ISOLASI DAN SKRINING BAKTERI ENDOFIT PENGHASIL ENZIM L ...repository.ub.ac.id/4478/1/Rizki Nur...
Transcript of ISOLASI DAN SKRINING BAKTERI ENDOFIT PENGHASIL ENZIM L ...repository.ub.ac.id/4478/1/Rizki Nur...
ISOLASI DAN SKRINING BAKTERI ENDOFIT PENGHASIL ENZIM
L-ASPARAGINASE DARI AKAR BATANG DAN DAUN MANGROVE Excoecaria agallocha
SKRIPSI
Oleh :
RIZKI NUR FAUZIAH NIM. 135080300111064
PROGRAM STUDI TEKNOLOGI HASIL PERIKANAN JURUSAN MANAJEMEN SUMBERDAYA PERAIRAN
FAKULTAS PERIKANAN DAN ILMU KELAUTAN UNIVERSITAS BRAWIJAYA
MALANG 2017
Judul : ISOLASI DAN SKRINING BAKTERI ENDOFIT PENGHASIL ENZIM L- ASPARAGINASE DARI AKAR BATANG DAN DAUN MANGROVE Excoecaria agallocha
Nama Mahasiswa : RIZKI NUR FAUZIAH
NIM : 135080300111064
Program Studi : Teknologi Hasil Perikanan
PENGUJI PEMBIMBING:
Pembimbing 1 : Dr. Sc. ASEP AWALUDIN PRIHANTO, S.Pi, MP
Pembimbing 2 : Dr. Ir. HAPPY NURSYAM, MS
PENGUJI BUKAN PEMBIMBING:
Dosen Penguji 1 : Dr. Ir. ANIES CHAMIDAH, MS
Dosen Penguji 2 : Dr.Ir. HARDOKO, MS
Tanggal Ujian : 28 AGUSTUS 2017
PERNYATAAN ORISINALITAS
Dengan ini saya menyatakan bahwa dalam skripsi yang saya tulis ini
dengan judul Isolasi dan Skrining Bakteri Endofit Penghasil Enzim L-
Asparaginase dari Akar, Batang dan Daun Mangrove Exoecaria agalloca benar-
benar merupakan hasil karya saya sendiri, dan sepanjang pengetahuan saya
juga tidak terdapat karya atau pendapat yang pernah ditulis atau diterbitkan oleh
orang lain kecuali yang tertulis dalam naskah ini dan disebutkan dalam daftar
pustaka.
Apabila kemudian hari terbukti atau dapat dibuktikan bahwa laporan
skripsi ini hasil penjiplakan (plagiasi), maka saya bersedia untuk menerima
sanksi atas perbuatan tersebut, sesuai hukum yang berlaku di Indonesia.
Malang, Agustus 2017
Mahasiswa,
Rizki Nur Fauziah NIM. 135080300111064
UCAPAN TERIMAKASIH
Penyusunan penulisan laporan penelitian ini selesai karena adanya
bantuan dari berbagai pihak,maka dari itu penulis menyampaikan ucapan
terimakasih kepada:
1. Orang tua tercinta Moch. Djamil,S.ST, MT dan Dra. Nur Nadhiroh, M.Pd,
yang telah memberikan motivasi, dukungan,do’a, restu, dan ridho, sehingga
penulis dapat menyelesaikan laporan skripsi ini dengan baik.
2. Dr.Sc. Asep Awaludin Prihanto, S.Pi, MP dan Dr. Ir. Happy Nursyam, MS
selaku dosen pembimbing dalam penulisan laporan skripsi yang senantiasa
selalu memberikan arahan dan bimbingan kepada penulis.
3. Dr. Ir. Anies Chamidah dan Dr. Ir. Hardoko selaku dosen penguji pada
sidang skripsi yang telah memberikan masukan dan arahan pada penulisan
laporan skripsi.
4. Kakak dan adik tersayang Huril ‘In Afqiha Taubatin dan Muhammad Mukhlis
yang telah memberikan semangat, dukungan, dan nasehat selama penulisan
skripsi.
5. Teman-teman nan jauh Fauziah Hidayati, Nurma Azuhra, dan Immamatul
Khoiriah yang selalu memberikan motivasi,dukungan, dan semangat hingga
penulis dapat menyelesaikan skripsi ini.
6. Sahabat-sahabat seperjuangan Febrianti Ambar Ningrum, Charta Chartusi
Lujeng N, Eka Rizky M, dan Titis Verdilah yang selalu memberikan
dukungan dan semangat agar skripsi ini dapat terselesaikan.
7. Saudara-saudara tersayang di Malang Laily, Ulid, Anggie, Mbak Nay, Mbak
Nana, Mbk Rine, dan Rina yang selalu menghibur disaat penulis jenuh, sedih
maupun senang dan senantiasa memberikan semangat hingga dapat
menyelesaikan skripsi.
8. Endyk Alvianto yang telah memberikan semangat, motivasi, nasehat, dan
yang selalu menerima keluh kesah penulis hingga skripsi ini dapat
terselesaikan dengan baik.
9. Teman-teman sebimbingan yang telah memberikan dukungan, dan
semangat yang dapat menjadikan motivasi penulis untuk dapat
menyelesaikan skripsi ini dengan baik.
10. Semua pihak yang tidak dapat penulis sampaikan semua, yang telah
memberikan bantuan kepada penulis selama proses hingga skripsi ini dapat
terselesaikan.
Malang, Agustus 2017
Rizki Nur Fauziah
NIM. 135080300111064
ISOLASI DAN SKRINING BAKTERI ENDOFIT PENGHASIL ENZIM L-ASPARAGINASE DARI AKAR BATANG DAN DAUN MANGROVE Excoecaria
agallocha
Rizki Nur Fauziah1), Asep Awaludin Prihanto2), Happy Nursyam3)
ABSTRAK
Enzim L-Asparaginase (L-Asparagin amidohydrolase) merupakan enzim yang mengkatalisis dan hidrolisis dari L-Asparagine menjadi l-aspartat dan ammonia. L-Asparaginase banyak ditemukan di jaringan hewan, tumbuhan, bakteri, dan dalam serum tikus tertentu. L-Asparaginase tidak ditemukan pada manusia. Salah satu jenis tumbuhan yang memiliki potensi untuk menghasilkan enzim l-asparaginase adalah endofit mangrove Excoecaria agalloca. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk memperoleh bakteri endofit dari akar, batang, dan daun mangrove Exoecaria agalloca yang mampu menghasilkan enzim L-Asparaginase dan mengetahui identitas bakteri berdasarkan uji Microbact system. Metode penelitian yang digunakan adalah deskriptif. Pada penelitian ini menggunakan sampel akar, batang, dan daun dari mangrove Excoecaria agalloca, yang diambil dari pantai Bajul Mati Malang. Sampel yang telah diambil kemudian dilakukan penanaman untuk mendapatkan isolat bakteri dengan cara dilakukan pengnceran dari 10-1 sampai 10-6 . Setelah didapatkan isolate bakteri maka akan dilakukan skrining dengan menggunakan media selektif L-asparaginase dan didapatkan hasil bakteri penghasil L-asparaginase. Bakteri yang memiliki aktifitas hidrolisis paling besar akan dilakukan uji pewarnaan gram dan uji microbact system. Dari hasil isolasi bakteri endofit didapatkan 12 isolat bakteri yaitu daun 4 isolat, batang 4 isolat, dan akar 4 isolat. Dari 12 isolat tersebut terdapat 5 isolat yang positif menghasilkan enzim L-asparaginase yaitu dari D10-4 dan D10-5, serta dari B10-3, B10-4 dan B10-5. Dari kelima isolat yang memiliki aktivitas penghasil L-asparaginase tertinggi adalah pada B10-3. B10-3
adalah bakteri gram positif yang memiliki bentuk sel basil dengan motilitas non motil, berdiameter koloni 3,11 mm, dan menurut uji microbact system yang dilakukan bakteri tersebut adalah Bacillus subtilis. Kata Kunci : endofit, L-asparaginase, Microbact system, Bacillus subtilis
ISOLATION AND SCREENING OF ENDOPHYTES BACTERIA WHICH PRODUCE L-ASPARAGINASE ENZYME FROM ROOT, STEM AND LEAF MANGROVES
Excoecaria agalloca
ABSTRACT
L-asparaginase enzyme (L-Asparagine amidohydrolase) is an enzyme that catalyzes and hydrolyses L-asparagine to L-aspartat and ammonia. L-asparaginase can be found in tissues of animals, plants, bacteria, and in rat serum. L-asparaginase can not be found in humans. One type of plant that has the potential source for producing l-asparaginase enzyme is the endophytes of mangrove Excoecaria agalloca. The purpose of this research was obtain bacteria endophytes from root, stem, and leaves of mangrove Excoecaria agalloca which capable of producing L-asparaginase enzyme and to identify the bacteria based on Microbact system test. The research method was descriptive. In this research used sampel roots, stems, and leaves from mangrove Excoecaria agalloca, taken from the beach of Bajul Mati Malang. Samples were taken and then plated to obtain
1) Mahasiswa Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan Universitas Brawijaya, Malang 2) dan 3) Dosen Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan Universitas Brawijaya, Malang
isolates of bacteria by dilution from 10-1 to 10-6. Obtained the bacterial isolates will be screened using selective media L-asparaginase and showed bacteria producing L-asparaginase. Bacteria that have the most substantial hydrolysis activity will be conducted gram stain test and microbact system test. From the result of endophytic bacteria isolation, there were 12 isolates of 4 isolate leaves, 4 isolates stems, and 4 isolate roots. There were 5 isolates among 12 isolates which produced L-asparaginase enzyme is D10-4 and D10-5, and from B10-3, B10-4 and B10-5. Of the 5 isolates that have the highest L-asparaginase-producing activity are in B10-3. B10-3 is a gram-positive bacteria that has a basil cell shape with non motile motility, 3.11 mm colony diameter, and according to microbact system test the bacteria was Bacillus subtilis. Keywords : Endophytes, L-asparaginase, Microbact system, Bacillus subtilis
KATA PENGANTAR
Dengan memanjatkan puji syukur ke hadirat Allah SWT, atas limpahan
rahmat dan hidayah-Mu penulis dapat menyajikan Laporan Skripsi yang berjudul
Isolasi Dan Skrining Bakteri Endofit Penghasil Enzim L-Asparaginase Dari Akar,
Batang, dan Daun Mangrove Excoecaria agallocha. Di dalam tulisan ini, disajikan
pokok-pokok bahasan yang meliputi cara mengisolasi bakteri hingga
menscreening bakteri yang dapat menghasilkan enzim L-Asparaginase dan
melakukan mutagenesis untuk mengetahui perubahan aktivitas enzim yang
didapatkan.
Sangat disadari bahwa dengan kekurangan dan keterbatasan yang
dimiliki penulis, walaupun telah dikerahkan segala kemampuan untuk lebih teliti,
tetapi masih dirasakan banyak kekurangtepatan, oleh karena itu penulis
mengharapkan saran yang membangun agar tulisan ini bermanfaat bagi yang
membutuhkan.
Malang, Agustus 2017
Rizki Nur Fauziah
NIM. 135080300111064
DAFTAR ISI
Halaman RINGKASAN ..................................................................................................... vii KATA PENGANTAR ........................................................................................ viii DAFTAR ISI ....................................................................................................... ix DAFTAR TABEL ................................................................................................ xi DAFTAR GAMBAR ........................................................................................... xii DAFTAR LAMPIRAN ....................................................................................... xiii 1. PENDAHULUAN ............................................................................................ 1
1.1 Latar Belakang .......................................................................................... 1 1.2 Rumusan Masalah .................................................................................... 2 1.3 Tujuan Penelitian....................................................................................... 3 1.4 Kegunaan Penelitian ................................................................................. 3 1.5 Waktu dan Tempat .................................................................................... 3
2. TINJAUAN PUSTAKA ...................................... Error! Bookmark not defined.4
2.1 Morfologi dan Klasifikasi Excoecaria agallocha ......................................... 4 2.2 Endofit Mangrove ...................................................................................... 5 2.3 Isolasi Mikroorganisme .............................................................................. 6 2.4 Enzim ........................................................................................................ 7 2.4.1 Pengertian Enzim ................................................................................... 7 2.4.2 Jenis Enzim ............................................................................................ 8 2.5 L-Asparaginase ........................................................................................ 9 2.6 Faktor –Faktor yang Mempengaruhi Aktifitas Enzim ............................... 10 2.7 Sumber Enzim L- Asparaginase ............................................................. 12 2.8 Aplikasi Enzim L- Asparaginase ............................................................. 12 2.9 Identifikasi Spesies Bakteri ..................................................................... 13
2.9.1 Identifikasi Spesies Bakteri Menggunakan Pewarnaan Gram ...... 13 2.9.2 Identifikasi Spesies Bakteri Menggunakan Microbact…………….15
3. METODE PENELITIAN ................................................................................. 17
3.1 Materi Penelitian...................................................................................... 17 3.1.1 Alat Penelitian ...................................................................................... 17 3.1.2 Bahan Penelitian .................................................................................. 17 3.2 Metode Penelitian .................................................................................... 17 3.3 Prosedur Penelitian ................................................................................. 18 3.3.1 Pengambilan Sampel dari Endofit Mangrove Excoecaria agalloca ...... 18 3.3.2 Tahap 1 (Skrining Bakteri Penghasil L-Asparaginase)…………………..19 a. Preparasi Sampel ...................................................................................... 19 b. Pengenceran ............................................................................................. 19 c. Pembuatan Media LBA (Luria Bertani Agar) .............................................. 20 d. Sterilisasi Alat dan Media .......................................................................... 21 e. Penanaman Sampel pada Media LBA ....................................................... 21 f. Isolasi Bakteri ............................................................................................. 22 g. Inokulasi pada Agar Miring ........................................................................ 22 h. Skirining Bakteri Pengahasil Enzim L-Asparaginase ................................. 23 3.3.3 Tahap 2 (Identifikasi Spesies Bakteri Menggunakan Microbact) ........... 24
a. Pewarnaan Gram ...................................................................................... 24 b. Uji Microbact System ................................................................................. 25
4. HASIL DAN PEMBAHASAN ......................................................................... 30
4.1 Isolasi Bakteri .......................................................................................... 30 4.2 Bakteri Penghasil L-Asparaginase ........................................................... 31 4.3 Isolasi Koloni ........................................................................................... 33 4.4 Identifikasi Bakteri ................................................................................... 34
4.4.1 Uji Pewarnaan Gram ..................................................................... 34 4.4.2 Uji Microbact System ..................................................................... 35
5. KESIMPULAN DAN SARAN ......................................................................... 44
5.1 Kesimpulan ............................................................................................. 44 5.2 Saran ...................................................................................................... 44
DAFTAR PUSTAKA .......................................................................................... 45 LAMPIRAN ........................................................................................................ 50
DAFTAR TABEL
Tabel Halaman
1. Kode sampel .................................................................................................. 20
2. Endofit yang menghasilkan isolat bakteri ....................................................... 31
3. Hasil Bakteri Endofit Penghasil L-Asparaginase ............................................ 32
4. Hasil Identifikasi dengan Microbact system .................................................... 36
DAFTAR GAMBAR
Gambar Halaman
1. Daun Excoearia agalloca ................................................................................ 5
2. Mekanisme Reaksi Katalisis L-Asparaginase ................................................. 10
3. Struktur bakteri a) Gram Positif dan b) Gram Negatif…………………………..14
4. Tahapan pewarnaan Gram positif berwarna ungu hingga biru yang dikarenakan oleh warna kompleks dari kristal violet, dan sedangkan Gram negatif berwarna merah mudah dikarekan oleh warna safranin………………………………………..……………………………………..14
5. Peta Wilayah Pengambilan Sampel di Pantai Bajul Mati ................................ 19
6. Hasil uji bakteri penghasil L-Asparaginase dari isolat Excoecaria agalloca, A.
D10-4, B. D10-5, C. B10-4, D. B10-3, G. B10-5………………………………………31
7. Isolat murni dari bakteri B10-3 ....................................................................... 33
8. Sel bakteri gram positif dari bakteri B10-3 ………………………………………35
9. Pengambilan sampel Excoecaria agalloca pada pantai Bajul Mati…………..50
10. Sampel Daun dan Batang dari Excoecaria agalloca .................................... 50
11. A.Pengenceran daun, B.Pengenceran batang, C.Pengenceran akan .......... 51
12. A. Isolat Bakteri B10-3 , B. Streak Kuadran Bakteri B10-3 .............................51
13. Isolat Bakteri pada Agar Miring .................................................................... 51
1. PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Enzim L-Asparaginase (L-Asparagin amidohydrolase) merupakan enzim
yang mengkatalisis dan hidrolisis dari L-Asparagine menjadi l-aspartat dan
ammonia (Kishore et al., 2015). Enzim ini dapat dimanfaatkan untuk kesehatan
dan pangan. Pada kesehatan enzim ini dimanfaatkan untuk terapi leukemia, dan
pada pangan digunakan untuk memproduksi makanan yang bebas akrilamid.
Akrilamid merupakan suatu senyawa yang terbentuk dari reaksi maillard antara
L-asparagin dan gula pereduksi dalam makanan yang diproduksi dalam suhu
yang tinggi (± 120 °C) (Fuhr et al., 2006). Penambahan L-asparaginase pada
proses produksi makanan yang diolah dengan suhu tinggi akan mencegah
pembentukan akrilamid dengan cara mengkoversi asam amino L-asparagin
sebagai prekursornya menjadi bentuk asam amino lain yakni asam aspartat yang
pada umumnya terdapat dalam makanan (Antara, 2009).
L-Asparaginase banyak ditemukan di jaringan hewan, tumbuhan,
bakteri,dan dalam serum tikus tertentu. Tetapi L-Asparaginase tidak ditemukan
pada manusia (Muslim et al., 2015). Salah satu jenis tanaman yang memiliki
potensi untuk menghasilkan enzim l-asparaginase adalah endofit mangrove.
Bagian dari endofit mangrove yang mampu menghasilkan mikroba endofit adalah
akar, batang, dan daun. Beberapa mikroba endofit yang dapat menghasilkan
enzim L-asparaginase dalam jumlah yang besar seperti E. coli, Erwinia cartova,
Enterobacter aerogenes, Corynebacterium glutamicum, Candida utilities, Bacillus
sp, dan Pisum sativum (El-Bessoumy et al., 2004). Mikroba endofit merupakan
mikroba yang hidup di dalam jaringan tumbuhan dan mampu untuk membentuk
suatu koloni dalam jaringan tumbuhan tanpa memberI efek negatif pada
tumbuhan yang ditempatinya sebagai inang (Kasi et al., 2015).
2
Mikroba endofit dapat berupa bakteri atau jamur, tetapi pada saat ini yang
lebih banyak dieksplorasi yaitu jamur-jamur endofit. Terdapat fakta menarik
tentang mikroba endofit yaitu kemampuannya untuk memproduksi senyawa-
senyawa bioaktif, senyawa bioaktif yang diproduksi terkadang sama dengan
inangnya ataupun berbeda dengan inangnya bahkan juga ada yang menyatakan
bahwa senyawa yang telah dihasilkan oleh mikroba endofit yaitu memiliki
aktivitas yang lebih besar dibandingkan aktivitas senyawa tumbuhan inangnya
(Sinaga et al., 2009).
Penelitian ini menggunakan mangrove Excoecaria agaloca yang diambil
dari Pantai Bajul Mati dengan sampel akar, batang, dan daun. Dari sampel
tersebut akan didapatkan bakteri endofit yang selanjutkan akan dilakukan
skrining enzim L-asparaginase. Hasil dari skrining bakteri penghasil enzim L-
asparaginase yang paling baik akan dilakukan uji pewarnaan gram dan uji
microbact system untuk mengetahui jenis spesies dari bakteri penghasil enzim L-
asparaginase.
1.2 Rumusan Masalah
Berdasarkan latar belakang yang telah dipaparkan , maka rumusan
masalah dari penelitian ini adalah :
1. Apakah terdapat bakteri endofit dari akar, batang, dan daun mangrove
Exoecaria agalloca yang mampu menghasilkan enzim L-
Asparaginase ?
2. Apakah spesies bakteri endofit akar, batang, dan daun mangrove
Exoecaria agalloca yang mampu menghasilkan enzim L-Asparaginase
berdasarkan identifikasi pewarnaan gram dan uji microbact system ?
3
1.3 Tujuan Penelitian
1. Mengetahui bakteri endofit akar, batang, dan daun mangrove
Exoecaria agalloca yang mampu menghasilkan enzim L-
Asparaginase.
2. Mengetahui spesies bakteri endofit akar, batang, dan daun mangrove
Exoecaria agalloca yang mampu menghasilkan enzim L-
Asparaginase berdasarkan identifikasi pewarnaan gram dan uji
microbact system.
1.4 Kegunaan Penelitian
Hasil dari penelitian ini diharapkan dapat berguna sebagai informasi
mengenai adanya bakteri penghasil enzim L-Asparaginase dari akar, batang, dan
daun mangrove.
1.5 Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilaksanakan melalui dua tahapan. Penelitian tahap pertama
yaitu isolasi dan skrining bakteri yang menghasilkan enzim L-Asparaginase yang
dilaksanakan di Laboratorium Keamanan Hasil Perikanan dan Laboratorium
Parasit dan Penyakit Ikan Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan Universitas
Brawijaya Malang pada bulan November 2016 - Maret 2017. Penelitian tahap
kedua yaitu Identifikasi Spesies Bakteri Menggunakan Microbact di Laboratorium
Mikrobiologi Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya Malang pada bulan
Maret 2017.
4
2. TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Morfologi dan Klasifikasi Excoecaria agallocha
Excoecaria agallocha merupakan salah satu spesies tumbuhan mangrove
yang memililiki habitus pohon dan semak. Tetapi di daerah Baluran yang ditemui
adalah habitus pohon. Memiliki batang berwarna abu-abu, berbentuk bulat,
memiliki getah yang dapat membuat iritasi mata dan kulit (Sartiono, 2007).
Adapun klasifikasi dari tumbuhan mangrove jenis Excoecaria agallocha
menurut Sofnowandi (2015), adalah sebagai berikut :
Kingdom : Plantae
Division : Magnoliophyta
Class : Magnoliopsida
Order : Malpighiales
Family : Euphorbiaceae
Subfamily : Euphorbioideae
Tribe : Hippomaneae
Subtribe : Hippomaninae
Genus : Excoecaria L.
Species : Excoecaria agallocha
Excoecaria agallocha adalah pohon yang merangas kecil yang memiliki
ketinggian mencapai 15 m. Kulit kayu berwarna abu-abu, halus, tetapi memiliki
bintil. Akar menjalar di sepanjang permukaan tanah, seringkali berbentuk kusut
dan ditutupi oleh lentisel. Batang, dahan dan daun memiliki getah yang berwarna
putih dan lengket, sehingga dapat mengiritasi kulit serta mata. Daunnya hijau tua
dan akan berubah menjadi merah bata sebelum rontok, pinggiran bergerigi
halus, memiliki 2 kelenjar pada pangkal daun. Bentuk daun elips, ujungnya
meruncing dengan ukuran 6,5 – 10,5 x 3,5 – 5 cm (Noor et al., 1999). Berikut
adalah gambar daun Excoearia agalloca :
5
2.2 Endofit Mangrove
Mangrove merupakan tumbuhan yang kawasan hidupnya di pesisir yang
pertumbuhannya dipengaruhi oleh pasang surut air laut. Mangrove dapat
didefinisikan sebagai sekumpulan tumbuhan yang didominasi oleh beberapa
spesies yang khas atau semak-semak yang mempunyai kemampuan untuk
tumbuh di perairan asin. Ekosistem mangrove merupakan ekosistem yang
berada pada wilayah intertidal, dimana pada wilayah tersebut terdapat interaksi
yang kuat antara perairan laut, payau, sungai dan terrestrial. Mangrove
menyebar di sepanjang pantai Asia, Afrika, Australia dan Amerika (Martuti,
2013).
Mangrove pada umumnya dibagi menjadi 4 zona, diantaranya yaitu
daerah terbuka, daerah tengah,daerah payau, dan daerah ke arah daratan.
Excoecaria agalloca dan Avecennia alba adalah jenis-jenis yang dominan pada
areal pantai yang sangat tergenang. Mangrove tengah terletak di belakang zona
mangrove terbuka yang banyak didominasi oleh jenis Rhizophora dan jenis
Bruguiera. Mangrove payau terletak di sepanjang sungai berair payau hingga
hampir tawar. Pada zona tersebut didominasi oleh jenis Nypa dan Sonneratia.
Mangrove daratan berada pada zona perairan payau hingga hampir tawar di
belakang jalur hijau mangrove yang sebenarnya. Jenis-jenis umum yang ditemui
Gambar 1. Daun Excoearia agalloca
6
adalah Ficus retusa, Nypa fruticans, Pandanus sp., Lumnitzera recemosa dan
Xylocarpus moluccensis. Pada sebenarnya zonasi tersebut tidak selalu bersifat
universal, karena masing-masing jenis mangrove memiliki karakteristik habitat
yang berbeda yang mampu mendukung kehidupannya (Noor et al., 1999).
Mikroba endofit merupakan mikroba yang hidup di dalam jaringan
tumbuhan dan mampu untuk membentuk suatu koloni dalam jaringan tumbuhan
tanpa member efek negatif pada tumbuhan yang ditempatinya sebagai inang
(Kasi et al., 2015). Mikroba endofit dapat berupa bakteri atau jamur, tetapi pada
saat ini yang lebih banyak dieksplorasi yaitu jamur-jamur endofit. Terdapat fakta
menarik tentang mikroba endofit yaitu kemampuannya untuk memproduksi
senyawa-senyawa bioaktif, senyawa bioaktif yang diproduksi terkadang sama
dengan inangnya ataupun berbeda dengan inangnya bahkan juga ada yang
menyatakan bahwa senyawa yang telah dihasilkan oleh mikroba endofit yaitu
memiliki aktivitas yang lebih besar dibandingkan aktivitas senyawa tumbuhan
inangnya (Sinaga et al., 2009).
2.3 Isolasi Mikroorganisme
Bakteri dapat diisolasi dari berbagai jenis sumber seperti akar, batang,
daun, tanah, dan air. Bakteri yang tumbuh secara alami sebagian besar
merupakan koloni campuran, sehingga perlu dilakukan isolasi untuk
mendapatkan biakan yang murni. Menurut Hadioetomo (1995), terdapat tiga
teknik untuk mengisolasi bakteri yaitu :
1. Teknik Goresan (Streak Plate Method)
Pada teknik goresan yaitu mengisolasi bakteri dengan menggoreskan
suspesnsi bahan yang mengandung bakteri pada permukaan media agar yang
terdapat didalam petridish yang telah steril. Setelah diinkubasi, pada bekas
7
goresan akan tumbuh koloni-koloni yang terpisah pada permukaan media yang
berasal dari satu biakan murni.
2. Teknik Tuang (Pour Plate Method)
Pada teknik tuang yaitu mengisolasi bakteri dengan cara menginokulasi
suspensi dalam bahan yang mengandung bakteri kedalam petridish steril,
setelah itu dilakukan penuangan media agar cair (suhu 50°C) dan diinkubasi.
Setelah diinkubasi, akan tumbuh koloni-koloni yang tersebar pada permukaan
media yang berasal dari satu biakan murni.
3. Teknik Sebaran (Spread Plate Method)
Pada teknik sebaran yaitu dengan cara menginokulasi suspensi bahan
yang mengandung bakteri pada sebuah media agar yang terdapat dalam
petridish steril dan dilakukan inkubasi. Setelah diinkubasi akan tumbuh koloni
yang terpisah pada permukaan media yang berasal dari satu biakan murni.
2.4 Enzim 2.4.1 Pengertian Enzim
Enzim merupakan biopolimer yang tersusun dari serangkaian asam
amino dalam komposisi dan susunan rantai yang teratur dan tetap. Enzim
berperan penting dalam berbagai reaksi di dalam sel. Enzim juga merupakan
protein yang digunakan oleh sel hidup untuk mengkatalis reaksi antara lain yaitu
konversi energi dan metabolisme pertahanan sel (Richana, 2004).
Enzim mampu bekerja terhadap zat atau substrat yang memiliki hubungan
atau kecocokan antara enzim dan substrat. Hubungan keduanya dapat terjadi
pada bagian atau tempat tertentu saja. Bagian atau tempat yang dapat
berhubungan tersebut dinamakan sebagai bagian aktif (active site). Hubungan
tersebut akan terjadi apabila bagian aktif memliki ruang yang tepat sehingga
dapat menampung substrat. Hubungan antara substrat dan enzim akan
membentuk kompleks enzim-substrat (Yuniarsih, 2012).
8
Enzim berfungsi sebagai katalis yang dapat digunakan untuk meningkatkan
atau mempercepat kecepatan reaksi kimia dengan cara menurunkan energi
aktivasinya. Selain itu, juga dapat dilakukan dengan meningkatkan suhu reaksi,
karena tingginya suhu akan mempercepat gerak molekul. Namun, tidak semua
penggunaan suhu itu baik dan tepat, karena tidak semua senyawa dapat tahan
terhadap suhu tinggi. Penggunaan suhu tinggi tersebut, selain dapat merusak
senyawa juga dapat mengakibatkan biaya proses yang lebih besar (Legninger,
1990).
2.4.2 Jenis Enzim
Menurut Meiyanto (2008), enzim-enzim dapat dikelompokkan menjadi 6
kelompok besar, tergantung dari jenis reaksi yang dikatalis yaitu sebagai berikut:
1. Oksidoreduktase, mengkatalis reaksi oksidasi dan reduksi dengan cara
pemindahan elektron. Contohnya : Dehidrogenase, Oksidase, Reduktse,dan
Katalase.
2. Transferase, reaksi pemindahan gugus fungsional (gugus metil atau gugus
fosfat). Contohya : Transaldolase dan Transketolase, Kinase, serta
Fosfomutase.
3. Hidrolase, reaksi hidrolisis yang melibatkan penambahan air (H2O).
Contohnya : Esterase, Glikosidase, Peptidase, Fosfatase, Amidase,
Deaminase, Dan Ribonuklease.
4. Liase, reaksi pemindahan gugus pada ikatan ganda atau sebaliknya.
Contohnya : Dekarboksilase, Aldolase, Hidratase, Dehidratase, dan Sintase.
5. Isomerase, reaksi pemindahan gugus dalam satu molekul yang akan
menghasilkan isomer. Contohnya : Rasemase, Epimerase, Isomerase, dan
Mutase.
9
6. Ligase, reaksi pembentukan ikatan C-C, C-S, C-O, dan C-N oleh reaksi
kondensasi yang akan berkaitan dengan penguraian ATP. Contohnya :
Sintetase dan Karboksilase.
L-Asparaginase termasuk dalam kelompok enzim hidrolase karena enzim
L-Asparaginase merupakan enzim yang mengkatalisis dan hidrolisis dari L-
Asparagine menjadi l-aspartat dan ammonia (El-Nanggar et al., 2014).
2.5 L-Asparaginase
L-asparaginase (L-asparagin amidohidrolase) merupakan enzim yang
mampu untuk mengkatalisis proses hidrolisa L-asparagin menjadi L-aspartat dan
ammonia (Kishore et al., 2015). Asam aspartat yang selanjutnya akan masuk
dalam siklus asam sitrat yang akan menjadi pemeran penting dalam suatu
metabolisme dari asam amino (Hendriksen et al., 2009). Substrat ataupun produk
yang didapatkan dari hasil reaksi tersebut akan berperan penting dalam
metabolisme semua organismee, mulai dari bakteri hingga mamalia. Jumlah L-
asparagin dalam tanaman yang berlebihan akan disimpan dan akan digunakan
pada transport nitrogen sebagai biosintesis protein (Borek dan Jaskolski, 2001).
Dalam teknologi pangan enzim L-asparaginase dapat digunakan untuk
mengurangi akrilamida yang terkandung dalam bahan pangan. Akrilamida
tersebut dapat bersifat karsinogen pada tubuh konsumen (Ciesarova et al.,
2006). Adapun mekanisme reaksi hidrolisis dan reaksi katalisis L-asparaginase
dapat dilihat pada gambar berikut :
10
Gambar 2. Mekanisme Reaksi Katalisis L-AsparaginaseSumber : El-Bessoumy et al. (2004)
2.6 Faktor –Faktor yang Mempengaruhi Aktifitas Enzim
Menurut Murray (2003), aktivitas enzim dapat dipengaruhi oleh beberapa
faktor, yaitu :
1. pH
pH sangat berpengaruh terhadap aktivitas enzim karena memiliki sifat
ionik pada gugus karboksil dan gugus amino yang mudah untuk dipengaruhi oleh
pH. Hal tersebut dapat menyebabkan konfermasi dan fungsi katalitik enzim dapat
berubah. Enzim memiliki pH optimum yang khas yaitu pH yang dapat
menyebabkan aktivitas maksimal.
2. Suhu
Reaksi kimia sangat dipengaruhi oleh suhu, maka reaksi yang akan
dikatalis oleh enzim juga akan peka terhadap suhu. Terdapat kisaran suhu
tertentu yang sesuai dengan jenis masing-masing enzim. Kecepatan reaksi akan
meningkat ketika suhu dinaikkan.
L-asparaginase Beta-acyl-enzyme intermediete
Aspartic acid
11
3. Waktu Inkubasi
Aktivitas enzim akan dipengarui oleh lamanya waktu inkubasi. Waktu
yang diperlukan enzim untuk berikatan dengan substrat hingga menghasilkan
produk dapat disebut waktu inkubasi enzimatis. Waktu inkubasi enzimatis akan
sebanding dengan produk yang akan dihasilkan. Waktu inkubasi yang lama akan
menyebabkan banyaknya enzim yang berikatan dengan substrat sehingga
semakin banyak produk yang dihasilkan. Apabila enzim sudah jenuh dengan
substrat maka lama waktu inkubasi tidak mempengaruhinya lagi.
4. Konsentrasi Enzim
Kecepatan reaksi akan bergantung pada tingkat konsentrasi enzim yang
akan berperan sebagai pengaktifan dalam melakukan suatu reaksi. Pada reaksi
enzimatis, kecepatan reaksi akan berbanding lurus dengan konsentrasi enzim.
Maka tingginya konsentrasi enzim akan semakin cepat reaksi berlangsung.
5. Konsentrasi Substrat
Peningkatan konsentrasi substrat akan menyebabkan kecepatan reaksi
yang meningkat, tetapi pada akhirnya penambahan konsentrasi substrat hanya
akan meningkatkan kecepatan reaksi sedemikian kecil.
2.7 Sumber Enzim L- Asparaginase
L-Asparaginase banyak ditemukan di jaringan hewan, tumbuhan,
bakteri,dan dalam serum tikus tertentu. Tetapi L-Asparaginase tidak ditemukan
pada manusia (Muslim et al., 2015). Salah satu jenis tanaman yang memiliki
potensi untuk menghasilkan enzim l-asparaginase adalah endofit mangrove.
Mikroba endofit merupakan mikroba yang hidup di dalam jaringan tumbuhan dan
mampu untuk membentuk suatu koloni dalam jaringan tumbuhan tanpa member
efek negatif pada tumbuhan yang ditempatinya sebagai inang (Kasi et al., 2015).
12
Mikroba yang dapat menghasilkan enzim L-Asparaginase diantaranya
adalah Escherichia coli, Serratia marcescens, Enterobacter cloacae,
Pseudomonas sutzeri, Erwinia sp., dan Capsicum annum (Mungi et al., 2014).
Enzim L-Asparaginase juga dapat ditemukan pada mikroorganisme eukariotik
seperti pada ragi dan jamur. Enzim ini dapat digunakan untuk terapi limfositik
leukemia dan jenis kanker lain yang ada pada manusia (Makky et al., 2013).
2.8 Aplikasi Enzim L- Asparaginase
Potensi enzim L-Asparaginase yang dihasilkan oleh bakteri E.coli
merupakan enzim yang efektif sebagai agen antitumor. Hal tersebut telah
dilakukan uji coba pada kelinci percobaan yang telah diberi perlakuan leukemia
limfoblastik akut dan limfosarkoma. Hasil yang didapatkan adalah enzim L-
Asparaginase tersebut mampu mengobati secara efektif leukemia limfoblastik
akut dan limfosarkoma tersebut. L-Asparaginase mampu untuk menghambat
sistesis protein dalam sel T dengan cara mengkonversi L-asparagin menjadi L-
aspartat dan ammonia. L-asparagin juga merupakan asam amino ensisal yang
dibutuhkan oleh tubuh namun tidak terdapat didalam tubuh (Jayam dan Kannan,
2014).
L- Asparaginane juga dapat diaplikasi dalam industri makanan yaitu untuk
mengurangi pembentukan akrilamida pada bahan pangan. Akrilamida tersebut
merupakan karsinogen yang terdapat pada bahan pangan yang berbahan dasar
tepung. Akrilamida akan terbentuk ketika bahan pangan tersebut dilakukan
proses penggorengan dan pada proses inilah terdapat asam amino asparagin
yang akan berubah menjadi akrilamida proses tersebut dinamakan reaksi
Maillard. Reaksi ini akan bertanggung jawab untuk membuat suatu produk
pangan yang dilakukan proses penggorengan menjadi berwarna kecoklatan.
Dengan ditambahkannya enzim L-asparaginase pada pangan sebelum dilakukan
13
proses penggorengan maka akan menggurangi secara signifikan proses
terbentuknya akrilamida. Hal tersebut dikarenakan karena asam amino asparagin
akan menjadi asam aspartat dan ammonium bukan menjadi akrilamida lagi
( Jayam dan Kannan, 2014).
2.9 Identifikasi Spesies Bakteri2.9.1 Identifikasi Spesies Bakteri Menggunakan Pewarnaan Gram
Identifikasi suatu mikroorganisme dapat dilakukan dengan cara
pewarnaan gram. Metode pewarnaan gram pada suatu mikroorganisme dapat
dikelompokkan menjadi dua, yaitu gram-positif dan gram-negatif berdasarkan
reaksi atau sifat mikroorganisme terhadap cat yang diberikan. Reaksi tersebut
ditentukan oleh komposisi dinding selnya (Nikaido, 1996).
Bakteri gram negatif lebih resisten terhadap obat-obatan dibandingkan
dengan bakteri gram positf. Perbedaan klasifikasi antara kedua jenis bakteri
tersebut adalah perbedaan struktur dinding sel bakteri. Pada bakteri gram positif
susunan dinding sel lebih sederhana terdiri dari 2 lapis namun memiliki
lapisanpeptioglikan yang tebal, sementara untuk bakteri gram negatif lebih
kompleks dan terdiri dari 3 lapis namun lapisan peptidoglikan tipis (Lay, 1994).
Gambar 3. Struktur bakteri a) Gram Positif dan b) Gram Negatif
Bakteri gram positif akan mempertahankan zat warna kristal violet
sehingga akan tampak berwarna ungu tua di bawah mikroskop. Adapun bakteri
14
gram negatif akan kehilangan zat warna kristal violet setelah dicuci dengan
alkohol, kemudian diberi zat pewarna tandingan yaitu safranin akan tampak
berwarna merah. Perbedaan warna tersebut disebabkan oleh adanya perbedaan
struktur kimiawi pada dinding selnya (Nofiani dan Gusrizal, 2004).
Gambar 4. Tahapan pewarnaan Gram positif berwarna ungu hingga biru yang dikarenakan oleh warna kompleks dari kristal violet, dan sedangkan
Gram negatif berwarna merah mudah dikarekan oleh warna safranin.
2.9.2 Identifikasi Spesies Bakteri Menggunakan Microbact
Pengidentifikasian spesies mikroorganisme yaitu dengan cara
menganalisa kemapuan metabolisme dengan menggunakan metode uji biokimia.
Uji biokimia tersebut meliputi kemampuan mikroorganisme dalam menggunakan
bagian dari beberapa jenis sumber karbon dan senyawa lainnya yang terdapat
pada tubuhnya. Uji biokimia ini beragam dan semakin banyak jenis senyawa
pengujian yang dilakukan maka akan dapat menghasilkan identifikasi
mikroorgasime secara spesifik hingga tingkat spesiesnya (Brock et al., 1978).
Uji secara fisiologis dapat menggunakan Microbact Identification System,
pada uji ini digunakan untuk mengetahui karakteristik fisiologis dari bakteri gram
positif atau bakteri gram negatif, sehingga dapat diketahui genus dan jenis
bakterinya. Format yang digunakan pada uji ini dalam bentuk test-strip atau
microplate sederhana, dengan hasil yang jelas terlihat sebagai reaksi-reaksi
15
warna berbeda yang dapat diintepretasikan menggunakan Microbact (Arrizal et
al., 2013).
Kit Microbact 12E dan Microbact 12B merupakan identifikasi sitem
komersial yang digunakan untuk bakteri secara umum, bakteri gram positif, dan
bakteri gram negatif golongan enterobacter. Microbact 12E untuk bakteri gram
negatif dan Microbct 12B untuk bakteri gram positif. Pada uji ini terdiri dari
sebanyak 12 substrat biokimia yang berbeda uji ini akan menggunakan
Microbact. Pengujian dengan menggunakan Microbact akan mempermudah
untuk melakukan identifikasi suatu mikroorganisme. Microbact memiliki sistem
yang telah dirancang sedemikian rupa untuk mengidentifikasi mikroorganisme
dengan komposisi substrat dan peraksi yang telah distandarisasi. Pengujian
dengan manggunakan Microbact akan memiliki beberapa ketentuan sebelum
dilakukan pengujian, yaitu sampel isolat yang akan diujikan harus merupakan
isolat yang telah dimurnikan dan dilarutkan kedalam garam fisiologis
(Murtiningsih, 1997).
Prinsip kerja dari Microbact adalah dengan mereaksikan sejumlah
suspense isolat kedalam sumur-sumur yang telah berisi sumber karbon dan
senyawa-senyawa biokimia lain yang berjumlahkan 12 jenis. Suspensi bakteri
yang dilarutkan ke dalam garam fisiologis akan ditambahkan ke dalam masing-
masing 12 sumur uji biokimia yang telah tersedia. Setelag dilakukan inkubasi
selama18-24 jam pada suhu 37oC reagen yang sesuai akan ditambhkan dan
perubahan warna pada setiap sumur yang berbeda akan dicatat. Evaluasi hasil
dapat dilihat melalui sumur-sumur Microbact apakah positif atau negatif dengan
cara membandingkan dengan tabel warna dan hasil akan ditulis pada formulir
Patient Record. Angka-angka oktal yang telah didapat dari penjumlahan reaksi
positif saja dari tiap-tiap kelompok (3 sumur didapatkan 1 angka oktal). Nama
16
bakteri dapat dilihat dengan menggunakan komputer berdasarkan dengan angka
oktal yang telah didapatkan (Murtiningsih, 1997).
17
3. METODE PENELITIAN
3.1 Materi Penelitian3.1.1 Alat Penelitian
Alat yang digunakan dalam penelitian ini meliputi beaker glass, erlenmeyer,
gelas ukur, autoklaf, inkubator, pH-meter, timbangan digital, neraca analitik,
cawan petri, mikro pipet, pengaduk magnet (stirer), lemari pendingin, freezer,
mortar dan alu, spatula bahan, pipet volume, pipet serologis, pipet tetes, bola
hisap, tabung reaksi, rak tabung reaksi, bunsen, loop ose, corong kaca, sprayer,
washing bottle, kompor, panci, laminar air flow, hot plate, blue tip, yellow tip,
vortex mixer, botol sampel dan nampan.
3.1.2 Bahan Penelitian
Bahan yang digunakan pada penelitian ini antara lain, sampel endofit
mangrove Excoecaria agalloca (batang, akar, daun), aquades, yeast exstract,
pepton, NaCl, agar bakteriologi, D-glucose, L-asparagin, Na2HPO4, KH2HPO4,
MgSO4.7H2O, CaCl2, NaOH, HCl, bromothymol blue (BTB), alkohol 70 %, spirtus,
tali benang, kapas, aluminuium foil, plastik wrap, tusuk gigi, penggaris 30 cm,
kertas label, spidol permanen, sarung tangan, masker, dan tissue.
3.2 Metode Penelitian
Metode penelitian yang digunakan adalah metode deskriptif. Metode
deskriptif eksploratif merupakan metode yang menggambarkan tentang suatu
keadaan atau kejadian. Dalam penelitian yang menggunakan metode deskriptif
hanya akan menggambarkan keadaan objek atau persoalannya dan tidak
dimaksudkan untuk mengambil kesimpulan yang berlaku untuk umum. Penelitian
secara deskriptif akan mengkamulasi data dasar, dan tidak menerangkan atau
mengetest hipotesis (Suryabrata, 1983).
18
Penelitian ini dilakukan dalam dua tahapan. Tahap pertama yaitu isolasi
dan skrining bakteri penghasil enzim L-asparaginase. Tahap kedua yaitu
Identifikasi Spesies Bakteri Menggunakan Microbact. Hasil penelitian dipaparkan
secara deskriptif berdasarkan tahapan-tahapan penelitian yang dilakukan.
Sedangkan hasil pengujian aktivitas enzim L-asparaginase dipaparkan secara
kuantitatif.
3.3 Prosedur Penelitian3.3.1 Pengambilan Sampel dari Endofit Mangrove Excoecaria agalloca (Prihanto et al., 2011)
Sampel yang digunakan pada penelitian ini adalah sampel yang berasal
dari batang pohon mangrove jenis Excoecaria agalloca yang berasal dari pantai
Bajul Mati Malang. Sampel daun, batang, dan akar diambil dari pohon mangrove
Excoecaria agalloca dengan cara memotong bagian daun beberapa lembar dan
batang yang memiliki ukuran tidak terlalu besar, kemudian dipotong ±10 cm dan
dimasukkan ke dalam wadah sampel. Sampel yang telah diambil dibawa menuju
Laboratorium Keamanan Hasil Perikanan Universitas Brawijaya Malang dan
disimpan pada suhu 4°C hingga sampel akan digunakan.
Pantai Bajul Mati merupakan pantai di pesisir selatan pulau Jawa yang
bertempat di Desa Gajahrejo, Kecamatan Gedangan, Kabupaten Malang, Jawa
Timur. Memiliki jarak sekitar 58 km dari kota Malang. Letak geografis pantai Bajul
Mati pada 8o25’52.6” S dan 112o38’07.8” E. Peta pengambilan sampel pada
pantai Bajul Mati dapat dilihat pada gambar 5.
Gambar 5. Peta Wilayah Pengambilan Sampel di Pantai Bajul Mati Gambar 1. Peta Wilayah Pengambilan Sampel di Pantai Bajul Mati
19
3.3.2 Tahap 1 (Skrining Bakteri Penghasil L-Asparaginase)a. Preparasi Sampel (Yulvizar, 2013)
Pertama yang dilakukan pada penelitian tahap satu ini adalah preparasi
sampel. Sampel yang digunakan dari tanaman magrove Excoecaria agalloca
adalah bagian dari batang, akar dan daun. Semua sampel yang berbeda tersebut
ditumbuk dan dihaluskan menggunakan mortal dan alu. Setelah halus, ditimbang
menggunakan timbangan digital sebanyak 1 gram.
b. Pengenceran (Darmayasa, 2008)
Pengenceran dilakukan dari 10-1 sampai 10-6. Pengenceran dilakukan
bertujuan untuk mengurangi kepadatan bakteri ketika dilakukan penanaman agar
bakteri yang tumbuh dapat mudah diambil. Sampel sebanyak 1 gram dilarutkan
pada 9 ml NaFis steril yang telah terdapat pada tabung reaksi dan didapatkan
pengenceran tingkat 10-1, kemudian dilakukan pengenceran bertingkat dengan
cara mengambil 1 ml larutan dari tabung 10-1 ke tabung lain untuk mendapatkan
pengenceran 10-2 begitu seterusnya hingga didapatkan pengenceran sebanyak
10-6. Adapun kode sampel yang digunakan adalah pada tabel berikut :
Gambar 2. Peta Wilayah Pengambilan Sampel di Pantai Bajul Mati
20
Tabel 1. Kode sampel
Kode sampel Keterangan
A (D10-4)B (D10-5)C (B10-4)D (B10-3)E (D10-3)F (B10-6)G (B10-5)H (A10-3)I (A10-4)J (A10-5)K (A10-6)L (D10-6)
Daun pengenceran 10-4
Daun pengenceran 10-5
Batang pengenceran 10-4
Batang pengenceran 10-3
Daun pengenceran 10-3
Batang pengenceran 10-6
Batang pengenceran 10-5
Akar pengenceran 10-3
Akar pengenceran 10-4
Akar pengenceran 10-5
Akar pengenceran 10-6
Daun pengenceran 10-6
c. Pembuatan Media LBA (Luria Bertani Agar) (Kurniasari, 2005)
Pertama semua bahan yang diperlukan adalah yeast extract 0,5 %, NaCl
1 %, pepton 1 %, dan agar bakteriologi 2 %. Pertama-tama yang dilakukan
adalah persiapan bahan yang akan digunakan. Cawan yang digunakan
sebanyak 12 cawan yang tiap cawanya diasumsikan berisi 20 ml media.
Sehingga dibutuhkan 12 cawan x 20 ml = 240 ml media LB. Sehingga
pembuatan agar dibuat sebanyak 250 ml. Kemudian masukkan akuades 125 ml
dan masukkan bahan 1,2 gram yeast extract, 2,5 gram NaCl, 2,5 gram pepton,
dan 5 gram agar bakteriologi ke dalam erlenmayer 1000 ml dan dihomogenkan
menggunakan magnetic stirrer setelah homogen kemudian tambahkan 125 ml
akuades dan homogenkan kembali. Hal ini bertujuan agar media yang dibuat
dapat homogen dan tidak menggumpal pada dasar erlenmayer. Kemudian media
yang sudah di homogenkan ditutup kapas dan dilapisi lagi dengan alufo dan di
sterilisasi dengan menggunakan autoklaf pada suhu 121 0C selama 15 menit
dengan tekanan 1 atm.
21
d. Sterilisasi Alat dan Media (Mayanti, 2013)
Semua alat yang akan disterilisasi harus dalam keadaan bersih dan
kemudian dibungkus dengan menggunkan kertas dan memasukkan kedalam
autoklaf pada suhu 121 oC selama 15 menit dengan tekanan 1 atm. Untuk media
dilakukan penghomogenan media dengan menggunakan magnetic stirrer dan
kemudian direbus terlebih dahulu selama 15 menit untuk lebih menghomogenkan
media. Setelah dilakukan perebusan kemudian dilakukan sterilisasi pada autoklaf
suhu 121oC selama 15 menit dengan tekanan 1 atm. Sedangkan untuk alat-alat
yang tidak tahan panas tinggi cukup dilakukan sterilisasi dengan menggunakan
alkohol 70 %.
e. Penanaman Sampel pada Media LBA (Kharisma dan Abdul, 2012)
Setelah media yang telah di sterilisasi diletakan ke dalam LAF (Laminer
Air Flow) yang sudah disinari UV selama kurang lebih 30 menit agar kondisi LAF
lebih aseptis. Media dibiarkan hingga menjadi hangat kuku sehingga tidak terlalu
panas. Media yang sudah hangat kuku kemudian dituang pada cawan petri dan
diasumsikan setiap cawan di berikan 20 ml media. Kemudian media ditunggu
hingga padat. Setelah dingin dan media telah padat, sampel pengenceran
ditanam pada media LBA dari pengenceran 10-3 sampai 10-6 secara duplo
sebanyak 200 µl pada tiap cawanya. Cawan yang telah dilakukan penggoresan
bakteri kemudian di wrap menggunakan plastik wrap yang bertujuan untuk
meminimalisir adanya kontaminasi dari luar. Selanjutnya media yang telah
ditanam diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 0C.
f. Isolasi Bakteri (Pastra et al., 2012)
Setelah diinkubasi bakteri yang berkoloni baik dan tidak spreader diisolasi
kembali pada media yang baru dengan menggunakan metode gores 3 kuadran
dan diinkubasi dengan suhu 37 0C selama 24 jam. Tujuan dari metode ini adalah
22
untuk mendapatkan koloni yang murni sehingga proses identifikasi nanti akan
jauh lebih mudah dilakukan. Pada tahap ini dilakukan dengan cara membagi
media cawan menjadi 3 bagian.
Goresan pada media dilakukan 3 kali dengan membentuk pola zig-zag.
Jarum ose ditempelkan pada sumber isolat dan kemudian digoreskan secara zig-
zag rapat pada media baru dibagian pertama. Lalu, jarum ose di fiksasi bunsen
dan digunakan untuk menggores goresan sebelumnya pada sisi kedua namun
tidak serapat goresan pertama dan begitu pula pada sisi ke tiga goresan dibuat
renggang. Pada metode ini, goresan sisi pertama diharapkan koloni tumbuh
padat dan berhimpitan , sedangkan pada goresan sisi kedua koloni mulai tampak
jarang dan begitu pula selanjutnya. Sehingga didapatkan koloni yang tumbuh
secara terpisah dari koloni lain atau disebut dengan isolat murni. Cawan yang
telah dilakukan penggoresan bakteri kemudian di wrap menggunakan plastik
wrap yang bertujuan untuk meminimalisir adanya kontaminasi dari luar.
Selanjutya diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 0C.
g. Inokulasi pada Agar Miring (Rakhmawati, 2012)
Hasil dari isolat murni yang didapatkan dari isolasi strik kemudian
dilakukan inokulasi pada tabung reaksi yang berisi media LBA berbentuk agar
miring. Inokulasi dilakukan dengan cara memanaskan jarum ose pada bunsen
hingga memerah kemudian dibiarkan sejenak hingga sedikit dingin. Selanjutnya
jarum ose digunakan untuk mengambil isolat murni (bakteri yang terpisah dari
koloninya) dan digoreskan secara zig-zag pada agar miring. Isolat bakteri yang
dipilih merupakan isolat yang berwarna putih kekuningan, berbentuk bulat
dengan tepian tidak rata dan membentuk elevansi yang datar serta terpisah dari
koloni yang lain. Kemudian tabung reaksi ditutup dengan menggunakan kapas
secara rapat dan di wrap menggunkan plastik wrap yang bertujuan untuk
23
meminimalisir adanya kontaminasi dari luar. Selanjutya diinkubasi selama 24 jam
pada suhu 37 0C.
h. Skirining Bakteri Pengahasil Enzim L-Asparaginase (Gulati et al., 1997)
Skrining atau seleksi bakteri penghasil enzim L-Asparaginase dilakukan
dengan cara menanam isolat murni bakteri yang telah didapat pada agar miring.
Media selektif yang digunakan adalah media L-Asparaginase . Bahan-bahan
yang digunakan dalam pembuatan media ini adalah 6 gram/liter Na2HPO4, 2
gram/liter KH2PO4, 0.5 gram/liter NaCl, 20 gram/liter L-Asparagine, 2 gram/liter
glucose, 0,2 gram/liter MgSO4, 0,005 gram/liter CaCl2, agar 2 % dan
bromothymol blue (BTB) sebanyak 0,007 %. Selanjutnya, pH diatur menjadi 5,5
menggunakan pH meter dengan ditambahkan HCl sehingga media bersifat asam
dan BTB berubah warnah menjadi kuning. Penambahan BTB bertujuan sebagai
indikator warna.
Media yang telah dihomogenkan kemudian disterilisasi menggunakan
autoklaf dengan suhu 121 0C selama 15 menit dengan tekanan 1 atm.
Selanjutnya media yang telah disterilisasi di diamkan pada Laminar Air Flow
(LAF) hingga hangat kuku, kemudian media yang telah hangat kuku dituang
kedalam cawan ditunggu media hingga padat dan dingin. Setelah media padat
kemudian cawan dibalik, hal ini bertujuan agar uap yang terdapat pada tutup
cawan tidak turun pada media, cawan yang telah dibalik kemudian dibagi
menjadi 12 bagian. Isolat bakteri yang didapat sebelumnya pada agar miring
ditanam dengan menggunakan tusuk gigi yang telah disterilkan pada media
selektif, dengan cara digoreskan secara vertikal pada masing-masing bagian
cawan dan diinkubasi selama 2-3 hari pada suhu 37 0C dan diamati setiap 24 jam
sekali dan dicatat perkembanganya. Lalu, didapatkan bakteri yang menghasilkan
enzim L-Asparaginase terbaik dan siap diidentifikasi.
24
3.3.3 Tahap 2 (Identifikasi Spesies Bakteri Menggunakan Microbact)a. Pewarnaan Gram (Hadioetomo, 1995)
Tahap awal adalah pengambilan isolat murni dengan menggunakan jarum
ose yang sebelumnya dipanaskan terlebih dahulu pada bunsen. Selanjutnya satu
ose bakteri diletakkan pada preparat dan dibuat pewarnaan. Langkah ini
dilakukan sebanyak 3 kali sehingga pada setiap preparat terdapat 3 kali
pewarnaan yang diberi kode yang berbeda. Sebelum diberikan pewarnaan,
preparat diberi akuades terlebih dahulu agar mempermudah pemberian
pewarnaan pada preparat. Hasil pewarnaan yang didapat di blower sampai
kering sehingga dapat mempermudah proses pewarnaan gram. Preparat yang
telah kering difiksasi agar bakteri pada preparat mati tetapi tidak merusak struktur
selnya. Kemudian ditetesi kristal ungu dan ditunggu satu menit. Pemberian kristal
ungu adalah sebagai pewarna primer. Setelah ditunggu 1 menit preparat dibilas
untung mencuci sisa kristal ungu yang ada. Lalu diberi iodium untuk memperkuat
warna dan didiamkan kembali satu menit dan dibilas. Kemudian diberi alkohol 70
% untuk melarutkan lemak dan dibilas denga air untuk menghilangkan sisa
alkohol yang tidak terpakai. Tahap berikutnya adalah pemberian safranin sebagai
pewarna sekunder dan dibiarkan selama 30 menit dan dibilas dengan air dan
ditetesi minyak imersi untuk memperjelas indeks bias, preparat yang telah
diwarnai kemudia diamati degan mikroskop.
b. Uji Microbact System (Murtiningsih, 1997)
Uji microbact system adalah uji yang digunakan untuk mengidentifikasi
mikroorganisme. Pengujian ini bergantung pada hasil uji oksidase yang dilakukan
sebelumnya. Apabila hasil oksidasenya positif maka pengujian dilakukan dengan
menggunakan microbact 24E, dan jika hasil yang didapat negatif maka akan
menggunakan microbact 12E. Sistem ini adalah sistem mikro-substrat standar
25
yang dirancang untuk mensimulasikan substrat biokimia konvensional yang
digunakan untuk mengidentifikasi basil gram negatif (Murtiningsih, 1997).
Tahapan pada uji ini pertama isolat murni di sentrifuge dengan kecepatan 3000
rpm selama 15 menit. Dari hasil sentrifuge didapatkan supernatan dan pelet
namun yang digunakan hanya bagian yang pelet saja. Kemudian pelet yang
dihasilkan diberi Nafis sebanyak 5 ml kemudian dimasukkan pada sumur
Microbact 24E atau 12E tergantung kepada hasil oksidasenya sebanyak 0,1 ml
dan diinkubasi selama 18-24 jam pada suhu 37 0C. Evaluasi hasilnya dapat
dilihat pada sumur microbact, apakah hasilnya positif atau negatif dengan cara
membandingkan tabel warna dan hasilnya akan ditulis pada formulir Patient
Record. Angka-angka oktal didapat dari penjumlahan reaksi positif saja, dari tiap-
tiap kelompok. Dari total ini selanjutnya dapat diketahui spesies bakteri yang
dimaksud dengan memasukkan data kedalam software komputer (Ballows et al.,
1991).
Identifikasi mikroorganisme menggunakan Microbact System ini terdiri
dari beberapa uji yaitu uji oksidase, motilitas, nitrat, lisin, ornitin, H2S, glukosa,
manitol, sitrat, indol, urease,V-P, sitrat, TDA, gelatin, malonase, intisitol, sorbitol,
rhamnosa, sukrosa, lactosa, arabinosa, adonitol, raffinosa, salicin, dan arginin.
Untuk penjelasan dari tiap uji dapat dijabarkan sebagai berikut:
- Uji Motilitas (Tittsler, 1996 dan Presscott, 2002)
Uji motilitas biasanya digunakan sebagai uji untuk membedakan
mikroorganisme berdasarkan matilitasnya, yaitu adalah salah satu ciri dari
mahluk hidup atau mikroorganisme yan mempunyai alat gerak sederhana yang
berupa flagel atau cilia. Bakteri menggunakan energi yang mereka dapat dari
ATP untuk bergerak. ATP diuraikan oleh koenzim ATP-ase dan membentuk fosfo
anorganik. Cara kerja pengujian ini adalah dengan menanam isolat pada media
26
NA tegak dan ditusukkan sedalam 5 mm, kemudian diinkubasi selama 24 jam
pada suhu 37 0C.
- Uji Oksidase (Lay, 1994)
Uji oksidase dilakukan untuk mengetahui adanya sitokrom oksidase yang
dapat ditemukan pada mikroorganisme tertentu. Pertama, biakan ditumbuhkan
pada media NA dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 30 0C. Kemudian
ditambahkan reagen uji oksidase yang terdiri dari campuran 1 % larutan α-naftol
dan 1 % larutan-p-fenilendiamin oksalat pada koloni bakteri dan selanjutnya
didiamkan selama 30 menit. Hasil uji dinyatakan postif apabila berwarna hitam.
- Uji Nitrat (Wedhastri, 2002)
Penggunaan uji nitrat adalah untuk menguji kemampuan mikroorganisme
yang dapat tumbuh pada media yang mengandung pepton sebagai sumber
nitrogen. Cara kerja dari pengujian ini adalah isolat ditumbuhkan pada media
yang mengandung KNO3, kemudian diinkubasi selama 48 jam pada suhu 37 0C.
Setelah itu ditambahkan larutan asam sulfanilat dan larutan alfa-naftilamin, dan
dilihat reaksinya. Pada umumnya, pada medium agar milk, isolat akan tumbuh
berbentuk bulat, dengan warna yang beragam dan besar diameter yang beragam
pula.
- Uji Ornitin (Wahyunio, 2011)
Pada pengujian ditahap ini kita menggukan media MIO untuk dapat
mengetahui reaksi terhadap ornitin, dapat juga digunakan untuk megetahui ada
atau tidaknya pergerakan bakteri yang diuji serta kemampuan bakteri tersebut
dalam penghasilan indol.
- Uji H2S (Didje et al., 2006)
Uji H2S biasa digunakan untuk mengetahui kemampuan mikroorganisme
dalam menghidrolisis logam berat yang terdapat pada media biakan. Hasil uji
dinyatakan positif apabila terjadinya pembentukan warna hitam pada media.
27
Cara kerja yang dilakukan adalah dengan menanam isolat pada media TSIA
(Triple Sugar Iron Agar).
- Uji Urease (Ramdany, 2008)
Pengujian ini dilakukan untuk mengetahui apakah suatu bakteri dapat
menghidrolisis atau mendegradasi urea dengan enzim urease. Isolat pertama di
tumbuhkan pada media yang mengandung urea. Beberapa bakteri mampu
menghasilkan enzim urease yang daoan menguraikan urea menjadi amonium
dan CO2. Uji ini dinyatakan positif apabila terjadi perubahan warna dari warna
merah jingga menjadi merah ungu. Apabila telah terjadi perubahan warna maka,
penguraian urea telah terjadi.
- Uji Indol (Ramdany, 2008)
Uji indol adalah uji untuk mengetahui kemampuan mikroorganisme unutk
mmbentuk lapisan cincin yang memiliki warna merah muda pada permukaan
biakan dengan penambahan larutan kovacs. Selain itu, Norman (2008) juga
menyatakan bahwa uji ini mampu menunjukan mampu atau tidaknya suatu
bakteri untul menghidrolisis triptofan dengan memanfaatkan enzim triftophanase.
Cara kerja dari pengujian ini adalah dengan menumbuhkan isolat bakteri pada
media yang mengandung triptofan dan menginkubasi biakan tersebut selama 48
jam pada suhu 37 0C. Kemudian dilakukan penambahan larutan reagen yang
mengandung paradimetil aminobenzal dehida.
- Uji V-P (Ramdany, 2008)
Uji V-P (Vogues-Proskauer) digunakan untuk menguji kemampuan bakteri
atau mikroorganisme untuk bereaksi dengan asetonin dan oksigen yang
menghasilkan fermentasi akhir berupa asetil metil karbinol. Cara kerja dari
pengujian ini adalah isolat ditumbuhkan pada media yang mengandung glukosa
dan diinkubasi selama 48 jam pada suhu 37 0C. Lalu, dilakukan penambahan
reagen KOH 40 % dan 15 tetes larutan alpha naphtol.
28
- Uji Gelatin (Ramdany, 2008)
Uji gelatin digunakan untuk mengetahui kemampuan mikroorganisme
dalam mencairkan gelatin. Cara kerja dari uji ini adalah dengan cara menusukan
isolat bakteri kedalam media semi pada yang mengandung nutrient kaldu dan
gelatin dan kemudian diinkubasi pada suhu 35 0C dan diamati. Gelatin yang telah
mencair setelah diinkubasi kemudia diletakkan kedalam lemari es selama 30
menit. Apabila bakteri dapat mencerna gelatin maka, media semi padat gelatin
tersebut akan tetap berbentuk cair, apabila bakteri tidak mampu mencerna
gelatin, maka media akan menjadi beku.
- Uji Sitrat (Ramdany, 2008)
Uji sitrat ini biasanya dilakukan untuk mengetahui dan menguji apakah
bakteri atau mkiroorganismee mampu memfermentasikan asam sitrat sebagai
sumber karbon satu-satunya pada media. Biasanya terjadinya fermentasi asam
sitrat terjadi dengan terjadinya perubahan warna pada media menjadi biru perusi
yang dinyatakan dengan hasil yang positif (+). Apabila tidak terjadi perubahan
warna maka, hasil yang didapatkan adalah negatif (-). Bakteri yang mengalami
perubahan menandakan bahwa bakteri tersebut memiliki enzim sitrat yang
merupakan enzim yang spesifik pembawa sitrat menuju kedalam sel.
- Uji Lisin (Wayan, 2007)
Uji lisin biasanya digunakan untuk mengetahui reaksi bakteri terhadap
asam amino, dan selain itu pengujian ini bertujuan untuk mengetahui apakah
bakteri yang diperiksa akan membetuk asam sulfida dan terjadi perubahan pH
media.
- Uji Arginin (Ramdany, 2008)
Pada pengujian arginin cara kerja yang dilakukan hampir sama dengan
kerja uji lisin. Pengujian ini dilakukan unutk mengetahui reaksi apakah yang
terjadi pada bakteri terhadap asam amino yang lebih kompleks. Apabila uji ini
29
dinyatakan positif (+) maka bakteri mampu bereaksi dengan asam amino, dan
apabila bakteri mendapatkan hasil negatif (-) maka, bakteri tidak mampu bereaksi
dengan asam amino kompleks.
- Uji Gula-gula (Tedja, 2007)
Uji gula-gula digunakan untuk mengetahui kemampuan suatu
mikroorganisme dalam mendegradasi dan memfermentasikan karbohidrat yang
akan disertai dengan adanya pembentukan asam maupun gas yang meliputi uji :
glukosa, sukrosa, laktosa, manitol, galaktosa dan maltosa.
30
4. HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Isolasi Bakteri
Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan bahwa bakteri yang diisolasi
dari endofit mangrove Excoecaria agalloca mampu tumbuh dan berkembang biak
pada media uji yaitu pada media LBA (Luria bertani agar). Bakteri yang tumbuh
tersebut didapatkan dari pengenceran 10-3 - 10-6 yang telah ditanam dari endofit
mangrove Excoecaria agalloca (daun, batang, dan akar) yang telah ditumbuk
dan ditanam pada media LBA (Luria bertani agar), untuk dilakukan inkubasi
selama 24 jam. Setelah dilakukan inkubasi maka akan tumbuh koloni bakteri
yang kemudian dilakukan pemurnian koloni dengan menggunakan metode
streak kuadran. Setelah dilakukan streak kuadran kemudian dilakukan inokulasi
bakteri pada agar miring yang selanjutnya untuk dilakukan uji aktivitas L-
asparaginase. Menurut Kismiati et al. (2009), streak kuadaran dilakukan untuk
memisahkan bakteri satu dengan bakteri yang lain yang berbeda spesies pada
satu habitat yang sama. Dari penanaman yang dilakukan didapatkan 12 isolat
bakteri yang akan dilakukan untuk skrining bakteri penghasil enzim L-
Asparaginase. Isolat bakteri yang terpilih merupakan isolat yang berwarna putih
kekuningan, berbentuk bulat dengan tepian tidak rata dan membentuk elevansi
yang datar serta terpisah dari koloni yang lain. Hal tersebut sesuai dengan
pernytaan Prihanta (2008), bahwa bakteri endofit adalah bakteri yang memiliki
bentuk bulat (circulair), berwarna putih kekuningan, dan terpisah antara satu
sama lain.
Setelah didapatkan 12 isolat bakteri hasil dari pengenceran maka
dilakukan pemurnian bakteri dengan melakukan strik 3 kuadran pada media LBA
dan kemudian dilakukan inokulasi pada agar miring dan jumlah isolat dapat
dilihat pada Tabel 2.
31
Tabel 1. Endofit yang menghasilkan isolat bakteriJenis Endofit Jumlah IsolatDaun 4Batang 4Akar 4Total 12
4.2 Bakteri Penghasil L-Asparaginase
Dari 12 isolat bakteri yang didapatkan dilakukan uji skrining bakteri
penghasil L-Asparaginase dengan menggunakan media selektif L-Asparaginase.
Gambar hasil dari skrining yang telah dilakukan dapat dilihat pada Gambar 6.
Gambar 1. Hasil uji bakteri penghasil L-Asparaginase dari isolat Excoecariaagalloca, A. D10-4, B. D10-5, C. B10-4, D. B10-3, G. B10-5.
Dari gambar diatas dapat diasumsikan pada tabel 2 yaitu menyatakan
bahwa bakteri endofit yang mampu untuk menghasilkan zona aktivitas enzim L-
asparaginase adalah bakteri pada D10-4 dengan lebar zona aktivitas 0,9 cm,
pada D10-5 dengan lebar zona aktivitas 0,8 cm, pada B10-4 dengan lebar zona
aktivitas 1 cm, pada B10-3 dengan lebar zona aktivitas 1,5 cm, dan pada B10-5
dengan lebar zona 1,2 cm.
32
Tabel 2. Hasil Bakteri Endofit Penghasil L-AsparaginaseKode Sampel Zona Aktivitas EnzimD10-3 -D10-4 +D10-5 +D10-6 -B10-3 ++B10-4 +B10-5 +B10-6 -A10-3 -A10-4 -A10-5 -A10-6 -
Keterangan :+++ : Zona Aktivitas Enzim Besar (2,5 – 3,4 cm)++ : Zona Aktivitas Enzim Sedang (1,5 – 2,4 cm)+ : Zona Aktivitas Enzim Kecil ( 0,5 – 1,4 cm)- : Tidak Ada Zona Aktivitas Enzim
Dari kelima isolat yang memiliki aktivitas enzim L-asparaginase paling
baik adalah pada sampel B10-3 dilihat dari lebar zona berwarna biru yang telah
terbentuk pada sekitar koloni yang tumbuh. Selanjutnya akan dilakukan isolasi
dan kultur kembali untuk dilakukan uji microbact system dan pewarnaan gram.
Adanya perubahan warna pada media uji adalah terjadinya aktivitas
enzim L-asparaginase yang merubah L-asparagin menjadi asam aspartat dan
ammonia. Perubahan warna pada media uji juga disebabkan karena adanya
perubahan media yang menjadi basa (Gulati et al., 1997). Bromotymol blue
(BTB) digunakan sebagai indikator perubahan warna pada suatu media, apabila
media tersebut bersifat asam maka dengan ditambahkan dengan BTB akan
berubah warna menjadi kuning dan sebaliknya ketika media bersifat basa maka
akan berubah warna menjadi biru. BTB juga merupakan indicator warna yang
lebih menonjol dibandingkan dengan menggunakan indikator warna phenol red.
Hal tersebut dikarenakan BTB mampu memberikan kontras warna yang tajam
(biru tua pada pH basa) dan juga mampu untuk memberikan warna yang lebih
jelas pada zona yang terhidrolisis, sehingga efektif untuk menjadi indikator
33
perubahan warna pada media tumbuh mikroorganisme penghasil enzim L-
asparaginase (Mahajan et al., 2013).
4.3 Isolasi Koloni
Isolasi koloni dilakukan untuk mendapatkan isolat murni yang selanjutnya
akan digunakan untuk uji pewarnaan gram dan uji microbact system. Isolat yang
akan diuji adalah isolat yang memiliki aktivitas L-asparaginase yang baik, yaitu
isolat B10-3 . Isolat murni yang telah didapatkan akan dilakukan uji pewarnaan
gram dan uji microbact system. Uji tersebut bertujuan untuk mengetahui jenis
dan spesies dari bakteri yang telah didapatkan.
Pada proses uji tersebut isolat yang telah murni ditanam pada media
TCBSA (Thiosulfate Citrate Bile Salt Agar) dengan menggunakan cawan petri.
Adapun hasil isolat yang tumbuh pada media tersebut memiliki karakteristik
berwarna krem, dengan diameter koloni 3,11 mm, berbentuk bulat, tepi koloni
tidak rata, elevansi koloni datar, dan konsistensi koloni basah. Hasil isolat
tersebut dapat dilihat pada gambar 7.
4.4 Identifikasi Bakteri
Identifikasi bakteri merupakan tahapan terakhir pada penelitian ini.
Identifikasi ini dilakukan dengan uji pewarnaan gram dan uji microbact system
Gambar 2. Isolat murni dari bakteri B10-3
34
yang bertujuan untuk mengetahui sifat gram dan sifat biokimia pada bakteri yang
telah didapatkan, sehingga dapat ditentukan jenis serta spesiesnya.
4.4.1 Uji Pewarnaan Gram
Uji pewarnaan gram dilakukan untik mengetahu sel bakteri dari
pewarnaan dan bentuk dari bakteri, tergolong dalam bakteri gram positif atau
gram negatif. Apabila sel bakteri berwarna ungu maka termasuk bakteri gram
positif karena bakteri tersebut mengikat kompleks zat kristal warna ungu-violet,
sedangkan apabila bakteri tersebut berwarna merah maka termasuk dalam
bakteri gram negative karena bakteri mengikat zat warna sekunder yaitu safranin.
Bakteri gram positif akan mempertahankan zat warna kristal violet
sehingga akan tampak berwarna ungu tua di bawah mikroskop. Adapun bakteri
gram negatif akan kehilangan zat warna kristal violet setelah dicuci dengan
alkohol, kemudian diberi zat pewarna tandingan yaitu safranin akan tampak
berwarna merah. Perbedaan warna tersebut disebabkan oleh adanya perbedaan
struktur kimiawi pada dinding selnya (Nofiani dan Gusrizal, 2004).
Pada hasil yang didapatkan bakteri B10-3, bahwa bakteri tersebut
termasuk dalam golongan bakteri gram positif karena memiliki warna ungu.
Bakteri tersebut memiliki bentuk sel basil dengan motilitas non motil. Memiliki
diameter koloni 3,11 mm. Adapun gambar bakteri dapat dilihat pada Gambar 8.
Gambar 3. Sel bakteri gram positif dari bakteri B10-3
35
4.4.2 Uji Microbact System
Setelah dilakukan uji pewarnaan gram dan diketahui bahwa isolat bakteri
merupakan jenis bakteri gram positif, maka dilakukan tahap identifikasi bakteri
dengan menggunakan microbact system. Sebelum dilakukan uji microbact
system dilakukan terlebih dahulu uji oksidase, apabila uji oksidase yang telah
dilakukan hasilnya positif maka menggunakan microbact 24E, dan apabila hasil
dari uji oksidase tersebut negatif maka menggunakan microbact 12E
(Murtiningsih,1997).
Pada hasil yang didapatkan bakteri B10-3, bahwa bakteri tersebut
memiliki uji oksidase positif, sehingga pada uji microbact system ini
menggunakan microbact 24E. Pada uji tersebut akan dilakukan uji meliputi uji
motilitas, oksidase, spora, nitrat,lysine, ornithin, H2S, glukosa, manitol, xylosa,
ONPG, indole, V-P, sitrat, TDA, gelatin, moalonat, inositol, rhammnosa, sukrosa,
laktosa, arabinosa, adonitol, raffinosa, salicin,arginin, katalase, koagulase,
hemolisa, starch hydrolysis, casein hydrolysis. Dengan hasil identifikasi yang
menyebutkan bahwa bakteri B10-3 adalah spesies Bacillus subtilis. Adapun hasil
identifikasi dapat dilihat pada Tabel 4.
Tabel 3. Hasil Identifikasi dengan Microbact systemNo. Uji Biokimia Penelitian Bergey’s Rohmah (2017)1 Spora + + +2 Oksidase + + +3 Motilitas - + +4 Nitrat + + -5 Lysin - Tidak diuji -6 Ornithin - Tidak diuji -7 H2S - Tidak diuji -8 Glukosa + + +9 Manitol + + +10 Xylosa + + +11 ONPG + Tidak diuji +12 Indole - Tidak diuji -13 Urease - Tidak diuji -14 V-P + Tidak diuji +15 Sitrat - + -16 TDA - Tidak diuji -
36
No. Uji Biokimia Penelitian Bergey’s Rohmah (2017)17 Gelatin - + -18 Malonat - Tidak diuji -19 Inositol - Tidak diuji -20 Rhamnosa - Tidak diuji -21 Sukrosa - + -22 Lactosa - - -23 Arabinosa + + +24 Adonitol - Tidak diuji -25 Raffinosa - Tidak diuji -26 Salicin - Tidak diuji -27 Katalase + + +28 Arginin - Tidak diuji -29 Koagulase - Tidak diuji -30 Beta Hemolisa + Tidak diuji +
31Uji sensitive Novobiosin
- Tidak diuji-
32 Starch hydrolysis + + +33 Casein hydrolysis + + +
Dari hasil yang didapatkan pada Tabel 4, dapat dijelaskan sebagai
berikut:
a. Uji Fermentasi Gula
Berdasarkan hasil identifikasi bakteri dengan menggunakan uji microbact
24E, maka isolat bakteri B10-3 termasuk dalam spesies Bacillus subtilis.
Adapaun fermentasi gula-gula yang dihasilkan bernilai positif adalah glukosa,
manitol, xylosa, dan arabinosa. Sedangkan yang bernilai negatif adalah malonat,
inositol, rhamnosa, sukrosa, laktosa, adonitol, raffinosa, salicin, dan arginin.
Menurut Yousef dan Clastrom (2003), umumnya bakteri menggunakan sumber
karbon dari gula-gula yang paling sederhana untuk fermentasi. Tidak adanya
sumber gula sederhana akan membuat bakteri memanfaatkan sumber gula
kompleks untuk difermentasi. Hal tersebut dapat dilihat bahwa kemampuan isolat
B10-3 dapat memfermentasi komponen gula glukosa, manitol, xylosa, dan
arabinosa.
37
b. Uji Karakteristik Biokimia
- Spora
Hasil dari pewarnaan endospora adalah positif. Pewarnaan endospora
tersebut dilakukan untuk mengetahui ada atau tidaknya pembentukan endospora
pada bakteri. Endospora dapat dihasilkan oleh bakteri yang mampu untuk
bertahan hidup pada lingkungan yang kurang menguntungkan, misalkan pada
lingkungan yang panas, asam dan asin bakteri yang memiliki endospora dapat
bertahan hidup dan bertumbuhkembang pada lingkungan tersebut dalam jangka
waktu yang cukup lama (Travis, 2007).
Endospora merupakan struktur intraseluler yang akan terbentuk apabila
kondisi lingkungan tidak memungkinkan untuk keberlangsungan hidup sel
vegetatif bakteri. Endospora memiliki tingkat resistensi yang tinggi pada saat
kekurangan nutrient, tahan pada suhu tinggi, radiasi sinar UV, pembekuan,
kekeringan, serta terkena bajan kimia (Cappuccino dan Sherman, 2005).
- Oksidase
Hasil dari oksidase adalah positif. Dengan hasil oksidase yang positif
maka akan menentukan reagen kit yang digunakan. Karena oksidasenya positif
maka menggunakan reagen kit 24E. Tujuan dari adanya uji ini adalah untuk
mengakumulasi energi pada mikroba yang akan diuji. Oksidase pada umumnya
akan dilakan pada respirasi aerob dan menghasilkan CO2 dan H2O.
- Motilitas
Hasil dari motilitas adalah negatif. Uji ini berperan untuk mengetahui
terjadinya pergerakan pada bakteri. Menurut Volk (1988), kemampuan suatu
bakteri untuk bergerak disebut dengan motilitas. Bakteri yang mampu bergerak
disebut dengan motil dan bakteri yang tidak bergerak disebut immotile. Hal ini
disebabkan karena adanya alat motorik cambuk yang disebut dengan flagella
sehingga sel bakteri dapat bergerak pada media cair.
38
- Nitrat
Hasil dari uji nitrat adalah positif. Dengan ditandai adanya perubahan
warna medium menjadi warna merah bata. Nitrat merupakan senyawa yang
potensial untuk menggantikan peran oksigen sebagai akseptor hydrogen pada
saat pembentukan energi (Cappuccino dan Sherman, 2005).
- Lysin
Hasil dari lysine adalah negatif. Dengan ditandai adanya perubahan
warna menjadi kuning. Pemecahan lisin oleh enzim dekarboksilase akan
menghasilkan karbondioksida yang akan berperan pada pembentukan dinding
sel dan proses metabolisme sel pada mikroorganisme (Cappuccino dan
Sherman, 2005).
- Ornithin
Hasil dari ornithin adalah negatif. Dengan ditandai adanya perubahan
warna menjadi kuning. Hal tersebut menunjukan bahwa isolat bakteri tidak
mampu dalam menguraikan gugus karboksil dari ornithin.
- H2S
Hasil dari H2S adalah negatif. H2S yang dilepaskan akan berikatan
dengan Fe3+ dari ferrous ammonium sulfat pada media SIM agar akan berikatan
danmembentk endapan ferrous berwarna hitam, endapan tersebut dapat terlihat
disepanjang inokulasi dan menunjukkan bahwa adanya reaksi positif, adapun
sebaliknya jika tidak terjadi perubahan apapun pada media, maka menunjukkan
reaksi negatif (Cappuccino dan Sherman, 2005).
- ONPG
Hasil dari ONPG positif, ditandai dengan adanya perubahan warna
menjadi kuning. Reaksi yang terjadi yaitu hidrolisis o-nitrofenil-β-d-
galactopyranoside (ONPG) melalui β-galactosidase.
39
- Indol
Hasil dari indol adalah negatif, hal tersebut berarti bahwa bakteri tidak
dapat menghasilkan indol yang akan tampak seperti cincin berwarna merah pada
proses reaksi deaminasi dan asam piruvat yang akan dimanfaatkan pada saat
proses fermentasi. Uji indol bertujuan untuk mengidentifikasi kemampuan bakteri
dalam menghasilkan indoldengan menggunakan enzim tryptophanase (Leboffe,
2011). Bakteri yang memiliki enzim tryptophanase akan menghidrolisis
tryptophan menjadi indol, piruvat dan ammonia. Dengan demikian dapat
digunakan sebagai bagian dari prosedur IMViC, yaitu sebuah tes yang dirancang
untuk membedakan antara anggota keluarga dari Enterobacteriaceae (Farmer et
al., 1985).
- Urease
Hasil uji urease adalah negatif, hal ini ditunjukkan karena tidak adanya
perubahan warna pada media uji. Uji urease dilakukan untuk mengidentifikasi
mikrorganismee yang mampu untuk menghidrolisis urea yang dapat
menghasilkan ammonia dan karbondioksida. Urea yang akan dihidrolisis oleh
mikroorganisme yang memiliki positif urease akan menjadi ammonia dan dapat
mengatasi buffer dalam jangka menengah dan mengubahnya dari orange
menjadi merah muda (Leboffe, 2011).
- V-P
Hasil dari V-P adalah positif, hal ini ditunjukkan dengan adanya
perubahan warna menjadi merah muda. Uji V-P dilakukan untuk mendeteksi
acetion dalam kultur cair bakteri. Pengujian ini dilakukan dengan menambahkan
alpha-naftol dan kalium hidroksida dengan kaldu Viges Proskauer yang telah
diinokulasi dengan bakteri. Uji ini bergantung terhadapt tingkat pencernaan
glukosa menjadi acetymethylcarbinol. Apabila glukosa pecah, maka akan
bereaksi dengan alpha-naftol dan kalium hidroksida untuk membentuk warna
40
merah muda. Alpha-naftol dan kalium hidroksida merupakanbahan kimia yang
dapat mendeteksi adanya acetoin (Sridhar, 2006).
- Sitrat
Hasil uji menunjukkanbahwa sitrat adalah negatif, hal tersebut
dikarenakan tidak adanya perubahan warna. Uji sitrat dilakukan untuk
mendeteksi tingkat kemampuan suatu organisme untuk memanfaatkan sitrat
sebagai satu-satunya sumber karbon dan energi. Bromothymol blue digunakan
sebagai indikator saat asam sitrat dimetabolisme, dan akan menghasilkan
karbondioksida yang akan digabungkan dengan natrium dan air untuk
membentuk natrium karbonat yang merupakan produk alkaline yang membuat
perubahan warna dari hijau menjadi biru dan menunjukkan tes positif
(Sridhar,2006).
- TDA
Hasil dari uji TDA adalah negatif, karena tidak adanya perubahan warna.
Hasil negatif juga dikarenakan bakteri tidak memiliki enzim tryptophan
deaminase, sehingga tidak dapat membentuk asam indolepiruvate dari
tryptophan yang menghasilkan warna coklat dengan adanya ion ferric dari TDA
reagent.
- Katalase
Hasil uji katalase adalah positif. Hal tersebut dapat diartikan bahwa
bakteri tersebut mampu untuk menghasilkan enzim katalase. Uji ini dilakukan
untuk mengetahui kemampuan isolat dalam menghasilkan enzim katalase dan
memiliki toleransi terhadap oksigen. Menurut Brooks et al. (2005), enzim katalase
merupakan enzim yang dapat mengkatalis secara langsung konversi hydrogen
proksida (H2O2) yang bersifat toksik pada sel bakteri menjadi air (H2O) dan
oksigen (O2).
41
Uji katalase dilakukan dengan cara member 1-2 tetes H2O2, pada kultur
bakteri uji yang memiliki umur 24 jam. Adanya reaksi positif pada uji katalase ini
akan ditunjukan dengan terbentuknya gelembung-gelembung. Gelembung
tersebut berarti terdapat pembentukan gas O2 pada bakteri uji. Dengan
terbentuknya gas dapat diartikan bahwa bakteri Bacillus subtilis merupakan
bakteri aerob. Menurut Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology Sevent
Edition oleh Breed et al. (1957), dikatakan bahwa bakteri Bacillus subtilis
merupakan bakteri aerob, dengan strain anaerob fakultafif. Bakteri tersebut akan
tumbuh sedikit apabila glucose broth dalam keadaan anaerob. Untuk kultur yang
memiliki umur 14 hari akan memiliki pH 5,5 atau lebih.
Mikroorganisme yang terdapat pada tanaman mampu memproduksi
berbagai metabolit sekunder yang memiliki kemampuan sebagai antibakteri.
Sumber daya mikroorganisme tersebut dikenal dengan mikroba endofit. Mikroba
endofit merupakan mikroorganisme yang sebagian atau seluruh siklus hidupnya
berada pada jaringan tumbuhan (batang, cabang, ataupun ranting), yang
keduanya dapat menjalin hubungan yang saling menguntungkan (Kumala et al.,
2006).
4.4.3 Bacillus subtilis
Klasifikasi Bacillus subtilis Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology
(1957) :
Kingdom : ProcaryotaeDivisi : BacteriaClass : SchizomycetesOrdo : EubacterialesFamili : BaciliaceaeGenus : BacillusSpesies : Bacillus subtilis
Dari hasil yang didapatkan bakteri B10-3, bahwa bakteri tersebut termasuk
dalam golongan bakteri gram positif karena memiliki warna ungu. Bakteri
42
tersebut memiliki bentuk sel basil dengan motilitas non motil. Memiliki diameter
koloni 3,11 mm. Memiliki reaksi oksidase dan katalase positif. Dengan warna
koloni krem dan berbentuk bulat. Memiliki tepi koloni yang tidak rata, elevansi
koloni datar, dan konsistensi koloni basah.
Bacillus subtilis adalah bakteri Gram positif, memiliki bentuk batang yang
membentuk rantai, terdapat beberapa spesies aerob obligat dan juga anaerob
fakultatif, memiliki endospora sebagai struktur yang mampu bertahan pada
kondisi lingkungan yang tidak mendukung. Suhu optimum pada pertumbuhan
Bacillus subtilis adalah 30-37°C, dengan suhu minimum 18°C dan maksimum
43°D (Korsten dan Cook, 1996).
Pada Bergey’s Manual of Systemic Bacteriology, edisi ke-2 (2004),
disebutkan bahwa sel Bacillus subtilis berukuran 1 x 3,4 µm, berbentuk batang
dan tersusun menjadi rantai yang panjang. Dengan memiliki spora yang terletak
pada tengah sel, tidak bergerak dan memiliki flagella (Jawetz et al., 1996).
Pada GRAS Notice (GRN) No. 649 dijelaskan bahwa Bacillus subtilis
adalah bakteri non-patogen dan non-tosik yang merupakan bakteri gram positif
dan memiliki karakteristik yang baik serta banyak digunakan pada produksi food-
grade enzyme. Bacillus subtilis merupakan mikroorganisme saprophytic yang
dapat ditemukan dimana-mana, biasanya dapat ditemukan di air, tanah, udara,
dan residu pada tanaman yang membusuk.
43
5. KESIMPULAN DAN SARAN
5.1 Kesimpulan
Berdasarkan hasil penelitian yang telah diperoleh maka dapat diambil
kesimpulan bahwa terdapat isolat bakteri endofit yang mampu menghasilkan enzim
L-asparaginase dari akar, batang, dan daun mangrove Excoecaria agalloca adalah
isolat D10-4, D10-5, B10-3, B10-4 dan B10-5.
Isolat B10-3 adalah bakteri gram positif dan menurut uji microbact system
yang telah dilakukan bakteri tersebut adalah spesies Bacillus subtilis.
5.2 Saran
Berdasarkan hasil penelitian yang telah diperoleh maka disarankan untuk
melakukan penelitian lebih lanjut dengan menggunakan uji secara genotip dengan
identifikasi molekular gen penyandi 16S r-RNA.
44
DAFTAR PUSTAKA
Antara, N.S. 2009. Mengurangu Pembentukan Akrilamida dengan MenggunakanEnzim dan Mikroba pada Produk Pangan. FTP. UNUD.
Arrizal, S., Rachmadiarti, F., dan Yuliani. 2013. Identifikasi Rhizobakteri padaSemanggi (Marsilea crenata Presl.) yang Terpapar Logam Berat Timbal (Pb).Lent. Bio. 2(1):165-169.
Ballows, A. Butnick, S. and Loyd, J. R. 1991. Manual of Clinical Micorbiology.Washington DC. Press.
Borek, D., dan Jaskolski, M. 2001. Sequence Analysis of Enzymes withAsparaginase Activity. 48(2): 893-902.
Breed, R.S., Murray, E.G.D., dan Smith, N.R. 1957. Bergey’s Manual ofDeterminative Bacteriology Seventh Edition. The Williams and WilkinsCompany. 620-621 hlm.
Brock, T.D and Brock, K.M. 1978. Basic Microbiology with Application. 2nd edition.New Jersey : Prentice Hall.
Brooks, G.F., Butel, J.S., dan Morse, S.A. 2005. Mikrobiologi Kedokteran Jilid I.Jakarta: Salemba Medika.
Cappuccino, J. .G dan Sherman, N. 1992. Microbiology a Laboratory Mannual. TheBenjamin/Cumming Publish. USA: 458.
Ciesarova, Z., Kiss, E., dan Boegl, P. 2006. Impact of L-asparaginase on AcrylamideContent In Potato Products. J. Food Nutr Res. 45(1): 141-146.
Darmayasa, I.B.G. 2008. Isolasi dan Identifikasi Bakteri Pendegradari Lipid (Lemak)pada Beberapa Tempat Pembuangan Limbah Estuari DAM Denpasar. J.Bumi Lestari. 8(1): 122-127.
Didje, N. Dan Sartini. 2006. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Laboratorium Biologi Farmasi.Universitas Hassanudin. Makasar.
El-Bessoumy, A.A., Sarhan, M., dan Mansour, J. 2004. Pruduction, Isolation, andPurification of L-Asparaginase from Pseudomonas aeruginosa 50071 usingSolid-state Fermentation. J. Biochem and Mol Bio. 4(37): 387-393.
El-Naggar, N.E., El-Ewasy. S., and El-Shweihy. N.M. 2014. Microbial L-Asparaginase as a Potential Therapeutic Agent for the Treatment of AcuteLymphoblastic Leukimia : The Pros and Cons. Int J. Phrm.10(4): 1811-7775.
Farmer, J. J., Clin, J., dan Micro, J. 1985. Biochemical Identificatiom of New Speciesand Biogroups of Enterobacteriaceae Isolatd from Clinical Specimens. J.ClinMicro. 21(1): 46-76.
45
Gulati, R., Saxena, R.K., dan Gupta, R. 1997. A Rapid Plate Assay for Screening L-Asparaginase Producing Micro-Organismes. Lett Appl. Micro. 24(1): 23-26.
Hadioetomo, R.S. 1995. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek. PT. Gramedia. Jakarta.
Hendriksen, H. V., Kornbrust, B. A., Ostergaard, P.R., dan Stringer, M.A. 2009.Evaluating the Potential for Enzymatic Acrylamide Mitigation in a Range ofFood Products using an Asparaginase from Aspergillus oryzae. J. Agri.andFood Chem. 57(10): 4168-4176.
Jawetz, E., Melnick, J.L., dan Adelberg, E.A. 1996. Mikrobiologi Kedokteran Edisi ke-20. Penerbit Buku Kedokteran : Jakarta.
Jayam, D. G. and Kannan,S. 2014. The Various Sources of L-Asparaginase. Int. J.Rec Sci Res. 5(2): 34-346.
Kasi, Y.A., Posangi, J., Wowor, P.M., dan Bara, R. 2015. Uji Efek Antibakteri JamurEndofit Daun Mangrove Avecennia marina Terhadap Bakteri UjiStaphylococcus aureus dan Shigella sysenteriae. J. e-Bm. 3(1): 112-117.
Kharisma dan Abdul. 2012. Aktivitas Asam Proteolitik Bakteri Asam Laktat dalamFermentasi Susu Kedelai. UGM: Yogyakarta.
Kishore, V., Nishita, K.P., and Manonmani, H.K. 2015. Cloning, Expression andCharacterization og L-Asparaginase from Pseudomonas fluorescens forLarge Scale Production in E. coli BL21. Spring 3 Bio 5(1):975-981.
Kismiyati., Subekti, S., Yusuf, R.W.N., dan Kusdarwati, R. 2009. Isolasi danIdentifikasi Bakteri Gram Negatif pada Luka Ikan Mas Koki (Carassiusauratus) Akibat Interfasi Ekoparasit Argulus sp. J. Ilm Per dan Kel. 1(2):129-134.
Korsten, L dan Cook, N. 1996. Optimizing Culturing Condition for Bacillus Subtilis. SAfri Avoc Grow Assosi Yb. 19 (1): 54-58.
Kumala, S., Fransisca, S., dan Priyo, W. 2006. Aktivitas Antimikroba MetabolitBioaktif Mikroba Endofitik Tanaman Trengguli (Casska fistula L.). J. FarmInd. 3(2): 97-102.
Kurniasari, R.M. 2005. Pengaruh Logam Berat Terhadap PertumbuhanMikroorganisme Pendegradari Minyak Diesel. SKRIPSI. Bogor: IPB.
Lay, B. 1994. Analisa Mikroba di Laboratorium. Raja Grafindo Persada: Jakarta.
Leboffe, M.J. dan Pierce, B.E. 2011. A Photographic Atlas for The MicrobiologyLaboratory. 4Th Edition. Morton Publishing Company. USA.
Lehninger, A. L. 1990. Dasar-dasar Biokimia. Alih Bahasa Dr. Ir. MaggyThenawidjaja. Bandung: Erlangga.
46
Mahajan, R.V.,Saran, S., Saxena, R.K., dan Srivastava, A.K. 2013. A Rapid,Efficientand Sensitive Plate Assay for Detection and Screening of L-Asparaginase-producing Microorganismes. FEMS Microbiol Lett. 1-5 hlm.
Makky, E.A., Ong, J.J., Karim, M.R., and Lee, C.M. 2013. Production andOptimization of L-Asparaginase by Bacillus sp. KK2S4 from Corn Cob. Afr J.Biotechnol. 12(19): 2654-2658.
Martuti,N.K.T.2013. Keanekaragaman Mangrove di Wilayah Tapak, Tugurejo,Semarang. J. MIPA. 36(2): 123-130.
Mayati, B. 2013. Identifikasi Keragaman Bakteri pada Comeal Seed PengolahanLimbah Cair Cat. IPB: Bogor.
Meiyanto, E. 2008. Efek Kemopreventif Ekstrak Etanolik Gynura procumbens (Lour.)Merr Pada Karsinogenesis Kanker Payudara Tikus. Maj Fari Ind. 18(3): 154-161.
Mungi, H., Carvalho, R., Ilegar, S., Ratnamala, G.M., and Priya, V.G.S. 2014.Optimization of L-Asparaginas Production from Pseudomonas fluorescens byResponse Surface Methodology. Int J. Cur Microbiol Appl Sci. 3(11): 350-362.
Murray, P. 2003. Isolation,Purification and Charaterization of The XylanaseProduced by Arthobacter sp. National Institute of Oceanography. DonaPaula.
Murtiningsih. 1997. Evaluation Of The SerobactTM And MicrobactTM System For TheDetection And Identification Of Listeria Spp. Department of Food Scienceand Technology, The university of New South Wales, Sydney, NWS,Australia.
Muslim, S.N., Al-Kadmy, I.M.S., Hussein, N.H., Ali, A.N.M., and Dwaish, A.S. 2015.Enhancement of the Activity and Stability of L-Asparaginase Food AdditivePurified from Acinetobacter baumannii as Anticarcinogenic in ProcessedFoods. Int J. Adv Chem Engg and Bio Sci. 2(1): 1349-1507.
Nikaido, H. 1996. Outer Membrane In: Escherichia coli and Salmonella lyphimurium:Cellular and Molecular Biology. American Society of Microbiology Press.
Nofiani dan Gusrizal. 2004. Bakteri Resisten Merkuri Spektrum Sempit dari DaerahBekas Penambangan Emas Tanpa Izin (PETI) Mandor, Kalimantan Barat. J.Natur Ind. 6(2): 67-74.
Noor, Y.R., Khazali, M., dan Suryadiputra, I.N.N. 1999. Panduan PengenalanMangrove di Indonesia. Wetlands International Indonesia Programme: Bogor.
Norman, P. 2008. Asam Indol Asetat yang Dihasilkan Azosprillium sp. J. AgroBiogen. 3(2): 66-72.
47
Pastra, D. A., Melki., dan Surbakti, H. 2012. Penapisan Bakteri yang Bersimbiosisdengan Spons Jenis Aplysina sp sebagai Penghasil Antibakteri dari PerairanPulau Tegal Lampung. Masp J. 4(1): 77-82.
Presscott. 2002. Laboratory Excercise In Microbiology. The Mac-Graw HillCompanies. New York.
Prihanto, A. A., Firdaus, M., dan Nurdiani, R. 2011. Endophytic Fungi Isolatt from(Rhyzopora mucronata) and Its Antibacterial Activity on Staphylococcusaureus and Escherichia coli. J. Food Sci Engineer. 1(1): 386-389.
Rakhmawati, A. 2012. Penyiapan Media Mikroorganisme. FMIPA. Yogyakarta: UNY.
Ramdany. 2008. Identifikasi Bakteri Vibrio parahaemolitycus Dengan Metode BiologiSecara PCR. J. Sain Tek Farm. 13(1): 1-7.
Richana,N., Lestina, P., dan Irawadi,T.T. 2004. Karakterisasi Lignoselulosa DariLimbah Tanaman Pangan dan Pemanfaatannya Untuk Pertumbuhan BakteriRXA III-5 Penghasil Xilanase. J. Pen Pert Tanam Pangan. 23(3): 171-176.
Rohmah, N. S. 2017. Isolasi dan Identifikasi Bakteri yang Berpotensi sebagai AgenBioremediasi Timbal (Pb) dari Lumpur Lapindo. Skripsi. UIN : Malang.
Safnowandi. 2015. Struktur Komunitas Mangrove Di Teluk Poton Bako SebagaiBuku Panduan Untuk Pemantapan Konsep Ekosistem Pada guru BiologiSMA Di Kabupaten Lombok Timur. J. Ilmi IKIP Mataram. 2(1): 2355-2358.
Sartiono, A. 2007. Profil Mangrove Taman Nasional Baluran. FMIPA ITS : Surabaya.
Sinaga, E., Noverita., dan Fitria, D. 2009. Daya Antibakteri Jamur Endofit yangDiisolasi dari Daun dan Rimpang Lengkuas (Alpinia galangal Sw.). J, FarmInd. 4(4): 161-170.
Sridhar, R. P.N. 2006. Polymerase Chain Reaction (PCR). Dept. Of Microbiology.JJMMC. Davangere.
Suryabrata, S. 1983. Metodologi Penelitian Ilmiah. Raja Grafindo. Jakarta.
Tedja, I. 2007. Seleksi Galur-galur Bradyrhizobium japanicum Resisten LogamBerat. Laporan Penelitian KB VI. FMIPA IPB. Bogor.
Tittsler, M. 1996. Introduction to Soil Microbiology. 2 ed. Willey Eastern Limited, NewDelhi.
Volk, S. 1988. Mikrobiologi Dasar. Erlangga: Jakarta.
Wahyunio. 2011. Dasar-Dasar Biokimia. Universitas Indonesia. Jakarta.
Wayan, dan Qomariah. 2007. Isolasi dan Identifikasi E.coli. Bali J. 52 hlm.
48
Wedhastri, S. 2002. Isolasi dan Seleksi Azotobacterspp. Pengahsil Faktor Tumbuhdan Penghambat Nitrogen dari Tanah Masam. J. Ilmu Tanah dan Lingk. 3(1):45-51.
Yousef, A.E dan Clastrom, C. 2003. Food Microbiology (A Laboratory Manual).Wiley-interscience, John Wiley and Sons, Inc. Ohiostate University : USA.
Yulvizar, C. 2013. Isolasi dan Identifikasi Bakteri Probiotik pada Rastrelliger sp.Biospecies. 6(2): 1-7.
Yuniarsih, M. 2012. Uji Aktivitas Antidiabetes Ekstrak dan Fraksi dari n-HeksanaBuah Ketapang (Terminalia catappa) sebagai Inhibitor α-Glukosidase danPenapisan Fitokimia dari Fraksi Teraktif. UI: Depok.