KINETIKA ENZIM

2

Dasar Teori

Penting untuk :Memahami fungsi katalitikMemahami fenomena biologik,

pengaruh suhu, pH dll.Prosedur pemurnian enzim

3

• Perubahan konformasi

Sisi aktif beberapa enzim mengandung gugus fungsional residu asam amino (berpartisipasi dalam proses katalitik sebagai pemberi atau penerima proton)

• Gugus -SH dimiliki oleh sistein • Gugus imidazole oleh histidin

Faktor2 yang mempengaruhi aktivitas enzim1) Pengaruh Suhu

0 70

20

40

60

80

100

suhu

5

1)Pepsin pH optimum 1,6

2) Glukosa 6 fosfatase pH optimum 7,8

2) Pengaruh pH

3) Pengaruh jumlah substrat

7

Pengukuran aktivitas enzim:

Berdasar pada aktivitasnya.1 IU, micromol P/menit

Pada enzim tertentu :1 IU, perobahan kepekatan pada 340nm

sebesar 0,001 per menitKecepatan reaksi :

jumlah substrat yg diubah per satuan waktujumlah produk yg terbentuk per satuan waktu

8

Prosedur :1. Panaskan larutan 1% kasein dalam bufer fosfat pH 8.0 sebanyak

30,0 ml, selama 5 menit, pada 380C. 2. Tambahkan bufer fosfat dan larutan enzim dalam bufer fosfat

pH 8,0 sesuai daftar dan diaduk rata dan di inkubasikan (setelah penambahan enzim selama 20 menit.

3. Siapkan seperti pd tabel :

Pengaruh konsentrasi substrat terhadap aktivitas enzim tripsin

No. Tabung Substrat Buffer Enzim1 t = 0 + t=20 menit 2,0 ml 3,0 ml 2,0 ml2 t = 0 + t=20 menit 3,0 ml 2,0 ml 2,0 ml

3 t = 0 + t=20 menit 4,0 ml 1,0 ml 2,0 ml

4 t = 0 + t=20 menit 5,0 ml 0,0 ml 2,0 ml

9

4. Inkubasi pada suhu 380C selama 20 ‘ (T 20’)5. Tambah TCA 3 ml6. Campuran disentrifugasi 10’ (2000 rpm)7. Supernatan + 1 mL Follin Ciocalteu + 4 ml 0,5 NaOH. 8. Diamkan 10‘9. Bacaabsorbansinya pada 650 nm.T 0 : Penambahan TCA dan kasein dibalik : TCA ditambahkan

sebelum inkubasi & kasein ditambahkan setelah inkubasi

Tugas :1) Tentukan aktivitas enzim dengan rumus :

Absorbansi T20 – Absorbansi T 0Aktivitas Enzim (v) =

---------------------------------------------------Waktu inkubasi

Y B x A

Data untuk membuat persamaan LRSumbu x Sumbu y

Kadar kasein (mL)

Kadar (%) Aktivitas Enzim (V0)

2345

2) Buat LR, hitung Km & Vmaks

1[S]

vs 1V0

y B X A

Kadar kasein mL : dikonversi ke % dengan rumus V1. N1 = V2. N2

11

Persamaan Michaelis-Menten & Grafiknya

Grafik mula-mula : [S] vs V0

Kebalikannya :

1[S]

vs1

V0

12

Pengaruh Lama Waktu Inkubasi terhadap aktivitas enzim tripsin

H2N CH C

R

OH

O

C

O

H HN CH C

R

OH

OHOH2C

HOH2C

N CH C

R

OH

OHOH2C

HOH2CN CH C

R

ONa

OHOH2C

HOH2C

NaOH

>>> NaOH + fenolptalin larutan berwarna merah muda

asam amino formalin (Bis-hydroxymethyl-amino)-acetic acid

Protein + enzim kompleks protein-enzim asam amino

Dasar Metode :

• Asam amino bersifat zwiter ion, titrasi ditambahkan formalin untuk mengikat –NH2 (dihasilkan senyawa dimetiol) sehingga asam amino berkelakuan penuh sebagai asam dan dapat dititrasi secara alkalimetri.

Prosedur :Campuran t=0 t =15 t=30 t=45 t=60Gelatin 5% 5 ml 5 ml 5 ml 5 ml 5 ml

Tripsin 1% 2 ml 2 ml 2 ml 2 ml 2 ml

Inkubsi380C

0 menit 15 menit 30 menit 45 menit 60 menit

Tuang masing-2 kedalam erlenmayer + formol 15 ml aduk rata tambah 3 tt ind. pp.Titrasi dengan NaOH 0,02 N ad warna tepat pinkHitung kadar protein

13

(Vt – Vo) NaOH x 2, 8 % Nitrogen AA = ------------------------------- x 100% = .... mg/100 ml lar. gelatin

ml gelatin

• Hitung % nitrogen asam amino dengan rumus :

• Buat kurva hubungan lama waktu inkubas vs % nitrogen asam amino

15

Pengaruh temperatur :Makin tinggi temperaturMakin mudah rusak

Enzim lebih stabil padaTemperatur yang rendah

50

607040

80

0C

0C

0C

0C

0C

SP( )S

P( )

t0 t2

Suhu

t__S

8040 6050 7000 0 0 0

V Rata-rata

=t

__S

Pengaruh Suhu Inkubasi terhadap Aktivitas Enzim amilase

Prosedur

Campuran Vol ml Blangko (1)

Suhu 0C selama 20 menit35 40 45 50 60

Amilum 1% 2,0 ml Aqua 1.0ml

2,0 ml 2,0 ml 2,0 ml 2,0 ml 2,0 ml

Amilase 1,0 ml 1,0ml 1,0ml 1,0ml 1,0ml 1,0ml 1,0ml

Dapar 1,0 ml 1,0 ml 1,0ml 1,0ml 1,0ml 1,0ml 1,0ml

Tabung masukkan dalam air mendidih 10 menit

dinginkan dan tambah 1 ml pereaksi lar. CuSO4 alkalis dan arsenomolibdat @ 1 ml diaduk rata, tunggu 10 menitEncerkan sampai tepat dalam labu takar 10.0 ml

Baca absorbansinya pd λ 580 nm.

16

Absorbansi sampel – Absorbansi blanko

Aktivitas Enzim (v) = ---------------------------------------------------

Waktu inkubasi

Tugas :1) Tentukan aktivitas enzim dengan rumus :

2) Buat kurva hubungan suhu inkubasi vs aktivitas enzim