UJI AKTIVITAS ANTIBAKTERI EKSTRAK DAN FRAKSI DAUN … · FRAKSI AKTIF DENGAN KROMATOGRAFI GAS -...

1

1

UIN SYARIF HIDYATULLAH JAKARTA

UJI AKTIVITAS ANTIBAKTERI EKSTRAK DAN

FRAKSI DAUN SINTOK (Cinnamomum sintoc Blume.)

TERHADAP Staphylococcus aureus DAN Pseudomonas

aeruginosa SERTA ANALISA KOMPONEN SENYAWA

FRAKSI AKTIF DENGAN KROMATOGRAFI GAS -

SPEKTROMETRI MASSA

SKRIPSI

ZAKIYA KAMILA MUHAMAD

1110102000012

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN

PROGRAM STUDI FARMASI

JAKARTA

SEPTEMBER 2014

ii

ii

UIN SYARIF HIDYATULLAH JAKARTA

UJI AKTIVITAS ANTIBAKTERI EKSTRAK DAN

FRAKSI DAUN SINTOK (Cinnamomum sintoc Blume.)

TERHADAP Staphylococcus aureus DAN Pseudomonas

aeruginosa SERTA ANALISA KOMPONEN SENYAWA

FRAKSI AKTIF DENGAN KROMATOGRAFI GAS -

SPEKTROMETRI MASSA

SKRIPSI

Diajukan sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Farmasi

ZAKIYA KAMILA MUHAMAD

1110102000012

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN

PROGRAM STUDI FARMASI

JAKARTA

SEPTEMBER 2014

iii

iii

HALAMAN PERNYATAAN ORISINALITAS

Skripsi ini adalah hasil karya sendiri,

dan semua sumber yang dikutip maupun dirujuk

telah saya nyatakan dengan benar.

Nama : Zakiya Kamila Muhamad

NIM : 1110102000012

Tanda Tangan :

Tanggal : 10 September 2014

iv

iv

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING


NIM : 1110102000012

Program Studi : Farmasi

Judul : Uji Aktivitas Antibakteri Ekstrak dan Fraksi Daun Sintok

(Cinnamomum sintoc. Blume) terhadap Staphylococcus aureus

dan Pseudomonas aeruginosa serta Analisa Komponen

Senyawa Fraksi Aktif dengan Kromatografi Gas – Spektrometri

Massa.

Menyetujui,

Pembimbing I

Prof. Dr. Atiek Soemiati, Apt. M.S

Pembimbing II

Arief Heru Prianto, M.Si

NIP: 197805032003121002

Mengetahui,

Ketua Program Studi Farmasi FKIK

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

Drs. Umar Mansur, Msc., Apt.

v

v

HALAMAN PENGESAHAN SKRIPSI

Skripsi ini diajukan oleh :


NIM : 1110102000012

Program Studi : Farmasi





Massa.

Telah berhasil dipertahankan di hadapan Dewan Penguji dan diterima

sebagai bagian persyaratan yang diperlukan untuk memperoleh gelar

Sarjana Farmasi pada Program Studi Farmasi Fakultas Kedokteran dan

Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta.

DEWAN PENGUJI

Pembimbing 1 : Prof. Dr. Atiek Soemiati, Apt. M.S ( )

Pembimbing 2 : Arief Heru Prianto, M.Si ( )

Penguji 1 : Drs. Umar Mansur, Msc., Apt. ( )

Penguji 2 : Puteri Amelia M.Farm., Apt. ( )

Ditetapkan di : Jakarta

Tanggal : 10 September 2014

vi

vi

ABSTRAK


Jurusan : Farmasi





Massa.

Cinnamomum sintoc Blume. merupakan salah satu tanaman yang terdapat di

hutan tropis Indonesia yang secara empiris digunakan untuk pengobatan luka dan

diare (Soh wuu - kuang, 2011). Penelitian ini bertujuan mengetahui aktivitas

antibakteri ekstrak n – heksana, etil asetat, metanol daun Cinnamomum sintoc dan

fraksi dari ekstrak yang mempunyai aktivitas antibakteri tertinggi. Ekstrak n –

heksana, etil asetat dan metanol diperoleh dengan metode maserasi bertingkat,

ketiga ekstrak tersebut diuji dengan metode difusi cakram untuk mengetahui

aktivitas antibakterinya. Dari ketiga ekstrak tersebut, ekstrak etil asetat memiliki

aktivitas antibakteri tertinggi dengan rata – rata diameter zona hambat 10,85 mm

terhadap bakteri Staphylococcus aureus ATCC 25923 dan 11,625 mm terhadap

bakteri Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853. Ekstrak etil asetat kemudian

difraksinasi menggunakan kromatografi kolom dan didapatkan 10 fraksi.

Kesepuluh fraksi tersebut diuji dengan metode bioautografi untuk mengetahui

aktivitas antibakterinya. Fraksi 1 mempunyai aktivitas antibakteri tertinggi

terhadap bakteri Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, tetapi tidak mempunyai

aktivitas antibakteri terhadap Staphylococcus aureus ATCC 2592. Fraksi 8

mempunyai aktivitas antibakteri tertinggi terhadap bakteri Staphylococcus aureus

ATCC 2592, tetapi tidak mempunyai aktivitas antibakteri terhadap Pseudomonas

aeruginosa ATCC 27853. Hasil pengujian mikrodilusi menunjukkan nilai KHM

fraksi 1 yaitu 12,5 mg/ml terhadap bakteri Pseudomonas aeruginosa ATCC

27853. Hasil Kromatografi Gas – Spektrometri Massa dari fraksi 1 diperoleh 21

senyawa yang merupakan golongan sesquiterpen (47,42%), fenol (5,88%), aldehid

alifatik (21,8%), ester (1,32%), asam lemak (2,65%), sesquiterpen alkohol (1,4%),

keton alifatik (2,64%), hidrokarbon alifatik (4,94%), dan alkohol (11,94%).

Senyawa yang memiliki kelimpahan terbesar yaitu δ – Cadinene (14,34%) dan

Myristaldehyde (13,03%).

Kata kunci: daun Cinnamomum sintoc, antibakteri, ekstrak, fraksi, difusi cakram,

bioautografi, KHM, GCMS.

vii

vii

ABSTRACT

Name : Zakiya Kamila Muhamad

Program Study : Pharmacy

Title : Antibacterial Activity of Leaf Extracts and Fractions of Sintok

(Cinnamomum sintoc. Blume) against Staphylococcus aureus

and Pseudomonas aeruginosa, and Gas Chromatography – Mass

Spectrometry Analysis of Chemical Constituent of Active

Fraction.

Cinnamomum sintoc is one of the plants which are founded in the tropical forest

of Indonesia, which empirically is used for the medicinal treatment of wounds and

diarrhea. This study aims to determine the antibacterial activity of extracts n -

hexane, ethyl acetate, methanol of leaf Cinnamomum sintoc and fractions of the

extract which has the highest antibacterial activity. Extract n - hexane, ethyl

acetate and methanol are obtained with multistage maceration method, those

extracts are tested by disc diffusion method to determine its antibacterial

activities. From those, ethyl acetate extract has the highest antibacterial activity

with average diameter of inhibiton zone is 10,85mm to Staphylococcus aureus

ATCC 25923 and 11,625 mm to Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, then

ethyl acetate extract is fractionated by using column chromatography and

produced 10 fractions. Each fraction is tested by biaoutographic method to

determine its antibacterial activities. Fraction 1 has the highest antibacterial

activity to Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, but does not have antibacterial

activity to Staphylococcus aureus ATCC 25923. Fraction 8 has the highest

antibacterial activity to Staphylococcus aureus ATCC 25923, but does not have

antibacterial activity to Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853. Microdilution

test results show MIC values of fraction 1 is 12.5 mg / ml to Pseudomonas

aeruginosa ATCC 27853. Gas Chromatography result - Mass Spectrometry of

fraction 1 is obtained with 21 compounds which are a class of sesquiterpenes

(47,42%), phenol (5,88%), aliphatic aldehydes (21,8%), esters (1,32%), fatty acid

(2,65%), sesquiterpen alcohol (1,4%), aliphatic ketones (2,64%), aliphatic

hydrocarbons (4,94%), alcohols (11,94%). Compounds that have the greatest

abundance are δ - Cadinene (14.34%) and Myristaldehyde (13.03%).

Keyword: Cinnamomum sintoc leaf, antibacterial, extract, fraction, disc diffusion,

bioautographic, MIC, GCMS.

viii

viii

KATA PENGANTAR

Alhamdulillahirabbil’alamin atas segala nikmat iman, Islam, kesempatan,

serta kekuatan yang telah diberikan Allah Subhanahuwata’ala sehingga Penulis

dapat menyelesaikan penelitian dan penulisan skripsi ini. Shalawat serta salam

untuk tuntunan dan suri tauladan Rasulullah Shallallahu‘alaihiwasallam beserta

keluarga dan sahabat beliau yang senantiasa menjunjung tinggi nilai-nilai Islam

yang sampai saat ini dapat dinikmati oleh seluruh manusia di dunia.

Skripsi ini dibuat sebagai salah satu syarat untuk mendapat gelar sarjana

farmasi dari Program Studi Farmasi Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan

Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah. Judul skripsi ini adalah “Uji

Aktivitas Antibakteri Ekstrak dan Fraksi Daun Sintok (Cinnamomum sintoc

Blume.) terhadap Staphylococcus aureus dan Pseudomonas aeruginosa serta

Analisa Komponen Senyawa Fraksi Aktif dengan Kromatografi Gas –

Spektrometri Massa”.

Penulis menyadari bahwa keberhasilan penelitian dan penulisan skripsi ini

tidak lepas dari bantuan dan bimbingan dari banyak pihak. Oleh karena itu, pada

kesempatan kali ini penulis mengucapkan terima kasih kepada:

1. Prof. Dr. Atiek Soemiati, Apt. MS. selaku pembimbing pertama dan

bapak A. Heru Prianto, Msi selaku pembimbing kedua yang senantiasa

dengan sabar tulus dan ikhlas memberikan arahan, bimbingan,

dorongan, semangat, saran dan solusi selama penelitian dan penulisan

skripsi.

2. Prof. Dr. (hc) dr. M.K. Tadjudin, Sp. And. selaku Dekan Fakultas

Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri Syarif

Hidayatullah Jakarta.

3. Drs. Umar Mansur, M.Sc., Apt selaku Ketua Program Studi Farmasi

Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri

Syarif Hidayatullah Jakarta.

4. Prof (Ris) Dr. Sulaeman Yusuf, M. Agr selaku kepala Puslit Biomaterial

LIPI.

5. Bapak dan Ibu staf pengajar dan karyawan yang telah memberikan

bimbingan dan bantuan selama saya menempuh pendidikan di Program

ix

ix

Studi Farmasi Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas

Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta.

6. Para laboran Farmasi UIN, Ka Liken, Ka Rahmadi, Ka Eris, Mba Rani,

Ka Lisna dan Ka Tiwi yang telah banyak membantu selama praktikum

maupun penelitian.

7. Pak Dedi, Pak Rivo, Bu Denny, Ka Awie, dan seluruh staf Puslit

Biomaterial LIPI Cibinong yang telah banyak memberi bimbingan dan

membantu selama penelitian.

8. Pusat Konservasi Tumbuhan – Kebun Raya Bogor, LIPI yang telah

membantu perihal bahan baku penelitian yaitu tanaman Cinnamomum

sintoc Blume.

9. Mama yang selalu memberikan kasih sayang, semangat dan doa yang

tiada henti serta dukungan baik moral maupun materil dan almarhum

papa yang telah mendidik dan memberi nasehat semasa beliau ada.

Kasih sayang yang kalian berikan sungguh tak ternilai.

10. Om dan tante, serta adik – adikku tersayang, Zaid Hafiz M yang selalu

mendukung dan memberikan bantuan setiap kali dibutuhkan, Zaim

Kamil M yang selalu menghibur dan memberikan keceriaan dikala

penat.

11. Teman – teman seperjuangan dalam penelitian ini yaitu Kurnia Anisah

dan Annisa Alfira yang senantiasa dengan sabar menemani, mendukung

dan membantu disaat sedang dibutuhkan.

12. Teman – teman “ngocol” tersayang Amel, Vicka, Afifah, Dita, Ipho,

Dias, Diah dan khususnya Desi Syifa yang telah memberikan

kesempatan kepada saya untuk melakukan penelitian di Puslit

Biomaterial, terima kasih karena kalian selalu mengerti, membantu,

mendukung dan berbagi cerita disaat senang maupun sedih, semoga

ukhuwah kita akan selalu terjaga sampai kapanpun.

13. Teman – teman “Andalusia” Farmasi 2010 yang solid dan selalu

membantu satu sama lain.

14. Ka Ainul, Ka luqman dan kakak kelas Farmasi UIN lainnya yang telah

banyak memberikan arahan dan bantuan.

x

x

Penulis menyadari bahwa skripsi ini masih banyak keterbatasan dan

kekurangan. Oleh Karena itu, dengan segala kerendahan hati, penulis sangat

mengharapkan kritik dan saran yang membangun demi kesempurnaan skripsi ini.

Penulis berharap semoga skripsi ini dapat bermanfaat dan member sumbangan

pengetahuan khususnya di Program Studi Farmasi Fakultas Kedokteran dan Ilmu

kesehatan, Universtas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta dan pembaca pada

umumnya.

Jakarta, 1 September 2014

Penulis

xi

xi

HALAMAN PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI

TUGAS AKHIR UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIK

Sebagai sivitas akademik Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah

Jakarta, Saya yang bertanda tangan di bawah ini :


NIM : 1110102000012

Program studi : Farmasi

Fakultas : Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan (FKIK)

Jenis Karya : Skripsi

Demi pengembangan ilmu pengetahuan, saya menyetujui skripsi/karya ilmiah

saya dengan judul :

UJI AKTIVITAS ANTIBAKTERI EKSTRAK DAN FRAKSI DAUN

SINTOK (Cinnamomum sintoc. Blume) TERHADAP Staphylococcus aureus

DAN Pseudomonas aeruginosa SERTA ANALISA KOMPONEN SENYAWA

FRAKSI AKTIF DENGAN KROMATOGRAFI GAS – SPEKTROMETRI

MASSA

untuk dapat diakses melalui Digital Library Perpustakaan Universitas Islam

Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta untuk kepentingan akademik sebatas

sesuai dengan Undang-Undang Hak Cipta. Dengan demikian persetujuan

publikasi karya ilmiah ini saya buat dengan sebenarnya.

Dibuat di : Jakarta

Pada Tanggal : 10 September 2014

Yang menyatakan,

(Zakiya Kamila Muhamad)

xii

xii

DAFTAR ISI

Halaman

HALAMAN JUDUL………………………………………………………... ii

HALAMAN PERNYATAAN ORISINALITAS.………………………….. iii

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING…………………………… iv

HALAMAN PENGESAHAN SKRIPSI…………………………………… v

ABSTRAK…………………………………………………………………… vi

ABSTRACT………………………………………………………………….. vii

KATA PENGANTAR…………………………………………………….… viii

HALAMAN PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI…………… xi

DAFTAR ISI………………………………………………………………… xii

DAFTAR GAMBAR………………………………………………………... xiv

DAFTAR TABEL…………………………………………………………… xv

DAFTAR LAMPIRAN……………………………………………………... xvi

BAB 1 PENDAHULUAN…………………………………………………… 1

1.1 Latar Belakang……………………………………………………..

1.2 Perumusan Masalah………………………………………………...

1.3 Tujuan Penelitian…………………………………………………...

1.4 Manfaat Penelitian …………………………………………………

1

3

4

4

BAB II TINJAUAN PUSTAKA…………………………………………… 5

2.1 Tanaman Kayu Sintok……………………………………………... 5

2.2 Metode Ekstraksi…………………………………………………... 7

2.3 Metode Pengujian Antibakteri……………………………………...

2.4 Tinjauan Tentang Bakteri…………………………………………..

10

13

2.5 Tinjauan Tentang Antibakteri……………………………………… 19

2.6 Macam – Macam Medium…………………………………………. 22

2.7 Kromatografi……………………………………………….………. 23

BAB III METODOLOGI PENELITIAN ………………………………… 27

3.1 Waktu dan Tempat Penelitian ……………………………………... 27

3.2 Alat dan Bahan…………………………………………………….. 27

3.3 Metode Penelitian………………………………………………….. 28

3.3.1 Pembuatan Simplisia..………………………………………

3.3.2 Penetapan Kadar Air Simplisia……………………………..

3.3.3 Pembuatan Ekstrak………………………………………….

3.3.4 Pewarnaan Gram…………………………………………….

3.3.5 Uji Aktivitas Antibakteri Ekstrak n – heksana, Etil asetat

dan Metanol daun Cinnamomum sintoc dengan Metode

Difusi Cakram……………………………………………….

3.3.6 Skrining Fitokimia Ekstrak yang Memiliki Aktivitas

Antibakteri Tertinggi………………………………………

28

28

28

29

30

32

xiii

xiii

3.3.7 Penetapan Kadar Air Ekstrak yang Memiliki Aktivitas

Antibakteri Tertinggi………………………………………..

3.3.8 Kromatografi Lapis Tipis (KLT)……………………………

3.3.9 Fraksinasi Ekstrak Etil Asetat Menggunakan Kromatografi

Kolom……………………………………………………….

3.3.10 Uji Aktivitas Antibakteri Fraksi dari Ekstrak yang Memiliki

Aktivitas Antibakteri Tertinggi dengan Metode Bioautografi

3.3.11 Penentuan Nilai Konsentrasi Hambat Minimum (KHM)

Fraksi yang Mempunyai Aktivitas Antibakteri Tertinggi….

3.3.12 Analisa Komponen Senyawa Fraksi yang Mempunyai

Aktivitas Antibakteri Tertinggi dengan Kromatografi Gas –

Spektrometri Massa…………………………………………

33

33

34

35

36

38

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN…………………………………... 39

4.1 Pembuatan Simplisia……………………………………………

4.2 Kadar Air Simplisia Daun Cinnamomum sintoc………………..

4.3 Pembuatan Ekstrak……………………………………………..

4.4 Pewarnaan Gram………………………………………………..

4.5 Pengujian Aktivitas Antibakteri Ekstrak n – heksana, Etil

Asetat dan Metanol Daun Cinnamomum sintoc Dengan Metode

Difusi Cakram (Disc Diffusion)………………………………...

4.6 Kadar Air Ekstrak Etil Asetat daun Cinnamomum sintoc………

4.7 Uji Fitokimia Ekstrak Etil Asetat……………………………….

4.8 Fraksinasi Ekstrak Etil Asetat Menggunakan Kromatografi

Kolom…………………………………………………………...

4.9 Uji Aktivitas Antibakteri Fraksi Dengan Metode Bioautografi...

4.10 Penentuan Nilai Konsentrasi Hambat Minimum (KHM) Fraksi

1 dari Ekstrak Etil Asetat……………………………………….

4.11 Analisa Komponen Senyawa pada Fraksi 1 dari Ekstrak Etil

Asetat dengan Kromatografi Gas – Spektrometri Massa……….

39

39

40

40

41

45

46

46

47

52

53

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN…………………………………… 57

5.1 Kesimpulan……………………………………………………….

5.2 Saran……………………………………………………………...

57

58

DAFTAR PUSTAKA……………………………………………………… 59

xiv

xiv

DAFTAR GAMBAR

Halaman

Gambar 2.1 Pohon Cinnamomum sintoc…………………………………. 6

Gambar 2.2 Daun dan batang Cinnamomum sintoc…………………........ 6

Gambar 2.3 Rumus bangun tetrasiklin…………………………………… 21

Gambar 4.1 Hasil pewarnaan Gram bakteri Staphylococcus aureus dan

Pseudomonas aeruginosa dibawah mikroskop perbesaran

100 x 10………………………………………………...........

41

Gambar 4.2 Hasil uji aktivitas antibakteri ekstrak metanol, etil asetat, n –

heksana daun C. sintoc konsentrasi 50 mg/ml terhadap

bakteri Staphylococcus aureus ATCC 25923 dan

Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853……………………..

43

Gambar 4.3 Hasil uji aktivitas antibakteri fraksi dari ekstrak etil setat

dan tetrasiklin dengan metode bioautografi terhadap bakteri

Staphylococcus aureus ATCC 25923 dan Pseudomonas

aeruginosa ATCC 27853……………………….....................

49

Gambar 4.4 Hasil uji bioautografi fraksi 8 terhadap S. aureus dan fraksi 1

terhadap P.aeruginosa……………………………………….

51

Gambar 4.5 Kromatogram fraksi 1 dari ekstrak etil asetat……………….. 54

xv

xv

DAFTAR TABEL

Halaman

Tabel 2.1 Perbedaan ciri – ciri bakteri Gram positif dan Gram negatif……... 15

Tabel 4.1 Hasil rendemen ekstrak n – heksana, etil asetat dan metanol…...... 40

Tabel 4.2 Rata – rata diameter zona hambat ekstrak n – heksana, etil asetat

dan metanol daun C. sintoc konsentrasi 50 mg/ml terhadap

bakteri Staphylococcus aureus dan Pseudomonas

aeruginosa…………………………………………………………

42

Tabel 4.3 Hasil uji fitokimia ekstrak etil asetat……………………………... 46

Tabel 4.4 Bobot masing – masing fraksi…………………………………... 47

Tabel 4.5 Hasil uji aktivitas antibakteri fraksi dari ekstrak etil asetat dengan

metode bioautografi terhadap bakteri Staphylococcus aureus

ATCC 25923 dan Pseudomonas aeruginosa ATCC

27853…………………………………………….........…………...

48

Tabel 4.6 Data hasil uji KHM fraksi 1 dari ekstrak etil asetat terhadap

bakteri Pseudomonas aeruginosa.………………………………...

52

Tabel 4.7 Hasil analisis senyawa pada fraksi 1 dari ekstrak etil asetat

dengan Kromatografi Gas – Spektrometri Massa…………………

54

xvi

xvi

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

Lampiran 1. Hasil determinasi tanaman Cinnamomum sintoc Blume……… 64

Lampiran 2. Alur penelitian………………………………………………… 65

Lampiran 3. Bagan kerja ekstraksi simplisia daun Cinnamomum sintoc….. 66

Lampiran 4. Penghitungan rendemen ekstrak………………………………. 67

Lampiran 5. Profil KLT ekstrak aktif antibakteri (ekstrak metanol dan

ekstrak etil Asetat)……………………………………………

68

Lampiran 6. Penghitungan kadar air simplisia dan ekstrak etil asetat……… 69

Lampiran 7. Skema pembuatan suspensi bakteri uji………………………... 70

Lampiran 8. Bagan kerja uji aktivitas antibakteri ekstrak n – heksana, etil

asetat dan metanol dengan metode disc diffusion……………..

71

Lampiran 9. Bagan kerja fraksinasi dengan kromatografi kolom………….. 73

Lampiran 10. Profil KLT eluat hasil fraksinasi dari ekstrak etil asetat dengan

kromatografi kolom………………………………….

74

Lampiran 11. Profil KLT fraksi gabungan………………………………….. 75

Lampiran 12. Bagan kerja uji aktivitas antibakteri fraksi 1 dari ekstrak etil

asetat dengan metode bioautografi…………………………….

76

Lampiran 13. Skema pengujian KHM larutan uji fraksi 1 dari ekstrak etil

asetat…………………………………………………………...

77

Lampiran 14. Hasil Uji KHM Fraksi 1 dari ekstrak etil asetat terhadap

Bakteri Pseudomonas aeruginosa……………………………..

78

Lampiran 15. Hasil GCMS fraksi 1 dari ekstrak etil asetat………………….. 79

Lampiran 16. Gambar bahan – bahan yang digunakan……………………… 80

Lampiran 17. Gambar alat – alat yang digunakan…………………………… 81

1


BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Penyakit infeksi merupakan salah satu masalah kesehatan yang

semakin meningkat. Infeksi dapat disebabkan oleh virus, jamur, parasit dan

bakteri. Staphylococcus aureus adalah jenis bakteri yang sering menimbulkan

penyakit pada manusia. Infeksi oleh bakteri ini menyebabkan timbulnya

penyakit dengan tanda – tanda khas, yaitu peradangan, nekrosis dan

pembentukan abses. Bakteri lain yang sering menimbulkan penyakit adalah

Pseudomonas aeuruginosa. Bakteri ini sering dihubungkan dengan penyakit

pada manusia. Organisme ini dapat merupakan penyebab 10 – 20 % infeksi

nosokomial, sering diisolasi dari penderita neoplastik, luka dan luka bakar

yang berat. Bakteri ini antara lain dapat menyebabkan infeksi pada saluran

pernafasan bagian bawah, saluran kemih, dan mata. Pengobatan penyakit

infeksi bakteri dengan penggunaan antibakteri. Penggunaan antibakteri secara

besar – besaran dan pemakaian yang tidak sesuai aturan menjadi penyebab

utama terjadinya resistensi antibakteri.

Resistensi antibakteri merupakan salah satu masalah kesehatan yang

sampai saat ini belum dapat teratasi dengan baik. Perpindahan resistensi

(resistance transference) antar bakteri menjadi salah satu sebab resistensi

antibakteri berkembang cepat dan sulit untuk diatasi. Penelitian – penelitian

dengan berbagai kuman patogen menunjukkan bahwa pemindahan resistensi

dari suatu bakteri ke bakteri lain adalah peristiwa yang umum di dunia

mikroba dan dengan dicapainya perkembangan mutakhir di dalam biologi

molekuler, pemindahan resistensi ini dapat dijelaskan secara rinci. Bakteri –

bakteri patogen telah mampu mengembangkan sejumlah besar mekanisme

untuk menghindarkan diri dari efek antibakteri dengan cara membentuk enzim

yang dapat merusak antibakteri sampai pada kemampuannya untuk melakukan

modifikasi dari proses metaboliknya. Situasi ini tidak statis, mekanisme yang

baru yang lebih kompleks secara cepat dikembangkan mikroorganisme

mengikuti diperkenalkannya dan digunakannya suatu antibakteri yang baru

1

2


(Yenny, 2007). Oleh karena itu seiring dengan berkembangnya resistensi

tersebut harus diimbangi dengan penemuan sumber antibakteri baru yang

dapat membunuh bakteri maupun menghambat pertumbuhannya. Penemuan

sumber antibakteri tersebut dapat berasal dari alam maupun sintetik.

Indonesia adalah suatu negara kepulauan yang memiliki hutan tropis

terbesar kedua di dunia, kaya dengan keanekaragaman hayati dan dikenal

sebagai salah satu dari tujuh negara “megabiodiversity” kedua setelah Brazil.

Distribusi tumbuhan tingkat tinggi yang terdapat di hutan tropika Indonesia

lebih dari 12 % (30.000) dari yang terdapat di muka bumi (250.000) (Taslim

Ersam, 2004). Penggunaan biodiversitas tumbuhan sebagai bahan pengobatan

merupakan salah satu alternatif untuk menemukan nilai manfaat dari hutan

yang ada di Indonesia. Disamping itu, yang tidak kalah menariknya adalah

hutan tropis Indonesia memiliki keanekaragaman hayati dapat dipandang

sebagai pabrik atau industri bahan – bahan kimia hayati, yang renewable

berproduksi sepanjang tahun. Keanekaragaman hayati Indonesia adalah salah

satu aset nasional dengan nilai ekonomis yang tinggi, yang merupakan

ecological specific dengan comparative advantage (Taslim Ersam, 2004).

Sebagai contoh, satu spesies tumbuhan pada awalnya mempunyai nilai sebesar

US$ 100, setelah diproses menjadi ekstrak kasar nilai ini dapat ditingkatkan

sampai 10 kali lipat (US$ 1000). Apabila dilakukan proses lebih lanjut sampai

senyawa murni dan memiliki aktivitas tertentu, nilainya menjadi berlipat

ganda, menjadi US$ 109 (Achmad,1999; Backer,1995). Oleh karena itu,

dibutuhkan penelitian lebih lanjut mengenai tanaman yang berasal dari hutan

tropis Indonesia, khususnya tanaman – tanaman yang berpotensi mempunyai

aktivitas sebagai obat.

Salah satu tanaman yang terdapat di hutan tropis Indonesia adalah

Cinnamomum sintoc. Tanaman ini tersebar di Kalimantan Barat, Kalimantan

Selatan, Jawa, dan Sumatera. Kulit kayunya digunakan sebagai pengobatan

tradisional untuk diare, gangguan usus dan penyembuhan luka (Soh wuu -

kuang, 2011). Penelitian tentang potensi tanaman Cinnamomum sintoc di

Indonesia belum banyak dilakukan. Namun penelitian lain mengenai potensi

cinnamomum dengan spesies berbeda (Cinnamomum sp.) sebagai antibakteri

3


telah banyak dilakukan. Penelitian mengenai aktivitas antibakteri dari ekstrak

daun Cinnamomum iners menunjukkan fraksi etil asetat dari ekstrak daun

Cinnamomum iners terstandar memiliki aktivitas antibakteri terhadap bakteri

Gram positif (Bacillus cereus, Bacillus subtilis, Salmonella typhi, methicillin

resistant Staphylococcus aureus (MRSA) dan Gram negatif (Escherichia coli,

Pseudomonas aeruginosa, Shigella sonnei, Pseudomonas aeruginosa)

(Sabariah Ismail, 2011). Komponen senyawa dalam ekstrak cinnamon seperti

cinmamaldehyde, eugenol dan cavracol dapat menghambat pertumbuhan

bakteri Helicobacter pylori (Mina Tabak, 1999). Penelitian yang dilakukan

oleh Shan et al (2007) menunjukkan bahwa ekstrak Cinnamomum burmanii

Bl. yang diperoleh dari Indonesia mengandung senyawa nonvolatile (Tannin

terkondensasi) yaitu 23,2 % proanthocyanidin dan 3,6 % (epi) cathecin dan

sebagai tambahan cinnamaldehyde 64,1 % yang mempunyai aktivitas

antibakteri terhadap bakteri patogen penyebab keracunan makanan. Bila

dilihat secara kemotaksonomi, maka sangat dimungkinan bahwa

Cinnamomum sintoc juga mempunyai kandungan senyawa dan manfaat yang

sama dengan Cinnamomum sp., khususnya sebagai antibakteri.

Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui aktivitas antibakteri ekstrak

n – heksana, etil asetat, metanol daun Cinnamomum sintoc dan fraksi dari

ekstrak yang mempunyai aktivitas antibakteri tertinggi terhadap bakteri

Staphylococcus aureus dan Pseudomonas aeruginosa serta mengetahui

komponen senyawa yang terdapat dalam fraksi yang mempunyai aktivitas

antibakteri tertinggi. Hasil penelitian ini diharapkan dapat memberikan

informasi ilmiah mengenai potensi daun Cinnamomum sintoc sebagai sumber

alternatif antibakteri baru, sehingga nantinya dapat dikembangkan menjadi

obat antibakteri dan dapat mengatasi masalah resistensi antibakteri.

1.2 Perumusan Masalah

1. Manakah diantara ekstrak n – heksana, etil asetat dan metanol daun

Cinnamomum sintoc yang menunjukkan aktivitas antibakteri tertinggi

terhadap bakteri Staphylococcus aureus ATCC 25923 dan Pseudomonas

aeruginosa ATCC 27853?

4


2. Manakah diantara fraksi hasil fraksinasi dari ekstrak terpilih yang

menunjukkan aktivitas antibakteri tertinggi terhadap bakteri

Staphylococcus aureus ATCC 25923 dan Pseudomonas aeruginosa

ATCC 27853?

3. Berapakah nilai Konsentrasi Hambat Minimum (KHM) dari fraksi yang

menunjukkan aktivitas antibakteri tertinggi?

4. Apa saja komponen senyawa yang terkandung dalam fraksi yang

menunjukkan aktivitas antibakteri tertinggi?

1.3 Tujuan Penelitian

1. Untuk mengetahui aktivitas antibakteri ekstrak n – heksana, etil asetat dan

metanol daun Cinnamomum sintoc terhadap bakteri Staphylococcus

aureus ATCC 25923 dan Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853.

2. Untuk mengetahui aktivitas antibakteri fraksi hasil fraksinasi ekstrak

terpilih terhadap Staphylococcus aureus ATCC 25923 dan Pseudomonas

aeruginosa ATCC 27853.

3. Untuk mengetahui nilai Konsentrasi Hambat Minimum (KHM) dari fraksi

yang menunjukkan aktivitas antibakteri tertinggi.

4. Untuk mengetahui komponen senyawa yang terkandung dalam fraksi yang

menunjukkan aktivitas antibakteri tertinggi.

1.4 Manfaat Penelitian

Penelitian ini diharapkan dapat menjadi salah satu sumber informasi

ilmiah mengenai aktivitas antibakteri daun Cinnamomum sintoc dan

komponen senyawa yang terkandung didalamnya, sebagai usaha dalam

menemukan alternatif obat antibakteri baru dari sumber daya alam yang ada.

5


BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Tanaman Kayu Sintok

2.1.1 Klasifikasi tanaman

Kingdom : Plantae

Sub kingdom : Tracheobionta

Super divisi : Spermatophyte

Divisi : Magnoliophyta

Kelas : Magnoliopsida

Sub kelas : Magnoliidae

Ordo : Laurales

Famili : Lauraceae

Genus : Cinnamomum

Spesies : Cinnamomum sintoc Bl

2.1.2 Deskripsi

Cinnamomum sintoc dapat mencapai tinggi 27 m, dengan diameter

30 cm, kulit kayu halus berwarna coklat terang sedangkan bagian

dalamnya berwarna coklat kemerahan dan memiliki bau seperti buah pala.

Ranting kokoh, berbentuk silinder dengan diameter 1,5 – 2,5 mm, tidak

berbulu, kering dan kehitaman. Daun opposite atau subopposite, kering

kecoklatan, tidak berbulu, berbentuk ellips sampai ovatus – ellips, dengan

ujung daun lancip. Buahnya berbentuk ellipsoid atau obovoid. (Soh wuu -

kuang, 2011)

5

6


Gambar 2.1. Pohon Cinnamomum sintoc

(Sumber: Koleksi pribadi)

Gambar 2.2. Daun dan Batang Cinnamomum sintoc

(Sumber: Koleksi pribadi)

2.1.3 Distribusi dan Habitat

Cinnamomum sintoc terdistribusi di Sarawak (wilayah Lundu),

Kalimantan barat dan Kalimantan timur. Spesies ini juga terdistribusi di

Sumatera, Semenanjung Malaysia dan Jawa. Habitat dari C.sintoc adalah

di hutan dipterokarpa dengan tanah berpasir. (Soh wuu - kuang, 2011).

7


2.1.4 Nama Daerah

Secara luas tanaman ini dikenal dengan nama sintok, huru sintok

(Jawa), huru sitok (Sunda), dan maang sangit atau madang lawang

(Sumatera) (Lemmens, Soerianegara and Wong, 1995).

2.1.5 Kegunaan

Kulit kayu Cinnamomum sintoc umumnya dimanfaatkan sebagai

obat untuk diare, gangguan usus dan serbuknya dimanfaatkan untuk

mengobati luka (Soh wuu - kuang, 2011).

2.1.6 Kandungan Senyawa

Minyak daun Cinnamomum sintoc yang diperoleh dari Peninsular

Malaysia mengandung safrole (23,4%) dan γ – muurolene (13,5%) sebagai

komponen mayor. Minyak kulit batang Cinnamomum sintoc mengandung

linalool (23,8%), sesquiterpen (25,2 %), tetradecanal (16,4%) (Jantan et

al., 1994).

Penelitian yang dilakukan oleh Yopi Iskandar (2008) menunjukkan

bahwa minyak atsiri kulit batang kayu sintok mengandung eugenol,

(33,83%), myristicin (13,54 %) dan safrol (10,17 %) sebagai komponen

utama.

2.2 Metode Ekstrakasi

Ekstraksi adalah kegiatan penarikan kandungan kimia yang dapat larut

pada pelarut cair sehingga terpisah dari kandungan kimia yang tidak dapat

larut dengan pelarut cair. Hasil dari ekstraksi disebut ekstrak. Ekstrak adalah

sediaan yang diperoleh dengan cara ekstraksi tanaman obat dengan ukuran

partikel tertentu dan menggunakan medium pengekstraksi (menstrum) yang

tertentu pula. Pengertian ekstrak yang tercantum dalam buku Farmakope

Indonesia Edisi IV adalah sediaan kental yang diperoleh dengan

mengekstraksi senyawa aktif dari simplisia nabati atau simplisia hewani

menggunakan pelarut yang sesuai, kemudian semua atau hampir semua

pelarut diuapkan dan massa atau serbuk yang tersisa diperlakukan sedemikian

hingga memenuhi baku yang telah ditetapkan. Ekstrak yang diperoleh sesudah

pemisahan cairan disebut “micella”. Micella dapat diubah menjadi bentuk obat

8


siap pakai, seperti ekstrak cair dan tincture atau sebagai produk bahan yang

selanjutnya dapat diproses menjadi ekstrak kering (Agoes.G, 2007).

Terdapat beberapa metode ekstraksi yang umum dan sering digunakan,

antara lain (Sampurno, 2000):

A. Ekstraksi Dengan Menggunakan Pelarut

a. Cara Dingin

1.Maserasi

Maserasi adalah proses ekstraksi dengan cara merendam

simplisia dengan pelarut tertentu dengan beberapa kali

pengocokan atau pengadukan pada temperatur ruangan. Jumlah

pelarut yang dipakai tergantung pada banyaknya sampel. Cara

ini dapat menarik zat – zat berkhasiat yang tidak tahan

pemanasan.

2.Perkolasi

Perkolasi adalah proses ekstraksi menggunakan alat perkolator

yang dilakukan dengan cara mengalirkan cairan pelarut organik

pada sampel yang sebelumnya telah dibasahi. Prinsip dari metode

perkolasi adalah pelarut yang telah jenuh yang berada didalam

perkolator akan digantikan oleh pelarut yang lebih baru dan

segar. Ekstraksi ini membutuhkan pelarut yang lebih banyak.

b. Cara Panas

1.Refluks

Refluks adalah ekstraksi dengan pelarut pada temperatur titik

didihnya, selama waktu tertentu dan jumlah pelarut terbatas yang

relatif konstan dengan adanya pendingin balik. Umumnya

dilakukan pengulangan proses pada residu pertama sampai 3 – 5

kali sehingga dapat termasuk proses ekstraksi sempurna.

2. Soxhlet

Soxhletasi adalah salah satu metode ekstraksi senyawa kimia

tumbuhan cara panas yang menggunakan alat soklet. Pada

keadaan ini sampel dan pelarut berada dalam keadaan terpisah.

Sampel dihaluskan kemudian dibungkus dengan kertas saring,

9


dimasukkan ke tempat tertentu pada alat soklet. Pelarut yang

digunakan berada pada labu yang terletak terpisah dari sampel.

Setelah semua alat soklet terpasang, kemudian dipanaskan

dengan menggunakan heating mantle. Pelarut dalam labu akan

menguap dan uapnya akan naik ke atas menuju tempat sampel

yang tergantung. Dengan adanya pendinginan dari kondensor,

uap akan menjadi cair dan melarutkan sampel, yang kemudian

akan kembali ke tempat pelarut awal. Proses ini akan terus

berulang (ekstraksi sinambung) sehingga proses ekstraksi terjadi

dengan sempurna.

3.Digesti

Adalah proses pengekstraksian yang hampir sama dengan

maserasi tapi dengan menggunakan pemanasan pada suhu 30˚-

40˚C. Cara ini digunakan untuk sampel pada suhu biasa tidak

tersari dengan baik.

4. Dekoktasi Dan Infusa

Adalah sediaan cair yang dibuat dengan mengekstraksi simplisia

nabati dengan air pada suhu 90˚C selama 15-20 menit untuk

infus sedangkan dekoktasi 30 menit dengan suhu ≥30˚C dan

temperaturnya sampai titik didih.

B. Destilasi Uap

Adalah ekstraksi senyawa kandungan menguap (minyak atsiri)

dari bahan (simplisia) dengan uap air berdasarkan peristiwa tekanan

parsial senyawa kandungan menguap dengan fase uap air dari kental

secara kontinu sampai sempurna dan di akhiri dengan kondensasi fase

uap campuran (senyawa kandungan menguap ikut terdestilasi) menjadi

destilat air bersama senyawa kandungan yang memisah sempurna atau

memisah sebagian. Pada destilasi uap, bahan simplisia benar – benar

tidak tercelup ke air yang mendidih, namun dilewati uap air sehingga

senyawa kandungan menguap ikut terdestilasi. Pada destilasi uap dan

air, bahan simplisia bercampur sempurna atau sebagian dengan air

10


mendidih, senyawa kandungan menguap tetap kontinu ikut terdestilasi

(Sampurno, 2000).

C. Ekstraksi Cara Lain

a. Ekstraksi berkesinambungan

Adalah proses yang dilakukan berulangkali dengan pelarut yang

berbeda atau resirkulasi cairan pelarut dan prosesnya tersusun

berturutan beberapa kali (Sampurno, 2000).

b. Superkritikal Karbondioksida

Penggunaan prinsip superkritik untuk ekstraksi serbuk simplisia,

dan umumnya digunakan gas karbondioksida (Sampurno, 2000).

c. Ekstraksi Ultrasonik

Getaran ultrasonik (>20.000 Hz) memberikan efek pada proses

ekstrak dengan prinsip meningkatkan permeabilitas dinding sel,

menimbulkan gelembung spontan (cavitation) sebagai stres

dinamik serta menimbulkan fraksi interfase (Sampurno, 2000).

d. Ekstraksi Energi Listrik

Energi listrik digunakan dalam bentuk medan listrik, medan

magnet serta electric-discharges yang dapat mempercepat proses

dan meningkatkan hasil dengan prinsip menimbulkan gelembung

spontan dan menyebarkan gelombang tekanan berkecepatan

ultrasonik (Sampurno, 2000).

2.3 Metode Pengujian Antibakteri

2.3.1 Metode Difusi

Metode difusi sering digunakan untuk uji antimikroba yang rentan

terhadap senyawa murni, senyawa polar maupun senyawa non polar

(Steward, et al., 1999 dalam Choma & Grzelak, 2010). Pada prosedur ini,

kertas filter cakram (berdiameter 6 mm), berisi senyawa uji yang

ditempatkan pada permukaan yang sebelumnya telah diinokulasikan

mikroba uji. Agen antimikroba akan berdifusi ke dalam agar dan

menghambat pertumbuhan dari mikroba uji. Cawan petri diinkubasi dan

zona inhibisi diukur. Pada metode silinder, silinder dari stainless steel atau

porselin dengan ukuran yang seragam (biasanya berukuran 8 mm x 6 mm

11


x 10 mm) ditempatkan diatas agar terinokulasi didalam cawan petri, dan

diisi dengan sampel dan standar. Setelah diinkubasi, silinder dipindahkan

dan zona inhibisi yang terbentuk diukur (Choma & Grzelak, 2010).

Pada uji menggunakan hole – plate, beberapa milimeter lubang

digali pada permukaan agar yang diinokulasi dan kemudian diisi sampel.

Larutan senyawa uji akan berdifusi kedalam medium agar dan

menghambat pertumbuhan mikroorganisme. Cawan petri dibiarkan pada

suhu ruangan untuk proses inkubasi. Kemudian zona hambat yang

terbentuk diukur (Shitandi, et al., 2005 dalam Choma & Grezlak, 2010).

2.3.2 Metode dilusi

Metode ini memiliki kemampuan untuk mengukur KHM (Kadar

Hambat Minimum) dan KBM (Kadar Bunuh Minimum) (Pratiwi, 2008).

Dua jenis metode dilusi adalah dilusi agar dan pengenceran tabung

(Choma & Grezelak, 2010). Pratiwi (2008) membedakan metode dilusi

menjadi metode dilusi cair (serial dilution) dan dilusi padat. Pada dilusi

cair, dibuat seri pengenceran agen antimikroba pada medium cair yang

ditambahkan dengan mikroba uji. Larutan uji agen antimikroba pada kadar

terkecil yang terlihat jernih tanpa adanya pertumbuhan mikroba uji

ditetapkan sebagai KHM. Larutan yan ditetapkan sebagai KHM dikultur

ulang tanpa penambahan mikroba uji ataupun agen antimikroba, dan

diinkubasi selama 18 – 24 jam pada suhu 37oC. Media cair yang terlihat

tetap jernih setelah diinkubasi ditetapkan sebagai KBM (Pratiwi, 2008).

Metode dilusi padat serupa dengan metode dilusi cair tetapi

menggunakan media padat. Keuntungan metode ini adalah satu

konsentrasi agen antimikroba yang diuji dapat digunakan untuk menguji

beberapa mikroba uji (Pratiwi, 2008).

2.3.3 Metode Bioautografi

Bioautografi merupakan metode skrining mikrobiologi yang umum

digunakan untuk mendeteksi aktivitas antimikroba. Skrining dapat

didefinisikan sebagai prosedur pertama, yang diterapkan pada sampel yang

dianalisis, dalam rangka untuk menetapkan ada atau tidaknya analit yang

didapat. Metode skrining ini memberikan sensitivitas yang lebih tinggi

12


daripada metode lainnya. Selain itu, sederhana, murah, hemat waktu dan

tidak memerlukan peralatan yang canggih (Choma, 2010).

Menurut Choma, skrining metode bioautografi pada dasarnya

untuk menguji aktivitas biologis, misalnya antibakteri, antijamur,

antitumor, dan antiprotozoa zat uji. Metode deteksi ini dapat berhasil

dengan dikombinasikan dengan teknik kromatografi lapis tipis (Choma,

2010).

Prosedur dalam metode bioautografi hampir sama dengan yang

digunakan dalam metode difusi agar. Perbedaannya adalah senyawa yang

diuji berdifusi ke media agar yang diinokulasi dari lapisan kromatografi,

yang merupakan adsorben atau kertas ( Wagman, 1969; Choma, 2010).

Metode bioautografi dibedakan menjadi bioautografi kontak,

bioautografi imersi atau bioautografi agar overlay, dan bioautografi

langsung. Dalam bioautografi kontak, lempeng KLT atau kromatogram

kertas ditempatkan pada permukaan agar diinokulasi selama beberapa

menit atau jam untuk memungkinkan difusi. Selanjutnya, lempeng

dipindah dan lapisan agar diinkubasi. Pertumbuhan zona hambat muncul

di mana senyawa antimikroba berada dalam kontak dengan lapisan agar.

Dalam bioautografi immersion (agar overlay), lempeng pertama

kali dicelupkan di medium agar atau ditutup dengan medium agar, setelah

agar memadat, ditambahkan mikroorganisme yang diuji dan kemudian

diinkubasi. Agar dapat berdifusi dengan baik dari senyawa uji ke

permukaan agar, lempeng dapat tetap pada suhu rendah selama beberapa

jam sebelum inkubasi. Metode ini merupakan kombinasi dari bioautografi

kontak dan langsung, karena senyawa antimikroba yang ditransfer dari

kromatogram ke media agar, seperti dalam metode kontak, tetapi lapisan

agar tetap pada permukaan kromatogram selama inkubasi dan visualisasi,

sebagai bioautografi langsung (Choma, 2010).

Di antara semua metode bioautografi, yang paling banyak

digunakan adalah bioautografi langsung. Prinsip dari metode ini adalah

lempeng KLT dicelupkan pada suspensi mikroorganisme yang tumbuh

dalam kaldu yang tepat dan kemudian diinkubasi dalam suasana lembab.

13


Permukaan silika dari lempeng KLT ditutupi dengan media kaldu menjadi

sumber nutrisi dan memungkinkan pertumbuhan mikroorganisme secara

langsung di atasnya, daerah di mana terdapat spot agen antimikroba

menunjukkan zona penghambatan pertumbuhan mikroorganisme yang

terbentuk. Visualisasi dari zona ini biasanya dilakukan dengan

menggunakan reagen dehidrogenase untuk deteksi aktivitas, yang paling

umum adalah garam tetrazolium. Dehidrogenase mengkonversi

mikroorganisme hidup garam tetrazolium menjadi berwarna. Sehingga,

spot krim - putih muncul dengan latarbelakang ungu pada permukaan

lempeng KLT menunjukkan keberadaan agen antibakteri (Choma, 2010).

2.4 Tinjauan Tentang Bakteri

2.4.1 Karakter Bakteri

Bakteri adalah sel prokariotik yang khas; uniselular dan tidak

mengandung struktur yang terbatasi membran di dalam sitoplasmanya.

Bakteri dapat dibedakan dari ukuran, susunan, dan responnya terhadap

antibiotik. Bentuk sel bakteri meliputi (Pelczar dkk, 1998):

a. Kokus (bulat)

b. Basil (batang)

c. Spirilium (spiral)

Bentuk sel menunjukkan karakteristik spesies bakteri tersebut,

tetapi dapat bervariasi tergantung kondisi pertumbuhannya. Ukuran bakteri

sangat kecil berkisar antara 0,5-5 μm. Struktur permukaan bakteri

meliputi:

a. Flagelum

Rambut yang teramat tipis mencuat menembus dinding sel dan

bermula dari tubuh dasar, suatu struktur granular tepat di bawah

membran sel di dalam sitoplasma. Flagel digunakan bakteri sebagai

alat gerak.

14


b. Pili

Pili berukuran lebih kecil, lebih pendek dari flagel. Pili hanya dapat

dilihat dengan mikroskop elektron. Pili tidak berfungsi untuk alat

gerak tetapi sebagai alat untuk melekat pada berbagai permukaan.

c. Kapsul

Kapsul penting artinya buat bakteri maupun organisme lainnya. Bagi

bakteri, kapsul merupakan penutup, pelindung dan juga berfungsi

sebagai gudang makanan cadangan.

2.4.2 Bakteri Gram Positif dan Negatif

Berdasarkan pewarnaan Gram, bakteri dapat dibedakan menjadi

dua golongan, yaitu bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif. Bakteri

Gram negatif zat lipidnya akan larut selama pencucian dengan alkohol,

sehingga pori – pori pada dinding sel akan membesar, permeabilitas

dinding sel menjadi besar, sehingga zat warna yang sudah diserap mudah

dilepaskan dan kuman menjadi tidak berwarna. Sedangkan pada bakteri

Gram positif, akan mengalami denaturasi protein pada dinding selnya oleh

pencucian dengan alkohol. Protein menjadi keras dan kaku. Pori – pori

mengecil, permeabilitas kurang sehingga kompleks ungu kristal iodium

dipertahankan dan sel kuman tetap berwarna ungu (Staf Pengajar FKUI,

1993). Hal itu disebabkan karena bakteri Gram positif dan Gram negatif

mempunyai susunan kimia dinding sel yang berbeda.

15


Tabel 2.1. Perbedaan ciri – ciri bakteri Gram positif dan Gram negatif

(Pelczar, JM, 1988).

Ciri Gram Positif Gram Negatif

Struktur dinding sel

Tebal (15 – 80 nm) Tipis (10 – 15 nm)

Berlapis Tunggal

(mono) Berlapis tiga (multi)

Komposisi dinding sel

Kandungan lipid

rendah (1 – 4%)

Kandungan lipid tinggi

(11-22%)

Peptidoglikan ada

sebagai lapisan

tunggal, komponen

utama merupakan lebih

dari 50% berat kering

pada beberapa sel

bakteri

Peptidoglikan ada di

dalam lapisan kaku

sebelah dalam,

jumlahnya sedikit

merupakan sekitar

10% berat kering.

Ada asam tekoat Tidak ada asam tekoat

Kerentanan terhadap

penisilin Lebih rentan Kurang rentan

Persyaratan nutrisi Relatif rumit pada

banyak spesies Relatif sederhana

Resistensi terhadap

gangguan fisik Lebih resisten Kurang resisten

2.4.3 Pertumbuhan Bakteri

Pertumbuhan mikroba adalah peningkatan semua komponen sel,

sehingga menghasilkan peningkatan ukuran sel dan jumlah sel (kecuali

mikroba yang berbentuk filamen) akan menyebabkan peningkatan jumlah

individu didalam populasi. Inokulum hampir selalu mengandung ribuan

organisme, pertumbuhan menyatakan pertambahan jumlah atau massa

melebihi yang ada di dalam inokulum asalnya (Pelczar dkk, 1998).

16


2.4.3.1 Faktor Lingkungan Yang Mempengaruhi Pertumbuhan

1. Suplai Nutrisi (Suharto dkk, 1993)

Mikroba sama dengan makhluk hidup lainnya,memerlukan

suplai nutrisi sebagai sumber energi dan pertumbuhan selnya. Unsur-

unsur dasar tersebut adalah: karbon, nitrogen, hidrogen, oksigen,

sulfur, fosfor, zat besi dan sejumlah kecil logam lainnya. Ketiadaan

atau kekurangan sumber-sumber nutrisi ini dapat mempengaruhi

pertumbuhan mikroba hingga pada akhirnya dapat menyebabkan

kematian.

2. Suhu

Suhu merupakan salah satu faktor penting dalam

mempengaruhi pertumbuhan mikroorganisme. Suhu yang berkaitan

dengan pertumbuhan mikroorganisme digolongkan menjadi tiga, yaitu:

a. Suhu minimum, yaitu suhu yang apabila berada di bawahnya maka

pertumbuhan bakteri terhenti.

b. Suhu optimum yaitu suhu dimana pertumbuhan berlangsung paling

cepat dan optimum (Disebut juga suhu inkubasi).

c. Suhu maksimum yaitu suhu yang apabila berada di atasnya maka

pertumbuhan tidak terjadi.

3. Keasaman atau Kebasaan (pH)

Setiap organisme memiliki kisaran pH masing-masing dan

memiliki pH optimum yang berbeda-beda. Kebanyakan

mikroorganisme dapat tumbuh pada kisaran pH 8,0 dan nilai pH di luar

kisaran 2,0 sampai 10,0 biasanya bersifat merusak.

4. Ketersediaan Oksigen

Mikroorganisme memiliki karakteristik sendiri-sendiri di

dalam kebutuhannya akan oksigen. Mikroorganisme dalam hal ini

digolongkan menjadi:

a. Aerobik: hanya dapat tumbuh apabila ada oksigen bebas.

b. Anaerob: hanya dapat tumbuh apabila tidak ada oksigen bebas.

c. Anaerob fakultatif: dapat tumbuh baik dengan atau tanpa oksigen

bebas.

17


d. Mikroaerofilik: dapat tumbuh apabila ada oksigen dalam jumlah

kecil.

2.4.4 Bakteri yang Digunakan

2.4.4.1 Staphylococcus aureus

Berikut adalah klasifikasi taksonomi Staphylococcus aureus:

Kingdom : Monera

Divisio : Protophyta

Kelas : Schizomycetes

Ordo : Eubacteriales

Familia : Micrococcaceae

Spesies : Staphylococcus aureus

Staphylococcus adalah sel-sel bulat yang terdapat sendiri-sendiri

atau bulat-bulat atau kadang-kadang berpasangan tetapi lebih sering

kelompok-kelompok yang tidak beraturan (Volk dkk, 1990).

Staphylococcus juga termasuk dalam bakteri Gram-positif, dan tidak

bergerak (Bonang, 2007). Mikroba ini bersifat aerob atau anaerob

fakultatif, katalase positif, oksidase negatif, famili nonmotil, tidak

membentuk spora dan fermentative.

S. aureus bakteri ini bervariasi dalam pembentukan pigmennya.

Pigmen dapat berwarna putih, kuning atau kuning-orange. Bakterinya

bersifat patogen yang banyak terdapat pada kulit dan lapisan lendir. Pada

dasarnya kebanyakan penyakit lebih banyak disebabkan oleh bakteri S.

aureus karena kemampuan organisme ini untuk menimbulkan penyakit

bergantung pada kemampuannya melawan fagositosis dan efek beberapa

diantara toksin dan enzim yang disekresi oleh sel (Hastowo dkk, 1992).

Batas suhu untuk pertumbuhan S. aureus adalah 15˚C dan 40˚C

mempunyai suhu optimum yaitu sebesar 35˚C - 40˚C dengan pH 7,4.

Bakteri dapat tumbuh pada medium dengan kadar garam 7,5-10% dan

dapat tumbuh baik dalam kaldu biasa pada suhu 37˚C. Pada lempeng agar,

koloninya berbentuk bulat, diameter 1-2 mm, cembung, buram, mengkilat

dan konsistensinya lunak (Nurhayati, 2004).

18


2.4.4.2 Pseudomonas aeruginosa

Bakteri ini sering dihubungkan dengan penyakit pada manusia.

Organisme ini dapat merupakan penyebab 10 – 20 % infeksi nosokomial.

Sering diisolasi dari penderita neoplastik, luka dan luka bakar yang berat.

Bakteri ini juga dapat menyebabkan infeksi pada saluran pernapasan

bagian bawah, saluran kemih, mata dan lain – lainnya.

Morfologi dari bakteri ini berbentuk batang negatif Gram,

berukuran 0,5 – 1,0 x 3,0 – 4,0 µm. Umumnya mempunyai flagel polar,

tetapi kadang – kadang 2 – 3 flagel. Bila tumbuh pada perbenihan tanpa

sukrosa terdapat lapisan lender polisakarida ekstraseluler.

Pseudomonas aeruginosa merupakan organisme yang sangat

mudah beradaptasi dan dapat memakai 80 gugus organik yang berbeda

untuk pertumbuhannya dan amonia sebagai sumber nitrogen. Suhu

pertumbuhan optimum adalah 35oC, tetapi dapat juga tumbuh 42

oC.

Pseudomonas aeruginosa adalah satu – satu nya spesies yang

menghasilkan:

1. Piosianin, suatu pigmen yang larut dalam kloroform.

2. Flouresen, suatu pigmen yang larut dalam air. Beberapa strain

menghasilkan pigmen merah.

Pseudomonas aeruginosa lebih resisten terhadap desinfektan

daripada bakteri lain lain. Bakteri ini menyenangi hidup dalam suasana

lembab seperti pada peralatan pernafasan, air dingin, lantai, kamar mandi,

tempat air, dan lain – lain.

Kebanyakan antibiotik dan antimikroba tidak efektif terhadap

kuman ini. Fenol dan beta – glutaraldehid biasanya merupakan

desinfektan yang efektif. Air mendidih dapat membunuh kuman ini.

Infeksi oleh Pseudomonas aeruginosa terjadi pada orang yang

mempunyai ketahanan tubuh yang menurun, yaitu penderita luka bakar,

orang yang sakit berat atau dengan penyakit metabolik atau mereka yang

sebelumnya memakai atau mempergunakan alat – alat kedokteran. (Staf

Pengajar FKUI, 1993)

19


2.5 Tinjauan Tentang Antibakteri

2.5.1 Aktivitas Antibakteri

Antimikroba adalah senyawa kimia yang dapat membunuh atau

menghambat pertumbuhan mikroorganisme. Berdasarkan jenis

mikroorganisme yang dimatikan atau dihambat pertumbuhannya,

antimikroba terbagi menjadi antibakteri, antifungi, antivirus dan

antiprotozoa.

Antibakteri adalah zat yang membunuh bakteri atau menekan

pertumbuhan dan reproduksi mereka. Sampai saat ini, antibakteri masih

merupakan salah satu obat yang paling sering digunakan (Volk dkk, 1990).

Obat untuk membasmi bakteri penyebab infeksi pada manusia harus

memiliki sifat toksisitas selektif setinggi mungkin. Artinya, obat tersebut

haruslah bersifat sangat toksik untuk bakteri, tetapi relatif tidak toksik

untuk hospes (Ganiswarna dkk, 1995).

Aktivitas suatu zat yang bersifat antibakteri dipengaruhi oleh

beberapa faktor penting seperti konsentrasi bahan, pH, komposisi medium,

suhu, jenis bakteri penguji dan kemampuan antibakteri untuk mengurangi

dalam medium. Berdasarkan jenis daya tahan kerjanya terhadap bakteri,

zat antibakteri dibagi dalam 2 kelompok yaitu bakteriostatik dan

bakterisidal. Zat bakterisidal adalah zat-zat yang dapat membunuh bakteri

karena daya kerjanya yang cepat dan mematikan. Sedangkan zat yang

hanya menghambat pertumbuhan bakteri disebut bakteriostatik (Irianto,

2006).

2.5.2 Mekanisme Kerja Antibakteri

Secara umum mekanisme kerja antibakteri dapat dibagi atas

(Hastowo dkk, 1992) :

1. Penghambatan Pertumbuhan oleh Analog

Dalam kelompok ini termasuk sulfonamida. Pada umumnya

bakteri memerlukan para-aminobenzoat (PABA) untuk sintesis asam

folat, yang diperlukan dalam sintesis purin. Sulfonamida memiliki

struktur seperti PABA, sehingga penggunaan sulfonamida

menghasilkan asam folat yang tidak berfungsi.

20


2. Penghambatan Sintesis Dinding Sel

Perbedaan struktur sel antara bakteri dan eukariot

menguntungkan bagi penggunaan bahan antimikroba. Penicillin dan

Cephalosporin merupakan contoh klasik. Kedua antibiotik ini

menyebabkan penghambatan pada pembentukan ikatan sebrang silang.

Pada konsentrasi rendah, penicillin menghambat pembentukan ikatan

glikosida, sehingga pembentukan dinding sel baru akan terganggu

dapat dilihat dari bakteri dengan bentuk sel yang panjang tanpa

dinding sekat. Pada konsentrasi tinggi, ikatan sebrang silang terganggu

dan pembentukan dinding sel terhenti. Kepekaan bakteri terhadap

penicillin tergantung pada kemampuan mikroorganisme menghasilkan

enzim beta-laktamase enzim ini dapat merusak daya kerja penicillin.

3. Penghambatan fungsi membran sel

Membran sel bakteri dan fungi dapat dirusak oleh beberapa

bahan tertentu tanpa merusak sel inang. Polymixin berdaya kerja

terhadap bakteri Gram-negatif, sedangkan antibiotik polyene terhadap

fungi.

Polymixin dihasilkan oleh Bacillus polymyxa. Daya kerja

polymixin merusak membran sel, sehingga isi sel akan keluar.

Antibakteri ini berdaya kerja terhadap sel baik yang sedang tumbuh

maupun yang tidak tumbuh.

4. Penghambatan sintesis protein

Beberapa antibiotik menghambat sintesis protein pada bakteri.

Sebagai contoh chloramphenicol, tetracycline, dan erythomycine.

Puromycin merupakan penghambat sintesis protein pada manusia.

Bakteri memiliki ribosom dengan 70S, sedangkan manusia 80S. Unit

ribosom pada bakteri adalah 50S dan 30S. Chloramphenicol mengikat

ribosom 50S, sehingga tidak dapat berfungsi. Antibiotik ini bersifat

bakteriostatik, pertumbuhan bakteri dimulai kembali bila tidak ada

antibakteri ini.

21


2.5.3 Antibakteri yang Digunakan Sebagai Kontrol Positif

Tetrasiklin Hidroklorida yang digunakan sebagai kontrol positif,

memiliki karakteristik sebagai berikut (Depkes RI, 1995):

Rumus bangun :

Gambar 2.3. Rumus bangun tetrasiklin.

Rumus molekul : C22H24N2O8.HCl

Bobot molekul : 480,90

Pemerian :Serbuk hablur, kuning, tidak berbau, agak

higroskopis. Stabil di udara tetapi pada pemaparan terhadap

cahaya matahari yang kuat dalam udara lembab. Dalam larutan

dengan pH lebih kecil dari 2, potensi berkurang dan cepat rusak

dalam larutan alkali hidroksida.

Kelarutan :Larut dalam 10 bagian air dan dalam 100

bagian etanol (95%), praktis tidak larut dalam kloroform dan

dalam eter.

Penyimpanan :Dalam wadah tertutup baik, terlindung dari

cahaya. Jika dalam udara lembab terkena sinar matahari

langsung, warna menjadi gelap dan dalam larutan pH tidak

lebih dari 2 menjadi inaktif dan rusak pada pH 7 atau lebih.

Tetrasiklin berikatan dengan ribosom subunit 30S mikrobia.

Tetrasiklin menghambat sintesis protein dengan memblokir penambahan

aminoacyl-t-RNA. Kemudian tetrasiklin mencegah pemasukan asam

amino ke rantai baru yang mulai memanjang. Cara kerjanya bersifat

menghambat dan reversibel jika obat dihilangkan. Resistensi terhadap

tetrasiklin diakibatkan perubahan oleh perubahan permeabilitas dinding

sel.

22


2.6 Macam – Macam Medium

Medium yang baik untuk bakteri adalah medium yang mengandung

zat-zat organik seperti rebusan daging, sayur-sayuran, sisa makanan, atau

ramuan-ramuan yang dibuat oleh manusia. Medium yang dibuat oleh manusia

adalah sebagai berikut (Dwidjoseputro, 1994):

2. Medium Cair

Medium cair yang biasa di gunakan adalah kaldu. Pembuatan

medium ini yaitu dengan cara air murni di tambahkan dengan kaldu daging

lembu dan pepton. Pepton adalah protein yang terdapat pada daging, pada

air susu, pada kedelai dan pada putih telur. Medium yang telah siap

tersebut ditentukan pHnya 6,8 - 7, jadi sedikit asam atau netral. pH

tersebut adalah pH yang sesuai bagi kebanyakan bakteri. Setelah di ukur

pHnya kaldu tersebut di saring menggunakan kertas saring lalu di

masukkan ke dalam tabung reaksi dan disumbat dengan kapas, barulah

dapat di masukkan ke dalam autoklaf.

3. Medium Padat

Dulu medium padat masih banyak menggunakan kentang yang di

potong-potong. Kentang tersebut di potong-potong dengan menggunakan

pipa besi lalu di masukkan ke dalam tabung reaksi kemudian di sumbat

dengan kapas dan setelah itu di sterilkan di dalam autoklaf. Setelah dingin

kentang dapat ditanami bakteri.

Lalu muncul penemuan baru dengan menggunakan kaldu yang di

campur dengan sedikit agar-agar. Baru dapat di peroleh medium padat

setelah di sterilkan. Agar-agar tersebut baru mencair pada suhu 95˚C.

Agar-agar ialah sekedar zat pengental, dan bukan zat makanan bagi

bakteri.

4. Medium yang Diperkaya

Bakteri patogen memerlukan makanan tambahan berupa serum

atau darah yang tidak mengandung fibrinogen. Fibrinogen adalah zat yang

menyebabkan darah menjadi kental, apabila keluar di luka. Serum dan

darah dicampurkan ke dalam medium yang sudah disterilkan.

23


Pencampuran ini dilakukan sebelum sterilisasi, maka serum atau darah

tersebut akan mengental akibat pemanasan.

5. Medium Kering

Medium ini berupa serbuk kering yang dilarutkan dalam air lalu di

sterilkan. Pada medium ini tidak perlu dilakukan pemeriksaan pH karena

sudah dilakukan lebih dahulu pada waktu pembuatan serbuk.

6. Medium Sintetik

Medium ini berupa ramuan-ramuan zat anorganik tertentu yang

mengandung zat karbon dan nitrogen. Bakteri autotrof dapat hidup dalam

medium ini. Medium ini dibuat secara eksperimental. Medium ini tidak

menimbulkan zat-zat penolak, apabila masuk ke dalam tubuh hewan atau

manusia.

2.7 Kromatografi

Kromatografi didefenisikan sebagai prosedur pemisahan zat terlarut

oleh suatu proses migrasi diferensial dinamis dalam suatu sistem yang terdiri

dari dua fase atau lebih, salah satu diantaranya bergerak secara

berkesinambungan dalam arah tertentu dan didalamnya zat – zat itu

menunjukkan perbedaan mobilitas disebabkan adanya perbedaan adsorpsi,

partisi, kelarutan ukuran molekul atau kerapatan muatan ion (Farmakope

Indonesia ed.4, 2000).

2.7.1 Kromatografi Kolom

Kromatografi kolom merupakan kromatografi cair dimana fase

diam ditempatkan di dalam tabung kaca berbentuk silinder pada bagian

bawah tertutup dengan katup atau keran dan fasa gerak dibiarkan mengalir

ke bawah karena adanya gaya berat (Gritter, Bobbit & Schwarting, 1991).

2.7.1.1 Penyerap (fase diam)

Penyerap untuk kolom biasanya berukuran 63 – 250 µm. sifat

penyerap terutama bergantung pada pH dan tingkat keaktifannya.

Penyerap yang biasa digunakan adalah silika gel, alumina, arang, selulosa,

poliamida dan polistiren (Gritter, Bobbit & Schwarting, 1991).

24


2.7.1.2 Pelarut Pengelusi (fase gerak)

Pemilihan pelarut pengelusi perlu dilakukan untuk mengetahui

pelarut atau campuran pelarut mana yang dapat menghasilkan pemisahan

yang diinginkan. Hal itu dapat dilakukan dengan tiga pendekatan, yaitu

penelusuran pustaka, penerapan data KLT pada pemisahan dengan kolom

dan pemakaian elusi landaian umum mulai dari pelarut yang tidak

menggerakkan linarut sampai pelarut yang lebih polar yang menggerakkan

linarut (Gritter, Bobbit & Schwarting, 1991).

2.7.1.3 Pembuatan Kolom

Pembuatan kolom ada 2 cara, yaitu:

a. Cara kering

Selapisan pasir diletakkan didalam kolom kemudian penyerap

dimasukkan ke dalam tabung sedikit demi sedikit, permukaan

diratakan dan dimampatkan sedikit. Setelah itu kertas saring diletakkan

diatasnya dan ditambah lagi selapis pasir sehingga jika ditambahkan

pelarut, permukaan penyerap tidak terganggu. Selanjutnya pelarut

pengelusi dibiarkan mengalir ke bawah melalui penyerap dengan keran

terbuka sampai permukaan pelarut tepat sedikit di atas bagian atas

kolom (Gritter, Bobbit & Schwarting, 1991).

b. Cara basah

Selapisan pasir silika dimasukkan kedalam kolom dan sepertiga tabung

diisi dengan pelarut. Kemudian suspensi fase diam dimasukkan ke

dalam pelarut di dalam tabung sedikit demi sedikit atau sekaligus

sambil diketuk – ketuk pada semua sisi secara perlahan – lahan agar

diperoleh lapisan yang seragam. Keran dapat dibuka atau ditutup

selama penambahan asal permukaan pelarut tetap di atas permukaan

penyerap (Gritter, Bobbit & Schwarting, 1991).

2.7.2 Kromatografi Lapis Tipis (KLT)

Kromatografi lapis tipis (KLT) merupakan metode pemisahan

fisikokimia yang didasarkan atas penyerapan, partisi (pembagian) atau

gabungannya. Lempeng pemisah tipis yang terdiri dari butir penyerap

dilapiskan pada lempeng kaca, logam dan lain – lain. Untuk mendapatkan

25


kondisi jenuh bejana kromatografi, dinding bejana dilapisi dengan

lembaran kertas saring, fase gerak dituang ke dalam bejana sehingga kertas

saring basah dan dalam bejana terdapat fasa gerak setinggi 5 – 10 mm,

bejana ditutup dan dibiarkan selama satu jam pada 20 – 25oC (Harmita,

2006).

KLT sangat bermanfaat untuk analisis obat dan bahan lain dalam

laboratorium karena hanya memerlukan peralatan sederhana, waktu cukup

singkat dan jumlah zat yang diperiksa cukup kecil. Di samping itu tidak

diperlukan ruang besar dan teknik pengerjaannya sederhana (Harmita,

2006).

2.7.3 Kromatografi Gas – Spektrometri Massa

Kromatografi gas digunakan untuk memisahkan komponen –

komponen yang dapat menguap dan hasil pemisahan dapat dilihat berupa

kromatogram. Spektroskopi massa adalah metode analisa dimana sampel

yang dianalisa akan diubah menjadi ion – ion gasnya dan massa dari ion –

ion tersebut dapat diukur berdasarkan hasil deteksi berupa spektrum massa

(Sudjadi, 2007).

Pemisahan senyawa dalam GC (Gas Chromatography) terjadi di

dalam kolom dengan melibatkan dua fase, yaitu fase diam dan fase gerak.

Fase diam merupakan zat yang berada di dalam kolom sedangkan fase

gerak adalah gas pembawa (helium atau hidrogen). GC (Gas

Chromatography) dengan teknik pemisahan dimana solut – solut yang

mudah menguap dan stabil terhadap pemanasan akan bermigrasi melalui

kolom yang merupakan fase diam dengan suatu kecepatan yang tergantung

pada rasio distribusinya. Pada umumnya solut akan terelusi berdasarkan

pada peningkatan titik didihnya (kecuali jika terjadi interaksi khusus antara

solute dengan fase diam). Pemisahan pada kromatografi gas didasarkan

pada titik didih suatu senyawa dikurangi dengan semua interaksi yang

mungkin terjadi antara solut dengan fase diam. Fase gerak yang berupa gas

akan mengelusi solut dari ujung kolom yang akan dihantarkan ke detektor.

Penggunaan suhu yang meningkat bertujuan untuk menjamin bahwa solut

26


akan menguap dan akan cepat terelusi, suhu yang biasa digunakan berkisar

50 – 350oC (Sudjadi, 2007).

27


BAB III

METODOLOGI PENELITIAN

3.1 Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian ini mulai dilakukan pada bulan Maret sampai dengan

Juli 2014 di Laboratorium Mikrobiologi dan Pengendalian Hama, Pusat

Penelitian (Puslit) Biomaterial LIPI Cibinong, Bogor, Jawa barat.

3.2 Alat dan Bahan

3.2.1 Alat

Alat-alat yang digunakan pada penelitian ini antara lain Erlenmeyer

(Iwaki), gelas ukur (Pyrex), hammer mill, ayakan no. mesh 40, cawan

petri, jarum ose, ose kapas steril, tabung reaksi, rak tabung reaksi, hot

plate, vortex, autoklaf, lampu spiritus, timbangan analitik, mikroskop

(Olympus CX21), LAF (Laminar Air Flow), oven, microtiter plate,

Lemari pendingin, kapas steril, spatula, mikropipet, shaker incubator,

kertas saring Whatman no. 1, vakum rotavapor (IKA RV 10), kromatografi

kolom, plat kromatrografi lapis tipis, GCMS (Gas Cromatography – Mass

Spectrometry), kertas cakram (paper disc), botol maserasi, jangka sorong.

3.2.2 Bahan

Bahan-bahan yang digunakan pada penelitian ini adalah daun

Cinnamomum sintoc yang diperoleh dari Kebun Raya Bogor, pelarut

metanol, etil asetat, n – heksana, DMSO (Merck), kultur bakteri

Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 dan kultur bakteri Staphylococcus

aureus ATCC 25923 yang diperoleh dari lab mikrobiologi fakultas

kedokteran Universitas Indonesia, antibiotik tetrasiklin, pewarnaan Gram,

aquadest steril, larutan NaCl fisiologis, medium NA (Nutrient Agar)

(Merck), medium NB (Nutrient Broth) (Merck), p-iodonitrotetrazolium

violet (INT) (Sigma aldrich), medium Brain Heart Infussion (BHI),

kloroform, asam asetat anhidrida, HCl 2 N, perekasi Dragendorf, Pb asetat,

NaOH 0,1 N, H2SO4 pekat, FeCl3.

27

28


3.3 Metode Penelitian

3.3.1 Pembuatan Simplisia

Sampel daun sintok (Cinnamomum sintoc) segar sebanyak 6 kg

diperoleh dari koleksi tanaman Kebun Raya Bogor, Jawa barat dan

diidentifikasi di Pusat Konservasi Tumbuhan Kebun Raya Bogor,

Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI), Jawa barat.

Daun sintok segar dikumpulkan dan dilakukan sortasi kemudian

dibersihkan untuk menghilangkan kotoran yang melekat pada daun.

Kemudian dilakukan proses pengeringan menggunakan oven pada suhu

40oC. Setelah kering, dilakukan sortasi kembali, kemudian daun dibuat

menjadi serbuk menggunakan alat penggiling hammer mill, diayak

menggunakan ayakan mesh no. 40 dan ditampung pada wadah tertutup.

3.3.2 Penetapan Kadar Air Simplisia (Depkes RI, 2000)

Penetapan kadar air menggunakan metode gravimetri. Krusibel

porselin kosong dikonstankan terlebih dahulu dengan pemanasan pada

suhu 100-105oC selama 2 jam, didinginkan dalam desikator, dan kemudian

ditimbang. Sebanyak 1 g sampel ditimbang dalam krusibel yang telah

diketahui beratnya, dikeringkan dalam oven pada suhu 105-110oC selama

5 jam, didinginkan dalam desikator dan selanjutnya ditimbang kembali.

Perlakuan ini diulang sampai beratnya konstan. Kadar air dihitung dalam

persen terhadap berat sampel awal.

3.3.3 Pembuatan Ekstrak

Setelah menjadi serbuk, dilakukan proses ekstraksi dengan cara

maserasi bertingkat menggunakan pelarut yang memiliki tingkat kepolaran

yang berbeda, yaitu n-heksana (non polar), etil asetat (semi polar), dan

metanol (polar).

Serbuk simplisia daun sebanyak 4300 g dimasukkan ke dalam

wadah, selanjutnya pelarut n – heksana dimasukkan ke dalam wadah yang

berisi serbuk simplisia hingga serbuk terendam 3 cm di atas permukaan

simplisia. Wadah disimpan dalam ruang gelap dan pada suhu ruang.

Maserasi dilakukan selama 2 hari dengan beberapa kali pengadukan. Hasil

maserasi disaring untuk memisahkan filtrat dengan ampas. Ampas yang

29


tersisa kembali ditambahkan n – heksana dan proses maserasi dilakukan

kembali sampai pelarut berwarna bening. Filtrat yang diperoleh diuapkan

dengan vacuum rotary evaporator hingga diperoleh ekstrak kental.

Selanjutnya ampas dimaserasi dengan pelarut etil asetat selama

2 hari dengan beberapa kali pengadukan. Kemudian hasil maserasi

difiltrasi, ampas yang tersisa dimaserasi kembali dengan etil asetat sampai

pelarut berwarna bening. Filtrat yang diperoleh diuapkan dengan vacuum

rotary evaporator hingga diperoleh ekstrak kental.

Ampas di maserasi dengan pelarut metanol selama 2 hari dengan

beberapa kali pengadukan. Kemudian hasil maserasi difiltrasi. Ampas

yang tersisa kembali ditambahkan metanol dan proses maserasi dilakukan

kembali sampai pelarut berwarna bening. Filtrat yang diperoleh diuapkan

dengan vacuum rotary evaporator hingga diperoleh ekstrak kental.

Penguapan pelarut menggunakan vacuum rotary evaporator

dilakukan pada suhu 45oC. Ekstrak disimpan dalam lemari pendingin pada

suhu 4oC untuk memperpanjang masa simpan sampai siap digunakan

untuk uji aktivitas antibakteri.

Rendemen ekstrak dinyatakan dalam persen dihitung menggunakan

persamaan:

Rendemen ekstrak (%) =

x 100 %

3.3.4 Pewarnaan Gram

Pewarnaan Gram digunakan untuk identifikasi anggota dari domain

bakteri ke dalam dua kelompok berdasarkan perbedaan dinding selnya.

Bakteri Staphylococcus aureus dan Pseudomonas aeruginosa diambil

masing – masing 1 ose dan digores-goreskan pada permukaan kaca objek

steril, ditetesi NaCl 0,9 %, kemudian dilakukan fiksasi. Kristal violet

sebanyak 1 tetes ditambahkan ke permukaan kaca objek yang terdapat

lapisan bakteri tersebut dan didiamkan selama 1 menit. Setelah 1 menit,

kaca objek dibilas dengan air sampai zat warna luntur. Kaca objek

dikeringkan di atas api spiritus. Setelah kering, larutan lugol sebanyak

1 tetes ditambahkan ke permukaan kaca objek tersebut dan didiamkan

30


selama 1 menit. Setelah 1 menit, kaca objek dibilas dengan air. Kaca objek

dibilas dengan alkohol 96% sampai semua zat warna luntur kemudian

dicuci dengan air. Kaca objek dikeringkan di atas api spiritus. Setelah

kering, safranin sebanyak 1 tetes ditambahkan ke permukaan kaca objek

dan didiamkan selama 45 detik. Preparat dicuci dengan air dan

dikeringkan. Preparat diamati menggunakan mikroskop dengan perbesaran

100x (Surya rosa putra, 2012).

3.3.5 Uji Aktivitas Antibakteri Ekstrak n – heksana, Etil asetat dan

Metanol daun Cinnamomum sintoc dengan Metode Difusi Cakram

3.3.5.1 Sterilisasi Alat dan Bahan

Sterilisasi dilakukan dengan beberapa cara, yaitu:

a. Sterilisasi dengan pemijaran, yaitu pembakaran alat – alat diatas lampu

spiritus sampai pijar seperti ose, batang L, dan mulut tabung biakan.

b. Sterilisasi dengan uap yang bertekanan (autoklaf), yaitu sterilisasi

dengan menggunakan suhu 121˚C selama 15 menit. Bahan – bahan

seperti media NB, NA, BHI, Aquadest disterilkan dengan autoklaf dan

juga alat-alat gelas seperti cawan petri, beacker glass, spreader.

3.3.5.2 Pembuatan Medium

3.3.5.2.1 Nutrien Agar (NA)

Medium yang digunakan untuk membiakkan bakteri uji adalah

medium NA. Serbuk NA sebanyak 20 gram dilarutkan dalam 1 liter

aquadest dan dipanaskan sampai mendidih sehingga larut. Lalu

disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121˚C selama 15 menit. Setelah

agak dingin, disimpan dalam lemari pendingin dan dapat digunakan

bila diperlukan dengan memanaskannya kembali dengan hot plate.

Untuk membuat agar miring, NA yang telah disterilkan

dituang pada suhu 60 – 50oC kedalam tabung reaksi yang telah

disterilkan sebanyak 5 ml, kemudian disumbat dengan kapas steril dan

diposisikan miring sekitar 45o kemudian ditunggu sampai mengeras.

3.3.5.2.2 Nutrien Broth (NB)

Serbuk NB sebanyak 8 gram dilarutkan dalam 1 liter aquadest

dan dipanaskan sampai mendidih sehingga larut. Lalu disterilkan

31


dalam autoklaf pada suhu 121˚C selama 15 menit. Setelah agak dingin

NB dapat disimpan dalam lemari pendingin.

3.3.5.3 Peremajaan Bakteri dan Pembuatan Kultur Kerja

Disiapkan agar miring NA steril, lalu diambil stok bakteri

Staphylococcus aureus ATCC 25923 dan Pseudomonas aeruginosa ATCC

27853 dengan menggunakan ose steril yang telah dipijarkan lalu ditanam

pada permukaan agar miring dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu

37˚C.

3.3.5.4 Pembuatan Suspensi Bakteri

Bakteri Staphylococcus aureus ATCC 25923 dan Pseudomonas

aeruginosa ATCC 27853 yang telah diremajakan pada umur 24 jam

diambil 1 ose dan dimasukkan dalam 10 ml NB (inokulum) lalu dikocok

menggunakan shaker incubator selama 24 jam pada suhu 37˚C.

Setelah 24 jam tabung menjadi keruh yang menunjukkan adanya

pertumbuhan bakteri. Kekeruhan kultur dibandingkan dengan larutan Mc.

Farland 0,5 yang setara dengan 108 CFU/ml. Kemudian dilakukan

pengenceran sampai diperoleh suspensi bakteri 106 CFU/ ml dengan cara

mengambil 1 ml (dari tabung 108 CFU/ml) dicampur dengan 9 ml NaCl

0,9% steril, maka akan didapat suspensi bakteri dengan kepadatan

107

CFU/ml. dilanjutkan dengan mengambil 1 ml lagi (dari tabung

107

CFU/ml) untuk dicampur dengan 9 ml Nutrient Broth sehingga

didapatkan suspensi bakteri dengan kepadatan 106 CFU/ml (Bobby wahyu

dkk, 2013)

3.3.5.5 Penentuan Diameter Zona Hambat

Media cair nutrient agar yang sudah disterilkan dituang secara

aseptis sebanyak 20 ml pada cawan petri berdiameter 9 cm yang sudah

disterilkan hingga merata, kemudian dibiarkan hingga membeku. Setelah

media nutrient agar membeku, celupkan 1 ose kapas kedalam suspensi

bakteri, kemudian inokulasikan bakteri yang telah diambil dengan ose

tersebut pada media nutrient agar.

Paper disc yang telah disterilkan (diameter 6 mm) diteteskan 25 µl

ekstrak metanol, etil asetat dan n – heksana yang masing – masing

32


dilarutkan dalam DMSO 15% (15% DMSO dan 65% Aquadest) sehingga

diperoleh konsentrasi 50 mg/ml. Kemudian paper disc yang telah ditetesi

larutan ekstrak, ditunggu selama 10 detik sampai ekstrak tersebut

menyerap pada paper disc dan diletakkan diatas permukaan lempeng agar

yang telah diinokulasikan bakteri. Kontrol negatif digunakan DMSO 15%,

Kontrol positif digunakan antibiotik Tetrasiklin 1000 ppm. Kemudian

diinkubasi pada temperatur 37oC selama 24 jam. Zona hambat yang

terbentuk diukur dengan menggunakan jangka sorong. Pengujian

dilakukan sebanyak dua kali (duplo). Ekstrak yang memiliki aktivitas

anitibakteri tertinggi kemudian difraksinasi menggunakan kromatografi

kolom.

3.3.6 Skrining Fitokimia Ekstrak yang Memiliki Aktivitas Antibakteri

Tertinggi

3.3.6.1 Pengujian Golongan Terpenoid dan Steroid (P.Lalitha et al 2012)

Uji Liebermann – Burchard. Sebanyak 1 ml sampel ditambahkan

kloroform, kemudian ditambahkan asam asetat anhidrida dan beberapa

tetes asam sulfat pekat. Hasil uji positif untuk terpenoid bila terbentuk

warna hijau gelap. Hasil uji positif untuk steroid bila terbentuk warna

merah muda atau merah.

3.3.6.2 Pengujian Golongan Saponin (Harborne 1996)

Sebanyak 1 ml sampel pekat dimasukkan ke dalam tabung reaksi,

dan ditambahkan 10 ml air panas lalu didinginkan. Selanjutnya dikocok

dengan vortex selama kurang lebih 10 detik. Bila terdapat senyawa

saponin dalam ekstrak maka akan terbentuk buih mantap selama sekitar

10 menit. Buih dikatakan mantap bila tingginya 1 – 10 cm, dan buih tidak

hilang bila ditambah HCl 2 N.

3.3.6.3 Pengujian Golongan Alkaloid (Harborne 1996)

Sampel yang telah dipekatkan dimasukkan dalam plat tetes

kemudian ditambahkan 3 tetes pereaksi Dragendorf. Hasil uji positif bila

terdapat endapan berwarna merah jingga.

33


3.3.6.4 Pengujian Golongan Flavonoid (Mojab F dkk, 2003)

Satu gram sampel diekstraksi dengan 5 ml etanol kemudian

tambahkan beberapa tetes HCl pekat dan 1,5 gram logam magnesium.

Adanya flavonoid, diindikasikan dari terbentuknya warna pink atau merah

magenta dalam waktu 3 menit.

3.3.6.5 Pengujian Golongan Fenolik (Robinson, 1991; Marliana, 2005)

Tambahkan ke dalam larutan sampel beberapa tetes larutan besi

(III) klorida 10%. Adanya senyawa kelompok fenol ditandai dengan

munculnya warna biru tua atau hitam kehijauan.

3.3.6.6 Pengujian Golongan Tannin (Farnsworth, 1996)

Ekstrak 0,5 gram dalam cawan ditambahkan 2 ml etanol 70 %

kemudian diaduk, ditambahkan FeCl3 sebanyak 3 tetes, positif jika

menghasilkan biru karakteristik, biru – hitam, hijau atau biru – hijau.

3.3.7 Penetapan Kadar Air Ekstrak yang Memiliki Aktivitas Antibakteri

Tertinggi (Depkes RI, 2000)

Penetapan kadar air menggunakan metode gravimetri. Krusibel

porselin kosong dikonstankan terlebih dahulu dengan pemanasan pada

suhu 100-105oC selama 2 jam, didinginkan dalam desikator, dan kemudian

ditimbang. Sebanyak 1 g sampel ditimbang dalam krusibel yang telah

diketahui beratnya, dikeringkan dalam oven pada suhu 105-110oC selama

5 jam, didinginkan dalam desikator dan selanjutnya ditimbang kembali.

Perlakuan ini diulang sampai beratnya konstan. Kadar air dihitung dalam

persen terhadap berat sampel awal.

3.3.8 Kromatografi Lapis Tipis (KLT)

Ekstrak yang mempunyai aktivitas antibakteri tertinggi dianalisa

menggunakan kromatografi lapis tipis untuk mengamati pola

pemisahannya. Sebagai fase gerak digunakan pelarut pengembang yang

sesuai, dilakukan uji coba untuk mendapatkan perbandingan pelarut yang

memberikan pemisahan terbaik. Fasa gerak yang telah dibuat, dimasukkan

ke dalam bejana KLT dan dijenuhkan dengan kertas saring ke dalamnya,

hingga kertas saring terbasahi semua. Selanjutnya, ekstrak dilarutkan

34


dengan pelarut yang sesuai dan ditotolkan pada plat KLT menggunakan

pipa kapiler.

Plat KLT dielusi di dalam masing – masing bejana KLT yang berisi

fase gerak, hingga fase gerak mencapai garis tepi bagian atas, kemudian

diangkat. Plat KLT dibiarkan kering dan dilihat pola pemisahannya secara

langsung. Dari hasil KLT, dilihat kombinasi sistem fase gerak yang

memberikan pola pemisahan terbaik.

3.3.9 Fraksinasi ekstrak yang Memiliki Aktivitas Antibakteri Tertinggi

dengan Kromatografi Kolom

3.3.9.1 Penyiapan Sampel

Berdasarkan uji aktivitas antibakteri dengan metode difusi cakram,

ekstrak etil asetat memiliki aktivitas antibakteri tertinggi. Sebanyak 10

gram ekstrak etil asetat daun Cinnamomum sintoc, dilarutkan dalam 7,5 ml

etil asetat kemudian diadsorpsikan dengan silika (sebagai fasa diam)

sebanyak 12 gram sedikit demi sedikit. Kemudian campuran silika dan

larutan ekstrak diaduk dan dikering anginkan sampai pelarutnya menguap

sehingga diperoleh sampel yang dapat mengalir seperti serbuk.

3.3.9.2 Penyiapan Kolom Kromatografi

Penyiapan kolom kromatografi, pertama - tama pada ujung kolom

kromatografi diberikan kapas untuk menahan agar silika gel tidak keluar.

100 gram Silika gel dimasukkan ke dalam beacker glass, pelarut n-

heksana ditambahkan hingga menghasilkan silika yang menyerupai

bubur kemudian aduk hingga terbentuk suspensi. Suspensi silika gel

yang telah terbentuk, dimasukkan kedalam kolom kromatografi sedikit

demi sedikit sambil diketuk ketuk. Pelarut yang mengalir ke ujung kolom

ditampung, kemudian dimasukkan kembali ke dalam kolom. Hal ini

dilakukan secara berulang-ulang hingga silika gel menjadi padat.

Kemudian 10 gram ekstrak etil asetat yang telah diadsorpsikan dengan

12 gram silika dimasukkan ke dalam kolom melalui bagian atas kolom

dengan cara menaburkannya sedikit demi sedikit.

35


3.3.9.3 Proses fraksinasi

Ekstrak etil asetat, selanjutnya difraksinasi menggunakan

kromatografi kolom. Sistem pelarut yang digunakan yaitu sistem gradien.

Dengan komposisi pelarut yang digunakan yaitu n-heksana dan etil asetat,

dimana setiap gradien kepolarannya ditingkatkan 5%. Fraksinasi pertama

dimulai dari menggunakan pelarut n-heksan 100% sebanyak 250 ml. Eluat

ditampung setiap 50 ml. Penggantian gradien fasa gerak dilakukan ketika

gradien sebelumnya telah habis digunakan untuk mengaliri kolom.

Fraksinasi dilakukan hingga fasa gerak yang digunakan telah

mencapai gradien akhir yaitu etil asetat 100%. Semua eluat yang

diperoleh, dikeringkan terlebih dulu dengan cara diangin – anginkan

kemudian diuji dengan Kromatografi Lapis Tipis (KLT) untuk melihat

pola noda masing – masing eluat. Eluat yang memberikan pola noda

dengan nilai Rf yang sama, digabungkan menjadi satu dan selanjutnya

diuji aktivitas antibakteri menggunakan metode bioautografi.

3.3.10 Uji Aktivitas Antibakteri Fraksi dari Ekstrak yang Memiliki Aktivitas

Antibakteri Tertinggi dengan Metode Bioautografi

Untuk menentukan fraksi dari ekstrak etil asetat daun Cinnamomum sintoc

yang mempunyai aktivitas antibakteri tertinggi, maka dilakukan uji

antibakteri dengan metode bioautografi.


Stok bakteri uji S.aureus dan P.aeruginosa yang telah diremajakan

pada medium NA miring diambil 1 ose, lalu disuspensikan ke dalam 10 ml

medium BHI (Brain Heart Infusion), kemudian diinkubasi dalam shaker

incubator dengan kecepatan 100 rpm pada suhu 37oC selama 24 jam.

3.3.10.2 Uji Bioautografi Fraksi Hasil Kromatografi Kolom

Fraksi hasil kromatografi kolom yang telah digabungkan

berdasarkan nilai Rf, masing – masing dilarutkan dengan kloroform dan

etil asetat sehingga diperoleh larutan fraksi dengan konsentrasi 50 mg/ml.

Larutan fraksi sebanyak 10 µl ditotolkan pada plat KLT berukuran

6,5 x 7 cm kemudian dikering anginkan untuk menghilangkan pelarutnya.

Plat KLT yang telah ditotolkan larutan fraksi sebanyak 10 µl, dicelupkan

36


dalam campuran BHI dan suspensi bakteri sebanyak 10 ml selama 5 detik,

selanjutnya disimpan dalam petri dish dan diletakkan kapas yang dibasahi

dengan aquadest yang telah disterilkan. Plat diinkubasi pada suhu 37o

C

selama 20 jam, setelah diinkubasi plat disemprot dengan larutan p-

iodonitrotetrazolium violet (INT) konsentrasi 2 mg/ml, dan diinkubasi

selama 1 jam pada suhu 37oC (Sabariah Ismail, 2011).

Untuk mengetahui nilai Rf senyawa aktif antibakteri maka

dilakukan uji bioautografi pada fraksi yang mempunyai aktivitas

antibakteri tertinggi, yaitu fraksi yang memiliki diameter zona hambat

terbesar. Fraksi yang mempunyai aktivitas antibakteri tertinggi dilarutkan

dengan etil asetat sehingga diperoleh larutan fraksi dengan konsentrasi

50 mg/ml. Larutan fraksi sebanyak 10 µl ditotolkan pada plat KLT,

kemudian dielusi menggunakan fasa gerak n – heksana : etil asetat. Setelah

larutan fraksi dielusi, plat KLT dicelupkan dalam campuran BHI dan

suspensi bakteri selama 5 detik, selanjutnya disimpan dalam petri dish dan

diletakkan kapas yang dibasahi dengan aquadest yang telah disterilkan.

Plat diinkubasi pada suhu 37o

C selama 20 jam, setelah diinkubasi plat

disemprot dengan larutan p-iodonitrotetrazolium violet (INT), dan

diinkubasi selama 1 jam pada suhu 37oC (Sabariah Ismail, 2011)

3.3.11 Penentuan Nilai Konsentrasi Hambat Minimum (KHM) Fraksi yang

Mempunyai Aktivitas Antibakteri Tertinggi

3.3.11.1 Pembuatan Medium

Medium yang digunakan adalah medium NB (Nutrient Broth)

untuk pertumbuhan bakteri uji. Medium NB 1 dibuat dengan cara

melarutkan 8 g NB dalam 1 liter aquadest dan medium NB 2 dibuat

dengan komposisi 2x medium NB 1 (16 g dalam 1 liter aquadest).


Bakteri Gram positif dan Gram negatif yang telah diremajakan

pada umur 24 jam diambil 1 ose dan dimasukkan dalam 10 ml NB

(inokulum) lalu dikocok menggunakan shaker incubator selama 24 jam

pada suhu 37˚C.

37


Setelah 24 jam tabung menjadi keruh yang menunjukkan adanya

pertumbuhan bakteri. Kekeruhan kultur dibandingkan dengan larutan Mc.

Farland 0,5 yang setara dengan 108 CFU/ml. Kemudian dilakukan

pengenceran sampai diperoleh suspensi bakteri 106 CFU/ ml dengan cara

mengambil 1 ml (dari tabung 108 CFU/ml) dicampur dengan 9 ml NaCl

0,9% steril, maka akan didapat suspensi bakteri dengan kepadatan

107 CFU/ml. Dilanjutkan dengan mengambil 1 ml lagi (dari tabung

107 CFU/ml) untuk dicampur dengan 9 ml Nutrient Broth sehingga

didapatkan suspensi dengan kepadatan 106 CFU/ ml (Bobby wahyu W,

dkk. 2013).

3.3.11.3 Pengenceran Larutan Uji

Fraksi yang mempunyai aktivitas antibakteri ditentukan nilai KHM

dengan metode mikrodilusi, dibuat pengenceran larutan uji dari larutan

induk 50000 µg/ml menjadi, 12500 µg/ml, 6250 µg/ml, 3125 µg/ml,

1562,5 µg/ml, 781,25 µg/ml, 390,66 µg/ml, 195,31 µg/ml, 97,66 µg/ml

menggunakan microtiter plate 96 sumur, dengan komposisi sebagai

berikut:

a) Sumur A1 – A6 diisi dengan 100 µl medium NB 2

b) Sumur B1 – H6 diisi dengan 100 µl medium NB 1

c) Sumur A1 – A3 diisi dengan 100 µl sampel uji

d) Sumur A4 – A6 diisi dengan 100 µl tetrasiklin (antibiotic control)

e) Dari sumur A1 – A6 masing – masing diambil 100 µl dan

dimasukkan dalam sumur B1 – B6, begitu seterusnya sampai

sumur F1 – F6 diambil 100 µl lalu dibuang.

f) Sumur A7 diisi 200 µl dengan medium NB 2 (Sterility control)

g) Sumur B7 diisi 100 µl dengan medium NB 1 (Sterility control)

h) Sumur C7 – D7 diisi 100 µl dengan medium NB 1 (Growth

control)

i) Sumur E7 – F7 diisi 100 µl dengan medium NB 2 dan 100 µl

DMSO dan dibuang 100 µl (Solvent control)

j) Masing – masing sumur ditambah dengan bakteri uji 100 µl kecuali

sumur untuk sterility control.

38


3.3.11.4 Inkubasi Microtiter plate yang Berisi Sampel Uji

Microtiter plate yang berisi sampel uji diinkubasi pada suhu 37oC

selama 24 jam.

3.3.11.5 Penentuan Nilai KHM

Setelah diinkubasi selama 24 jam, microtiter plate ditambahkan p-

iodonitrotetrazolium violet (INT) (0,5 mg/ ml, 20 µl) ke dalam microtiter

plate. Perubahan warna merah menunjukkan adanya pertumbuhan bakteri.

Nilai KHM ditentukan sebagai konsentrasi terendah dari sampel uji dalam

sumur yang tidak membentuk warna merah (Sabariah Ismail 2011).

3.3.12 Analisa Komponen Senyawa Fraksi yang Mempunyai Aktivitas

Antibakteri Tertinggi dengan Kromatografi Gas – Spektrometri

Massa

Sampel fraksi yang mempunyai aktivitas antibakteri tertinggi

dianalisis secara kualitatif menggunakan Kromatografi Gas – Spektrometri

Massa untuk mengetahui komponen senyawa yang ada di dalamnya. Jenis

kolom yang digunakan adalah DB – 5 MS (30m x 0,25mm i.d dengan film

thickness 0,25 m). Gas pembawa adalah helium dengan kecepatan aliran 1

ml/menit dan tekanan 53,5 Kpa. Suhu kolom diprogram dari 50o C sampai

200oC. Pada tahap awal, suhu dibuat konstan pada 50

oC selama 3 menit

kemudian dinaikkan sampai suhu 200oC dengan kecepatan kenaikan suhu

5oC/ menit dan dipertahankan selama 3 menit pada suhu 200

oC.

Temperatur interface adalah 250o C dan autosampling sebanyak 1 μL.

Solvent cut time selama 3 menit dan scan MS mulai dari 50 – 400 (m/z).

Spektrum massa yang diperoleh kemudian diidentifikasi dengan cara

membandingkannya dengan library pusat data Wiley 7 dan NIST

(National Institute of Standard and Technology) 147.

39


BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Pembuatan Simplisia

Tanaman Cinnamomum sintoc yang digunakan dalam penelitian ini

diperoleh dari Kebun Raya Bogor dan telah dilakukan determinasi di Lembaga

Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI) Pusat Konservasi Tumbuhan Kebun Raya

Bogor, Jawa barat. Hasilnya adalah tanaman yang diperoleh merupakan

tanaman Cinnamomum sintoc Blume dan merupakan anggota suku Lauraceae

(Lampiran 1).

Daun kayu sintok yang diperoleh sebanyak 6 kg, disortasi dan

dibersihkan untuk menghilangkan kotoran yang melekat pada daun. Kemudian

dilakukan proses pengeringan yang bertujuan untuk menghentikan reaksi

enzimatik dan mengurangi kadar air sehingga diperoleh simplisia yang tidak

mudah rusak. Pengeringan dilakukan dengan menggunakan oven pada suhu

40oC selama 3 hari. Pengeringan dengan menggunakan oven memiliki

beberapa kelebihan diantaranya yaitu berat kering konstan lebih cepat

diperoleh dan kadar air paling rendah dimiliki simplisia yang menggunakan

pengeringan oven dibandingkan dengan pengeringan menggunakan sinar

matahari langsung dan kering angin (Winangsih dkk, 2013).

Daun segar Cinnamomum sintoc sebanyak 6 kg setelah dikeringkan

menjadi 4,7 kg daun kering yang selanjutnya dilakukan sortasi kembali untuk

memisahkan bagian – bagian tanaman yang tidak diinginkan, seperti batang

yang masih tertinggal.

Daun kering yang telah disortasi kemudian dihaluskan menggunakan

alat penggiling hammer mill dan diayak menggunakan ayakan mesh no. 40

sehingga diperoleh 4,3 kg serbuk simplisia kering. Simplisia ditampung pada

wadah tertutup untuk menghindari cemaran oleh mikroorganisme.

4.2 Kadar Air Simplisia Daun Cinnamomum sintoc

Kadar air serbuk simplisia kering daun Cinnamomum sintoc yaitu

6,75%. Hasil tersebut sesuai dengan syarat kadar air simplisia dari Materia

Medika Indonesia (MMI) yaitu kadar air simplisia kurang dari atau sama

39

40


dengan 10%. Kadar air ditetapkan untuk menjaga kualitas simplisia. Simplisia

dengan kadar air yang tinggi akan lebih mudah terkontaminasi oleh

mikroorganisme.

4.3 Pembuatan Ekstrak

Ekstraksi dilakukan menggunakan ekstraksi cara dingin, yaitu dengan

metode maserasi. Ekstraksi maserasi merupakan suatu metode yang sering

digunakan untuk mendapatkan senyawa dari tumbuhan dengan menarik

senyawa organik dalam suatu bahan padat menggunakan pelarut organik

(Nurcahyati A, 2010). Proses ekstraksi ini menggunakan teknik maserasi

bertingkat dengan pelarut yang memiliki tingkat kepolaran yang berbeda –

beda yaitu n – heksana yang merupakan pelarut non polar, etil asetat yang

merupakan pelarut semi polar dan metanol yang merupakan pelarut polar.

Dengan menggunakan teknik maserasi bertingkat, maka senyawa akan

terekstraksi berdasarkan tingkat kepolarannya sehingga proses ekstraksi akan

lebih maksimal.

Dari proses ekstraksi, diperoleh tiga ekstrak kental yaitu ekstrak kental

n – heksana sebanyak 37,91 g, ekstrak kental etil asetat sebanyak 151,381 g,

dan ekstrak kental metanol sebanyak 192,731 g.

Tabel 4.1. Hasil rendemen ekstrak n – heksana, etil asetat dan metanol

Total Simplisia

yang Dimaserasi Ekstrak Bobot Rendemen

4300 g

atau 4,3 Kg

n – heksana 37,91 g 0,88%

Etil asetat 151,381 g 3,52%

Metanol 192,731 g 4,48%

Total 349,622 g 8,88%

4.4 Pewarnaan Gram

Pewarnaan Gram digunakan untuk identifikasi anggota dari domain

bakteri ke dalam dua kelompok berdasarkan perbedaan dinding selnya. Dalam

hal ini, pewarnaan Gram bertujuan untuk memastikan bahwa tidak ada

kontaminasi bakteri lain pada kultur kerja bakteri Staphylococcus aureus dan

41


kultur kerja bakteri Pseudomonas aeruginosa yang dibiakkan. Hasil

pewarnaan Gram ditunjukkan pada gambar 4.1.

Gambar 4.1. Hasil Pewarnaan Gram Bakteri Staphylococcus aureus dan

Pseudomonas aeruginosa dibawah mikroskop perbesaran 100 x 10

Keterangan:

(a) Bakteri Staphylococcus aureus

(b) Bakteri Pseudomonas aeruginosa

Gambar 4.1 (a) menunjukkan bahwa bakteri yang dibiakkan pada

kultur kerja adalah bakteri S.aureus yang merupakan bakteri Gram positif

berbentuk kokus (bulat). Sedangkan gambar 4.1 (b) menunjukkan bahwa

bakteri yang dibiakkan pada kultur kerja lainnya adalah bakteri P.aeruginosa

yang merupakan bakteri Gram negatif berbentuk basil (batang).

Bakteri Gram positif akan mempertahankan warna ungu dari kristal

violet sehingga ketika diamati dengan mikroskop akan menunjukkan warna

ungu sedangkan bakteri Gram negatif tidak dapat mempertahankan warna

ungu dari kristal violet tetapi zat warna safranin dapat terserap pada dinding

sel sehingga pada saat dilihat menggunakan mikroskop akan memperlihatkan

warna merah (Putra, 2012).

4.5 Pengujian Aktivitas Antibakteri Ekstrak n – heksana, Etil Asetat dan

Metanol Daun Cinnamomum sintoc Dengan Metode Difusi Cakram (Disc

Diffusion)

Tahap uji antibakteri yang pertama adalah proses screening dengan

metode difusi cakram yang bertujuan untuk menentukan ekstrak yang

(a) (b)

42


mempunyai aktivitas antibakteri tertinggi. Aktivitas antibakteri ditentukan

melalui besarnya diameter zona hambat yang terbentuk disekitar kertas

cakram.

Rata – rata diameter zona hambat yang dihasilkan ekstrak n-heksana,

etil asetat dan metanol dapat dilihat pada tabel 4.2.

Tabel 4.2. Rata – rata diameter zona hambat ekstrak n – heksana, etil asetat

dan metanol daun C. sintoc konsentrasi 50 mg/ml terhadap bakteri

Staphylococcus aureus dan Pseudomonas aeruginosa.

Bakteri

Rata – Rata Diameter Zona Hambat (mm)

Ekstrak

n - heksana

Ekstrak

etil asetat

Ekstrak

metanol

Kontrol

positif

Kontrol

negatif

Staphylococcus

aureus - 10,85 7,575 16,62 -

Pseudomonas

aeruginosa - 11,62 10,05 14,9 -

Keterangan :

Pengukuran diameter zona hambat termasuk diameter kertas cakram

(6mm)

Tanda (-) menunjukkan tidak terbentuknya zona hambat

43


Gambar 4.2. Hasil uji aktivitas antibakteri ekstrak metanol (M), etil asetat (Ea),

n – heksana (H) daun C. sintoc konsentrasi 50 mg/ml terhadap bakteri

Staphylococcus aureus ATCC 25923 dan Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853.

Keterangan:

(a) Hasil pengujian ke 1 ekstrak daun C. sintoc dengan kontrol positif tetrasiklin

1000 µg/ml (K+), kontrol negatif DMSO 15% (K-) terhadap S.aureus.

(b) Hasil pengujian ke 2 ekstrak daun C. sintoc dengan kontrol positif tetrasiklin

µg/ml 1000 (K+), kontrol negatif DMSO 15% (K-) terhadap S.aureus.

(c) Hasil pengujian ke 1 ekstrak daun C. sintoc dengan kontrol positif tetrasiklin

1000 µg/ml (K+), kontrol negatif DMSO 15% (K-) terhadap P. aeruginosa.

(d) Hasil pengujian ke 2 ekstrak daun C. sintoc dengan kontrol positif tetrasiklin

1000 µg/ml (K+), kontrol negatif DMSO 15% (K-) terhadap P. aeruginosa.

Konsentrasi larutan ekstrak yang digunakan untuk uji adalah 50 mg/

ml, konsentrasi tersebut mengacu pada penelitian Sabariah Ismail (2011).

Ekstrak n – heksana, etil asetat, dan metanol dilarutkan dengan DMSO

(a) (b)

(c) (d)

44


(dimetil sulfoksida) 15% (15% DMSO dan 65% aquadest), untuk

mempercepat proses kelarutannya digunakan alat ultrasonic homogenizer.

DMSO digunakan karena merupakan bahan alami dari serat kayu dan tidak

berbahaya. DMSO berfungsi sebagai pelarut yang cepat meresap kedalam

epitel ekstrak tanpa merusak sel – sel tersebut dan DMSO juga sering

digunakan dalam bidang kedokteran dan kesehatan (Cut R. Alfath dkk, 2013).

DMSO digunakan sebagai kontrol negatif dan dari hasil penelitian ini (Tabel

4.2) diketahui bahwa kontrol negatif tidak menunjukkan adanya

penghambatan pertumbuhan bakteri, hal tersebut membuktikan bahwa pelarut

tidak berpengaruh terhadap aktivitas antibakteri, sehingga aktivitas hanya

berasal dari larutan uji bukan pelarut yang digunakan. Untuk kontrol positif

digunakan antibiotik tetrasiklin 1000 µg/ml.

Hasil penelitian menunjukkan bahwa ekstrak etil asetat daun C. sintoc

(50 mg/ml) mempunyai aktivitas antibakteri tertinggi dibandingkan ekstrak

metanol dan n - heksana dengan rata – rata diameter zona hambat terhadap

bakteri Staphylococcus aureus adalah 10,85 mm sedangkan terhadap bakteri

Pseudomonas aeruginosa adalah 11,625 mm. Ekstrak etil asetat memberikan

zona hambat parsial terhadap bakteri Staphylococcus aureus, hal ini

disebabkan karena konsentrasi antibakteri yang berdifusi sampai kedaerah itu

semakin berkurang, sehingga tidak cukup untuk menghambat semua

pertumbuhan bakteri (Lorian V, 1980). Zona hambat yang terbentuk pada uji

antibakteri terbagi dua, yaitu zona hambat yang bersifat total dan zona hambat

yang bersifat parsial. Zona hambat total apabila daerah disekeliling cakram

jernih, artinya bakteri tersebut benar – benar sensitif terhadap konsentrasi

ekstrak uji yang diberikan. Zona hambat parsial apabila ada zona hambat yang

terbentuk disekitar cakram masih terdapat beberapa koloni bakteri. Hasil uji

aktivitas pada ekstrak etil asetat dapat dikatakan sebagai antibakteri kuat

terhadap bakteri Staphylococcus aureus dan Pseudomonas aeruginosa karena

menurut Davis Stout (1971) ketentuan kekuatan suatu zat uji terhadap bakteri

bila ukuran zona hambat 20 mm atau lebih disebut sebagai sangat kuat, bila

10 mm – 20 mm kuat dan 5 – 10 mm dikatakan sebagai zat uji bersifat sedang

dan dibawah 5 mm bersifat lemah.

45


Ekstrak metanol daun C. sintoc (50 mg/ml) juga mempunyai aktivitas

terhadap bakteri Staphylococcus aureus maupun bakteri Pseudomonas

aeruginosa meskipun diameter zona hambat yang dihasilkan tidak lebih besar

dari zona hambat ekstrak etil asetat, diameter zona hambat terhadap bakteri

Staphylococcus aureus adalah 7,575 mm sedangkan terhadap bakteri

Pseudomonas aeruginosa adalah 10,05 mm. Dengan penggolongan kekuatan

zat uji berdasarkan diameter zona hambat menurut Davis Stout (1971), maka

ekstrak metanol dapat dikatakan sebagai antibakteri sedang terhadap bakteri

Staphylococcus aureus dan antibakteri kuat terhadap Pseudomonas

aeruginosa. Berdasarkan hasil KLT, terdapat senyawa dengan nilai Rf yang

sama pada ekstrak metanol dan ekstrak etil asetat, oleh karena itu ekstrak

metanol kemungkinan juga mempunyai senyawa yang berpotensi sebagai

antibakteri, dibutuhkan penelitian lebih lanjut mengenai aktivitas antibakteri

ekstrak metanol daun C.sintoc.

Ekstrak n – heksana daun C. sintoc (50 mg/ml) tidak menunjukkan

adanya penghambatan terhadap pertumbuhan bakteri Staphylococcus aureus

maupun bakteri Pseudomonas aeruginosa. Hal ini dapat disebabkan karena

ekstrak n – heksana mengandung lebih banyak minyak dan lemak daripada

ekstrak etil asetat dan metanol. Minyak dan lemak yang mempunyai ukuran

molekul besar, menganggu proses difusi, menjadi penghalang masuknya

senyawa fenolik maupun senyawa antibakteri lainnya ke dalam sel dan

melindungi bakteri dari senyawa antibakteri, sehingga ekstrak n – heksana

tidak cukup untuk berdifusi dan tidak mampu menghambat pertumbuhan

bakteri (Agustina dkk, 2011).

4.6 Kadar Air Ekstrak Etil Asetat daun Cinnamomum sintoc

Hasil pengukuran kadar air ekstrak etil asetat daun C.sintoc yaitu

8,23%. Menurut literatur, kadar air dalam ekstrak tidak boleh lebih dari 10%.

Hal ini bertujuan untuk menghindari cepatnya pertumbuhan jamur dalam

ekstrak (Soetarno dan Soediro, 1997).

Kadar air merupakan salah satu parameter penting yang menentukan

daya tahan ekstrak dan terkait dengan aktivitas mikroorganisme selama

46


penyimpanan. Ekstrak yang mempunyai kadar air yang tinggi lebih mudah

rusak karena ekstrak tersebut dapat menjadi media yang kondusif bagi

pertumbuhan mikroorganisme. Ekstrak dengan kadar air rendah relatif lebih

stabil dalam penyimpanan jangka panjang daripada ekstrak dengan kadar air

tinggi (Pardede antoni, 2013).

4.7 Uji Fitokimia Ekstrak Etil Asetat

Uji fitokimia untuk mengetahui jenis senyawa yang ada di dalam

ekstrak etil asetat daun C. sintoc, sehingga dapat diketahui senyawa berpotensi

sebagai antibakteri. Hasil uji fitokimia dapat dilihat pada Tabel 4.3.

Tabel 4.3. Hasil Uji Fitokimia Ekstrak Etil Asetat

Parameter Uji Hasil Pengamatan Hasil Uji

Terpenoid Terbentuk warna hijau gelap +

Steroid Terbentuk warna hijau gelap -

Alkalloid Tidak ada perubahan warna -

Saponin Tidak terbentuk busa -

Fenol Terbentuk warna hijau kehitaman +

Flavonoid Tidak ada perubahan warna -

Tannin Terbentuk warna hijau kehitaman +

4.8 Fraksinasi Ekstrak Etil Asetat Menggunakan Kromatografi Kolom

Berdasarkan hasil pemisahan 10 g ekstrak etil asetat menggunakan

kromatografi kolom dengan fasa diam silika gel 60 (0,040 – 0,063 mm) mesh

230 – 400 dan fasa gerak n – heksana : etil asetat, diperoleh eluat sebanyak

125 vial. Eluat tersebut diuji dengan KLT untuk melihat pola noda dari

masing – masing eluat. Profil KLT eluat dapat dilihat pada lampiran 10.

Dari 125 eluat diperoleh 10 fraksi gabungan yang memiliki pola noda

dengan nilai Rf yang sama. Fraksi tersebut yaitu:

Fraksi 1 merupakan gabungan fraksi no. 1 – 14




47








Setelah digabungkan, fraksi – fraksi tersebut kemudian dikering

anginkan untuk menguapkan pelarut yang terdapat dalam fraksi. Bobot

masing – masing fraksi ditimbang saat fraksi telah kering atau pelarut telah

menguap. Bobot masing – masing fraksi dapat dilihat pada Tabel 4.4. Profil

KLT masing – masing fraksi yang telah digabungkan dapat dilihat pada

lampiran 11.

Tabel 4.4. Bobot Masing – Masing Fraksi

Fraksi Bobot

1 1,5299 g

2 1,7406 g

3 0,9461 g

4 1,0519 g

5 0,0984 g

6 0,6825 g

7 0,7841 g

8 0,111 g

9 0,087 g

10 0,107 g

4.9 Uji Aktivitas Antibakteri Fraksi dari Ekstrak Etil Asetat Dengan Metode

Bioautografi

Kesepuluh fraksi diuji aktivitas antibakteri menggunakan metode

biaoutografi langsung dengan konsentrasi 50 mg/ml, dimana 10 µl fraksi

ditotolkan ke plat KLT, kemudian plat KLT dicelupkan kedalam suspensi

48


bakteri 106 CFU/ml sebanyak 10 ml selama 5 detik dan diinkubasi selama 20

jam suhu 37oC. Untuk melihat hasil pengujian, maka plat KLT disemprot

dengan p – iodonitrotetrazolium (INT) (2mg/ml). Hasil pengujian aktivitas

antibakteri 10 fraksi terhadap bakteri Staphylococcus aureus ATCC 25923 dan

Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 dapat dilihat pada Tabel 4.5.

Tabel 4.5. Hasil Uji aktivitas antibakteri fraksi dari ekstrak etil asetat dengan

metode bioautografi terhadap bakteri Staphylococcus aureus ATCC 25923

dan Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853

Keterangan:

(+) : ada aktivitas antibakteri (-) : tidak ada aktivitas antibakteri

Fraksi

(50 mg/ml)

Aktivitas Antibakteri

Staphylococcus

aureus

Pseudomonas

aeruginosa

1 - +

2 - -

3 - -

4 - -

5 - -

6 + -

7 - -

8 + -

9 - -

10 - -

Kontrol positif tetrasiklin

(1000 µg/ml) + +

49


(c) (d)

Gambar 4.3. Hasil uji aktivitas antibakteri fraksi dari ekstrak etil setat dan

tetrasiklin dengan metode bioautografi terhadap bakteri Staphylococcus aureus

ATCC 25923 dan Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853

Keterangan :

(a) Hasil pengujian sepuluh fraksi dengan metode bioautografi terhadap bakteri

Staphylococcus aureus

(b) Hasil pengujian sepuluh fraksi dengan metode bioautografi terhadap bakteri

Pseudomonas aeruginosa

(c) Hasil pengujian Tetrasiklin 1000 µg/ml sebagai kontrol positif terhadap

bakteri Staphylococcus aureus

(d) Hasil pengujian Tetrasiklin 1000 µg/ml sebagai kontrol positif terhadap

bakteri Pseudomonas aeruginosa

Bioautografi adalah suatu teknik untuk mendeteksi zat yang

mempengaruhi tingkat pertumbuhan organisme uji dalam campuran yang

kompleks dan matriks (Choma, 2005). Metode ini menggabungkan

penggunaan teknik kromatografi lapis tipis dengan respon mikroorganisme

yang diuji berdasarkan aktivitas biologi suatu sampel yang memiliki aktivitas

antibakteri (Kusumaningtyas, dkk, 2008). Pengujian ini bertujuan untuk

menentukan fraksi yang mempunyai aktivitas antibakteri tertinggi.

5

1 2 3

4

8 9 7

6

10 Kloroform Ea

(a) (b)

1 2 3

4 6

7 8 9

10 Kloroform Ea

5

50


Aktivitas antibakteri positif ditunjukkan jika terbentuk zona hambat

yang berwarna putih – krim disekitar ekstrak pada latar plat KLT berwarna

merah atau ungu setelah penyemprotan p – iodonitrotetrazolium (INT). Hal ini

terjadi karena adanya reaksi enzimatik antara larutan INT dengan bakteri,

dimana larutan INT yang tadinya berwarna kuning kehijauan akan direduksi

oleh enzim dehidrogenase yang terdapat pada bakteri sehingga berubah

menjadi formazan yang berwarna merah atau ungu.

Dari hasil uji bioautografi ini, dapat diketahui bahwa fraksi 1 memiliki

aktivitas antibakteri tertinggi terhadap P.aeruginosa dengan diameter zona

hambat 13 mm, tetapi tidak memiliki aktivitas antibakteri terhadap S.aureus.

Fraksi 8 memiliki aktivitas antibakteri tertinggi terhadap S.aureus dengan

diameter zona hambat 8,6 mm, tetapi tidak memiliki aktivitas antibakteri

terhadap terhadap P.aeruginosa.

Selanjutnya fraksi 1 dan fraksi 8 konsentrasi 50 mg/ml ditotolkan pada

plat KLT sebanyak 10 µl dan fraksi 1 dielusi menggunakan eluen

n – heksana : etil asetat (19:1) sedangkan fraksi 8 dielusi dengan eluen n –

heksana : etil asetat (4: 6). Eluen tersebut dipilih setelah dilakukan optimasi

untuk mencari fasa gerak yang tepat agar memberikan noda/ spot pemisahan

yang baik sehingga diketahui nilai Rf dari senyawa yang aktif sebagai

antibakteri. Fraksi 1 dan fraksi 8 yang telah dielusi, diuji aktivitas antibakteri

menggunakan metode biaoutografi langsung. Pengujian ini bertujuan untuk

mengetahui nilai Rf senyawa yang aktif sebagai antibakteri. Hasil pengujian

dapat dilihat pada gambar 4.4.

51


Gambar 4.4. Hasil uji bioautografi fraksi 8 terhadap S. aureus dan fraksi 1

terhadap P.aeruginosa

Keterangan:

(a) Fraksi 8 sebelum dicelupkan kedalam suspensi bakteri S.aureus

(b) Hasil uji bioautografi fraksi 8 terhadap bakteri S.aureus

(c) Fraksi 1 sebelum dicelupkan kedalam suspensi bakteri P.aeruginosa

(d) Hasil uji biouatografi fraksi 1 terhadap bakteri P.aeruginosa

Profil KLT fraksi 1 (Gambar 4.4 (c)) menunjukkan bahwa fraksi 1

mempunyai 7 spot atau noda. Profil KLT fraksi 8 (Gambar 4.4 (a))

menunjukkan bahwa fraksi 8 mempunyai 7 spot atau noda. Berdasarkan hasil

uji bioautografi fraksi 1 terhadap bakteri P. aeruginosa (Gambar 4.4 (d)),

diketahui bahwa senyawa dengan nilai Rf 0,16 dan 0,90 diduga mempunyai

aktivitas antibakteri. Sedangkan hasil uji bioautografi fraksi 8 terhadap bakteri

S.aureus (gambar 4.4 (a)), diketahui bahwa senyawa dengan nilai Rf 0,25; 0,4;

0,8 dan 0,9 diduga mempunyai aktivitas antibakteri. Nilai Rf dari senyawa

yang diduga mempunyai aktivitas antibakteri ditentukan dengan melihat

adanya zona jernih (putih – krim) dengan latar belakang plat yang berwarna

ungu.

Fraksi 1 dipilih untuk pengujian selanjutnya karena fraksi 1

mempunyai diameter zona hambat terbesar terhadap Pseudomonas

aeruginosa, selain itu fraksi 1 juga mempunyai jumlah yang cukup untuk

(a) (b) (c) (d)

7

6

5

4

3

2

1 1

2

3

4

5

6 7

52


dilakukan pengujian selanjutnya. Dikarenakan fraksi 8 yang sedikit jumlahnya

dan tidak mencukupi untuk pengujian, fraksi 8 tidak dapat digunakan untuk

pengujian selanjutnya.

4.10 Penentuan Nilai Konsentrasi Hambat Minimum (KHM) Fraksi 1 dari

Ekstrak Etil Asetat

Berdasarkan uji bioautografi, fraksi 1 hanya mempunyai aktivitas

antibakteri terhadap Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, maka fraksi 1

ditentukan nilai konsentrasi hambat minimumnya terhadap bakteri tersebut.

Penentuan nilai KHM (Konsentrasi Hambat Minimum) menggunakan metode

mikrodilusi cair. Metode mikrodilusi cair paling banyak digunakan karena

sederhana dan sesuai untuk sebagian besar mikroba (Jorgensen, 1993).

Keuntungan metode ini yaitu dapat memberi hasil kuantitatif yang

menunjukkan jumlah antimikroba yang dibutuhkan untuk menghambat

viabilitas bakteri (Jawetz et al, 2005). Data hasil pengujian ini dapat dilihat

pada Tabel 4.6.

Tabel 4.6. Data hasil uji KHM fraksi 1 dari ekstrak etil asetat terhadap Bakteri

Pseudomonas aeruginosa.

No Larutan uji Nilai KHM

1 Fraksi 1 12500 µg/ml

2 Tetrasiklin 16 µg/ml

Pada uji KHM, suspensi bakteri yang digunakan berisi koloni bakteri

sebanyak 106 CFU/ml, bakteri uji yang digunakan sebanyak 100 µl dipipet

kedalam masing – masing sumur yang berisi seri pengenceran larutan uji dan

media Nutrient broth (NB). Inkubasi dilakukan selama 20 jam pada suhu

37oC. untuk mempermudah pengamatan, maka digunakan reagen p –

iodonitrotetrazolium (INT) yang akan tereduksi oleh enzim dehidrogenase

pada bakteri menjadi formazan sehingga akan terjadi perubahan warna

menjadi berwarna ungu kemerahan. Dari hasil uji, diketahui terjadi

penghambatan pertumbuhan bakteri pada konsentrasi fraksi 1 12500 µg/ml

(12,5 mg/ml) terhadap pertumbuhan bakteri Pseudomonas aeruginosa. Nilai

53


KHM antibiotik tetrasiklin sebagai kontrol positif yaitu 16 µg/ml terhadap

bakteri Pseudomonas aeruginosa. Tingginya nilai KHM yang dihasilkan

fraksi 1 pada uji mikrodilusi ini, dapat disebabkan karena fraksi 1 masih terdiri

dari beberapa campuran senyawa yang memiliki potensi yang beragam.

Kemungkinan besar ada senyawa yang bersifat tidak sinergis atau antagonis,

sehingga hal tersebut dapat saling melemahkan atau menghilangkan efek dari

senyawa yang mempunyai aktivitas antibakteri. Oleh karena itu, diperlukan

penelitian lebih lanjut mengenai isolasi senyawa murni yang mempunyai

aktivitas antibakteri dari fraksi 1 ekstrak etil asetat daun Cinnamomum sintoc

untuk mengetahui aktivitas antibakteri senyawa tersebut dalam bentuk

tunggal.

Pada uji KHM digunakan juga kontrol lain yaitu SC (Sterility Control)

yaitu kontrol sterilitas yang berisi medium saja untuk menjamin bahwa media

dan microtiter plate yang digunakan steril dan tidak ditumbuhi bakteri,

ditunjukkan dengan tidak berwarna ungu setelah penambahan reagen INT. GC

(Growth Control) yaitu kontrol pertumbuhan yang menunjukkan bahwa

bakteri uji dapat tumbuh pada kondisi atau perlakuan uji ditandai dengan

terjadi perubahan warna ungu setelah penambahan reagen INT. SoC (Solvent

Control) yaitu kontrol pelarut yang menunjukkan bahwa pelarut tidak

memberikan aktivitas antibakteri ditandai dengan terjadi perubahan warna

ungu setelah penambahan reagen INT. Kontrol pelarut yang digunakan dalam

uji ini yaitu DMSO 15%.

4.11 Analisa Komponen Senyawa pada Fraksi 1 dari Ekstrak Etil Asetat

dengan Kromatografi Gas – Spektrometri Massa

Dari hasil uji identifikasi senyawa menggunakan Kromatografi Gas –

Spektrometri Massa, diketahui bahwa kromatogram fraksi 1 memperlihatkan

adanya 21 puncak, kromatogram fraksi 1 dapat dilihat pada gambar 4.6.

Spektrum senyawa yang muncul pada kromatogram tersebut dibandingkan

dengan library pusat data Wiley 7 dan NIST (National Institute of Standard

and Technology) 147. Senyawa yang terkandung pada fraksi 1 dapat dilihat

pada tabel 4.7.

54


Tabel 4.7. Hasil analisis senyawa pada fraksi 1 dari ekstrak etil asetat dengan

Kromatografi Gas – Spektrometri Massa.

Puncak Waktu retensi

(menit)

Area

(%) BM Nama Senyawa Golongan

Senyawa

1 17,533 2,43 204 α - Cubebene Sesquiterpen

2 17,924 0,65 204 β - Elemene Sesquiterpen

3 18,638 1,95 204 Caryophyllene Sesquiterpen

4 19,540 1,59 204 α - Humulene Sesquiterpen

5 20,376 7,83 204 β - Selinene Sesquiterpen

6 20,557 3,31 204 α - Selinene Sesquiterpen

7 20,661 1,59 204 α - Muurolene Sesquiterpen

8 21,136 14,34 204 δ - Cadinene Sesquiterpen

9 21,207 6,87 202 Calamenene Sesquiterpen

10 21,932 2,64 193,24 3,5-Diacetyllutidin Keton alifatik

11 22,590 2,26 204 Eremophilene Sesquiterpen

12 23,045 4,94 224 1 - Hexadecena Hidrokarbon

alifatik

13 23,240 1,40 220 (-)-Cayophyllene

oxide Sesquiterpen

14 23,500 13,03 212 Myristaldehyde Aldehid

alifatik

15 23,687 3,20 204 2 – Epi – α – cedrene Sesquiterpen

16 24,020 1,40 222 δ - Cadinol Sesquiterpen

alkohol

17 26,761 1,32 212 Benzyl Benzoate Ester

18 27,466 8,77 252 E-15-Heptadecanal Aldehid

alifatik

19 31,480 11,94 286 1 – Octadecanathiol Alkohol

20 34,880 2,65 310 Ethyl Oleate Asam lemak

21 35,629 5,88 340 1 – Tricosanol Fenol

Gambar 4.5. Kromatogram Fraksi 1 dari Ekstrak Etil Asetat

55


Fraksi 1 mengandung golongan senyawa sesquiterpen (47,42%), fenol

(5,88%), aldehid alifatik (21,8%), ester (1,32%), asam lemak (2,65%),

sesquiterpen alkohol (1,4%), keton alifatik (2,64%), hidrokarbon alifatik

(4,94%), dan alkohol (11,94%). Senyawa mayor yang terkandung dalam fraksi

1 yang yaitu δ – Cadinene (14,34%) yang merupakan golongan senyawa

sesquiterpenoid dan Myristaldehyde (13,03%) yang merupakan senyawa

golongan aldehid alifatik.

Terpenoid merupakan senyawa fenolik yang menunjukkan aktivitas

antimikroba, terutama monoterpen dan sesquiterpen yang aktif terhadap

bakteri dan jamur (Vijayakumar A, 2012). Hasil penelitian ini menunjukkan,

sebagian besar senyawa yang terkandung dalam fraksi 1 ekstrak etil asetat

merupakan golongan sesquiterpen diantaranya yaitu α – Cubebene, β –

Elemene, Caryophyllene α - Humulene, β – Selinene, α – Selinene, α –

Muurolene, δ – Cadinene, Calamenene, Eremophilene, (-)-Cayophyllene

oxide, 2 – Epi – α – cedrene. Mekanisme antibakteri senyawa terpenoid yaitu

bereaksi dengan porin (protein transmembran) pada membran luar dinding sel

bakteri, membentuk ikatan polimer yang kuat sehingga mengakibatkan

rusaknya porin. Rusaknya porin yang merupakan pintu keluar masuknya

senyawa akan mengurangi permeabilitas dinding sel bakteri yang akan

mengakibatkan sel bakteri akan kekurangan nutrisi, sehingga pertumbuhan

bakteri terhambat atau mati (Cowan, 1999).

Fraksi 1 mengandung senyawa golongan aldehid yaitu Myristaldehyde

dan E-15-Heptadecanal. Senyawa golongan aldehid mempunyai mekanisme

antibakteri yang berkaitan dengan elektronegativitasnya. Gugus aldehid

terkonjugasi karbon atau karbon ikatan rangkap merupakan susunan yang

sangat elektronegatif yang bertanggung jawab terhadap aktivitas antibakteri

senyawa tersebut (Moleyar & Narasimham 1986). Peningkatan

elektronegativitas dapat meningkatkan aktivitas antibakterinya (Kurita et al.

1979, 1981). Senyawa elektronegatif tersebut dapat mengganggu dalam proses

biologis yang melibatkan transfer elektron dan bereaksi dengan komponen

nitrogen penting pada bakteri, misalnya protein dan asam nukleat dan oleh

karena itu dapat menghambat pertumbuhan mikroorganisme (Dorman & S. G.

56


Deans, 2008). Selain itu, Myristaldehyde dapat teroksidasi menjadi bentuk

asamnya yang juga memilki aktivitas antibakteri (Noryati mulyono, 2012).

Golongan senyawa fenol dan alkohol juga mempunyai aktivitas

sebagai antibakteri. Mekanisme senyawa fenol sebagai antibakteri pada

konsentrasi rendah adalah dengan merusak membran sitoplasma dan dapat

mengakibatkan kebocoran inti sel, sedangkan pada konsentrasi tinggi senyawa

fenol berkoagulasi dengan protein seluler. Aktivitas tersebut sangat efektif

ketika bakteri dalam tahap pembelahan dimana lapisan fosfolipid di sekeliling

sel sedang dalam kondisi yang sangat tipis sehingga fenol dapat dengan

mudah merusak isi sel (Volk & Wheller, 1984). Senyawa alkohol diketahui

memiliki aktivitas bakterisidal terhadap sel vegetatif bakteri (Dorman & S. G.

Deans, 2008). Alkohol mendenaturasi protein dengan cara dehidrasi, dan juga

merupakan pelarut lemak, oleh karenanya membran sel akan dirusak dan

enzim – enzim akan diinaktifkan oleh alkohol (Staf Pengajar Fakultas

Kedokteran UI, 1993).

57


BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

5.1 Kesimpulan

1. Dari hasil pengujian aktivitas antibakteri ekstrak n – heksana, etil asetat

dan metanol daun Cinnamomum sintoc terhadap bakteri Staphylococcus

aureus ATCC 25923 dan Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853

diketahui bahwa ekstrak etil asetat mempunyai aktivitas antibakteri

tertinggi dengan rata – rata diameter zona hambat yaitu 10,85 mm

terhadap Staphylococcus aureus ATCC 25923 dan 11,625 mm terhadap

Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853.

2. Hasil fraksinasi ekstrak etil asetat daun Cinnamomum sintoc didapatkan

10 fraksi, yaitu fraksi 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10.

3. Fraksi 1 mempunyai aktivitas antibakteri tertinggi terhadap Pseudomonas

aeruginosa ATCC 27853, tetapi tidak mempunyai aktivitas antibakteri

terhadap Staphylococcus aureus ATCC 25923 dan fraksi 8 mempunyai

aktivitas antibakteri tertinggi terhadap Staphylococcus aureus ATCC

25923 tetapi tidak mempunyai aktivitas antibakteri terhadap

Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853.

4. Konsentrasi Hambat Minimum (KHM) yang dihasilkan fraksi 1 dari

ekstrak etil asetat yaitu 12,5 mg/ml terhadap Pseudomonas aeruginosa

ATCC 27853.

5. Hasil analisa komponen senyawa yang terdapat pada fraksi 1 dari ekstrak

etil asetat dengan menggunakan GCMS yaitu terdapat 21 senyawa yang

merupakan golongan sesquiterpen (47,42%), fenol (5,88%), aldehid

alifatik (21,8%), ester (1,32%), asam lemak (2,65%), sesquiterpen

alkohol (1,4%), keton alifatik (2,64%), hidrokarbon alifatik (4,94%), dan

alkohol (11,94%). Senyawa yang memiliki kelimpahan terbesar yaitu δ –

Cadinene (14,34%) dan Myristaldehyde (13,03%).

57

58


5.2 Saran

1. Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut mengenai isolasi senyawa aktif

antibakteri yang terkandung dalam fraksi 1 dari ekstrak etil asetat daun

Cinnamomum sintoc.

2. Perlu dilakukan pengujian KHM lebih lanjut fraksi 8 dari ekstrak etil

asetat terhadap bakteri Staphylococcus aureus.

3. Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut mengenai ekstrak metanol yang

juga mempunyai aktivitas antibakteri.

4. Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut dengan menggunakan bakteri

Gram positif dan bakteri Gram negatif lainnya.

59


DAFTAR PUSTAKA

Achmad S.A., E.H. Hakim, L. Makmur, D. Mujahidin, Y.M. Syah, (1999),

Penyelidikan keanekaragaman senyawa fenol dari spesies Moraceae

hutan tropika: Suatu strategi penelitian kimia bahan alam, Prosiding

Seminar Nasional Kimia Bahan Alam ’99, Depok, Kosela, S., dkk.,

Editor, Pusat Penelitian Sains dan Teknologi, Universitas Indonesia, 1-

9.

Adolf J.N. Parhusip. (2006). Kajian mekanisme antibakteri ekstrak andaliman

(Zanthoxylum acanthopodium DC) terhadap bakteri patogen pangan.

Disertasi Institut Pertanian Bogor.

Agoes, Goeswin. 2007. Teknologi Bahan Alam. Penerbit ITB. Bandung. Hal 31

Agustina D.R. Nurcahyati dkk. (2011). Aktivitas Antioksidan dan Antibakteri

Ekstrak Polar dan Non Polar Biji Selasih (Ocimum sanctum. Linn.)

Jurnal Teknologi dan Industri Pangan, Vol XXII No. 1. Jakarta.

Agustini, D. D. Profil Daya Hambat Dari Kombinasi Antibiotik Terhadap Bakteri

Escherichia coli. Diakses dari http://www.majalah-farmacia.com pada

desember 2013.

Baker J.T., R.P. Borris, B. Carte, G.A. Cordell, G.M. Cragg, M.P. Gupta, M.M.

Iwu, D.R. Madulid, V.E. Tyler, (1995), Natural product drug discovery

and development: New perspectives on international collaboration, J.

Nat. Prod, 58 (9) 1325-1357.

Berna elya, Atiek Soemiati dan Farida. (2009). Antibakteri Ekstrak Kulit Batang

Manggis Hutan (Garcinia Rigida Miq.) jurnal Majalah Ilmu

Kefarmasian ISSN 1693-9883.

Choma, I.M & Grzelak, E.M., 2010. Bioautographic detection in thin layer

chromatography. Journal Of Chromatography A. Poland: Elsevier.

Cowan, M. (1999). Plant Product as Antimicrobial Agent, Clinical Microbial

Reviews, 12 (4), hal. 564 – 582

Cut R. Alfath dkk. (2013). Antibacterial Effect of Granati fructus Cortex Extract

on Streptococcus mutans In Vitro. Journal of Dentistry Indonesia 2013,

Vol. 20, No. 1, 5-8.

Departemen Kesehatan Republik Indonesia. (1995). Farmakope Indonesia. Edisi

IV. Jakarta: Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan.

Diyah dan N. Wahyuning. Penggunaan Metode Spektrofotometer dengan

Pereaksi Cu Untuk Penetapan Kadar Senyawa Aktif Amoksisilin.

Diakses dari www.unair.ac.id pada Desember 2013

59

60


Dorman, H.J.D., Deans, S.G. (2008). Antimicrobial agents from plants:

antibacterial activity of plant volatile oils. Journal of Applied

Microbiology volume 88 issue 2. Page 308 – 316.

Dwidjoseputro, D. (1994). Dasar-Dasar Mikrobiologi. Penerbit Djambatan.

Jakarta. Hal 37-40

Ersam Taslim, (2004), Keunggulan Biodiversitas Hutan Tropika Indonesia dalam

Merekayasa Model Molekul Alami, Seminar Nasional Kimia VI ITS,

Surabaya.

Farnsworth, N. R. (1996). Biological and photochemical screening of plants.

Journal of Pharmaceutical Science. 55: 225 – 276.

Gritter, R.J., Bobbit, J.M., & Schwarting A.E. (1991). Pengantar Kromatografi.

Terjemahan dari Introduction to Chromatography (Padwinata K &

Soediro I, Penerjemah.). Bandung: ITB Press

Harborne JB.(1996). Metode Fitokimia. Penuntun cara modern menganalisis

tumbuhan. Padmawinata K, Sudiro I, Penerjemah. Bandung: Penerbit

ITB.

Harmita. (2006). Buku Ajar Analisis Fisikokimia. Depok: Departemen Farmasi

Universitas Indonesia.

Helmi et al. (2006). Standarisasi Ekstrak Etanol Daun Eugenia cumini. Merr.

Jurnal sains teknologi farmasi 11(2).

Iskandar, yoppi dan S, Supriyatna. (2008). Chemical composition of volatile oil

from Cinnamomum sintoc stem barks. Proceeding of The International

Seminar on Chemistry 2008: 601 – 603.

Jantan, I., Mohd Ali N.A., Ahmad, A.R. and Ahmad, A.S. (1994) Chemical

constituents of the essential oils of Cinnamomum sintok Blume.

Pertanika J. Sci. Techn., 2, 39-45.

Jawetz, E., Melnick, J.L., and Adelberg. (2005). Mikrobiologi Kedokteran,

Penerjemah dan editor bagian mikrobiologi Kedokteran Universitas

Airlangga. Penerbit Salemba Medika, Jakarta.

Jawetz, M. and Adelberg. (1996). Mikrobiologi Kedokteran Edisi 20. EGC.

Jakarta.

Kurita, N., Miyaji, M., Kurane, R., Takahara, Y., Ichimura, K. (1979). Antifungal

activity and molecular orbital energies of aldehyde compounds from

oils of higher plants. Agriculture and Biological Chemistry, 43, 2365

237.

Kurita, N., Miyaji, M., Kurane, R., Takahara, Y., Ichimura, K. (1981). Antifungal

activity of components of essential oils. Agriculture and Biological

Chemistry, 45, 945 952.

61


Kusumaningtyas dkk. (2008). Sensitivitas Metode Bioautografi Kontak Dan Agar

Overlay Dalam Penentuan Senyawa Anti Kapang. Jurnal Ilmu

Kefarmasian Indonesia. Vol 6, No. 2, Hal 75 – 70.

Lemmens, R.H.M.J, I. Soerianegara and W.C. Wong (ed). (1995). PROSEA

(Plant Resources of South East Asia) No. 5 (2) Timber Tree : Minor

Commercial Timbers. PROSEA Foundation. Bogor.

Lorian V. 1980. Antibiotics in Laboratory Medicine. The William and Wilkins

Co., Baltimore: 1-179.

Manimaran S, Dhanabal P, Nanjan J, Suresh B. (2007). Chemical composition

and antimicrobial activity of the volatile oil of the cones of Cupressus

torulosa D. DON from Nilgiris, India. Asian J Trad Med; 2(6): 206-211.

Marliana, S.D., V. Suryanti., Suyono. 2005. Skrining Fitokimia dan Analisis

Kromatografi Lapis Tipis Komponen Kimia Buah Labu Siam (Sechium

edule Jacq. Swartz.) dalam Ekstrak Etanol. Biofarmasi. 3(1): 26-31.

Mojab F, Kamalinejad M, Naysaneh G. & Hamid RV. 2003. Phytochemical

Screening of Some Species of Iranian Plants, Iranian Journal of

Pharmaceutical Research, 2003, 77- 82.

Moleyar, V. & Narasimham, P. (1986). Antifungal activity of some essential oil

components. Food Microbiology, 3, 331 336.

Nain P, Kumar A, Sharma S, Nain J. (2011). In vitro evaluation of antimicrobial

and antioxidant activities of methanolic extract of Jasminum humile

Leaves. Asian Pac J Trop Med; 4(10): 804-807.

Nurcahyati, A. (2010). Evaluasi pH ekstrak daun the (Camellia sinensis) terhadap

pertumbuhan Streptococcus mutans. Banda Aceh (skripsi) Program

studi FK Unsyiah.

P. Lalitha, et al. (2012). Preliminary studies on phytochemicals and antimicrobial

activity of solvent extracts of Eichhornia crassipes (Mart.)Solms. Asian

Journal of Plant Science and Research (2):115-122. ISSN: 2249 – 7412.

Pelczar. M.J. dan E.C.S. Chan. (1998). Dasar-Dasar Mikrobiologi. Jilid 1. UI

Press.Jakarta.Hal 106-113

Pelczar. M.J. dan E.C.S. Chan. (1998). Dasar-Dasar Mikrobiologi. Jilid 2. UI

Press. Jakarta. Hal 49-51.

Pratiwi, S.,T., 2008. Mikrobiologi farmasi. Jakarta: Erlangga.

62


Putra, Surya Rosa dkk. (2012). Isolasi Dan Identifikasi Bakteri Termofilik Dari

Sumber Mata Air Panas Di Songgoriti Setelah Dua Hari Inkubasi.

Jurnal Teknis Pomits: 1-5.

Putri W.S, dkk. Skrining Fitokimia Ekstrak Etil Asetat Kulit Buah Manggis

(Garcinia mangostana L.). Universitas Udayana.

Robinson, T. (1991). Kandungan Organik Tumbuhan Tingkat Tinggi. Bandung:

Penerbit ITB

Sabariah Ismail (2011). An Antimicrobial Compound Isolated from Cinnamomum

Iners Leaves with Activity against Methicillin-Resistant Staphylococcus

Aureus. Molecules journal 1420-3049.

Saeed, S., & Tariq, P. (2005). Screening Of Antibacterial Activity Of

Cinnamonium zeylanicum. IntI. Chern. Pharrn. Med. J. Vol. 2(1), 175 -

178.

Sampurno. 2000. Parameter Standar Umum Ekstrak Tumbuhan Obat.

Departemen Kesehatan.

Shan et al. (2007). Antibacterial Properties and Major Bioactive Components of

Cinnamomum Stick (Cinnamomum burmanii): Activity against

Foodborne Pathogenic Bacteria. Journal of Agricultural and Food

Chemistry 55: 5484 – 5490.

Soetarno S dan IS. Soediro. (1997). Standardisasi Mutu Simplisia dan Ekstrak

Bahan Obat Tradisional. Presidium Temu Ilmiah Nasional Bidang

Farmasi.

Soh Wuu Kuang. (2011). Taxonomic revision of Cinnamomum (Lauraceae) in

Borneo. Blumea 56:241–264

Staf Pengajar Fakultas Kedokteran UI. (1993). Buku Ajar Mikrobiologi

Kedokteran Edisi Revisi. Jakarta: binarupa Aksara.

Suharto dan A. Chatim. 1993. Mikrobiologi Kedokteran. Jakarta. Hal 18-22.

Sylviana Husein, dkk. (2009). Study on Antibacterial Activity from “Temulawak”

(Curcuma xanthorrhiza Roxb.) Rhizomes against Pathogenics Microbes

Cell Destruction journal of applied and Industrial Biotechnology in

tropical region: 1979-9748.

Tabak, mina et al. (1999). Cinnamon extracts inhibitory effect on Helicobacter

pylori Journal of Ethnopharmacology 67 (1999) 269–277.

63


Vangalapati Meena. (2012). Purification of Cinnamaldehyde from Cinnamon

Species by Column Chromatography. International Research Journal of

Biological Sciences: 2278-3202

Vijayakumar A, et al. (2012). Phytochemical analysis and in vitro antimicrobial

activity of Illicium griffithii Hook. f. & Thoms extracts. Asian Pacific

Journal of Tropical Diseas: 190 – 199.

Volk and Wheller. (1984). Mikrobiologi Dasar, diterjemahkan oleh Soenarto

Adisoemarto, hal. 137 – 138, Erlangga, Jakarta.

Wahyu, Bobby Widiatmo, dkk. (2013). Efek antimikroba Ekstrak Etanol Daun

Pepaya (Carica papaya L.) terhadap bakteri Shigella dysnteriae kode

Isolat 2312-F secara in vitro. Malang. Universitas Brawijaya.

Winangsih dkk. (2013). Pengaruh Metode Pengeringan Terhadap Kualitas

Simplisia Lempuyang Wangi (Zingiber Aromaticum L.). Buletin

Anatomi dan Fisiologi Volume XXI, Nomor 1, Maret 2013. Universitas

Diponogoro, Semarang.

Yenny. (2007). Resistensi Dari Bakteri Enterik: Aspek Global Terhadap

Antimikroba. Universa Medicina 26: 46-56.

64


Lampiran 1. Hasil Determinasi Tanaman Cinnamomum sintoc Blume

65


Lampiran 2. Alur penelitian

Ekstrak n – heksana

Ekstrak etil asetat

Ekstrak metanol

Fraksinasi dengan

kromatografi kolom

Uji aktivitas antibakteri menggunakan metode disc diffusion

Ekstrak aktif antibakteri

Skrining fitokimia Pengukuran kadar air

Penentuan nilai KHM dengan

metode mikrodilusi

Pembuatan ekstrak daun menggunakan metode maserasi

bertingkat dengan pelarut n – heksana, etil asetat, dan

metanol

Uji aktivitas antibakteri dengan bioautografi

Fraksi aktif antibakteri

Pembuatan simplisia

Analisa komponen fraksi aktif

antibakteri menggunakan GC-MS

Pengukuran kadar air

66


Maserasi dengan n – heksana

Difiltrasi

Dievaporasi

Disortasi

Dicuci

Dikeringkan

Dihaluskan

Maserasi dengan etil asetat

Difiltrasi

Dievaporasi

Maserasi dengan metanol

Difiltrasi

Dievaporasi

Lampiran 3. Bagan Kerja Ekstraksi Simplisia Daun Cinnamomum sintoc

Uji antibakteri dengan

difusi cakram


difusi cakram


difusi cakram

Daun Cinnamomum sintoc

Serbuk kering daun Cinnamomum

sintoc

Ekstrak n - heksanana Ampas

Ekstrak etil asetat Ampas

Ekstrak metanol Ampas

67


Lampiran 4. Penghitungan Rendemen Ekstrak

Ekstrak n – heksana


x 100 %


x 100 %


Ekstrak etil asetat


x 100 %


x 100 %


Ekstrak Metanol


x 100 %


x 100 %


68


Lampiran 5. Profil KLT Ekstrak Aktif Antibakteri (Ekstrak Metanol dan Ekstrak

Etil Asetat)

Keterangan :

M = Ekstrak metanol

Ea = Ekstrak etil asetat

Ekstrak Fasa gerak Jumlah

spot/ noda

Gam

bar

(a)

Metanol Kloroform : metanol (9 : 1) 5

Etil asetat Kloroform : metanol (9 : 1) 5

Gam

bar

(b)

Metanol n – heksana : etil setat (4 : 6) 4

Etil asetat n – heksana : etil setat (4 : 6) 4

M Ea

K : Ea (9 :1)

M Ea

(a) (b)

69


Lampiran 6. Penghitungan Kadar Air Simplisia dan Ekstrak Etil Asetat

Kadar air simplisia (%)

=

x 100%

=

x 100%

= 6,754%

Kadar air ekstrak etil asetat (%)

=

x 100%

=

x 100%

= 8,231%

70

Disetarakan

kekeruhannya

dengan larutan

0,5 Mc. Farland

Larutan 0,5 Mc.

Farland setara

dengan 108 CFU/

ml

Lampiran 7. Skema Pembuatan Suspensi Bakteri Uji

Diinkubasi

Kultur bakteri uji

dalam NA miring

diambil 1 ose

10 ml NB steril Suspensi bakteri

71

Dilarutkan dalam 15% DMSO

(7,5 ml) di add dengan

aquadest sampai volume 50 ml

Dilarutkan dengan ultrasonic

homogenizer

Diteteskan sebanyak 25 µl

pada kertas cakram yang telah

disterilisasi

Lampiran 8. Bagan Kerja Uji Aktivitas Antibakteri Ekstrak n – Heksana, Etil

asetat dan Metanol dengan Metode Disc Diffusion

2,5 g ekstrak

kental n – heksana

daun C. sintoc

2,5 g ekstrak

kental etil asetat

daun C. sintoc

2,5 g ekstrak

kental metanol

daun C. sintoc

Larutan ekstrak n

– heksana daun C.

sintoc konsentrasi

50 mg/ml

Larutan ekstrak

etil asetat daun C.

sintoc konsentrasi

50 mg/ml

Larutan ekstrak

metanol daun C.

sintoc konsentrasi

50 mg/ml

Diletakkan kertas

cakram pada NA

yang telah

diinokulasikan

bakteri

Diinkubasi selama

20 jam pada suhu

37oC

Adanya zona bening disekitar cakram

menunjukkan aktivitas antibakteri (+)

72

Difraksinasi menggunakan

kromatografi kolom

Fasa diam: silika gel sebanyak

100 g

Fase gerak: n – heksana : etil

asetat dengan sistem gradien

Lampiran 9. Bagan Kerja Fraksinasi dengan Kromatografi Kolom

Ekstrak etil asetat daun C. sintoc

sebanyak 10 g

F.1

(1-14)

1,53 g

F.2

(16-23)

1,74 g

F.3

(24-29)

0,96 g

F.4

(30-37)

1,05 g

F.5

(38-40)

0,098 g

F.6

(41-64)

0,68 g

F.7

(65-85)

0,78 g

F.8

(86-92)

0,11 g

F.9

(93-103)

0,087 g

F.10

(104-125)

0,107 g

Diuji aktivitas antibakteri

menggunakan metode

bioautografi

73

Lampiran 10. Profil KLT Eluat Hasil Fraksinasi dari Ekstrak Etil Asetat dengan

Kromatografi Kolom

No. Eluat Fasa gerak

Jumlah Spot


Jumlah Spot

Gam

bar

(a)

3 n– heksana : etil aseat (8 : 2) -

Gam

bar

(b)

24 n– heksana : etil aseat (7 : 3) 5

6 n– heksana : etil aseat (8 : 2) - 27 n– heksana : etil aseat (7 : 3) 5

9 n– heksana : etil aseat (8 : 2) 1 30 n– heksana : etil aseat (7 : 3) 2





(a) (b) (c)

(d) (e) (f)

(g)

74

(lanjutan)


Jumlah Spot


Jumlah Spot

Gam

bar

(c)


Gam

bar

(d)








Gam

bar

(e)


Gam

bar

(f)








Gam

bar

(g) 114 n– heksana : etil aseat (4 : 6) 2





75

Lampiran 11. Profil KLT Fraksi Gabungan

Keterangan:

Fraksi Gabungan

dari eluat Fasa gerak

Jumlah

spot/ noda

1 No. 1 – 14 n – heksana : etil asetat (8 : 2) 3






6 No. 41 - 64 n – heksana : etil asetat (7 : 3) 5







N : Ea (8 : 2)

1 2 3

N : Ea (7 : 3)

3 4 5 6 8 9 10

N : Ea (4 : 6)

6 7 8

N : Ea (3 : 7)

76

Lampiran 12. Bagan Kerja Uji Aktivitas Antibakteri Fraksi 1 dari Ekstrak Etil

Asetat dengan Metode Bioautografi

10 fraksi dari

ekstrak etil asetat

hasil kromatografi

kolom

Plat KLT berukuran

6,5 cm x 7 cm Ditotolkan sebanyak 10 µl

ke plat KLT

Diletakkan pada cawan petri yang telah diletakkan kapas steril basah

Dicelupkan pada

cawan petri steril

yang berisi

suspensi bakteri uji

Inkubasi selama 20 jam pada suhu 37oC

Disemprotkan INT 2mg/ml pada permukaan plat

Terbentuk zona yang berwarna putih – krim

pada latar plat yang berwarna ungu atau merah

menandakan aktivitas antibakteri positif

Konsentrasi 50 mg/ml dalam

kloroform dan etil asetat

77

Lampiran 13. Skema Pengujian KHM Larutan Uji Fraksi 1 dari Ekstrak Etil

Asetat

Larutan Induk

(50000 µg/ml)

100 µl

100 µl

NB 2

100 µl

NB 1 100 µl

NB 1 100 µl

NB 1

100 µl

NB 1

100 µl

NB 1

100 µl

NB 1

100 µl

NB 1

100 µl 100 µl 100 µl 100 µl 100 µl 100 µl 100 µl

25000

µg/ml

12500

µg/ml

6250

µg/ml

3125

µg/ml

1562,5

µg/ml

781,25

µg/ml

390,66 µg/ml

195,31

µg/ml

25000

µg/ml

12500

µg/ml

6250

µg/ml

3125

µg/ml

1562,5

µg/ml

781,25

µg/ml

390,66 µg/ml

195,31

µg/ml

12500 µg/ml

6250 µg/ml

3125 µg/ml

156,25 µg/ml

781,25 µg/ml

390,625 µg/ml

195,3125

µg/ml

97,656 µg/ml

Suspensi bakteri

106 CFU/ ml

Dipipet 100 µl

78

Lampiran 14. Hasil Uji KHM Fraksi 1 dari Ekstrak Etil Asetat terhadap Bakteri

Pseudomonas aeruginosa

Sampel Uji Fraksi 1 Tetrasiklin

256 µg/ml

128 µg/ml

64 µg/ml

32 µg/ml

16 µg/ml

8 µg/ml

4 µg/ml

2 µg/ml

Sterility

Control

Growth

Control

Solvent

Control

DMSO 15%

12500 µg/ml

6250 µg/ml

3125 µg/ml

1562,5 µg/ml

781,25 µg/ml

390,62 µg/ml

195,31 µg/ml

97,66 µg/ml

79

Lampiran 15. Hasil GCMS Fraksi 1 dari Ekstrak Etil Asetat

80

Lampiran 16. Gambar Bahan – Bahan yang Digunakan

(a) (b) (c)

(d)

Keterangan :

(a) Kultur kerja bakteri Staphylococcus aureus ATCC 25923

(b) Kultur kerja bakteri Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853

(c) Ekstrak kental etil asetat daun C.sintoc

(d) Larutan uji: ekstrak n – heksana, etil asetat, dan metanol daun C.sintoc

yang telah dilarutkan dengan DMSO 15% (50 mg/ml)

81

Lampiran 17. Gambar Alat – Alat yang Digunakan

Rotary Evaporator

Ultrasonic Homogenizer

Shaker Incubator

Kolom Kromatografi

GCMS

UJI AKTIVITAS ANTIBAKTERI EKSTRAK DAN FRAKSI DAUN … · FRAKSI AKTIF DENGAN KROMATOGRAFI GAS -...

Documents

Transcript of UJI AKTIVITAS ANTIBAKTERI EKSTRAK DAN FRAKSI DAUN … · FRAKSI AKTIF DENGAN KROMATOGRAFI GAS -...