raja.B. Cara KerjaKromatografi Koloma. Ditimbang fraksi daun Raja 1 gram, lalu dilarutkan dengan n-heksanb. Disiapkan kolomc. Dibebas lemakkan dengan cara dimasukkan kapas kedalam kolom bagian bawah lalu lapisi dengan kertas saringd. Dimasukkan silika kasar yang telah dilarutkan dengan n-heksan, lalu dilapisi dengan kertas saringe. Dimasukkan pelarut/eluen ke dalam kolom hingga mampatf. Dimasukkan sampel yang sudah disuspensikan dengan n-hexang. Lalu di tambahkan eluen yang telah dibuat dimulai dengan perbandingan 10:0 sampai 0:10 (n-Hexan : Etil Asetat) masing-masing 50 mlh. Dibuka kran perlahan-lahani. Tampung hasil isolat dalam vial sebagai fraksi.Beberapa tahap dalam pengerjaan Kromotografi kolom konvensional1. Pengemasan KolomKolom dipasang tegak lurus pada statif dian dibebaslemakkan menggunakan metanol. Kemudian bagian bawah kolom dilapisi kapas secukupnya dan silica gel yang sudah ditimbang sebanyak 30 gram, lalu dinding kolom diketuk-ketuk sampai silika gel mampat.2. Pengemasan SilikaPertama-tama silika gel ditimbang sebanyak 30 gram dengan menggunakan timbangan analitik. Kemudian silika gel dilarutkan dengan n-heksan kemudian dimasukkan pada kolom dan dimampatkan yang kemudian adsorben tersebut diratakan dengan cara dinding kolom dipukul-pukul atau dengan menggunakan batang pengaduk sehingga permukaannya rata dan siap untuk digunakan.3. Pengemasan SampelMetode yang digunakan yaitu metode basah dimana ekstrak hasil partisi terlebih dahulu ditimbang 1 gram lalu dibuat suspensi dengan menggunakan silika gel dan n-heksan secukupnya sebagai pelarutnya. Diaduk-aduk hingga memadat, kemudian dimasukkan ke dalam kolom yang terlah berisi silika gel dan kertas saring yang telah dilubangi hingga rata. Kemudian dimasukkan lagi kertas saring yang telah dilubangi pula. Setelah itu, dimasukkan eluen berdasarkan tingkat kepolarannya.4. Pemisahan/isolasiSilica gel ditimbang berdasarkan perbandingan 1 gram ekstrak : 30 gram silica gel (tergantung ketersediaan ekstrak dan kapasitas kolom). Dalam praktikum ini digunakan metode basah dengan eluen n-heksan : eter dengan perbandingan 10:0. Dengan meletakkan silika gel di dasar kolom, penjerap dituangkan dalam kolom sedikit demi sedikit.Ekstrak ditimbang berdasarkan perbandingan 2 gram ekstrak:30 gram silica gel dan dikemas menggunakan n-heksan:eter dengan perbandingan 10:0 selapis di atas permukaan kertas saring. Selanjutnya dielusi sampai menghailkan fraksi-fraksi dan ditampung ke dalam vial. Eluen sebelumnya yang telah habis diganti dengan eluen 9:1, kemudian secara berturut-turut dilanjutkan dengan eluen perbandingan 8:2, 7:3, 6:4, 5:5, 4:6, 3:, 2:8, 1:9 dan 0:10 (jumlah perbandingan eluen boleh berubah). Hasil kromatografi kolom berupa fraksi. Fraksi-fraksi digabung dan dianggap satu fraksi berdasarkan warna atau profil KLT sama dengan kolom. Kemudian di masukan silika gel halus lalu di ratakan permukaanya dan di mampatkan. Dimasukkan eluen 1/3 bagian kolom, kemudian dibuka kran hingga eluen keluar semua. Selanjutnya kolom diisi dengan suspensi ektrak dan absorben, dan ditambahkan dengan eluen hingga ekstrak terendam. Dibuka krannya dan ditampung fraksi didalam vial 1 hingga seterusnya. Kemudian dilanjutkan dengan pelarut yang lainnya hingga mencapai vial ke 150 dan diamati.

BAB IVHASIL DAN PEMBAHASAN1. Hasil Praktikum0. Hasil dan data kromatografi kolom konvensionalDari praktikum Kromatografi Kolom yang dilakukan didapatkan data-data sebagai berikut :Sampel: ekstrak kering daun dewaJenis Eluen: campuran n-Hexan : etil-asetat0. Berdasarkan perbandingan eluen.Perbandingan eluenVial

10 : 01 11

9 : 112 24

8 : 225 39

7 : 340 51

6 : 452 61

5 : 562 72

4 : 673 81

3 : 782 93

2 : 894 108

1: 9109 118

0 : 10119- 127

0. Berdasarkan perubahan warnaGolonganVialWarna

11 26Bening

227- 33Kuning terang

334 39Kuning pudar

440 49Hijau muda

550 68Hijau tua

669 -86Hijau

787-110Hijau pudar

8111- 127Hijau bening

B. PembahasanKromatografi kolom konvensional adalah metode kromatografi klasik yang sampai saat ini masih banyak digunakan. Kolom kromatografi digunakan untuk memisahkan senyawa-senyawa dalam jumlah banyak. Prinsip dari kromatografi kolom jenis ini adalah kecenderungan komponen kimia untuk terdistribusi ke dalam fase diam atau fase gerak dengan proses elusi berdasarkan gaya gravitasi.Prinsip kerja kromatografi kolom adalah dengan adanya perbedaan daya serap dari masing-masing komponen, campuran yang akan diuji, dilarutkan dalam sedikit pelarut lalu di masukan lewat puncak kolom dan dibiarkan mengalir kedalam zat menyerap. Senyawa yang lebih polar akan terserap lebih kuat sehingga turun lebih lambat dari senyawa non polar terserap lebih lemah dan turun lebih cepat. Zat yang di serap dari larutan secara sempurna oleh bahan penyerap berupa pita sempit pada kolom. Pelarut lebih lanjut / dengan tanpa tekanan udara masin-masing zat akan bergerak turun dengan kecepatan khusus sehingga terjadi pemisahan dalam kolomSistem pelarut dilakukan dengan cara menggantikan / mengubah kepolaran dari eluen yang digunakan secara bertahap. Eluen tersebut merupakan campuran dua jenis pelarut dengan kepolaran berbeda.Dengan mengubah perbandingan campurannya kita dapat menggeser tingkat kepolaran dari eluen ini.Pada pengerjaannya di awali dengan satu jenis pelarut yaitu berupa heksan saja, kemudian digeser tingkat kepolarannya dengan mencampurkannya dengan pelarut etil asetat.Pencampuran dilakukan dengan perbandingan yang divariasikan secara bertahap, hingga diakhiri dengan hanya menggunakan etil asetat saja sebagai eluen.Dengan ini diharapkan dapat memberikan pemisahan yang lebih baik.Eluen dialirkan untuk pemisahan komponen dengan kecepatan alir sekitar 100 tetesan per menitnya.Aliran eluen diatur agar tidak terlalu cepat agar komponen dapat terpisah. Alirannya pun diusahakan tidak terlalu lambat agar proses tidak terlalu lama. Eluen mengalir mengelusi sampel menyusuri fase diam di sepanjang kolom dengan memanfaatkan gaya gravitasi.Dengan adanya perubahan tingkat kepolaran secara bertahap, keterikatan komponen terhadap pelarut dan keterikatan masing-masing komponen terhadap fase diam akan berubah-ubah, sesuai dengan sifat-sifat masing-masing komponen.. Komponen ini dibawa oleh pelarut dan tertampung pada vial penampung. Hasil pemisahan dapat diakumulasikan dan masih dalam keadaan terlarut dalam pelarut.Pada praktikum ini dilakukan kromatografi kolom konvensional dengan menggunakan sampel daun raja yaitu fraksi n-heksan. Pertama-tama disiapkan alat dan bahan. Dipasang kolom pada statif. Dibilas kolom dengan menggunakan metanol. Dimasukkan kapas didalam kolom. Dimasukkan kertas saring sesuai dengan lubang dari kolom. Dimasukkan silika gel setelah itu, ditambahkan n-heksan untuk dibasahi silica gelnya. Kemudian dimanpatkan agar gelembung udara hilang. Dimasukkan kertas saring sesuai dengan ukuran kolom. Dimasukkan fraksi n-heksan dari daun raja. Dimasukkan pelarut dan eluen dengan perbandingan 10 : 0 (n-heksan : etil asatat) 50 ml petama yaitu n-heksan saja. Lalu dilajutkan dengan perbandingan berikutnya. Sambil ditampung fraksi kedalam via, tiap vial sebanyak 5 ml dan di foto fraksi yang dihasilkan sesuai dengan warnanya. Adapun factor kesalahan yang perlu diperhatikan dalam praktikum ini adalah cara penyiapan kolom. Pemilihan kolom dan cara-cara penyiapannya harus benar agar diperoleh kolom yang baik.

BAB VKESIMPULANA. KesimpulanDari hail praktikum dapat disimpulkan bahwa hasil keseluruhan fraksi dalam vial menggunakan pelarut dan eluen dengan perbandingan n-heksan : etil asatat (10:0, 9:1, 8:2, 7:3, 6:4, 5:5, 4:6, 3:7, 2:8, 1:9, 0:10) yaitu sebanyak 127 vial.B. SaranSaran untuk laboratorium agar alat dan alat didalam laboratorium harus ditambah agar dapat meminimalkan dan mengefisienkan waktu praktikum. Terutama alat yang berhubungan dengan praktikum ini.

DAFTAR PUSTAKAAnonim, 2012, Penuntun dan Buku Kerja Praktikum Fitokimia 1, Fakultas Farmasi, Universitas Muslim Indonesia, Makassar.

Dirjen POM, 1979, "Farmakope Indonesia Edisi III", Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta.

Djamil, R., Iwang S., dan Komar R., 1998,Telaah Fitokimia dan Uji Hayati PendahuluanUlva FasciataDelile,Sekolah Farmasi ITB.

Harborne. I.B., "Metode Fitokimia" , terjemahan K. Radmawinata dan I. Soediso, penerbit ITB, Bandung, 1987.

Heyne, K.,1987. "Tumbuhan Berguna Indonesia" , Jil. II, terjemahan Badan Litbang Kehutanan Jakarta, Yayasan Santana Warna Jaya, Jakarta.Raymond G. Reid and Satyajit D.Sarker.2006.Isolation of Natural Product by Low- Pressure Column Chromatography. In Sarker, SD., Latif,Z., and Gray, AI. (Ed). Natural Products Isolation. Humana Press Inc.Totowa, New Jersey

Steenis, van Dr., 1992, Flora untuk Sekolah di Indonesia, PT. Pradnya Paramita, Jakarta.

Sudjadi, Drs., 1986, Metode Pemisahan, UGM Press, Yogyakarta.

http://ccrc.farmasi.ugm.ac.id/?page_id=2401

LAMPIRANA. Skema Kerja PraktikumKolom dipasang tegak lurus pada statif sibilas menggunakan methanol

Bagian bawah kolom dilapisi kapas dan kertas saring

Silika gel kasar 30 gram disuspensi dengan eluen n-heksan : etil asetat

Suspensi dari silika gel dimasukkan ke dalam kolom lalu dimampatkan

Diberikan kertas saring

Ekstrak ditimbang 1 gram disuspensikan dengan eluen dengan perbandingan 10 : 0 selapis diatas permukaan kertas saring

Dielusi sampai menghasilkan fraksi fraksi dan ditampung ke dalam vial.

Eluen yang sebelumnya yangtelah habis diganti dengan eluen 9 : 1, kemudian secara berturut turutdilanjutkan dengan eluen perbandingan 8:2, 7:3, 6:4, 5:5, 4:6, 3:7, 2:8, dan 9:1

Hasil kromatografi kolom berupa fraksi.Fraksi fraksi digabung dan dianggap satu fraksi berdasarkan warna atau profil KLT.

B. Gambar Praktikum

Husnul Khatimah Ulfa MUH. IKBAL 15020120092