Isolasi PlasmidPrinsip dan TujuanSebelum melakukan tahap-tahap lanjutan dalam proses rekayasa genetika, peneliti harus mendapatkan materi genetik yang diinginkan melalui teknik isolasi. Isolasi dilakukan dengan tujuan untuk memperoleh DNA yang diinginkan dengan kualitas baik, yang dalam praktikum kali ini adalah DNA plasmid. Terdapat dua metode yang dapat digunakan dalam melakukan isolasi DNA plasmid, yaitu metode yang tertera pada kit yang digunakan dan metode alkalin lisis. Prinsip dalam melakukan isolasi plasmid adalah penghancuran dinding sel, lisis sel, pembersihan debris sel, dan presipitasi DNA. Prinsip-prinsip tersebut akan dibahas lebih lanjut dalam bagian pembahasan.

Alat dan BahanBahan yang digunakan untuk metode alkalin lisis adalah larutan glukosa-EDTA (larutan A), larutan SDS 10%, larutan NaOH 4N, Larutan KOAc/HOAc (larutan C) dingin, etanol 70% dingin, etanol absolute dingin, Fenol CHCl3 Isoamilalkohol (25:24:1), dH2O steril, buffer TE ph 8.0, dan E. coli DH5 (pUC19) yang telah ditumbuhkan selama 16 jam dalam medium LB dengan penambahan antibiotik ampisilin. Adapun alat yang digunakan adalah sentrifuge mikro, tabung mikro, pipet mikro dan tip, gelas beker, rak tabung mikro, bak es dan es, tabung reaksi steril, dan vortex.

Namun, pada praktikum kali ini, praktikan menggunakan Prepease Plasmid Isolation Kit. Kit tersebut terdiri atas buffer A1, buffer A2, buffer A3, minispin column-centrifuge, buffer A4, dan buffer elusi. Untuk alat yang digunakan tidak berbeda dengan metode alkalin lisis.

Protokol (Metode Alkalin Lisis)DH5 ditumbuhkan dalam medium LB+Amp (100 g/ml) pada suhu 37 oC secara aerobik selama semalam. 1,5 ml kultur bakteri dimasukkan ke dalam tabung mikro. Tabung mikro disentrifugasi selama 2 menit dengan kecepatan 10.000 rpm. Supernatan dibuang. Kemudian, pellet diresuspensikan dalam 110 l larutan A dan didiamkan pada suhu ruangan selama 5 10 menit. Sementara itu, larutan B dibuat dengan mencampurkan 4,25 ml dH2O steril, 0,5 ml larutan SDS 10%, dan 0,25 ml larutan NaOH 4 N. Ke dalam tabung mikro, ditambahkan 200 l larutan B. Kemudian, tabung mikro dibolak-balikkan secara perlahan. Tabung mikro diinkubasi pada suhu 0 oC (di atas es) selama 5 10 menit. Larutan C sebanyak 150 l ditambahkan dan divortex kurang lebih 10 detik. Tabung mikro diinkubasi selama 5 10 menit di atas es. Tabung mikro disentrifugasi selama 3 menit dengan kecepatan 5000 rpm. Supernatan dipindahkan ke tabung mikro baru dan 0,5 ml campuran fenol kloroform isoamil alkohol ditambahkan. Campuran divorteks sebentar sampai terbentuk suspensi dan disentrifugasi dengan kecepatan 13.000 rpm selama 10 menit. Supernatan diambil (jangan sampai bagian fenol terambil) dan 1 ml etanol absolut dingin ditambahkan. Campuran diinkubasikan pada 20 oC selama 10 menit. Kemudian disentrifugasikan dengan kecepatan 10.000 rpm selama 5 menit. Supernatan dibuang. Pellet dicuci dengan 700 l etanol 70 % dingin. Pellet dikeringkan dan disuspensikan 40 50 l buffer TE ph 8.0. Kemudian, campuran disimpan dalam freezer dengan suhu -20 oC.

Protokol (Prepease Kit)Kultur disiapkan dengan menginokulasikan bakteri ke media LB. Lalu, diinkubasi selama 24 jam sambil dishaking. Kultur bakteri dimasukkan ke tabung mikro dan disentrifugasikan selama 30 detik dengan kecepatan 11.000 rpm. Supernatan dibuang dan pellet diresuspensikan dengan buffer A1. Campuran divortex. Buffer A2 ditambahkan ke dalam suspensi dan dikocok perlahan (tidak menggunakan vortex). Kemudian, buffer A3 ditambahkan dan dikocok perlahan sampai suspensi berwarna keputihan. Campuran disentrifugasi selama 5 10 menit dengan kecepatan 11.000 rpm. Lisat murni dimasukkan ke minispin column-centrifuge. Lalu, lisat dicuci dengan buffer A4 atau wash buffer. Kemudian campuran disentrifugasi. Campuran kemudian dikeringkan dan disentrifugasi kembali. Buffer elusi ditambahkan dan diinkubasi selama 1 menit. Campuran disentrifugasi.

Gambar X. Protokol Kerja Prepease Plasmid Isolation Kit

PembahasanIsolasi yang dilakukan pada DNA genomik dan DNA plasmid menggunakan prinsip yang sama. Namun, terdapat beberapa perbedaan pada metode yang digunakan. Pada isolasi DNA plasmid, untuk melakukan lisis sel juga menggunakan larutan NaOH. Selain itu, pada metode DNA plasmid, dilakukan renaturasi untuk memisahkan DNA genomik dan DNA plasmid. Metode alkalin lisis menghasilkan yield yang lebih rendah dibandingkan menggunakan kit yang tersedia. Pada saat terjadi denaturasi, DNA genomik, yang terdiri atas untaian panjang, akan menjadi kusut sehingga sulit untuk terrenaturasi kembali. Hal ini tidak terjadi pada DNA plasmid yang dapat dengan mudah terrenaturasi.DNA plasmid dan DNA genomik memiliki beberapa perbedaan mendasar. DNA plasmid memiliki struktur supercoiled pada struktur tersiernya, sedangkan DNA genomik memiliki struktur linier. Dikarenakan struktur tersier yang berupa supercoiled, DNA plasmid memiliki berat yang lebih dibandingkan DNA genomik. Perbedaan berat dapat digunakan untuk membedakan kedua DNA pada ultrasentrifugasi, dimana DNA plasmid berada di bawah. Metode ultrasentrifugasi CsCl / Ethidium Bromida dilakukan untuk isolasi pada skala yang lebih besar. Perbedaan berat tersebut juga dapat diamati melalui elektroforesis gel agarosa.Terdapat beberapa tahapan dalam melakukan isolasi DNA plasmid. Tahapan pertama adalah penghancuran dinding sel. Penghancuran dinding sel dapat dilakukan secara mekanis ataupun enzimatis. Tahapan berikutnya adalah melakukan lisis pada sel. Pada metode alkalin lisis, digunakan larutan SDS dan NaOH untuk melakukan lisis. Cara dan bahan yang digunakan pada penghancuran dinding sel dan lisis sel bergantung pada jenis bakteri yang digunakan juga. Misalnya lisozim digunakan pada bakteri Gram positif. Kemudian, organel-organel sel yang tidak diinginkan (debris sel) dibersihkan dengan cara memecah protein penyusun organel-organel sel tersebut. Pemecahan dapat menggunakan proteinase-K. Debris sel yang telah dipecah kemudian diekstraksi dengan menggunakan pelarut organik. Kemudian, DNA yang berada pada fase air dipresipitasi dengan menggunakan alkohol. Ketika menggunakan kit, DNA yang diinginkan tidak dipresipitasi, melainkan dijerat dengan menggunakan kolom yang disediakan kit. Penyimpanan DNA yang diinginkan dapat menggunakan buffer TE. Buffer TE bekerja dengan cara mengkhelat logam yang bekerja sebagai kofaktor enzim DNAse sehingga tidak terjadi degradasi pada DNA. Namun, buffer TE juga dapat menyebabkan enzim polimerase tidak aktif. Selain menggunakan buffer TE, suhu rendah (-20 oC) dapat digunakan untuk mencegah aktifnya enzim DNAse.

Karp, Gerald. 2010. Cell and Molecular Biology. Denver, AS : Johns Wiley & Sons Co.Malik, A. 2012. Penuntun Kerja : Isolasi Plasmid dan Kloning DNA. Depok : Departemen Farmasi FMIPA UI.Yuwono, Triwibowo. 2008. Biologi Molekuler. Jakarta : Erlangga.