KROMATOGRAFI CAIR-CAIR

Cair-cair kromatografi adalah pemisahan kromatografi teknik di mana fase gerak

adalah cairan (biasanya pelarut atau campuran biner sederhana pelarut) dan fase diam juga

cair (yang harus larut dan tidak larut dalam cairan fase gerak). Fase diam cair didukung pada

beberapa bahan yang cocok seperti tanah diatom atau di bawah gel silika keadaan tertentu.

Sistem ini secara inheren tidak stabil, sebagai fase diam akan selalu memiliki beberapa

kelarutan dalam fase gerak dan, sebagai akibatnya, akhirnya akan dilucuti dari dukungan.

Sistem cair-cair pertama dilaporkan oleh AJP Martin yang menggunakan air didukung pada

silika gel sebagai fase diam dan n-heptana sebagai fase gerak. Untuk menghindari

ketidakstabilan cair-cair sistem, fase terikat dikembangkan yang secara ketat cair-padat

sistem, tetapi sebagai gugus terikat sangat besar, berperilaku sangat mirip dengan cair-cair

sistem. Sebagai isoterm serapan dari cair-cair sistem yang linier sampai dengan konsentrasi

zat terlarut yang relatif tinggi, beban yang relatif besar dapat diterapkan untuk cair-cair

kolom. Cair-cair sistem, dengan demikian, tidak umum digunakan dalam kromatografi cair

yang modern.

Fase diam merupakan cairan (lebih baru-baru ini bonded phase) yang dilapiskan pada

patana inert (bahan pendukung). Bahan terlarut ditambahkan ke dalam sistem yang

mengandung dua pelarut yang tidak dapat dicampur dan memenuhi keseimbangan

Konstanta Partisi dihubungkan pada rasio partisi k’ via volume tiap fase oleh persamaan

FASE GERAK UNTUK KROMATOGRAFI CAIR

Sifat-sifat berikut diperlukan untuk fase gerak dalam Kromatografi Cair.

A. Solven (pelarut) harus siap tersedia

B. Pelarut harus sesuai dengan detektor yang digunakkan. Denganmempertimbangkan :

- Deteksi Photometric – UV

- Deteksi Refractive Index –|ΔR| pelarut dan analit

- Ketidakmurnian yang memiliki extinction coeffisient tinggi, yaitu mengabsorbsidengat kuat.

C. Reaktivitas Pelarut. Pelarut sbaiknya tidak bereaksi dengan sampel ataupolymerisasi dengan fase

diam. Hal ini meniadakan aldehid, olefin dansenyawa sulphur (kecuali DMSO) ( misal pH kontrol

untuk kolom basa silikaantara 2-8)

D. Pelarut sebaiknya tidak terlalu kental. Viskositas tinggi (menimbulkantekanan

operasional) mengurangi efisiensi pemisahan. Tiik didih dapt menjadipetunjuk viskositas, senyawa

dengan titik didih yang rendah lebih kurangkental. Pelarut sebaiknya mendidih pada 200-500 diatas

temperatur pemisahane.

E. Untuk Kromatografi Cair Partisi dengan fase diam mekanik, fase gerak harustidak dapat dicampur

dengan fase diam.

F. Keamanan dalam penggunaan pelarut harus dipertimbagkan terutamakemungkinan timbulnya

pembakaran atau keracunan.

HPLC (HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY)

Hplc (high performance liquid chromatography) atau biasa juga disebut dengan

Kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) dikembangkan pada akhir tahun 1960-an dan awal

tahun 1970-an. Saat ini, HPLC merupakan teknik pemisahan yang diterima secara luas untuk

analisis bahan obat, baik dalam bulk atau dalam sediaan farmasetik. 

SISTEM PERALATAN HPLC

Instrumentasi HPLC pada dasarnya terdiri atas: wadah fase gerak, pompa, alat untuk

memasukkan sampel (tempat injeksi), kolom, detektor, wadah penampung buangan fase

gerak, dan suatu komputer atau integrator atau perekam. Diagram skematik sistem

kromatografi cair seperti ini :

1. Wadah Fase gerak dan Fase gerak

Wadah fase gerak harus bersih dan lembam (inert). Wadah pelarut kosong ataupun

labu laboratorium dapat digunakan sebagai wadah fase gerak. Wadah ini biasanya dapat

menampung fase gerak antara 1 sampai 2 liter pelarut(1). Fase gerak atau eluen biasanya

terdiri atas campuran pelarut yang dapat bercampur yang secara keseluruhan berperan dalam

daya elusi dan resolusi. Daya elusi dan resolusi ini ditentukan oleh polaritas keseluruhan

pelarut, polaritas fase diam, dan sifat komponen-komponen sampel. Untuk fase normal (fase

diam lebih polar daripada fase gerak), kemampuan elusi meningkat dengan meningkatnya

polaritas pelarut. Sementara untuk fase terbalik (fase diam kurang polar daripada fase gerak),

kemampuan elusi menurun dengan meningkatnya polaritas pelarut.

Fase gerak sebelum digunakan harus disaring terlebih dahulu untuk menghindari

partikel-partikel kecil ini. Selain itu, adanya gas dalam fase gerak juga harus dihilangkan,

sebab adanya gas akan berkumpul dengan komponen lain terutama di pompa dan detektor

sehingga akan mengacaukan analisis.

Elusi dapat dilakukan dengan cara isokratik (komposisi fase gerak tetap selama elusi)

atau dengan cara bergradien (komposisi fase gerak berubah-ubah selama elusi) yang analog

dengan pemrograman suhu pada kromatografi gas. Elusi bergradien digunakan untuk

meningkatkan resolusi campuran yang kompleks terutama jika sampel mempunyai kisaran

polaritas yang luas.4).

Fase gerak yang paling sering digunakan untuk pemisahan dengan fase terbalik adalah

campuran larutan bufer dengan metanol atau campuran air dengan asetonitril. Untuk

pemisahan dengan fase normal, fase gerak yang paling sering digunakan adalah campuran

pelarut-pelarut hidrokarbon dengan pelarut yang terklorisasi atau menggunakan pelarut-

pelarut jenis alkohol. Pemisahan dengan fase normal ini kurang umum dibanding dengan fase

terbalik.2)

2. Pompa

Pompa yang cocok digunakan untuk HPLC adalah pompa yang mempunyai syarat

sebagaimana syarat wadah pelarut yakni: pompa harus inert terhadap fase gerak. Bahan yang

umum dipakai untuk pompa adalah gelas, baja tahan karat, Teflon, dan batu nilam. Pompa

yang digunakan sebaiknya mampu memberikan tekanan sampai 5000 psi dan mampu

mengalirkan fase gerak dengan kecepatan alir 3 mL/menit. Untuk tujuan preparatif, pompa

yang digunakan harus mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan 20 mL/menit.

Tujuan penggunaan pompa atau sistem penghantaran fase gerak adalah untuk menjamin

proses penghantaran fase gerak berlangsung secara tepat, reprodusibel, konstan, dan bebas

dari gangguan. Ada 2 jenis pompa dalam HPLC yaitu: pompa dengan tekanan konstan, dan

pompa dengan aliran fase gerak yang konstan. Tipe pompa dengan aliran fase gerak yang

konstan sejauh ini lebih umum dibandingkan dengan tipe pompa dengan tekanan konstan.6)

3. Tempat penyuntikan sampel

Sampel-sampel cair dan larutan disuntikkan secara langsung ke dalam fase gerak yang

mengalir di bawah tekanan menuju kolom menggunakan alat penyuntik yang terbuat dari

tembaga tahan karat dan katup teflon yang dilengkapi dengan keluk sampel (sample loop)

internal atau eksternal.

Posisi pada saat memuat sampel                 Posisi pada saat menyuntik sampel

4. Kolom dan Fase diam

Ada 2 jenis kolom pada HPLC yaitu kolom konvensional dan kolom mikrobor.

Kolom merupakan bagian HPLC yang mana terdapat fase diam untuk berlangsungnya proses

pemisahan solut/analit.

Kolom mikrobor mempunyai 3 keuntungan yang utama dibanding dengan kolom

konvensional, yakni:

Konsumsi fase gerak kolom mikrobor hanya 80% atau lebih kecil dibanding dengan

kolom konvensional karena pada kolom mikrobor kecepatan alir fase gerak lebih

lambat (10 -100 μl/menit).

Adanya aliran fase gerak yang lebih lambat membuat kolom mikrobor lebih ideal jika

digabung dengan spektrometer massa.

Sensitivitas kolom mikrobor ditingkatkan karena solut lebih pekat, karenanya jenis

kolom ini sangat bermanfaat jika jumlah sampel terbatas misal sampel klinis.

Meskipun demikian, dalam prakteknya, kolom mikrobor ini tidak setahan kolom

konvensional dan kurang bermanfaat untuk analisis rutin.3]

Kebanyakan fase diam pada HPLC berupa silika yang dimodifikasi secara kimiawi, silika

yang tidak dimodifikasi, atau polimer-polimer stiren dan divinil benzen. Permukaan silika

adalah polar dan sedikit asam karena adanya residu gugus silanol (Si-OH).

Silika dapat dimodifikasi secara kimiawi dengan menggunakan reagen-reagen seperti

klorosilan. Reagen-reagen ini akan bereaksi dengan gugus silanol dan menggantinya dengan

gugus-gugus fungsional yang lain.

Oktadesil silika (ODS atau C18) merupakan fase diam yang paling banyak digunakan

karena mampu memisahkan senyawa-senyawa dengan kepolaran yang rendah, sedang,

maupun tinggi. Oktil atau rantai alkil yang lebih pendek lagi lebih sesuai untuk solut yang

polar. Silika-silika aminopropil dan sianopropil (nitril) lebih cocok sebagai pengganti silika

yang tidak dimodifikasi. Silika yang tidak dimodifikasi akan memberikan waktu retensi yang

bervariasi disebabkan karena adanya kandungan air yang digunakan. 

5. Detektor HPLC

Detektor pada HPLC dikelompokkan menjadi 2 golongan yaitu: detektor universal (yang

mampu mendeteksi zat secara umum, tidak bersifat spesifik, dan tidak bersifat selektif)

seperti detektor indeks bias dan detektor spektrometri massa; dan golongan detektor yang

spesifik yang hanya akan mendeteksi analit secara spesifik dan selektif, seperti detektor UV-

Vis, detektor fluoresensi, dan elektrokimia.

Idealnya, suatu detektor harus mempunyai karakteristik sebagai berikut:

1. Mempunyai respon terhadap solut yang cepat dan reprodusibel.

2. Mempunyai sensitifitas yang tinggi, yakni mampu mendeteksi solut pada kadar yang

sangat kecil.

3. Stabil dalam pengopersiannya.

4. Mempunyai sel volume yang kecil sehingga mampu meminimalkan pelebaran pita.

5. Signal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi solut pada kisaran yang

luas (kisaran dinamis linier).

6. Tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak.2)

Beberapa detektor yang paling sering digunakan pada HPLC dengan karakteristik detektor

seperti berikut :

Detektor Sensitifitas

(g/ml)

Kisaran

linier

Karakteristik

Absorbansi Uv-

vis

Fotometer filter

Spektrofotomete

r

spektrometer

photo-diode

array

5 x 10-10

5 x 10-10

> 2 x 10-10

104

105

105

Sensitivitas bagus, paling

sering digunakan, selektif

terhadap gugus-gugus dan

struktur-struktur yang

tidak jenuh.

Fluoresensi 10-12 104 Sensitifitas sangat bagus,

selektif, Tidak peka

terhadap perubahan suhu

dan kecepatan alir fase

gerak.

Indeks bias 5 x 10-7 104 Hampir bersifat universal

akan tetapi sensitivitasnya

sedang. Sangat sensitif

terhadap suhu, dan tidak

dapat digunakan pada

elusi bergradien

Elektrokimia

Konduktimetri

Amperometri

10-8

10-12

104

105

Peka terhadap perubahan

suhu dan kecepatan alir

fase gerak, tidak dapat

digunakan pada elusi

bergradien. Hanya

mendeteksi solut-solut

ionik. Sensitifitas sangat

bagus, selektif tetapi

timbul masalah dengan

adanya kontaminasi

elektroda.