ISOLASI, SELEKSI DAN FERMENTASI PRODUKSI ASAM SITRAT DARI KAPANG PENGHASIL ASAM SITRAT

Oleh : Prima Agung P., SP., M.Si. – Widyaiswara PPP PTK Pertanian Cianjur

I PENDAHULUAN

Asam sitrat atau 2-hidroksi

propana-1,2,3-asam trikarboksilat (C6H8O7) adalah asam organik penting yang dihasilkan melalui proses fermentasi oleh mikroba. Asam sitrat disintesis sebagai hasil intermediet dalam siklus asam trikarboksilat (TCA) ketika karbohidrat dioksidasi menjadi karbondioksida (Ishaq et al., 2002). Asam sitrat banyak digunakan dalam industri makanan, minuman dan obat-obatan. Komposisi pengguanaan asam sitrat dalam industri adalah kurang lebih 60 % dari total produksi asam sitrat digunakan dalam industri makanan, 30 % digunakan dalam industri farmasi dan sisanya digunakan dalam industri kosmetika dan lainnya. Penggunaan asam sitrat dalam industri minuman adalah sebagai pemacu rasa, pengawet, pencegah rusaknya warna dan aroma, sebagai antioksidan, pengatur pH dan pemberi kesan rasa dingin. Penggunaan asam sitrat dalam industri makanan dan kembang gula adalah sebagai pemacu rasa, penginversi sukrosa, penghasil warna gelap dan pengkelat ion logam. Penggunaan asam sitrat dalam industri farmasi dan kosmetika adalah sebagai pelarut, pembangkit aroma dan antioksidan (Crueger & Crueger, 1984).

Asam sitrat secara alami terdapat dalam berbagai buah-buahan seperti lemon, jeruk, gooseberry, pear, daun-daun ara dan lain-lain. Asam sitrat pertama kali diisolasi dari jus lemon dan sejak itu diketahui sebagai substansi alami tanaman terutama dalam buah jeruk. Asam sitrat diperoleh dari buah-buahan diketahui sebagai asam sitrat alami jika dibandingkan dengan yang dihasilkan secara sintetis melalui fermentasi oleh mikroba (Rehman et al., 2003).

Ada banyak mikroba yang diketahui mampu menghasilkan asam sitrat termasuk kapang, khamir dan bakteri. Kapang Aspergillus niger pertama kali digunakan oleh Currie untuk menghasilkan asam sitrat pada medium pH rendah dengan kadar gula tinggi yang kemudian mikroba tersebut banyak dipilih untuk produksi asam sitrat secara komersial. Keuntungan utama penggunaan mikroba ini untuk produksi asam sitrat secara komersial antara lain : mudah dalam penanganannya, punya kemampuan untuk memfermentasi berbagai substrat yang murah dan mampu memberikan hasil asam sitrat yang tinggi. Kapang-kapang penghasil asam sitrat lainnya antara lain : Aspergillus wentii, A. carbonarious, A. aculateus, A. awomori, A. fonsecaus, A. luchuensis, A. saitoi, A. flavus, A. clavatus, A. fumaricus, A. phoenicus, Mucor viriformis dan Ustulina vulgaris. (Grewal dan Kalra, 1995; Crueger dan Crueger, 1984). Penelitian ini bertujuan untuk melakukan isolasi kapang penghasil asam sitrai dari berbagai sumber seperti buah-buahan busuk dan tanah lalu menseleksi isolat-isolat potensial yang akan digunakan sebagai isolat penghasil asam sitrat melalui proses fermentasi padat. II METODE PENELITIAN

2.1 Isolasi Kapang Penghasil

Asam Sitrat dari Sampel Tanah

Tanah sebanyak 1 gram disuspensikan dalam 9 ml larutan garam fisiologis. Larutan sampel dilakukan pengenceran secara serial sampai 10-5. Larutan sampel sebanyak 0,1 ml dari pengenceran 10-3 sampai 10-5 dikulturkan dengan metode cawan sebar pada medium agar cawan Prescott. Kultur mikroba

diinkubasi pada suhu 30o C selama 2-5 hari dan diamati pertumbuhan kapang dan pembentukan zona asam pada mediumnya. Koloni kapang yang membentuk zona asam dimurnikan pada medium yang sama dan isolat murninya disimpan dalam medium agar miring PDA. Genus kapang ditentukan berdasar mikroskopi morfologi struktur dari konidianya (gunakan teknik solatif transparan agar struktur konidia tidak rusak). 2.2 Isolasi Kapang Penghasil

Asam Sitrat dari Sampel Buah-buahan Busuk Menggunakan Metode Tanam Langsung

Sampel buah-buahan busuk dipotong-potong dengan ukuran 1 x 1 x 1 cm 3. Potongan-potongan tersebut diletakkan di atas medium agar cawan Prescott dan dinkubasi pada suhu 30o C selama 2-5 hari. Pertumbuhan kapang dan pembentukan zona asam pada medium diamati dan koloni yang membentuk zona asam dimurnikan pada medium yang sama. Isolat murninya disimpan dalam medium agar miring PDA. Genus kapang ditentukan berdasar mikroskopi morfologi struktur dari konidianya (gunakan teknik solatif transparan agar struktur konidia tidak rusak) 2.3 Isolasi Kapang Penghasil

Asam Sitrat dari Sampel Buah-buahan Busuk Menggunakan Metode Sebar

Sampel buah-buahan busuk

sebanyak 10 gram diblender dan dicampur dengan 90 ml larutan garam fisiologis. Larutan sampel diencerkan secara serial sampai 10-3 dan sebanyak 0,1 ml dari pengenceran 10-1 sampai 10-3

dikulturkan dengan metode cawan sebar pada medium agar cawan Prescott. Kultur diinkubasi pada suhu 30o C selama 2-5 hari

dan dimati pertumbuhan kapang dan pembentukan zona asam pada medium. Koloni kapang yang membentuk zona asam dimurnikan pada medium yang sama dan isolat murninya disimpan dalam medium agar miring PDA. Genus kapang ditentukan berdasar mikroskopi morfologi struktur dari konidianya (gunakan teknik solatif transparan agar struktur konidia tidak rusak). 2.4 Seleksi Isolat Kapang

Penghasil Asam Sitrat Berdasarkan Nilai Satuan Asam (Acid Unitage/AU)

Isolat uji diinokulasikan di tengah-tengah medium agar cawan Prescott+0,1 % KH2PO4 dan diinkubasi pada suhu 30o C selama 3 hari (72 jam). Diameter zona asam dan diameter koloni kapangnya diukur dan dihtung nilai AU-nya dengan rumus :

Isolat-isolat yang memiliki nilai AU relatif tiggi disimpan untuk percobaan selanjutnya dalam medium agar miring PDA. 2.5 Fermentasi Padat

Produksi Asam Sitrat Onggok tapioka basah (segar)

diperas sampai kadar airnya mencapai 65 %. Dedak halus dengan kadar sir sekitar 12 % disiapkan dan dicampur merata pada onggok tapioka dengan perbandingan 5 : 1. Campuran ditambah aquades sampai kadar air campuran onggok tapioka dan dedak mencapai 65 %. Campuran tersebut sebanyak 30 gram dimasukkan dalam labu erlenmeyer 250 ml & disterilkan. Medium tersebut diinokulasi dengan 1 ml suspensi konidia (7-8 x 105 konidia/ml) dari isolat terpilih secara merata. Kultur diinkubasi pada suhu kamar selama 4 hari dengan posisi erlenmeyer dimiringkan dan diduk secara merata hasil fermentasinya. Sampel sebanyak 10 gram dimasukkan dalam erlenmeyer 300 ml dan ditambah aquades sampai total volumenya 200 ml (20 x pengenceran). Campuran tersebut kemudian diaduk dan dipanaskan sampai mendidih. Larutan sampel

disaring dengan kertas saring Whatman No. 40 dan dinginkan pada suhu kamar. Filtrat larutan sampel sebanyak 10 ml dititrasi dengan larutan NaOH 0,1 N dan dihitung total asam sebagai asam sitrat monohidrat dengan rumus :

dimana : a = bobot bahan (mg), b = volume larutan NaOH 0,1 N (ml), c = Normalitas larutan NaOH (0,1 N), 210 = berat molekul asam sitrat monohidrat, 20 = pengenceran 20 kali, dan 3 = banyaknya ion H+ yang dapat dilepaskan oleh asam sitrat

2.6 Penentuan Kadar Asam Sitrat Secara Kuantitatif

Filtrat larutan sampel pada kegiatan di atas sebanyak 10 ml dimasukkan dalam labu ukur 50 ml dan ditambah aquades sampai tanda tera. Asam asetat glacial sebanyak 5 ml ditambahkan dalam tabung reaksi yang bersih, ditambah 1 ml larutan piridin dan diaduk dengan vortex. Contoh filtrat sebanyak 0,25 ml ditambahkan dan untuk blanko digunakan 0,25 ml aquades. Larutan diaduk secara merata dengan vortex. Absorbansinya diukur dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 420 nm (asam sitrat dan garam sitrat secara spesifik akan memberikan warna merah carmin (carmin red) bila dilarutkan dalam campuran piridin dan asam asetat). Kadar asam sitratnya ditentukan dari perbandingan menggunakan standar asam sitrat monohidrat (konsertrasi standar 0; 0,25; 0,5; 1,0; 1,5 mg/ml)

III HASIL PENELITIAN

Hasil isolasi kapang penghasil asam sitrat dari sampel buah-buahan busuk dan tanah terindentifikasi ada 6 species kapang yaitu : Aspergillus flavus, Aspergillus flavus, Penicillium sp., Chloribium sp., Neurospora sp. dan Panerochaeta sp. Warna koloni dan morfologi masing-masing species kapang secara lengkap dapat dilihat pada tampilan di Tabel 1.

Tabel1. Hasil Isolasi Kapang Penghasil Asam Sitrat dari Berbagai Sampel

Ket. : sampel buah yang lain hampir

sama teridentifikasi kapang genus Aspergillus dengan warna koloni hijau muda

Mikroskopi Morfologi Struktur Konidia

Aspergillus flavus

Mikroskopi Morfologi Struktur Konidia

Aspergillus niger

Seleksi isolat kapang berdasarkan nilai satuan asamnya tidak berhasil dilakukan karena gradasi warna zona asam dengan warna koloni yang terbentuk akibat pengaruh indikator brom cresol green (BCG) tidak terlihat dengan jelas. Hasil fermentasi padat produksi asam sitrat yang dilakukan hanya dapat menghitung total asam sitrat monohidrat menggunakan titrasi larutan NaOH 0.1 N (Tabel 2.). Sedangkan perhitungan kadar asam sitrat secara kuantitatifnya tidak berhasil dilakukan karena larutan sampel dan standarnya tidak menunjukkan perubahan warna setelah direaksikan dengan larutan asam asetat glasial dan piridin (warna tetap jernih dan hasil pengukuran transmitannya semua bernilai 100). Hal ini

menyebabkan nilai yield produksi asam sitratnya tidak dapat dihitung. Hasil total asam sitrat monohidrat pada Aspergillus flavus sebesar 4.76 % dengan waktu fermentasi selama 1 bulan dan pada Panerochaeta sp. sebesar 0.7 % dengan waktu fermentasi selama 4 hari Tabel 2. Hasil Fermentasi

Padat Produksi Asam

Ket. : * waktu fermentasinya selama 1

bulan dan ** waktu fermentasinya 4 hari

Hasil isolasi seleksi kapang penghasil asam sitrat dari sampel buah-buahan busuk dan tanah paling sering ditemui ternyata kapang dari genus Aspergillus yaitu ada 2 spesies (Aspergillus flavus dan Aspergillus niger). Hal ini sesuai dengan yang tercantum pada literatur bahwa golongan kapang yang potensial sebagai penghasil asam sitrat kebanyakan dari genus tersebut.

Seleksi isolat kapang berdasarkan nilai satuan asamnya tidak berhasil dilakukan karena gradasi warna zona asam dengan warna koloninya tidak jelas. Hal ini seharusnya diantisipasi dengan adanya suatu kontrol positif dengan penumbuhan isolat kapang yang memang sudah terindentifikasi menghasilkan asam sitrat pada media yang sama sehingga gradasi warna zona asam dan warna koloninya dapat mudah dibedakan. Tetapi dapat juga disebabkan memang isolat kapang yang ditumbuhkan memang hanya sedikit menghasilkan asam sitrat atau indikator warna yang digunakan kurang sensitif. Hal ini ditunjukkan setelah medium Prescott diuji dengan ditetesi asam sulfat 6 N baru menunjukkan perubahan warna yang jelas hasil reaksi indikatornya menjadi kuning.

Hasil nilai total asam monohidrat yang diperoleh baik pada Aspergillus flavus maupun Panerochaeta sp. sangat kecil apalagi proses fermentasi pada Aspergillus flavus membutuhkan waktu sampai 1 bulan baru dapat

menghasilkan asam sitrat. Hal ini menunjukkan isolat kapang yang dipakai pada fermentasi padat produksi asam sitratnya kurang kurang begitu potensial. Hal ini juga didukung dari hasil seleksi awal isolat kapang berdasarkan nilai satuan asamnya juga tidak memperlihatkan zona asam yang jelas pada koloninya. Sedangkan larutan sampel dan standarnya yang tidak menunjukkan perubahan warna setelah direaksikan dengan larutan asam asetat glasial dan piridin (warna tetap jernih dan hasil pengukuran transmitannya semua bernilai 100) dapat disebabkan larutan piridin yang digunakan kurang bagus. Hal ini ditunjukkan dengan tidak terbentuknya warna merah carmin ketika campuran piridin dan asam asetat glasial ditambah larutan asam sitrat monohidrat dan larutan sampel. Perhitungan kadar asam sitrat secara kuatitatif yang tidak berhasil ini menyebabkan perhitungan yield produksi asam sitratnya tidak dapat dihitung.

IV KESIMPULAN

Isolasi kapang penghasil asam sitrat dari sampel buah-buahan busuk dan tanah terindentifikasi ada 6 species kapang yaitu : Aspergillus flavus, Aspergillus flavus, Penicillium sp., Chloribium sp., Neurospora sp. dan Panerochaeta sp. Hasil total asam sitrat monohidrat hanya diperoleh pada Aspergillus flavus sebesar 4.76 % dengan waktu fermentasi selama 1 bulan dan pada Panerochaeta sp. sebesar 0.7 % dengan waktu fermentasi selama 4 hari. Seleksi isolat kapang berdasarkan nilai satuan asamnya dan perhitungan kadar asam sitrat secara kuantitatifnya tidak berhasil dilakukan.

DAFTAR PUSTAKA

Crueger, W. dan A. Crueger. 1984. Biotechnology : A Textbook of Industrial Microbiology. Sinauer Associates Inc. USA.

Grewal, H.S. dan K.L. Kalra. 1995. Fungal Production of Citric Acid. Biotechnol. Adv. 13 (2) : 209-234.

Ishaq, A., S. Ali, I. Haq dan M.A. Qadeer. 2002. Time Course Profile of Citric Acid Fermentation by Aspergillus niger and Its Kinetic Relations. J. Biol. Sci. 2 (11) : 760-761.

Rehman, A., S. Ali dan I. Haq. 2003. Phospate Limitation for Enhanced Citric Acid Fermentation Using Aspergillus niger Mutant Uv-M9 on Semi-pilot Scale. Pakistan J. Biol. Sci. 6 (14) : 1247-1249.