Kromatografi Cair Kinerja Tinggi 2014

2014/4/16

1

KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI

LO Bahan Kajian

Setelah menyelesaikan topik ini mahasiswa mampu menjelaskan dan menerapkan pemisahan dengan kromatografi cair kinerja tinggi beserta instrumentasi utamanya.

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

Definisi dan Sejarah 1

Instrumentasi 2

Kromatografi Partisi Kinerja Tinggi 3

Kromatografi Adsorpsi Kinerja Tinggi 4

Kromatografi Penukar Ion 5

Kromatografi Filtrasi 4

Perbandingan KCKT dan KG 5

Buku Acuan

Skoog DA, West DM, Holler FJ, Crouch SR. 2004. Fundamental of Analytical Chemistry. Ed. Ke-8. Belmont: Brook/Cole-Thomson Learning

2014/4/16

2

Varian HPLC System

9010 Solvent

Delivery System

9050 Variable UV/Vis Detector

HPLC Solvent

Reservoirs

HPLC Column

Rheodyne

Injector

9060 Polychrom

(Diode Array) Detector

Computer

Workstation

Keep an eye on

these 4 screens!

Varian Solvent Delivery System

Varian 9010 Solvent Delivery System

Rheodyne

Injector

%A %B %C Flow Rate Pressure

{H2O} {MeOH} (mL/min) (atmos.)

Ready

Ternary Pump

A

C

B

from solvent

reservoir

Colu

mn

to

detector

to column

through

pulse

dampener

to injector

through pump

load

inject

Definisi dan Sejarah

Kromatografi: teknik analitik Kromatograf: instrumen

Kromatogram: gambar/hasil Kromatografer: orang

2014/4/16

3


Fase gerak

Gas cairan Padatan

Fase

diam

Gas

Cairan

Padatan

Gas

chromatography

Liquid

chromatography


Kromatografi cair: dapat menganalisis berbagai senyawa yang dapat larut dalam fase gerak: analat nonvolatil hingga yang mudah terdekomposisi

Tipe mekanisme pemisahan Partisi: kromatografi cair-cair Adsorpsi: kromatografi cair-padat Penukar ion Size exclusion Afinitas kiral

Definisi dan Sejarah Definisi dan Sejarah

Kolom gelas dengan diameter dalam 10-50 mm dengan panjang 50 500cm, ukuran partikel fase diam 150 - 200m laju alir 1/10 ml/min.

Perlu tekanan untuk meningkatkan tekanan laju alir dengan meningkatkan tinggi pelat dan menurunkan efisiensi kolom.

Perkembangan teori LC: peningkatan tinggi pelat dapat diturunkan dengan menurunkan ukuran partikel 1960: ukuran partikel makin kecil memerlukan pompa untuk menambah tekanan

2014/4/16

4

H

P igh

erformance

L iquid

C hromatography

H

P igh

ressure

L iquid

C hromatography


Kelebihan KCKT

Pemisahan pemisahan tinggi, memungkinkan analisis batch beberapa komponen

Reproduksibilitas tinggi

Sensitivitas tinggi

Kondisi analisis umum (KG perlu diuapkan)

Memerlukan jumlah sampel yang sedikit

Mudah preparasi pemisahan dan pemurnian sampel

Instrumentasi Reservoar fase gerak dan sistem penanganan pelarut

Sistem pompa Sistem injeksi sampel

Kolom untuk KCKT detektor

Pompa

injektor

kolom

oven (thermostatic column

chamber)

Detektor

Eluen

(fase gerak)

buangan

Data processor Degasser

2014/4/16

5

Reservoar fase gerak dan sistem penanganan pelarut

Biasanya dilengkapi dengan instrumen penghilang gas terlarut dalam fase gerak spt sistem pompa vakum, penyaringan vakum, distilasi, pemanasan, pengadukan, sonikasi atau pemercikan/sparging (gas didorong oleh gas lembam yang solubilitasnya rendah spt He)

Gas mampu membentuk gelembung pada kolom, menyebabkan pelebaran pita, dan mengganggu kinerja detektor

Perlu dihilangkan debu karena mengganggu deteksi, menyumbat kolom, dan merusak sistem pompa (penyaringan milipore dengan vakum)


Cara menghilangkan gas pada fase gerak

Sonikasi

Memberikan tekanan parsial saat agitasi

Diberi gas helium

In-line degasser


Online degasser

Gas-liquid separation membrane method Helium purge method

Helium

cylinder

To draft

To pump

Eluent container

Regulator

Drain valve

To pump

Eluent container

Polymeric film tube Vacuum chamber


Elusi Isokratik & Elusi gradien

Long analysis time!!

Poor

separation!!

CH3OH / H2O = 6 / 4

CH3OH / H2O = 8 / 2

(Column: ODS type)

2014/4/16

6


Elusi Isokratik & Elusi gradien

95%

30%

Co

nce

ntr

atio

n o

f m

eth

ano

l in

elu

ent

KCKT

Sistem Pompa

Syarat:

Tekanan yang dihasilkan tinggi, bebas pula

Pengaturan laju alir lebar 0.1-10 mL/min dan tepat

Kontrol laju alir dan keterulangan laju alir baik

Komponen instrumen tahan korosi

Mudah untuk pergantian pelarut

Sistem Pompa

Pompa piston timbal balik

Pompa pergeseran

Pompa pneumatik

Seluruh pompa dikontrol oleh komputer dalam pengoperasiannya

2014/4/16

7

Sistem Pompa

Pompa timbal balik Eluen dipompa dengan gerakan timbal balik (maju mundur)

oleh piston Tekanan yang dihasilkan tinggi, dapat digunakan untuk elusi

gradien, laju alir yang dihasilkan konstan dan bebas dari viskositas eluen dan tekanan balik kolom

Menghasilkan tekanan yang memiliki pulsa

Sistem Pompa

Pompa pergeseran Menyerupai syringe

besar yang terdiri atas bejana dan alat penyedot,

menghasilkan aliran yang bebas dari viskositas eluen

Bebas pulsa Terbatas pada

kapasitas fase gerak

Sistem Pompa

Pompa pneumatik Eluen dalam kontainer

didorong oleh tekanan gas/udara

Bebas dari pengaruh viskositas eluen dan tekanan balik kolom

Tidak dapat digunakan untuk elusi gradien dan tekanan yang dihasilkan kurang dari 2000 psi

KCKT

2014/4/16

8

Sistem Injeksi

Tempat memasukkan sampel ke kolom

Sistem injeksi dengan menggunakan simpal pencuplikan (sampling loop) lebih banyak digunakan

KCKT

Kolom untuk KCKT

Bentuk: koil, kolom biasa, kolom gabungan (coupling column)

Jenis: kolom kemas (packed column), kapiler, preparatif

Kolom penjaga: kolom untuk menyingkirkan kontaminan dalam eluen dan

matriks sampel yang teikat tidak reversible pada kolom, memperpanjang umur kolom pemisahan

Termostat kolom: menjaga suhu operasi kolom

Kolom untuk KCKT

Terbuat dari baja, stainless stell atau teflon

Panjang: 10-30 cm Diameter dalam 4-40mm atau 1-

4.6mm Partikel fase diam 5-10m

2014/4/16

9

Pemanas kolom

Untuk mengoptimumkan pemisahan

Perubahan suhu waktu retensi berubah, selektivitas kolom berubah

Menghitung efisiensi kolom

Lebar puncak pada setengah tinggi digunakan untuk menghitung efisiensi kolom

N = 5.54 (T/W)2; N: pelat teoritis, W: lebar pada setengah tinggi, T: waktu retensi, 5.54: konstanta berdasarkan pada distribusi normal

tr

Faktor lain

Ingat kembali: faktor retensi, resolusi, selektivitas

Tailing factor: Tf: lewar puncak/ 2 (lebar setengah puncak) Tf>1.5 terjadi interaksi yang tidak diinginkan

Front width

Peak width

5% height

Faktor lain

Faktor asimetri (As)

10% height

Back half width

AS = ----------------------

Front half width

2014/4/16

10

KCKT

Detektor

Dasar sifat yang digunakan untuk deteksi Sifat limbak (bulk property):

Membandingkan perubahan keseluruhan sifat fisis fase gerak dengan dan tanpa zat yang dielusi

Relatif kurang sensitif Memerlukan kontrol suhu yang baik Contoh

Detektor indeks refraksi (refractive index detector, RID)

Sifat solut (solute property) Berdasar sifat fisik yang terlarut yang tidak ditunjukkan oleh fase

gerak 1000 kali lebih sensitif dari pada detektor sifat limbak Mendeteksi dalam jumlah ng Contoh

Detektor UV-Vis

Detektor

Detektor

Detektor fluoresens Radiasi datang fluoresens lurus/90o

Untuk analisis senyawa polinuklir, steroid, pigmen tumbuhan, vitamin, alkaloid, dsb

Detektor elektrokimia Karakteristik voltametri molekul dalam fase gerak polar pada

permukaan elektroda Untuk analisis senyawa amino aromatik, asam askorbat, asam

urat, sistein, dsb

Detektor fotometri Absorpsi UV-Vis: UV 254/280nm, sensitivitas tinggi (ng), tidak

sensitif terhadap perubahan suhu, laju alir, komposisi fase gerak Untuk analisis senyawa kimia/biologis yang aromatik, senyawa

mengandung karbonil, tiokarbonil, nitroso, dan azo

2014/4/16

11

Detektor

Detektor UV

Paling umum digunakan

Sistem sederhana

Baik untuk elusi gradien

Tingkat derat 1% dari skala penuh

Detektor

Detektor

Detektor indeks refraktif

Merespon hampir semua pelarut

Memerlukan peredaman pulsa pada sistem pompa: pulse dampers untuk sistem elusi gradien

Limit deteksi 1000x lebih rendah dari UV

Sensitif terhadap perubahan suhu

Tidak berguna untuk analisis renik

Kisaran linear rendah

Detektor

Diode array detektor

Merekam spektrum tiap solut yang melewatinya

2014/4/16

12

Kromatografi Partisi Kinerja Tinggi

Pengemasan fase pengikat Pengemasan fase normal dan fase terbalik

Pemilihan fase diam dan fase gerak Aplikasi

Kromatografi Partisi

Berdasarkan permukaan silika yang telah dimodifikasi

Fase terikat C18 lebih melarutkan dibandingkan mengadsorpsi spesies analat, sehingga partisi terjadi antara 2 fase cairan

Fase diam: cairan (disangga dengan pengisi kolom)

Fase gerak: cairan Sistem: Fase normal dan fase

terbalik


Terdiri atas

Kromatografi cair-cair: cairan pada fase diam terikat secara adsorpsi fisik

Kromatografi cair-fase terikat: cairan pada fase diam terikat dengan ikatan kimia

Pengemasan Fase Pengikat

Sebagian besar pengikatan fase terikat dilakukan dengan reaksi organoklorosilan dengan gugus OH pada permukaan silika oleh hidrolisis dalam panas

R: rantai lurus oktil atau oktildesil Gugus fungsi lain yang telah diikat pada

permukaan silika termasuk amina alifatik, ester, nitril dan hidrokarbon aromatik perbedaan kepolaran fase diam

2014/4/16

13

Chromatography Stationary Phases

relatively polar surface

O O O

| | |

OSiOSiOSiOH | | |

O O O

| | |

OSiOSiOSiOH | | |

O O O

bulk (SiO2)x surface

relatively nonpolar surface

Silica Gel

O O O

| | |

OSiOSiOSiOR | | |

O O O

| | |

OSiOSiOSiOR | | |

O O O

bulk (SiO2)x surface

Derivatized Silica Gel

Where R = C18H37 hydrocarbon chain

(octadecylsilyl deriv.

silica or C18)

normal phase reversed phase

Proteksi dari hidrolisis

Fase terikat lebih stabil dibandingkan ikatan fisik pada fase diam.

Pengikatan secara fisik secara bertahap akan larut oleh fase gerak

Elusi gradien tdk cocok untuk kromatografi cair-cair karena akan kehilangan kelarutannya oleh fase gerak

Fase diam terikat terbatas pada kapasitas sampel

Pengemasan Fase Normal dan Fase Terbalik

Fase normal: fase diam: polar; fase gerak: nonpolar

Sblmnya KCKT menggunakan silika yang belum dimodifikasi (sangat polar) sehingga menuntut fase gerak yang nonpolar untuk pemisahan

Fase terbaik: fase diam: nonpolar; fase gerak: polar

KCKT saat ini menggunakan silika C18 yang dimodifikasi permukaannya sehingga dapat menggunakan fase gerak yang polar

2014/4/16

14

Fase normal dan fase terbalik

Fase diam - NON POLAR

Fase gerak - POLAR

-

+

-

- + +

Fase diam - POLAR

Fase gerak -NON POLAR

+ - + - + - + - + - + - + - +

- + - + - + - + - + - + - + - +

Fase normal dan fase terbalik

Kromatografi pasangan ion bagian dari fase terbalik (spesies yang mudah terionisasi

dipisahkan pada kolom fase terbalik) Garam organik seperti amonium kuarterner atau alkil sulfonat

ditambahkan pada fase diam sebagai reagen pasangan ion. Postulat 1: ion counter membentuk pasangan ion tak

bermuatan dengan ion zat terlarut pada muatan berlawanan di fase gerak, pasangan ion terpartisi ke fase diam nonpolar memberikan retensi yang berbeda

Postulat 2: ion counter tertahan dengan kuat pada fase diam yang netral dan menyebabkan muatan pada fase diam. Pemisahan karena muatan berlawanan yang terbentuk oleh pembentukan kompleks pasangan ion yang reversible, paling kuat tertahan membentuk kompleks yang kuat dengan fase diam


1. niasinamida, 2. piridoksine, 3. riboflavin, 4. thiamin

Pemilihan Fase Diam dan Fase Gerak

Keseimbangan gaya intermolekular antara sampel, fase gerak, dan fase diam sangat diperlukan

Polaritas gugus fungsi senyawa organik secara umum: hidrokarbon alifatik < olefin < hidrokarbon aromatik < halida < sulfida < eter < senyawa nitro < ester aldehida keton < alkohol amina < sulfone < sulfoksida < amida < asam karboksilat < air

Umum: mencocokkan polaritas analat ke fase diam, fase gerak ditentukan berdasarkan perbedaan polaritas yang digunakan

Jika sebaliknya: waktu retensi terlalu pendek secara praktek

2014/4/16

15

Pemilihan Fase Diam dan Fase Gerak

Aplikasi kromatografi fase terikat

Aplikasi

Bidang Analat yang dipisahkan

Farmaseutika Antibiotik, sedatif, steroid, analgesik

Biokimia Asam amino, protein, karbohidrat, lipid

Produk makanan Pemanis buatan, antioksidan, aflatoksin, bahan tambahan makanan

Industri kimia Aromatik terkondensasi, surfaktan, pewarna

Polutan Pestisida, herbisida, fenol, PCB

Kimia forensik Obat, racun, alkohol dalam darah, narkotik

Kimia medisinal Asam empedu, obat metabolisme, ekstrak urin, estrogen

Aplikasi

Aplikasi

2014/4/16

16

Aplikasi

Kromatografi adsorpsi kinerja tinggi

Fase gerak dan fase diam

Aplikasi

KCKT Adsorpsi

Berdasarkan permukaan silika yang belum dimodifikasi yang bersifat sangat polar

Zat terlarut akan teradsorbsi di permukaan ini Analat teradsorpsi pada fase diam padat,

bersaing dengan molekul fase gerak Fase diam: silika dan alumina (tidak selalu) Fase gerak: komposisi beragam Kemampuan yang khas: memisahkan campuran

isomer misalnya turunan benzena tersubstitusi meta dan para

Fase Gerak dan Fase Diam

Silika lebih sering digunakan sebagai fase diam karena kapasitas sampel yang tinggi dan kisaran penggunaan yang lebar

Waktu retensi akan lebih besar jika polaritas sampel meningkat

Yang mempengaruhi koefisien distribusi analat adalah komposisi fase gerak

2014/4/16

17

Aplikasi

KCKT cair-padatan banyak digunakan untuk pemisahan senyawa nonpolar, senyawa organik tak larut air dengan Mr kurang dari 5000.

Mampu memisahkan isomer seperti substittusi meta dan para pada turunan benzena

Aplikasi

Aplikasi

Kromatografi penukar ion

Kromatografi ion dengan suppersor

Kromatografi ion kolom tunggal

2014/4/16

18

KCKT Penukar Ion

Fase diam: penukar ion (polimer gugus fungsi counter ion)

Sampel: ion/dapat diionkan/ligan

Fase gerak: Variasi pH (bufer)

Variasi kekuatan ion C garam

Pengompleks (sitrat, EDTA) untuk kation logam

Mn+ + Xy-1 MX(n-m)

(kation/anion/netral) pH; Kf

KCKT Penukar Ion

Penukar Kuat SO3

-H+ penukar kation kuat CH2N

+(CH3)Cl- penukar anion kuat

Mengion sempurna kekuatan pertukaran pH kapasitas pertukaran pH

Penukar lemah COO-H+ penukar kation lemah CH2N(CH3)2 penukar anion lemah Pengionan tidak sempurna kapasitas pertukaran pH COO-H+ pH tinggi CH2N(CH3)2 pH rendah

Kapasitas pertukaran Jumlah gugus fungsi tersedia untuk pertukaran per satuan

massa atau volume penukar ion

Cation exchangers

Anion exchangers

SO3 COOH

N(R3) N(RR) NHR NH2

Weakly basic

Weakly acidic

Kromatografi Penukar Ion Sejak 1949

N(R3)

E- S-

eluent sample

Strongly acidic

Strongly basic

e.g., anions are retained by attraction force

Kromatografi Ion dengan Suppresor

E- S-

E- E-

E-

E-

E-

E-

E-

E- E-

E-

S-

E- E-

E- E-

E- E-

E-

E-

E-

E-

E-

Bagaimana menentukan sampel ion?

Konduktivitas merupakan sinyal umum untuk ion, tetapi eluen pada kromatografi ion juga merupakan ion.

Penghilangan konduktivitas eluen kunci untuk menentukan konduktivitas sampel

2014/4/16

19

Cation Anion

H+ 350 OH- 198

Li+ 39 F- 55

Na+ 50 Cl- 76

NH4+ 74 NO3

- 71

K+ 74 SO42- 80

Cs+ 77 I- 77

Ag+ 62 CH3COO- 41

Cu2+ 54

Konduktivitas ekuivalen () 25C

S cm2 mol-1 S cm2 mol-1

Pompa

Injektor

Kolom penukar ion

Suppressor

Detektor konduktivitas

Buangan

Eluen

Kromatografi Ion 1975 H. Small

Dionex

H+ Na2CO3 (Eluen)

NaNO3 (Analat)

H2CO3 (kecil)

HNO3 (besar)

Suppressor Packed column, ion-exchange hollow tube,

ion-exchange micromembrane, electrolytic

Kromatografi Anion

OH- HNO3 (Eluen)

NaNO3 (Analat)

H2O (kecil)

NaOH (besar)

Cation chromatography

TOSOH

Conditions Column: TSKgel SuperIC-AZ (4.6mmI.D.15cm Eluent: 1.9 mM NaHCO3 + 3.2 mM Na2CO3 Flow rate: 0.8mL/min Temp.40 Inj. volume30L Detection: CM

F-

Cl-

NO2-

NO3-

Br- PO4

3-

SO42-

2014/4/16

20

Kromatografi Ion dengan Kolom Tunggal

Instrumentasi kromatografi ion komersial tanpa suppressor telah tersedia.

Penukar ion dengan kapasitas rendah digunakan sebagai eluen dengan konsentrasi elektrolit rendah konduktivitas rendah

Keuntungan tidak memerlukan suppressor khusus

Sensitivitas rendah untuk menentukan anion

Aplikasi

Aplikasi

Aplikasi

2014/4/16

21

Kromatografi filtrasi

Kolom

aplikasi

Kolom

Terdiri atas silika yang kecil atau polimer yang tersusun secara seragam dan memungkinkan analat dan pelarut dapat berdifusi

Dalam pori fase diam, molekul secara efektif terjebak dan bergerak oleh aliran fase gerak

Molekul yang lebih besar dari ukuran pori2 tidak terjerap dan tidak memiliki retensi

Pemilihan metode pemisahan

2014/4/16

22

Pelebaran Pita pada KC

Efek kinetik pada transfer massa dari dan ke fase gerak ke dan dari fase diam

Transfer massa pada fase gerak:

Makin kecil diameter packing partikel, meningkatkan rasio luas permukaan/volume sehingga meningkatkan efek transfer massa pada fase gerak

Pelebaran Pita pada KC

Persamaan van Deemter

H= A + B/u + Cu

Dari 3 komponen tsb manakah yang paling berhubungan dengan H?

B/u: difusi biasanya pada cairan 100x lebih kecil daripada fase gas

Cu: dapat dieliminasi oleh proses dengan mengasumsikan bahwa efek transport massa adalah paling besar pada LC untuk efek H

Aplikasi Aplikasi

2014/4/16

23

Aplikasi Perbandingan KCKT dan KG

Sifat kedua metode Efisien, selektivitas tinggi, banyak aplikasinya Memerlukan jumlah sampel yang sedikit Mungkin nondestruktif Mudah diadaptasikan menjadi analisis kuantitatif

Keuntungan KCKT Dapat digunakan untuk senyawa non-volatil dan tidak tahan

terhadap panas Secara umum cocok untuk ion anorganik

Keuntungan KG Mudah dan peralatannya tidak terlalu mahal Cepat Resolus tidak unparaleled (dengan kolom kapiler) Mudah digabungkan dengan spektrometri massa

Latihan

Jelaskan senyawa seperti apa yang baik dipisahkan dengan metode kromatografi berikut Gas-cair Partisi cairan Pertukaran ion Adsorpsi cairan Permeasi gel Filtrasi gel Gas-padat

Apa yang dimaksud dengan Elusi isokratik Elusi gradien Pengemasan fase terbalik Pengemasan fase normal Kromatografi pasangan ion

Kromatografi ion Eluen kolom suppressor Filtrasi gel Permeasi gel

Tentukan urutan keluarnya senyawa berikut pada KCKT fase terbalik Benzena, dietil eter, n-heksana Aseton, diklorometana,

asetamida

Tentukan urutan keluarnya senyawa berikut pada KCKT fase normal Etil asetat, asam asetat,

dimetilamina Propilena, heksana, benzena,

diklorobenzena

Latihan

Jelaskan perbedaan mendasar antara kromatografi adsorpsi dan

partisi Kromatografi penukar ion

dan size-exclusion Filtrasi gel dan permeasi gel Kolom tunggal dan kolom

suppressor dalam kromatografi ion

Jelas senyawa apa yang dapat dipisahkan oleh KCKT tapi tidak dapat dipisahkan oleh KG

Jelaskan berbagai tipe

pompa pada KCKT, serta jelaskan kelemahan dan kelebihannya

Jelaskan detektor KG yang cocok untuk KCKT. Mengapa beberapa detektor tidak cocok digunakan pada KCKT

Detektor yang ideal untuk KG telah Anda ketahui, dari 8 ciri detektor KG yang ideal, ciri apakah yang diperlukan juga untuk KCKT? Apakah syarat tambahan detektor KCKT yang ideal

2014/4/16

24

Latihan

Meskipun suhu tidak terlalu penting dalam pemisahan dalam KCKT dibandingkan dalam KG, jelaskan bagaimana dan mengapa suhu dapat mempengaruhi pemisahan berikut: Kromatografi fase terbalik

pada pemisahan campuran steroid

Pemisahan isomer dalam kromatografi adsorpsi

Dua senyawa dalam pemisahan KCKT memiliki perbedaan waktu retensi sebesar 15 detik. Puncak

pertama keluar pada 9.0 menit, dan lebar puncak keduanya identik. Waktu mati sebesar 65 detik. Tentukan jumlah pelat teoritis yang diperlukan untuk mendapatkan nilai resolusi sebesar 0.5, 075, 0.9, 1.0, 1.1, 1.25, 1.5, 1.75, 2.0, dan 2.5. Bagaimana hasilnya perubah jika puncak kedua melebar dua kali dibandingkan puncak pertama

Hal 994 soal no 32-16 Hal 995 soal no 32-17 dan 18

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi 2014

Documents

Transcript of Kromatografi Cair Kinerja Tinggi 2014