KLON GEN PENISILIN ASILASE PADA COSMID pHC79

Linar Z. Udin* dan Hadi Sutedjo *** Puslitbang Kimia Terapan LIP!. Jalan SaJJikuriang, Bandung** Jurusan Kimia-ITB, Jalan Ganesha 10, Bandung

ABSTRAK

Penisilin asilase berperan mengkatalisishidrolisa benzilpenisilin menghasilkan

'3 asam 6-aminopenisilanat (6-AP A),senyawa yang merupakan bahan dasar pada

PCW:Ja1.ClD turunan penisilin.Telah dilakukan klon gen penisilindari D A kromosom Escherichia colipada vektor cosmid pHC79 untuk

_blbn aktifitas enzim tersebut. Klond:lIaklWlll melalui beberapa tahap, yakni isolasi

kromosoru, pemotongan molekul DNA~~m enzim restriksi, penyambungan molekuk

dengan enzim T4-DNA ligase,onnasi basil ligasi. dan seleksi selrman. Pengujian terhadap sel transforman

.!rInbal'\\'3 gen penisilin asilase dilakukan secaramikrobiologi menggunakan Serratia

escens sebagai bakteri penguji, sedangkanias penisilin asilase ditentukan berdasarkan

·ornfeld.Basil pengujian menggunakan S.

>='lFrP''U'Pn5 menunjukkan bahwa di an tara 2070yang ada. hanya 4 koloni yang

~resikan adanya penisilin asilase. Kekoloni ini ternyata mempunyai aktifitas

enzim ~ - 6 kali lebih tinggi dari aktifitasoenisilin asilase yang berasal dari E. coli B 130.

ABSTRACT

Penicillin acylase plays an important role incatalysis of benzylpenicillin hydrolytic

re.ac:tion.. prodeucing 6-aminopenicilanic acid (6-APA . a precursorfor the formation of penicillin

.arives.Cloning of the penicillin acylase gene ofrichia coli B130 chromosomal DNA on

L'9 cosmid vector to increase the enzymeity has been investigated. The cloning was

cooducted with several steps, including isolationthe chromosomal DNA. digestion byiction enzyme, ligation by T4-DNA ligase,ormation of the recombinant DNA, and

.tt Vol. 6, No. 1-2, Desember 1996

selection of the transformans. Microbial assayutilizing Serratia marcescens was carried out forscreening the penicillin acylase colony, whereasthe determination of the enzyme activity wasexamined based on Kornfeld method.

From 2070 colonies screened by S.marcescens, only 4 positive colonies wereobtained. The enzyme activity of these colonieswas 4-6 fold higher than the penicillin acylaseactivity from E. coli B 130.

PENDAHULUAN

Penisilin asilase merupakan enzim yangmengkatalisis reaksi hidrolisa benzilpenisilindengan menghasilkan produk berupa asam 6-aminopenisilanat (6-APA) (Gamabr I). Enzimini menjadi sangat pcnting karena 6-APA yangdihasilkan digunakan sebagai prekursor (bahandasar) untuk pembuatan antibiotik semisintetikturunan penisilin (1, 2, 3). Hingga saat inipenelitian yang berhubungan dengan penisilinasilase ditujukan untuk memperoleh kuantitasenzim yang sebanyak-banyaknya sertameningkatkan efisiensi katalitik enzim denganmaksud untuk mengoptimalkan pembentukan 6-APA.

Berbagai metoda telah dikembangkanuntuk maksud tersebut di atas (4, 5). Salah satumetoda yang sekarang ini banyak dikembangkanadalah teknik pembuatan DNA rekombinan (6.7). Motivasi dalam mengembangkan teknik DNArekombinan ini .di antaranya. adalah (a)perpindahan materi genetik dapat diikuti denganseksama secra terkontrol; (b) memungkinkandilakukannya pemindahan sifat secara selektif;(c) khusus dengan penggunaan vektor, gen dapatdiamplifikasi dan produk yang dihasilkandiharapkan akan dapat meningkat (8).

Penelitian-penelitian terdahulu yangberhubungan dengan teknik DNA rekombinan,pada umumnya menggunakan sumber gen dariDNA kromosom E. coli, disisipkan pada vektorplasmid (9, 10, 11).

69

(Q)-Cfu-':r:Dr02H

&nziffHInisiPn

Gambar 1. Hidrolisa benzil penisilin oleh penisilin asilase menghasilkan 6-AP A.

Pada penelitian ini dilakukan kloninggen penisilin asilase dari DNA kromosom E. coliB 130, disisipkan pada vektor cosmid.Penggunaan vektor cosmid dalam proses kloningadalah sangat menguntungkan karena ke dalamcosmid dapat disisipkan molekul DNA asingdengan ukuran yang reiatif panjang. Sehinggadalam klon rekombinan yang mengandungfragmen insersi yang panjang ini diharapkanbahwa semua bagian-bagian penting dalam suatugen dapat diperoleh secara lengkap dan utuh.Dengan demikian sel transforman yang

Tabel 1. Mikroorganisme dan cosmid yangdigunakan.

Strain dancosmid

Escherichiacou.ano

Escherichiacoli trnlOl

Serratiamarcescens

pHC79

70

SifatJ PustakaPenggunaan

membawa DNA rekombinan akan dapatmengekspresikan adanya penisilin asilase.

BAHAN DAN METODA

Mikroorganisme dan cosmid.

Sumber gen (4, 9, 10)penisilin asilaseSel inang DNA (16)rekombinanBakteri penguji (14)pada seleksisel transformanpembawa penisilinasilaseAmpisilin (16)resistanTetrasiklinresistanDNA vektor

Mikroorganisme dan comsid yangdigunakan dalam percobaan terlihat pada Tabel1.

Medium.

Medium peliharaan E. coli dan seltransforman terdiri dari (g/l) : bacto pepton 10,yeast extract 5, NaCl 5,bacto agar 18. Setelahsterilisasi, ke dalam medium ditambahkantetrasiklin dengan konsentrasi akhir 10 uglml.Medium pertumbuhan untuk membiakkan seltransforman dibuat berdasarkan formula mediumP (12). Sedang medium pertumbuhan untuk S.marcescens adalah sebagai berikut (g/l) : bactopepton 5, yeast extract 2, buffer KH2P04 50 roMpH 7,5.

JKTI Vol. 6, No. 1-2, Desember 1996

Sebelum dilakukan Iigasi, terlebih dahuludilakukan defosforilasi pada DNA cosmid yangsudah dipotong oleh enzim restriksi PstI, denganbantuan enzim BAP. Terbadap DNA kromosom,DNA cosmid basil pemotongan oleh Pstl danDNA basil ligasi, dilakukan uji elektroforesa.Sebagai pembanding digunakan DNA')... yangsudah dipotong oleh Hindlil.

Isolasi DNA kromosom.

Gen penisilin asilase diisolasi dari DNAkromosom E. coli B130 dengan cara seperti padaBagan 1 (\3).

Kultur E. coli B 13inkubasi 37oC, semalam

KIon dengan cosmid.

Panen (setelah 20 jam inkubasi)

ITahap pengetjaan pada pembuatan

DNA rekombinan dilakukan seperti pada Bagan2 (13).I

Endapan bakteri

ISupematan Kloning dengan cosmid

Lisis selditambah lysozimSDS

Vektor DNA kromosom

L Dipotong : Pstl JElektroforesa

Ekstraksidikocok dengankloroform : isoamilalkohol (24: 1)ditambah Na-asetat, etanoldililit pada batang pengaduk

Invitro packaging

ITransfeksi

ISeleksi

koloni : membawacosmidterinsersi

Ligasi

Transfonnasi

Elektroforesa

EndapanDNA Supematan

Ekstraksidikocok dengan fenol jenuhditambah Na-asetat, etanolSentrifuga 12000 rpm. 10 menit

EndapanDNA

Elekfroforesagel agarosa

Supematan Seleksikoloni : membawa

gen penisilinasilase

Uji aktivitas enzim

Bagan 1. Isolasi DNA kromosom. Bagan 2. Kloning dengan vektor cosmid.

JKTI Vol. 6, No. 1-2, Desember 1996 71

Transformasi.

Transformasi hasil ligasi ke dalam selinang dilakukan secara transfeksi setelah melaluiin vitro packaging.

Seleksi sel transforman.

(a). Seleksi sel transforman pembawa cosmidterinsersi : sel transforman ditanam dalammedium yang mengandung tetrasiklin. Sebagaipembanding dibuat kontrol positif dan kontrolnegatif. Untuk membedakan sel transforman,dilakukan penanaman ulang dalam medium yangmengandung tetrasiklin dan medium yangmengandung ampisilin.(b). Seleksi sel transforman penghasil penisilinasilase : dilakukan dengan cara shot-gun, yaitumelalui pengujian rnikrobiologis berdasarkanmetoda Meevotisom (14).

Uji aktifitas penisilin asilase.

Bakteri dibiakkan dalam medium Pselama 20 jam. Setelah 8 jam inkubasi, ke dalammedium ditambahkan induser. Sel dipanenmelalui sentrifugasi dan dipecah dengansonikator. Uji aktifitas enzim dilakukanberdasarkan metoda Kornfeld (15). Sistemlarutan yang terdiri dari 0,2% benzilpenisilin,buffer fosfat O,OIM pH 7,0 dan larutan enzimkasar, diinkubasi pada 370C selama 30 menit.Setelah penambahan reagen Erlich, serapanlarutan diukur pada 538 nm. Konsentrasi 6-APAdihitung berdasarkan kurva standar 6-APA.Kadar protein ditentukan berdasarkan metodaLowry. Aktifitas enzim dinyatakan sebagaibanyaknya 6-APA yang dihasilkan dari substratpada kondisi reaksi 37oC, pH 7,0 selama 30menit.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Analisa larutan DNA kromosom E. coliB130 hasil isolasi secara elektroforesa gelagarose menunjukkan adanya suatu pita tebalpada posisi relatif dekat dengan tempat pemuatan

72

sampel (Gambar 2). Setelah pengenceran 50 kalilarutan DNA kromosom mempunyai A260 =0,050 dan A280 = 0,027. Hasil ini memberikanratio A260/A280 = 1,85 dan konsentrasi DNAsebesar 130 ug/rnl. Hal ini menunjukkan bahwalarutan DNA yang diperoleh adalah cukupmumi.

Hal serupa juga dijumpai pada analisalarutan DNA cosmid hasil isolasi. Elektroforesagel agarose terhadap DNA cosmid tanpapemotongan dengan enzim restriksi memberikan2 pita DNA dengan karakteristik DNA plasmid(Gambar 2). Analisa spektroskopi DNA cosmidsetelah pengenceran 50 kali memberikan A260 =

0,1 dan A280 = 0,052, dengan ratio A260/A280= 1,92. Keadaan ini menunjukkan bahwa DNAcosmid pHC79 yang ada juga diperoleh dalamkeadaan murni. Konsentrasi DNA cosmid iniadalah 250 ug/rnl. Analisa restriksi terhadapDNA cosmid ini dengan enzim PstI memberikan1 pita DNA berukuran 6,0 kb (Gambar 2).

Untuk keperluan kloning dalampenelitian ini, DNA kromosom E. coli BPOdipotong secara parsial oleh enzim PstI.Pemotongan secara parsial dimaksudkan untuk ,memperoleh fragmen-fragmen DNA kromosomyang sesuai untuk kloning ke dalam cosmid. Darihasil interpolasi migrasi fragmen DNAkromosom terhadap logaritma pasang basa DNAlambda terlihat bahwa fragmen DNA kromosomhasil pemotongan berukuran antara 7-16 kb danberukuran lebih besar dari 23 kb (Gambar 2).

Defosforilasi yang dilakukan sebelumproses ligasi ditujukan untuk mencegahterjadinya ligasi intramolekul (self ligation)terutama antara DNA cosmid. Hal ini karenafragmen hasil pemotongan dengan enzimrestriksi akan mempunyai ujung-ujung 5'P dan3'OH yang akan membentuk kembali ikatanfosfodiester antara potongan-potongan DNAcosmid dengan adanya enzim ligase. Ikatanfosfodiester tersebut akan menurunkan efisiensiligasi antara DNA kromosom dengan DNAcosmid. Setelah defosforilasi, kedua ujungpotongan DNA cosmid mengandung gugus-gugus OH, maka tidak terjadi ligasi di antaracosmid.

JKTl Vol. 6, No.1-2, Desember 1996

elektroforesa gel agarose dari DNA kromosom, DNA cosmid, dan fragmen DNA hasilongan dengan enzim PstI. (1) Pita-pita DNA A, berukuran2,3; 9,4; 6,5; 4,3 2,3 dan 2,0

- D...A kromosom yang belum dipotong. (3) DNA kromosom yang dipotong oleh PstIgan waktu pemotongan 15 menit. (4) DNA kromosom hasil pemotongan oleh PstI setelah 30t - D A kromosom hasil pemotongan oleh PstI setelah 40 menit. (6) Cosmid yang belum

potong, ( Cosmid hasil pemotongan oleh Pstl.

Gambar ~- Hasil uji elektroIacesa gel agarose setelah ligasi antara DNA cosmid dengan DNA kromosom.1 Pita-pita DNA A, (2) DNA cosmid sebelum diligasi, (3) Hasil ligasi DNA cosmid-DNA

kromosom.

JK]] vot. 6, No. 1-2, Desember 1996 73

Dari hasil ligasi seperti yang terlihatpada Gambar 3, diketahui bahwa proses ligasiyang terjadi relatif sempuma. Hal ini terlihat daripita hasil elektroforesa yang hanya memberikanI pita DNA didekat tempat pemuatan sampeldengan ukuran lebih besar dari 23 kb.

Untuk mengetahui suatu sel transformanmembawa DNA cosmid terinsersi (DNA

rekombinan), sel ditumbuhkan dalam 2 macammedium yang masing-masing mengandungampisilin dan tetrasiklin. Koloni yang membawaDNA rekombinan diidentifikasi sebagai koloniyang tidak dapat tumbuh dalam medium yangmengandung ampisilin tetapi dapat tumbuhdalam medium yang mengandung tetrasiklin(Gambar 4).

Gambar 4. Hasil seleksi sel transforman yang membawa DNA cosmid terinsersi. Sel ditumbuhkan dalam 2macam medium LB masing-masing mengandung tetrasiklin dan ampisilin.

Gambar 5. Kontrol negatif dan positif dari sel transforman yang ditanam dalam medium LB. (A) kontrolnegatif : sel transforman ditumbuhkan dalam medium LB yang mengandung ampisilin, (B)kontrol positif: sel transforman ditumbuhkan dalam medium LB yang mengandung tetrasiklin .

74 JKTI Va/' 6, No,J-2, Desember J996

pHC79 dapat tumbuh baik pada medium yangmengandung baik tetrasiklin maupun ampisilin.Keadaan ini disebabkan sel inang dengan adanyacosmid menjadi tahan terhadap kedua antibiotiktersebut.

. Jumlah koloni transforman yan6 adapada pengenceran suspensi koloni 10 -10-2setelah penanaman dalam medium LB yangmengandung tetrasiklin adalah sebanyak 2070(Gambar 6).

seleksi bakteri penghasilyang dikembangkan oleh

merupakan teknik overlay yangdaya hambat 6-AP A terhadap

S. marcescens, yang ditandaiterbentuknya daerah bening disekitarDi antara semua koloni yang ada,

. -a ada 4 koloni yang memberikanterhadap S. marcescens

".•..•._ ..••••-, Adanya hambatan disekitar koloni. . menunjukkan bahwa sel transforman

~m~ mengekspresikan adanya penisilinSel tersebut dapat mengurai

I.:IeilZillpelru'sj'ili'[.n yang ada dalam medium menjadisehingga terjadi inhibisi terhadap

pe:I:lIDzOmalD s. marcescens. Selain itu, keempat. ~-ang mengekspresikan penisilin asilase

bahwa klon rekombinanmen~an(bm.g DNA insersi dengan bagian-bagian

g gen secara utuh. Artinya kemungkinanpromotor dan gen-gen utama lainnya yanggenda.l.ikan proses sintesis penisilin asilase

JK17 1'01, 6, No. 1-2, Desember 1996

ikut terinsersi, sehingga proses transkripsi dapatberlangsung yang menyebabkan dapatdiproduksinya penisilin asilase oleh seltransforman.

Pada ke empat koloni yang aktif secaramikrobiologi ini, setelah dilakukan uji aktifitasenzimnya menggunakan metoda Kornfeld yangberdasarkan pada pembentukan basa shift antara6-AP A dengan pDAB (paradimetilaminobenzal-dehid), menunjukkan bahwa aktifitas penisilinasilase sel transforman meningkat menjadisekitar 4-6 kali lebih tinggi (Gambar 8) dariaktifitas penisilin asilase yang berasal dari E.coli. Salah satu penyebab kemampuan seltrasnforman menghasilkan penisilin asilase lebihtinggi dari kemampuan E. coli adalah karenaDNA vektor yang membawa gen penisilin asilasedi dalam sel transforman direplikasi lebih banyakdibanding DNA kromososm. Dengan demikian,dalam sel transforman akan terkandung lebihdari satu DNA vektor yang membawa genpenisilin asilase. Sebaliknya, pada E. co liB 130,gen penisilin asilase hanya terdapat di dalam

75

57

6 SeS8 4 5

g,>~~

't:,i < ~UJ~~ 3 4 ~].., ,!I \0 3 :; •...l;:::- 2 ~~13 5' 2 ""0

"1< E 0..•.~S·0

0

5 239 246 1841 B130No, Koloni

mAktifitas ~Akt.spec

DNA krornosom, dan hanya direplikasi denganjalan pembelahan sel. Sehingga kuantitas enzim

yang dihasilkan juga akan lebih rendahdibanding produksi oleh sel transforman.

Gambar 7. Hasil seleksi sel transforman yang membawa gen penisilin asilase secara mikrobiologimenggunakan S. marcescens sebagai bakteri penguji. Koloni yang positif terhadap uji S.marcescens uu ditandai dengan adanya hambatan (zona bening) disekitar pertumbuhan S.marcescens.

Gambar 8. Aktivitas penisilin asilase ekstrak kasar sel E. coli B130 dan sel transforman.

Pemeriksaan terhadap ukuran DNAterinsersi hanya dilakukan terhadap koloni yangmemberikan uji positif dengan S. marcescens.Analisa restriksi dengan enzim PstI terhadaptransforman nO.1841 memberikan fragmen-fragmen berukuran 20: 9; 6; 4 dan 3 kb. Ukuranvektor cosmid pHC79 adalah 6,0 kb; jadi dapat

dihitung bahwa ukuran DNA insersi dalamtransforman adalah sekitar 36,0 kb. Analisaterhadap koloni yang sarna dengan enzim EcoRImemberikan fragmen-fragmen berukuran 20; 9;6; 5; dan 3 kb. Ukuran DNA insersi dalamtransforman adalah sekitar 37,0 kb.

76 JKTI Vol. 6, No. 1-2, Desember 1996

terima kasihmO(eialOlogi ITB clan

esempatan clanc::~l:s;tWlD pekerjaan ini serta

tersedia,

AKA

t:li:ctJ1Xf:La.h. -sis, Biotech. andIt

""."'010a_::;" 0.1. Yoo. Expression of.ase Gene from Bacillus

'u, T.E. Treffry, T.R. Lilley,Isolation of Penicillin Acylase

~~~"1c.'J ia coli by Aqueous Two-Phase

OL 6, • '0.1-2, Desember 1996

Partitioning, Biotech. and Bioeng., 40 : 517(1992).

4. P.B. Mahajan, Penicillin Acylase, Appl.Biochem. and Biotech., 9 : 537 (1984).

5. F. Valle, B. Paulina, M. Enrique, B.Francisco, The Role of Penicillin Amidase inNature and in Industry, TIBS, 16 : 36 (1991).

6. R. Meyer, 1. Collins, F. Wagner, Cloning ofthe Penicillin G Acylase Gene of E.. coliATCC 11105 on Multycopy Plasmid, EnzymeEng., 5 : 61 (1979).

7. 1.L. Garzia, 1.M. Buesa, J. Biotech., 3 : 187(1986).

8. 1.E. McCullough, Gene Cloning in BacilliRelated to Enhanced Penicillin AcylaseProduction, Biotech., 1 : 879 (1983).

9. R. Silaban, K10n Gen Penisilin Asilase padaBakteri E. coli, Tesis S2-ITB (1991).

10. E.Wonohadi, Kloning Gena Penisilin Asilasedan Seleksi Hasil Klon dengan berbagai cara,Tesis S2-ITB (1993).

11. A. Dahliaty, Subklon Fragmen Gen PengkodePenisilin Asilase pada Plasmid pBR322Ampisilin Sensitif, Tesis S2-ITB (1992).

12. L.Z. Udin, Klon Gen Penisilin Asilase padaCosmid pHC79, Tesis S2-ITB (1994).

l3. 1. Sambrook, E. F. Fritsch, T. Maniatis,Molecular Cloning; A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press, USA(1989).

14. V. Meevotisom, P. Somsuk, R. Prachatam,T.W. Flegel, Appl. Environ. Microbiol., 46, 5: 1227 (1983).

15.1. M. Kornfeld, A New Colorimetric Methodfor the Determination of 6-AminopenicilanicAcid, Anal. Biochem., 86 : 118 (1978).

16. -------, Biochemicals for Molecular Biology,Boehringer Mannheim Biochemica GMBH,1991.

77