Mikroba Endofit 2 - univpancasila.ac.id

Mikroba Endofit

2

Prof.Dr.apt. Shirly Kumala, M.Biomed

Pemanfaatan mikroba endofit dalam bidang farmasi

ISBN : 978-623-93512-1-2

Mikroba Endofit 2Pemanfaatan Mikroba Endofit dalam Bidang Farmasi

Hak Cipta dilindungi oleh Undang-undang

Diterbitkan pertama kali oleh:PT. ISFI Penerbitan Tahun terbit 2014

Edisi ke 2Tahun terbit 2019

Penulis :Prof. Dr. apt. Shirly Kumala, M. Biomed

Editor :Dr.apt. Prih Sarnianto, M.Sc

Desain Cover & layout :Guguh SujatmikoRamli Badrudin

PT. ISFI PenerbitanJl. Wjaya Kusuma No.17 Tomang Jakarta Barat 11430Fax: 021-56943842email: [email protected]

1. Barang siapa dengan sengaja melanggar dan tanpa hak melakukan perbuatan sebagaimana dimaksud dalam Pasal 2 Ayat (1) atau Pasal 49 Ayat (1) dan Ayat (2) dipidana dengan pidana penjara masing-masing paling singkat 1(satu) bulan dan/atau paling lama 7 (Tujuh) tahun dan/ atau denda paling banyak Rp. 5.000.000.000,- (lima miliar rupiah)

2. Barang siapa dengan sengaja menyiarkan, memamerkan, mengedarkan atau menjual kepada umum suatu ciptaan atau barang hasil pelanggarn Hak Cipta atau hak terkait sebagaimana dimaksud dalam Ayat (1), dipidana dengan pidana penjara paling lama 5 (lima) tahun dan/atau denda paling banyak Rp. 500.000.000,- (lima ratus juta rupiah).

Sanksi Pelanggaran Pasal 72 Undang-undang Nomor 19 Tahun 2002 - Tentang Hak Cipta

Mikroba Endofit, Pemanfaatan Mikroba Endofit dalam Bidang Farmasivi

Mikroba Endofit, Pemanfaatan Mikroba Endofit dalam Bidang Farmasi i

kata PEnGantar

MIKROORGANISME seperti bakteri, kapang dan khamir dapat dimanfaatkan sebagai sumber obat. Mikroba yang hidup di dalam tanaman dikenal sebagai mikroba endofit. Mikroba yang hidup di dalam jaringan tanaman dalam kurun waktu tertentu dan tidak menyebabkan kerugian pada tanaman yang ditumpanginya. Selain itu, mikroba endofit dapat menghasilkan metabolit sekunder yang menyerupai khasiat dari tanaman inangnya.

Sifat mikroba endofit yang dapat menghasilkan metabolit sekunder berkhasiat tersebut memungkinkan pengembangan mikroba menjadi sumber bahan baku obat yang berasal dari alam. Pemanfaatan mikroba endofit sebagai sumber metabolit sekunder akan membuat produksi bahan baku obat alam lebih efisien dan ramah lingkungan. Mikroba dapat tumbuh lebih cepat dan membutuhkan ruang jauh lebih kecil daripada pohon atau tanaman obat lainnya. Lebih dari itu, dengan memanfaatkan mikroba endofit sebagai sumber bahan baku obat alam, tidak diperlukan lagi penebangan pohon atau tanaman yang berkhasiat obat sehingga kemungkinan eksploitasi alam yang berlebih dan segala akibat buruknya dapat dihindari.

Penelitian tentang mikroba endofit belum banyak dilakukan, karena itu perlu ditingkatkan. Dalam buku ini diuraikan berbagai aspek terkait mikroba yang unik tersebut, termasuk cara untuk mengisolasi dan menetapkan aktivitas biologi metabolit sekunder yang dihasilkan.

Penerbitan buku ini diharapkan dapat ikut mendorong penelitian tentang mikroba endofit sehingga meningkatkan peluang untuk penemuan metabolit sekunder yang berpotensi untuk dikembangkan menjadi bahan baku obat. Tetapi, karena berbagai keterbatasan, mungkin masih cukup banyak hal penting yang belum tercakup dalam bukukecil ini. karena itu, Penulis mengharapkan masukan saran dan kritik untuk penyempurnaan edisi selanjutnya.

Jakarta, Agustus 2014

Penulis.

Mikroba Endofit, Pemanfaatan Mikroba Endofit dalam Bidang Farmasiii

kata PEnGantar Edisi kEdua

DALAM 5-6 tahun semenjak penerbitan pertama Buku ini, banyak terjadi kemajuan dalam penelitian tentang mikroba endofit. Penelitian terbanyak terkait bakteri, kapang dan khamir yang hidup di dalam jaringan tanaman dan menghasilkan metabolit sekunder yang menyerupai metabolit dari tanaman inang ini masih di bidang pertanian secara luas, termasuk peternakan. Namun demikian, banyak pula hasil penelitian baru di bidang kefarmasian. Kemajuan yang disebut terakhir inilah yang coba Penulis sampaikan pada buku Mikroba Endofit Edisi Kedua ini.

Dapat menghasilkan metabolit sekunder yang menyerupai metabolit inang sehingga “khasiat” atau aktivitasnya pun serupa mikroba endofit memungkinkan untuk dikembangkan menjadi sumber bahan baku obat yang berasal dari alam. Dengan demikian, penelitian mikroba endofit sangat relevan bagi Indonesia. Sebagai negara dengan biodiversitas di dunia, obat dari bahan alam merupakan salah satu keunggulan Indonesia. Saat ini, jamu telah berkembang dari sekadar produk obat tradisonal menjadi jamu saintifik, bahkan ekstrak terstandar dan fitofarmaka yang telah melalui uji klinik laiknya produk obat modern.

Perkembangan jamu menjadi produk modern tersebut tentunya diikuti dengan peningkatan penjualan. Permintaan yang meningkat tersebut membuat industri obat bahan alam yang berkembang memerlukan bahan baku, yaitu simplisia dalam jumlah besar dan terus meningkat. Permintaan bahan baku yang meningkat ini pada gilirannya meningkatkan kebutuhan lahan untuk kebun tumbuhan obat atau, jika sumber simplisia tersebut tidak dapat dibudidayakan, eksploitasi hutan dan sumber alami lainnya.

Dengan mengisolasi mikroba endofit dari tanaman obat tersebut dan membudidayakannya, bahan aktif dapat diperoleh dengan lebih mudah, tanpa harus menyediakan lahan luas untuk penanaman. Dengan pertumbuhan mikroba yang cepat dan tidak memerlukan ruangan yang kelewat luas, industri bahan obat alam tidak perlu berebut lahan dengan industri pangan—lahan yang ketersediaannya terbatas itu dapat lebih banyak dialokasikan untuk perkebunan tanaman pangan atau persawahan. Dengan pemanfaatan mikroba endofit sebagai sumber bahan baku obat alam, kita juga tak perlu lagi melakukan penebangan pohon atau tanaman yang berkhasiat obat sehingga kemungkinan eksploitasi alam yang berlebih dan segala akibat buruknya dapat dihindari.

Seperti pada penerbitan Edisi terdahulu, buku Mikroba Endofit Edisi Kedua ini juga diharapkan dapat ikut mendorong penelitian tentang mikroba endofit, termasuk cara untuk mengisolasi dan menetapkan aktivitas biologi metabolit sekunder yang dihasilkan, sehingga meningkatkan peluang untuk penemuan yang berpotensi untuk dikembangakan menjadi bahan baku obat. Tetapi, mungkin masih cukup banyak hal penting yang belum tercakup dalam buku ini. Penulis mengharapkan masukan saran dan kritik untuk penyempurnaannya.

Jakarta, Agustus 2019

Penulis.

Mikroba Endofit, Pemanfaatan Mikroba Endofit dalam Bidang Farmasi iii

Kata Pengantar ................................................................................................ iDaftar Isi ......................................................................................................... iiiPendahuluan .................................................................................................... 1

bab i Mikroba Endofit .............................................................................................. 4Kapang Endofit................................................................................................ 5Komponen Penghambat................................................................................... 6Interaksi Kapang Endofit dan Tanaman Inang ............................................... 7Keberadaan Endofit di Beerapa Tanaman ...................................................... 10Racun Kapang Endofit..................................................................................... 11Hubungan Simbiosis Kapang Endofit.............................................................. 11Bakteri Endofit................................................................................................. 12

bab ii Biosintesis Metabolit Primer dan Metabolit Sekunder.................................... 14Metabolit Primer.............................................................................................. 15Metabolit Sekunder.......................................................................................... 17Metabolit Sekunder Mikroba Endofit.............................................................. 19Asal mula Metabolit Sekunder........................................................................ 20Hipotesis "antagonisme berimbang" (Balanced Antagonism) ....................... 22Crosstalk Antara Spesies Tumbuhan dan Endofit........................................... 25Crosstalk antar-Spesies Endofit – Endofit ..................................................... 26

bab iii Isolasi dan Identifikasi Mikroba Endofit.......................................................... 30Isolasi Mikroba Endofit .................................................................................. 30

daftar isi

Mikroba Endofit, Pemanfaatan Mikroba Endofit dalam Bidang Farmasiiv

Isolasi baketri endofit dari akar tanaman ........................................................ 34Identifikasi Mikroba Endofit ........................................................................... 37 Identifikasi lanjut isolat bakteri endofit Gram positif ................................. 38 Identifikasi kapang endofit ......................................................................... 39 Identifikasi kapang secara Konvensional ................................................... 39Penyimpanan mikroba endofit ......................................................................... 51 bab iV Uji Aktivitas Biologi Metabolit Sekunder........................................................ 53Teknik Fermentasi ........................................................................................... 53Medium Fermentasi ......................................................................................... 54Faktor-faktor yang mempengaruhi proses fermentasi .................................... 55Ekstraksi dan Fraksinasi ................................................................................. 57Kromatografi ................................................................................................... 57Uji Aktivitas Biologik .................................................................................... 60Uji Bioaktivitas Metabolit Sekunder .............................................................. 60Uji Antimikroba .............................................................................................. 60Teknik dilusi menggunakan Microplate 96 (plat 96 sumur) .......................... 64Uji Aktivitas Anti Kapang .............................................................................. 65Uji Aktivitas Antivirus .................................................................................... 65Uji Antidiabetes secara In Vitro ..................................................................... 66Uji Aktivitas untuk Antikanker ....................................................................... 67Uji Sitotoksik dengan Metoda Biru Tripan .................................................... 68Uji Sitotoksik menggunakan Sel MCF-7 ....................................................... 69Teknik Bioassay Antioksidan ........................................................................ 70Teknik Bioassay Antiinflamasi secara In Vitro............................................... 72Uji Aktivitas Antimalaria ................................................................................ 73Uji Aktivitas Enzim ........................................................................................ 74Uji Imunomodulator ........................................................................................ 76

bab V Pemanfaatan Mikroba Endofit......................................................................... 78 Berbagai Enzim dari Mikroba Endofit ............................................................ 80 Senyawa Antidiabetes dari Mikroba Endofit .................................................. 81 Senyawa Antimikroba dari Mikroba Endofit .................................................. 81Senyawa Antifungsi dari Mikroba Endofit ..................................................... 84

Mikroba Endofit, Pemanfaatan Mikroba Endofit dalam Bidang Farmasi v

Penghambat Proliferasi Lymphocyt dari Mikroba Endofit.............................. 85 Antivirus dari Mikroba Endofit ....................................................................... 85Antioksidan dari Mikroba Endofit ................................................................... 85Anti-inflamasi dari Mikroba Endofit .............................................................. 86Antimalaria dari Mikroba Endofit ................................................................... 86Pemanfaatan Bakteri Endofit di Bidang Pertanian ......................................... 86

bab Vi Prospek Mikroba Endofit................................................................................. 88Pertimbangan Masa Depan : Menjawab Tantangan Masa kini ...................... 89

LAMPIRAN .................................................................................................... 93DAFTAR RUJUKAN...................................................................................... 114INDEKS........................................................................................................... 145

Mikroba Endofit, Pemanfaatan Mikroba Endofit dalam Bidang Farmasivi

Mikroba Endofit, Pemanfaatan Mikroba Endofit dalam Bidang Farmasi 1

HARGA obat yang tinggi masih menjadi masalah kesehatan di negara sedang berkembang. Di Indonesia, mahalnya harga obat tersebut disebabkan oleh kenyataan bahwa lebih dari 90% bahan baku obat — termasuk untuk jenis obat yang telah kedaluwarsa perlindungan patennya (off patent) — masih harus diimpor, terutama dari Cina dan India. Untuk obat yang masih dalam perlindungan paten, semua harus didatangkan dalam bentuk obat jadi yang sangat mahal dari beberapa negara maju, seperti Amerika Serikat, Jerman dan beberapa negara Eropa lainnya, serta Jepang.

Tingginya komponen impor produk obat-obatan tersebut menunjukkan bahwa industri farmasi Indonesia belum mampu, atau belum banyak yang tertarik, pada pengembangan bahan baku obat (active pharmaceutical ingredient). Ketergantungan seperti ini bukan saja menjadi beban secara ekonomi, tetapi juga membuat ketahanan nasional di bidang kesehatan sulit diharapkan untuk cukup kuat karena obat memiliki posisi strategis di bidang yang terkait hajat masyarakat luas.

Peran obat yang demikian besar menuntut kita semua, terutama para peneliti dari lembaga penelitian dan perguruan tinggi, untuk terus mengupayakan sumber bahan baku obat alternatif guna menambal kelemahan industri farmasi nasional. Untuk negara dengan biodiversitas sangat tinggi seperti Indonesia, alternatif sumber bahan baku obat yang paling menjanjikan adalah bahan kimia dari alam.

Sejarah pengembangan obat juga menunjukkan, tidak sedikit obat modern yang digunakan (sampai) sekarang berasal dari aneka jenis tanaman atau bahan alam lainnya. Bagian tanaman yang digunakan dalam pengobatan dapat berupa herba (tanaman utuh), bagian kulit kayu, daun, ataupun eksudat tanaman. Eksudat adalah isi sel yang dikeluarkan dari selnya dan belum berupa zat kimia murni.

Selain tanaman, aneka jenis biota laut, seperti ganggang dan karang lunak (sponges), dapat pula dimanfaatkan sebagai sumber bahan baku obat. Namun demikian, sumber yang eksotik seperti ini juga memiliki keterbatasan, yaitu sulit

PEndaHuLuan

Mikroba Endofit, Pemanfaatan Mikroba Endofit dalam Bidang Farmasi2

diperoleh dalam jumlah yang cukup besar. Bahkan tanaman, yang relatif mudah diperoleh dibanding biota laut, juga memiliki sejumlah keterbatasan sebagai sumber bahan berkhasiat obat.

Untuk mendapatkan (bahan) obat dalam jumlah yang memadai bagi kalangan industri, diperlukan biomassa tanaman dalam jumlah besar dan waktu tunggu yang lama untuk memanennya bila tanaman obat tersebut tergolong tanaman tahunan. Pengambilan tanaman obat dari hutan atau sumber non-budidaya lainnya juga terkendala, bahkan dapat mendorong kepunahan tanaman tersebut, karena cara pemanenannya dapat mempengaruhi kehidupan tanaman induk.

Dengan demikian, jika kita ingin membangun ketahanan nasional dibidang kesehatan dengan memanfaatkan bahan baku obat alternatif, yaitu bahan baku obat dari alam, diperlukan sebuah terobosan untuk mengatasi kendala besar yang ada. Kalau tanaman maupun biota laut sulit diharapkan ketersediaannya secara berkelanjutan sebagai sumber bahan baku, harus dicari sumber lain yang dapat memberikan senyawa biologis aktif yang sama: Mikroba endofit.

Mikroba endofit menjanjikan peluang besar untuk dikembangkan karena organisme renik yang hidup di dalam tanaman (atau inang lain) ini dapat menghasilkan metabolit sekunder seperti inangnya. Dengan memanfaatkan bakteri, kapang atau khamir yang diisolasi dari daun, batang, akar atau bagian lain tanaman obat atau, mungkin juga, diisolasi dari biota laut, tidak perlu lagi digunakan bagian tanaman (atau biota laut) dalam jumlah besar, sehingga tak perlu lagi menebang tanaman aslinya (atau mengambil biota laut dari habitatnya) untuk penyediaan simplisia (bahan mentah obat). Mikroba endofit dapat menghasilkan metabolit sekunder seperti inangnya antara lain karena terjadinya transfer genetik dari inang-umumnya tanaman (sehingga, untuk selanjutnya, kalau tak disebut lain inang dari mikroba endofit adalah tanaman) — ke mikroba yang hidup di dalamnya.

Keunggulan lain dari pemanfaatan mikroba endofit adalah karena terhadap mikroba tersebut lebih mudah dilakukan manipulasi genetik dibandingkan terhadap tanaman atau inang lainnya. Biaya produksi bahan obat melalui proses fermentasi juga lebih murah dibandingkan dengan teknik kultur jaringan tanaman untuk skala produksi bahan obat yang setara. Pengembangan mikroba endofit bukan hanya memungkinkan penemuan serta produksi bahan obat alami secara berkelanjutan dan ramah lingkungan, melainkan juga membuka peluang bagi penemuan metabolit sekunder bioaktif lainnya yang sejauh ini seringkali diabaikan untuk suatu saat


diproduksi dalam skala komersial. Selain itu pemanfaatan mikroba endofit juga sudah banyak dikembangkan dalam bidang pertanian khususnya pada tanaman rempah.

Buku ini dimaksudkan untuk memberikan informasi tentang mikroba endofit, terutama yang hidup di dalam tanaman, dan dapat menghasilkan metabolit sekunder yang mirip dengan senyawa yang dihasilkan oleh tanaman inangnya. Beberapa metabolit sekunder dari tanaman tertentu telah terbukti dapat dimanfaatkan di bidang kesehatan, khususnya di bidang farmasi, sebagai bahan baku untuk obat.


MIKROBA adalah mahluk hidup yang hanya dapat dilihat dengan menggunakan alat bantu mikroskop. Mikroba yang hidup di luar bagian tubuh host (inang atau pejamu) disebut mikroba epifit, sementara yang hidup di dalam tubuh inang disebut endofit. Inang yang dimaksud umumnya adalah tanaman.

Konsep mengenai mikroba endofit pertama kali diusulkan oleh De Barry pada 1866. Setelah itu, pada 1986, Carroll menggunakan istilah endofit untuk mikroba yang menyebabkan infeksi asimptomatis pada tanaman, tetapi tidak termasuk fungi patogen dan mycorrhizae. Konsep yang diterima sekarang adalah yang dikemukakan oleh Orland Petrini, yang mendefinisikan endofit sebagai mikroorganisme yang mempunyai habitat hidup di dalam organ tanaman dalam kurun waktu tertentu, dapat berkolonisasi di dalam jaringan tanaman tanpa merugikan tanaman inangnya. Mikroba endofit dapat hidup bersimbiose dengan tanaman inangnya dan dapat menghasilkan metabolit sekunder, termasuk metabolit sekunder yang memiliki bioaktivitas, seperti enzim, zat pengatur tumbuh, zat antimikroba, antifungi dan antikanker.

Mikroba endofit-termasuk bakteri, kapang dan khamir-dapat ditemu-kan pada semua jenis tanaman, mulai dari pohon berkayu dan herba sampai rumput-rumputan, bahkan algae. Pada umumnya, kapang yang lebih banyak ditemukan sebagai kapang endofit, tetapi actinomycetes endofit juga dapat ditemukan dari dalam jaringan tanaman yang sehat.

Mikroba endofit dapat diisolasi dari semua jaringan tanaman. Namun demikian, diperlukan seleksi dan penapisan (screening) untuk mengetahui endofit secara lebih spesifik. Bagian organ atau jaringan tanaman tertentu mengandung mikroba endofit tertentu pula yang berbeda satu dengan lainnya. Hal ini terjadi karena mekanisme adaptasi dari endofit terhadap mikroekologi dan kondisi fisiologis yang spesifik dari setiap tanaman inang.

BAB IMikroba Endofit


Dalam satu jaringan tanaman kemungkinan dapat ditemukan beberapa jenis mikroba endofit. Jumlah isolat yang diperoleh dari satu bagian tanaman inang biasanya amat banyak, tetapi hanya beberapa mikroba saja yang dominan pada satu inang. Endofit yang hidup di dalam rumput-rumputan berbeda dengan yang berada di dalam tanaman berkayu.

Senyawa bioaktif yang dihasilkan pada umumnya adalah alkaloid. Kapang endofit yang diperoleh dari daun lebih banyak bila dibandingkan dengan kapang endofit yang diperoleh dari bunga. Hal ini mungkin disebabkan lapisan kutikula yang tipis pada daun dan permukaan daun yang luas, sehingga lebih banyak kapang endofit dapat berpenetrasi. Pada bunga, karena bagian tanaman ini hanya berkembang pada waktu tertentu dan menjadi layu dalam beberapa hari, hanya sedikit terpapar mikroba sehingga jumlah kapang yang dapat diisolasi juga lebih sedikit dibandingkan yang dari daun.

kaPanG Endofit

Fungi adalah suatu mikroorganisme heterotrof yang memerlukan senyawa organik untuk nutrisinya. Sebagian besar tubuh fungi terdiri dari benang-benang yang disebut hifa, yang saling berhubungan menjalin semacam jala yang disebut miselium. Pada fungi ada dua istilah, yaitu mold (kapang) dan khamir.

Kapang merupakan kelompok mikroorganisme eukariotik yang tergolong dalam fungi berfilamen dan multiseluler. Kapang memiliki beberapa ciri spesifik, yaitu mempunyai inti sel, memproduksi spora, tidak mempunyai klorofil sehingga tidak dapat melakukan fotosintesis, dan dapat berkembang biak secara seksual maupun aseksual. Beberapa kapang mempunyai bagian tubuh berbentuk filamen dengan dinding sel yang mengandung selulosa atau khitin, atau keduanya. Sementara itu, khamir adalah bentuk fungi berupa sel tunggal dengan pembelahan sel melalui pertunasan.

Kehidupan kapang sangat tergantung pada beberapa faktor eksternal. Faktor yang paling mempengaruhi kehidupan kapang adalah ketersediaan air. Selain itu, pertumbuhan fungi multiseluler ini juga dipengaruhi suhu, oksigen, dan pH lingkungan, serta ketersediaan nutrisi.

Ketersediaan airSel mikroba memerlukan air untuk hidup dan berkembangbiak. Karena itu,


pertumbuhan sel mikroba di dalam suatu medium sangat dipengaruhi oleh jumlah air yang tersedia. Untuk pertumbuhannya, sebagian besar kapang membutuhkan air dalam jumlah relatif lebih rendah dibandingkan dengan khamir dan bakteri. Artinya, kapang dapat tumbuh dalam lingkungan yang relatif kering.

Suhu pertumbuhanSebagian besar kapang bersifat mesofilik, yaitu tumbuh baik pada suhu kamar.

Suhu optimum pertumbuhan untuk sebagian besar kapang berkisar 25‒30oC, tetapi beberapa kapang dapat tumbuh pada suhu 35‒37oC atau lebih tinggi. Di antara kapang ada pula yang bersifat psikotropik, yaitu dapat tumbuh baik pada suhu lemari es (4‒10oC), bahkan ada pula masih dapat tumbuh dengan lambat di bawah suhu pembekuan, yaitu pada suhu ‒5oC sampai ‒10oC. Sebaliknya, ada pula kapang yang bersifat termofilik, dapat tumbuh pada suhu tinggi.

Kebutuhan oksigen dan pHSemua kapang bersifat aerobik sejati, yaitu membutuhkan oksigen untuk

pertumbuhannya. Sebagian besar kapang dapat tumbuh optimum pada kisaran pH 2‒8,5.

NutrisiPada umumnya kapang dapat memanfaatkan berbagai sumber nutrisi, mulai dari

yang sederhana sampai yang kompleks. Kebutuhan dasar nutrisi bagi kapang adalah energi atau sumber karbon, sumber nitrogen, dan unsur anorganik.

komponen Penghambat

Beberapa kapang mengeluarkan komponen yang bersifat menghambat organisme lain. Komponen ini disebut antibiotik. Beberapa kapang lain dapat menghasilkan komponen bersifat mikostatik atau fungistatik, yaitu menghambat pertumbuhan kapang lain, misalnya asam sorbat, asam propionat dan asam asetat yang bersifat fungisidal.

Fungi dapat dibagi dalam kelompok:

• Ascomycota. Kelompok fungi ini adalah kelompok terbesar, meliputi 3.250 genera dan mencakup sekitar 32.250 spesies, dan sebagian besar adalah mikrofungi.

• Deuteromycota. Kelompok ini disebut fungi anamorf, imperfekti, fungi konidial,


fungi mitosporik atau fungi aseksual. Deuteromycota mencakup 2.600 genera dan 15.000 spesies.

• Basidiomycota. Kelompok ini, yang terdiri dari 1.400 genera dan 22.250 spesies, sebagian besar berukuran mikroskopik.

• Zygomycota. Kelompok ini mencakup 56 genera dan ± 300 spesies, tidak mempunyai septa dalam hifanya.

• Chytridiomycota. Kelompok ini mencakup 112 genera dan 793 spesies, disebut fungi akuatik

Interaksi kapang Endofit dan Tanaman Inang

Kapang endofit ada di mana-mana dan dapat ditemukan di semua spesies tanaman. Kapang endofit tak bersifat spesifik pada tanaman inang. Beberapa galur kapang endofit yang sama, yang diisolasi dari bagian yang berbeda pada inang yang sama, akan berbeda dalam kemampuannya mengguna-kan substansi yang berbeda.

Kapang endofit dapat diisolasi dari tanaman yang berbeda, baik berbeda familia, kelas maupun lingkungan dan kondisi geografik tempat tanaman inang tersebut tumbuh. Sebagian besar kapang endofit menyebabkan infeksi sistemik secara intraselular, namun tidak menyebabkan kerugian pada inangnya. Dengan demikian, kapang ini hidup secara simbiosis mutualisme atau secara simbiosis netralisme.

Keberadaan kapang endofit pada tanaman dapat dilihat secara mikroskopik dalam jaringan tanaman (Gambar 1), atau dapat juga melalui isolasi biakan murni. Kapang endofit dapat berkolonisasi di dalam jaringan, masuk ke dalam sel inangnya, atau masuk ke dalam tanaman tanpa menyebabkan kerusakan pada sel (sehingga dapat dikatakan tidak menyebabkan infeksi pada sel inangnya). Keberadaan kapang dalam tanaman karena kemampuan fungi multiseluler tersebut berpenetrasi ke dalam sel inang.

Untuk mendapatkan isolat kapang endofit dari tanaman harus dilakukan sterilisasi pada permukaan bagian tanaman terlebih dahulu. Setelah itu, potongan dari bagian tanaman tersebut diletakkan di permukaan medium biakan standar dan diinkubasi. Setelah beberapa hari, fungi endofit akan tumbuh dan mungkin bersporulasi.


Kapang endofit dapat dikelompokkan ke dalam empat kelas berdasarkan jenis inangnya, jenis kolonisasi endofit pada jaringan inang, dan keragam-an jenis tanaman.

Kapang Endofit Kelas I Termasuk ke dalam kapang endofit kelas I adalah kapang yang tumbuh di rumput-

rumputan (Clavicipitaceae). Kapang endofit yang secara filogenetik mewakili kelas ini hanya ditemukan dalam jumlah kecil. Kapang endofit kelas I termasuk kapang yang sulit dikultivasi dan terbatas hanya dapat ditemukan pada musim dingin dan panas di padang rumput. Transmisi kapang endofit ini terjadi secara vertikal dari induk ke anaknya, dan biasanya melalui infeksi pada biji. Keuntungan yang diberikan oleh kapang endofit ini tergantung dari jenis spesies inang, genetik dari inang, dan kondisi lingkungan tumbuh inang.

Kapang Endofit Kelas IIKapang endofit kelas II terdiri dari beragam spesies, termasuk spesies kapang

dari divisi Ascomycota dan Basidiomycota. Kapang ini mempunyai kemampuan untuk hidup toleran terhadap tanaman inangnya.

Gambar 1 : Kapang endofit yang berada dalam daun dari tanaman Rhizomatous Tall Fescue. (→ ) sel hifa endofit (http://www.aboutrtf.com,2014)


Kapang Endofit Kelas IIIKapang endofit kelas III dibedakan berdasarkan keberadaan endofit dan transmisi

endofit secara horizontal. Termasuk ke dalam kelas ini adalah kapang endofit pada tumbuhan vascular (berpembuluh) dan non-vascular (tidak berpembuluh), woody (berkayu) dan herba angiosperma di hutan tropis dalam komunitas antartika. Biasanya kapang endofit kelas III dikenal karena keberagamannya dalam jaringan inang secara individual, dalam tumbuhan, atau dalam populasi tumbuhan. Satu tumbuhan tunggal dapat mempunyai beratus-ratus kapang endofit yang berbeda.

Kapang Endofit Kelas IVKapang endofit kelas IV dikenal memiliki septa berwarna gelap karena

mengandung pigmen hitam, dan ditemukan terbatas hanya dalam akar tumbuhan. Termasuk dalam kapang endofit kelas ini adalah kelompok fungi Ascomycetous yang memiliki konidia atau steril. Kapang endofit kelas IV umumnya membentuk struktur berpigmen pada inter- dan intraseluler hifa dan microsclerotia pada akar. Kapang kelas ini dapat dijumpai pada tumbuhan inang, untuk jenis kapang yang tidak dapat tumbuh pada akar (nonmycorrizal), di daerah antartika, kawasan pegunungan, atau daerah beriklim sedang serta dalam ekosistem tropis.

Kapang endofit dapat berada dalam tumbuhan yang hidup, dan diisolasi dari keluarga tumbuhnan yang beragam, yang tumbuh dalam ekologi dan geografi yang berbeda. Hanya sedikit kapang yang spesifik untuk spesies tumbuhan inang tertentu.

Penyebaran kapang endofit ke dalam tumbuhan melalui biji tumbuhan yang kemudian tumbuh berkembang bersama dengan tumbuhan inangnya. Beberapa kapang endofit tidak dapat secara langsung masuk ke dalam tumbuhan, dan hanya disebarkan oleh biji dari tumbuhan yang telah terinfeksi. Dengan demikian, biji yang bebas dari kapang akan menghasilkan tumbuhan yang bebas dari kapang endofit.

Sampai saat ini masih belum diketahui apakah ada bahan kimia yang dapat menghilangkan endofit dari tumbuhan, sehingga dapat mencegah terinfeksinya tumbuhan dari kapang endofit. Kapang endofit dapat dikelompokkan menjadi dua kelompok, yaitu endofit tidak berspora dan endofit berspora. Sebagian besar kapang endofit tidak berspora, termasuk kelompok Acremonium.


Keberadaan Endofit di Beberapa Tanaman

Kapang endofit dapat berada di berbagai tanaman dan beragam pada bagian tanaman.

Endofit yang Tumbuh pada ClavicipitaceaeKapang endofit yang tumbuh di dalam rumput pada umumnya menyebabkan

tanaman menjadi steril, karena adanya stroma yang dihasilkan oleh kapang endofit tersebut. Namun kapang endofit ini akan meningkatkan ketahanan tanaman inangnya terhadap keadaan stres (akibat kekurangan air, perubahan suhu dan tekanan lingkungan lainnya). Contoh dari kapang ini Neoryphodium spp.

Kapang Endofit Sistemik LainMeski spesies dari Acremonium telah sering diisolasi dari beberapa tanaman

padi asimptomatik, masih belum banyak diketahui dampak dari keberadaan kapang endofit tersebut terhadap tanaman inangnya. Kapang endofit Pseudocercosporella trichachincola yang diisolasi dari tanaman rumput Trichachne insularis, Alternaria alternata, Cladosporium spp, dan Epicocum purpurscens merupakan kapang non-sistemik dan juga dikenal sebagai kapang epifit yang berada pada Graminacoccus, serta merupakan kapang patogen pada rumput.

Kapang Alternaria alternata, Cladosporium tenuissimum, Epicocum purpurascens adalah endofit yang dominan ditemukan pada padi dan jagung. Hifa intraseluler dari Fusarium moniliforme ditemukan berada dalam jagung dan tidak memberikan dampak yang buruk pada tanaman inangnya.

Kapang Endofit dari Lichenes (Lumut Kerak)Kapang endofit dapat berada dalam thallus (tubuh) dari lumut kerak (lichenes),

dan ditemukan sebanyak 506 jenis taxa kapang endofit yang berbeda dari 17 spesies lumut kerak fruticose (yang mirip herba, memiliki daun dan ranting). Hasil penelitian menunjukkan bahwa sebagian besar isolat tersebut tidak mewakili jamur lichenicolus, melainkan termasuk spesies umum yang dikenal. Tingginya tingkat keanekaragaman jamur ini mungkin disebabkan oleh sifat dari pori thallus lumut kerak yang sangat beragam.

Kapang Endofit dari Bryophyta (Lumut) dan PakisBryophyta juga merupakan tempat bagi endofit. Dari hasil penelitian histologis,

diketahui adanya asosiasi antara kapang endofit dan tumbuhan yang tidak


berpembuluh, seperti hornwort (Phanoceros laevis). Ascomycetes, Basidiomycetes dan Zygomycetes diketahui berasosiasi dengan berbagai tumbuhan tidak berpembuluh sebagai tumbuhan inangnya, dengan bentuk asosiasi yang sangat beragam, dari yang sederhana sampai yang kompleks. Sebagian besar dari kapang endofit adalah kapang yang tumbuh di akar (mikorhiza), ada yang mempunyai hifa yang bersepta pada akar dari Pteridophyte.

Kapang Endofit dari Kulit PohonKulit pohon merupakan tempat yang paling disukai oleh kapang endofit, terutama

kapang yang dapat berkolonisasi. Banyak spesies jamur yang secara asimptomatik tumbuh di dalam kulit kayu, ranting atau cabang dari tumbuhan, ataupun dalam daun. Namun, sampai saat ini, masih belum diketahui dengan jelas keadaan biologi mereka dalam tumbuhan inangnya. Kapang yang banyak ditemukan di pohon cemara adalah Nycoglaena subcoerulescens atau Arthipyrenia plumbaria.

Racun Kapang Endofit

Kapang endofit yang berada dalam rumput-rumputan ternyata dapat menghasilkan mikotoksin dari jenis alkaloid ergot. Mikotoksin ini dapat menyebabkan ergotism pada manusia bila termakan sklerotia dari Claviceps purpurea. Mikotoksin ergovaline ditemukan pada tall fescue, Festuca arundinacea Schreb, yaitu sejenis rumput tinggi yang hidup di daerah beriklim dingin di Amerika Utara. Mikotoksin ini menyebabkan keracunan pada ternak yang makan rumput dan dikenal sebagai fescue toxicosis.

Akibat yang ditimbulkan dari ergovaline pada hewan ternak adalah bobot badan ternak menurun. Ergovaline juga dapat menyebabkan kelesuan dan berkurangnya produksi susu karena mikotoksin itu dapat menekan hormon prolaktin pada sapi dan ternak lainnya. Selain itu, toksin endofit tersebut juga dapat menyebabkan abortus pada ternak.

Rumput yang terinfeksi oleh kapang endofit beracun juga bagi serangga. Mikotoksin dapat menghambat pembentukan larva serangga dan menyebabkan kematian.

Hubungan Simbiosis kapang Endofit

Hubungan simbiosis kapang endofit merupakan hubungan yang obligat bagi


kapang. Dari hubungan simbiosis tersebut, tanaman inang lebih banyak mendapat keuntungan. Infeksi kapang endofit dapat meningkatkan pertumbuhan vegetatif dari rumput sebagai inangnya. Selain itu, rumput menjadi lebih tahan (toleran) terhadap kekeringan, dan toksin yang dihasilkan oleh endofit membuat rumput menjadi tidak disukai oleh hewan pemakan rumput. Infeksi oleh kapang Acremonium, misalnya, diketahui menyebabkan pertumbuhan yang meningkat, dan rumput menjadi tahan terhadap kekeringan dan gangguan dari hewan herbivora.

baktEri Endofit

Berdasarkan susunan dinding selnya, bakteri dapat dibedakan menjadi bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif. Bakteri Gram positif memiliki susunan peptidoglikan yang tebal. Sementara itu, bakteri Gram negatif memiliki peptidoglikan tipis, tetapi dilengkapi dengan lapisan lipopolisakarida.

Bedasarkan bentuknya, bakteri dapat dibedakan menjadi bentuk kokus bulat atau oval, koma, basil, dan spiral. Bentuk basil sebagian besar tampak sebagai batang tunggal. Bakteri bentuk spiral beberapa memiliki lekukan, sehingga menyerupai spiral. Sementara itu, bakteri bentuk koma memiliki satu lekukan.

Bakteri endofit memiliki sifat dan bentuk morfologis yang sama dengan lazimnya bakteri. Bakteri endofit ini dapat berasosiasi dengan tanaman, membantu metabolisme tanaman inang dan menghasilkan metabolit sekunder yang mirip dengan senyawa tanaman inangnya.

Sejumlah hasil penelitian tentang bakteri endofit menunjukkan bahwa mikroba tersebut dapat berperan dalam menghasilkan metabolit sekunder, dengan jenis maupun aktivitas senyawa yang beragam. Beberapa metabolit sekunder tersebut berupa senyawa antimikroba yang dapat menghambat pertumbuhan beragam mikroba lain yang bersifat patogen bagi tanaman inang melalui aktivitasnya sebagai antibakteri atau antijamur.

Peneliti lain melaporkan bahwa bakteri endofit mampu menghasilkan berbagai enzim, termasuk xylanase, amilase, dan selulase, serta zat pengatur tumbuh tanaman. Dari beberapa hasil penelitian tentang pemanfaatan dan pengembangan bakteri dilaporkan bahwa telah diidentifikasi dan dikarakterisasi sejumlah senyawa yang berkhasiat sebagai antitumor atau antikanker, antidiabetes, dan antiinflamasi.


Beberapa metabolit sekunder yang dihasilkan bakteri endofit memiliki aktivitas antimikroba yang diharapkan dapat dimanfaatkan untuk membunuh bakteri penyebab penyakit infeksi yang telah resisten terhadap antimikroba yang ada.

Secara umum, baik kapang maupun bakteri endofit dapat menghasilkan metabolit sekunder yang bermanfaat di bidang industri farmasi maupun pertanian.


DALAM fase pertumbuhannya, mikroorganisme akan menghasilkan metabolit yang merupakan hasil proses biosintesis mikroba tersebut. Pada kurva pertumbuhan mikroba yang merupakan hubungan antara konsentrasi biomassa dan waktu, terdapat empat fase pertumbuhan. yaitu fase lag, fase log, fase stationary dan fase kematian eksponensial.

Fase lag atau fase adaptasi berlangsung setelah dilakukan inokulasi pada medium nutrien, merupakan fase penyesuaian dari mikroorganisme terhadap lingkungan baru. Fase log disebut juga fase pertumbuhan eksponensial, merupakan fase ketika mikroba aktif membelah pada kecepatan maksimum. Pada kedua fase tersebut, terutama fase log, komposisi kimia medium mengalami perubahan, karena nutrien dikomsumsi dan zat-zat metabolik diproduksi. Keadaan tersebut akan mengakibatkan kondisi yang stabil.

Setelah fase log, laju pertumbuhan mulai menurun, karena nutrien esensial telah berkurang dan terjadi hambatan oleh produk metabolik yang tertimbun. Sel-sel akan mengalami transisi, sehingga laju pertumbuhan bersih menjadi nol. Di sini terjadi fase stationary, yaitu fase ketika laju pembelahan sel dan laju kematian mikoba mencapai keseimbangan. Di ujung fase stationary adalah fase kematian eksponensial yang ditandai dengan menurunnya jumlah mikroba karena terjadinya penurunan laju pembelahan sel sehingga akhirnya berhenti, di tengah peningkatan laju kematian mikroba.

BAB IIbiosintEsis MEtaboLit PriMEr dan

MEtaboLit sEkundEr


MEtaboLit PriMEr

Metabolit primer dibentuk atau diproduksi bersamaan dengan pembentukan sel baru, merupakan produk akhir dalam proses metabolisme mahluk hidup, dibentuk secara intraselular dan pada umumnya tidak diproduksi secara berlebihan. Termasuk ke dalam metabolit primer, yaitu yang digunakan sebagai kebutuhan pokok untuk hidup dan tumbuh, adalah asam amino, nukleotida, protein, asam nukleat, lemak, dan karbohidrat.

Ada pendapat yang mengatakan bahwa metabolit primer juga dihasilkan pada proses katabolisme. Metabolit primer yang terbentuk pada jalur Embden- Meyerhof, siklus pentosa, siklus asam trikarboksilat itu di antaranya adalah asam sitrat, asam fumarat, asam glukonat dan produk akhir katabolisme anaerob, seperti etanol, aseton dan butanol.

Metabolit primer mempunyai beberapa karakteristik, antara lain terbentuk melalui metabolisme primer serta memiliki fungsi yang esensial dan jelas bagi kelangsungan hidup organisme penghasilnya. Metabolit primer merupakan komponen esensial tubuh, seperti asam amino, vitamin, nukleotida, asam nukleat, dan lemak. Kebanyakan metabolit primer yang dibentuk memiliki hubungan erat dengan pertumbuhan organisme penghasil. Namun demikian, metabolit primer tidak mempunyai sifat yang spesifik (karena ada pada hampir semua mahluk hidup), dan hasil akhir dari metabolismenya adalah alkohol.

Pembentukan metabolit primer dan sekunder tergantung pada mikro- organismenya, dan juga produk yang ingin dihasilkan. Metabolit dapat dibentuk selama fase pertumbuhan atau setelah fase pertumbuhan. Metabolit primer dihasilkan selama fase pertumbuhan aktif, sementara metabolit sekunder dibentuk setelah fase pertumbuhan sempurna. Pembentukan metabolit primer dan sekunder dapat dilihat pada Gambar 2 berikut:


Pertumbuhan

Pembentukan metabolit primer

Pertumbuhan

Pembentukan metabolite sekunder

Waktu

Gambar 2. Pembentukan metabolit primer dan sekunder (Willey JM, dkk,2009)


MEtaboLit sEkundEr

Metabolit sekunder adalah senyawa yang disintesis oleh makhluk hidup (mikroba, tanaman, atau hewan) dan bukan untuk memenuhi kebutuhan dasarnya, yakni tumbuh dan berkembang, melainkan untuk mempertahankan eksistensi makhluk hidup yang bersangkutan serta keberlanjutan spesiesnya dalam berinteraksi dengan ekosistem. Awalnya, diduga bahwa metabolit sekunder hanya diproduksi oleh tanaman tingkat tinggi. Tetapi, dengan berkembangnya ilmu, khususnya di bidang biokimia, diketahui bahwa selain tumbuhan, hewan dan mikroorganisme juga menghasilkan metabolit sekunder.

Terdapat kesamaan produk metabolisme yang dihasilkan oleh tumbuhan, hewan, dan mikroorganisme. Selain itu, pada prinsipnya, mekanisme pem-bentukan metabolit sekunder pada tumbuhan, hewan, dan mikroorganisme juga memiliki kesamaan. Disintesis untuk memenuhi kebutuhan pelengkap, metabolit sekunder diproduksi pada fase stasioner, dan produksi maupun penyimpanannya bersifat ekstraseluler. Contoh metabolit sekunder antara lain antibiotik, pigmen, vitamin, dan steroid.

Ada perbedaan pendapat di kalangan ahli biologi dalam pemahaman tentang metabolit sekunder karena perbedaan perspektif yang dilatarbelakangi spesialisasi keahliannya. Metabolit sekunder pada tumbuhan adalah suatu senyawa yang dihasilkan tumbuhan dengan menggunakan metabolit primernya sebagai bahan dasar. Senyawa-senyawa yang tergolong metabolit sekunder ini tidak berperan nyata atau langsung dalam kegiatan yang menunjang pertumbuhan, perkembangan, dan reproduksi, tetapi bermanfaat bagi keseluruhan pertumbuhan tanaman tersebut.

Konsep metabolit sekunder pada dasarnya adalah mengubah suatu produk menjadi produk lain agar tidak menjadi toksik (detoksifikasi). Namun, ada pendapat lain yang memperkirakan bahwa metabolit sekunder merupakan produk akhir suatu aberasi atau merupakan produk sisa yang disekresikan. Metabolit sekunder yang utama melibatkan sejumlah kecil prekursor. Jalur metabolit sekunder dapat saling berkaitan dengan metabolit primer yang juga memegang peranan penting. Metabolit primer dan metabolit sekunder pada mikroorganisme sangat dipengaruhi oleh jenis dan nutrisi yang tersedia dalam medium.

Metabolit sekunder mempunyai karakteristik antara lain dihasilkan melalui


proses metabolisme sekunder, diproduksi selama fase stationary, belum diketahui jelas fungsinya bagi organisme penghasil dan diduga tidak berhubungan dengan sintesis komponen sel atau pertumbuhan. Metabolit sekunder disimpan secara ekstraseluler, hanya dibuat oleh spesies tertentu dan dalam jumlah terbatas, pada umumnya diproduksi oleh fungi berfilamen dan bakteri yang membentuk spora.

Metabolit sekunder mempunyai struktur kimia yang heterogen, distribusinya terbatas, dikatalisis oleh enzim yang dikode oleh materi genetik khusus dan proses sintesisnya diawasi dengan ketat oleh jumlah dan aktivitas enzim. Ekspresi metabolisme sekunder dapat merupakan salah satu aspek kekhasan dari sel, atau pembentukan senyawa baru karena adanya integritas dalam perubahan dan pengembangan sel.

Hewan dapat mengeliminasi produk yang tidak diinginkan melalui proses ekskresi melalui ginjal, hati, atau organ eksresi lain, sementara mikroorganisme dapat dengan mudah melepasnya ke medium di sekitarnya. Tetapi keadaannya berbeda pada tanaman, karena tanaman akan menyimpan produk yang tidak diinginkan tersebut sebagai metabolit sekunder.

Kapang Ascomycota, Basidiomycota dan Zygomycota dapat menghasilkan berbagai enzim ekstraseluler yang berkontribusi dalam menstabilkan simbiosis. Kapang endofit yang hidup di dalam tanaman inang dapat mensintesis senyawa biologik aktif yang mirip dengan metabolit sekunder yang dihasilkan oleh inangnya.

Mikroba endofit memegang peranan penting dalam kehidupan tanaman. Organisme renik yang menumpang itu dapat memberi ketahanan pada tanaman, misalnya terhadap penyakit atau serangan herbivora, meningkatkan pertahanan tubuh, memungkinkan tanaman inang bertahan dalam kondisi yang buruk. Sebaliknya, keberadaan endofit juga akan memberikan dampak terhadap kondisi lingkungan, populasi lingkungan, dan ekosistem.

Sintesis metabolit sekunder dimulai pada saat beberapa zat gizi di dalam medium pertumbuhan mikroorganisme telah habis. Keterbatasan zat gizi tersebut menyebabkan terakumulasinya induser enzim metabolit sekunder dan gen-gen untuk sintesis metabolit sekunder dari represi katabolit. Pada akhir fase log dapat terjadi perubahan komposisi enzim sel dan enzim yang dibutuhkan untuk sintesis metabolit sekunder dapat muncul secara tiba- tiba. Diduga enzim tersebut mengalami represi selama fase log. Dalam sintesis metabolit primer, adanya senyawa prekursor


diduga meningkatkan dan mengatur produksi metabolit sekunder.

Pengertian metabolit primer dan sekunder tidak selalu dapat diartikan secara kaku. Ada beberapa metabolit sekunder yang tidak sepenuhnya mengikuti karakteristik dari metabolit sekunder. Hal ini juga terjadi pada metabolit primer. Sebagai contoh, hormon testoteron merupakan metabolit primer, namun dibuat dalam jumlah kecil seperti metabolit sekunder.

Metabolit Sekunder Mikroba Endofit

Keberadaan mikroba endofit tidak menyebabkan kerugian terhadap tanaman inangnya, tetapi justru dapat melindungi inang dari faktor di luar tanaman. Perlindungan yang diberikan mikroba endofit disebabkan oleh adanya simbiosis tanaman tersebut dengan mikroba endofit, termasuk kapang, khamir, dan bakteri. Mikroba endofit dapat membantu proses metabolisme dan menghasilkan metabolit sekunder yang dalam hal ini disebut metabolit bioaktif yang potensial, seperti zat antibakteri, zat antifungi, antivirus dan antiserangga.

Sebagai contoh, kapang endofit Acremonium sp yang hidup intraselular di dalam rumput suku Poaceae. Kapang ini dikenal sebagai mikroba endofit yang tidak menimbulkan penyakit pada rumput, tetapi dapat menyintesis sejumlah alkaloid, seperti ergopeptida, loline, lolitrem, dan peramine ketika tanaman inang melakukan fotosintesis. Alkaloid tersebut merupakan racun atau zat untuk pertahanan diri terhadap nematoda, serangga, dan mamalia herbivora yang memakan rumput. Sifat neurotoksin yang kuat terhadap mamalia dapat menyebabkan kematian pada ternak di padang rumput.

Alkaloid ergovaline dari kapang endofit Acremonium coenophiliam adalah racun untuk hewan ternak, dapat menyebabkan abortus pada ternak. Padang rumput yang indah rumputnya tidak lagi menjadi makanan yang disukai oleh ternak karena toksik bagi sapi, kambing, dan mamalia herbivora besar lainnya. Dengan demikian, keberadaan mikroba endofit dapat melindungi tumbuhan inang dari kondisi buruk di sekitarnya.

Mengenai mengapa metabolit sekunder disintesis, masih banyak hipotesis yang berbeda, sehingga batasan metabolit sekunder menjadi beragam. Terbentuknya metabolit sekunder, apakah karena interaksi antar-tumbuhan atau antara tumbuhan


dengan makhluk hidup lain, masih belum diteliti dan belum diketahui dengan pasti.

Endofit yang berada di dalam tumbuhan umumnya lebih dari satu jenis, sehingga dalam menghasilkan metabolit sekunder terjadi interaksi antar-mikroorganisme dan juga antara mikroorganisme dengan tumbuhan inangnya. Hal ini terjadi karena tumbuhan dapat menjadi tempat penampungan sejumlah besar mikroba endofit.

asal Mula Metabolit sekunder

Sampai saat ini, terbentuknya metabolit sekunder dari mikroba endofit masih belum diketahui dengan jelas. Namun, dari beberapa penelitian yang ada, telah diperoleh suatu dugaan sementara bahwa ada suatu komunikasi antara mikroba endofit dan tumbuhan inang sehingga terbentuk metabolit sekunder tertentu.

Mikroba endofit merupakan kelompok multi-organisme yang sangat beragam dan banyak ditemukan pada tumbuhan, memiliki kemampuan memelihara suatu hubungan dengan tumbuhan inangnya, dan tidak kelihatan secara visual. Hubungan ini paling sedikit untuk satu siklus dari kehidupan mikroba endofit tersebut dan melibatkan kemampuan untuk melakukan biosintesis metabolit sekunder yang bersifat bioaktif. Komunikasi yang terjadi dapat digambarkan sebagai suatu interaksi antara tumbuhan dengan endofit.


Gambar 3. Skema Interpretasi ekologi kimia, interaksi yang menguntungkan antara tumbuhan dan kapang, khususnya kapang endofit.

(Kusari S. dkk, 2012)

Mikroba endofit 31

biosintesis metabolit sekunder yang bersifat bioaktif. Komunikasi yang terjadi dapat digambarkan sebagai suatu interaksi antara tumbuhan dengan endofit.

Interaksi Tumbuhan – Endofit

Gambar 3. Skema Interpretasi ekologi kimia, interaksi yang menguntungkan antara tumbuhan dan kapang, khususnya kapang endofit. (Kusari S. dkk, 2012)

A. Menunjukkan hipotesis antagonisme yang seimbang antara tumbuhan dan kapang. Kapang memberi faktor virulensi pada tumbuhan, sebaliknya tumbuhan memberi respons pertahanan pada kapang.

B. Menyebabkan adanya penyakit tumbuhan yang disebabkan oleh kapang patogen, ketika respons pertahanan tumbuhan dihambat oleh faktor virulensi tertentu.

C. Menunjukkan hubungan timbal-balik antara kapang patogen dan endofit. Fenomena ini menunjukkan kemungkinan tidak bersifat umum, masih merupakan suatu pertanyaan, dan masih perlu dilakukan penelitian lebih lanjut.

Interaksi Tumbuhan – Endofit

A. Menunjukkan hipotesis antagonisme yang seimbang antara tumbuhan dan kapang. Kapang memberi faktor virulensi pada tumbuhan, sebaliknya tumbuhan memberi respons pertahanan pada kapang.

B. Menyebabkan adanya penyakit tumbuhan yang disebabkan oleh kapang patogen, ketika respons pertahanan tumbuhan dihambat oleh faktor virulensi tertentu.

C. Menunjukkan hubungan timbal-balik antara kapang patogen dan endofit. Fenomena ini menunjukkan kemungkinan tidak bersifat umum, masih merupa-kan suatu pertanyaan, dan masih perlu dilakukan penelitian lebih lanjut.

D. Menggambarkan strategi pertahanan endofit. Kapang endofit bertahan dengan mekanisme resisten terhadap metabolit sekunder tumbuhan

E. Tumbuhan, kapang endofit dan kapang patogen menunjukkan sinergisme yang seimbang.


Semua bentuk interaksi antara tumbuhan dan kapang diawali dengan suatu kontak fisik antara tumbuhan tersebut dengan kapang. Selain itu, ada pula sejumlah penghalang, baik fisik maupun kimia, yang harus diatasi sebelum hubungan di antara keduanya terbentuk. Ada beberapa hipotesis tentang hubungan antara mikroba endofit dengan tumbuhan, bahkan sampai metabolit sekunder yang dihasilkan.

Hipotesis “antagonisme berimbang” (Balanced Antagonism)

Hipotesis “antagonisme yang seimbang” menjelaskan bagaimana endofit dapat menghindari serangan dari sistem pertahanan alami tumbuhan inangnya dan mampu melindungi dirinya sendiri, sehingga tidak dilumpuhkan oleh metabolit toksik dari tumbuhan inangnya, bahkan pada akhirnya dapat tumbuh dalam tumbuhan inangnya tanpa menimbulkan suatu penyakit atau yang dapat terlihat (pada Gambar 3, Bagian A).

Kolonisasi asimptomatik dari mikroba endofit menunjukkan adanya antagonis yang seimbang antara endofit dan tumbuhan inangnya. Mikroba endofit maupun agen patogen lainnya memiliki sejumlah faktor virulensi yang harus diatasi oleh mekanisme pertahanan tumbuhan. Bila virulensi kapang dan sistem pertahanan tumbuhan seimbang, hubungan antara keduanya akan bersifat asimptomatik dan non-virulen. Keadaan ini merupakan suatu tahapan transisi, dimana berbagai faktor lingkungan memiliki peran besar yang dapat menggoyahkan keseimbangan antagonisme yang rapuh di antara keduanya.

Bila mekanisme pertahanan tumbuhan dapat mengalahkan faktor virulensi kapang secara total, kapang itu akan mati. Sebaliknya, bila sistem pertahanan tumbuhan dapat dikalahkan oleh faktor virulensi kapang tersebut, hubungan antara tanaman dan patogen akan berakibat timbulnya penyakit pada tanaman (Gambar 3, Bagian B).

Karena sebagian besar dari mikroba endofit mungkin saja mempunyai sifat patogen laten atau tersembunyi, mungkin dibutuhkan pengaruh suatu unsur tertentu atau faktor lingkungan lain untuk dapat menimbulkan faktor patogennya (Gambar 3, Bagian C). Sebagai contoh, ekspresi dari stres dan gen protein kinase yang diaktifkan oleh mitogen (mitogen-activated protein kinase gene) (sakA) pada endofit Epichloë festucae terbukti memegang peranan penting dalam mempertahankan


hubungan mutualistik dengan inangnya, yaitu Lolium perenne (perennial ryegrass) dan mencegah hubungan ini menjadi patogenik.

Interaksi antara tumbuhan dan mikroba endofit mungkin lebih dari sekadar suatu keseimbangan antara virulensi dan sistem pertahanan tumbuhan, tetapi merupakan suatu interaksi yang kompleks dan lebih terkendali (Gambar 3, Bagian D). Sebagai contoh, tanaman Camptotheca acuminata (happy tree) menghasilkan senyawa camptothecin, antikanker yang menghambat topoisomerase I dengan cara mengikat dan menstabilkan ikatan kovalen kompleks dari DNA topoisomerase I. Endofit penghasil Acamptothecin (Fusarium solani) diisolasi dari jaringan kulit bagian dalam dari tanaman C. acuminata untuk memastikan agar terlindung dari camptothecin yang dihasilkan oleh dirinya sendiri dan tanaman oleh suatu residu asam amino khusus yang mengadakan perubahan dari pengikatan camptothecin dan catalytic domains (enzim yang berinteraksi dengan substrat untuk memicu reaksi enzimatik) dari topoisomerase I-nya. Topoisomerase I yang diperoleh dari endofit lain yang diisolasi dari jaringan yang sama tetapi tidak menghasilkan camptothecin juga akan mengadakan perubahan sehingga membuatnya mampu bertahan terhadap aksi camptothecin.

Hal tersebut menunjukkan adanya suatu proses evolusi pra-adaptasi yang serupa dari endofit yang menginfeksi tumbuhan yang sama, terlepas dari kemampuan biosintetisnya. Sebagaimana telah diketahui, tumbuhan menggunakan camptothecin sebagai sarana pertahanan kimia terhadap serangan serangga dan patogen. Semua jenis kapang yang berusaha untuk menginfeksi tumbuhan penghasil camptothecin akan bereaksi dengan camptothecin yang dihasilkan oleh tanaman tersebut.

Karena itu, kapang yang menyerang akan dibunuh oleh camptothecin yang mentargetkan DNA kompleks topoisomerase I nya, kecuali bila kapang tersebut memiliki kemampuan untuk menahan serangan camptothecin dari inangnya setelah terjadinya infeksi. Dalam hal ini, kapang endofit yang menginfeksi, F. solani, harus memiliki kemampuan dari dalam untuk menahan toksisitas dari camptothecin yang dikeluarkan oleh tumbuhan inang.

Ada pula tumbuhan yang menunjukkan resistensi terhadap camptothecin yang dikeluarkan oleh residu asam amino khusus dalam pengikatan camptothecin dan dalam catalytic domains dari enzim topoisomerase I nya. Sebagai contoh, Ophiorrhiza japonica menunjukkan resistensi parsial terhadap camptothecin secara in vivo, meski organisme tersebut tidak menghasilkan senyawa ini. Hal ini menunjukkan


adanya kontribusi dari residu asam amino tertentu yang belum diketahui yang menyebabkan terjadinya pra-adaptasi topoisomerase I pada Ophiorrhiza japonica.

Di sisi lain, konsep mengenai resistensi yang bergantung pada waktu dan berdasar pada target tertentu atau adaptasi evolusi bersama (coevolutionary adaptation), pada berbagai spesies bersifat spesifik. Kapang endofit F.solani mampu menghasilkan camptothecin, sehingga sangat mungkin bahwa kapang ini juga mampu mengembangkan resistensi tambahan berdasarkan target terhadap camptothecin sepanjang jalur evolusinya. Dalam hal ini, tampaknya jenis interaksi antara tumbuhan dengan mikroba endofit harus sangat khusus dan sangat spesifik terpilih sehingga memungkinkan terjadinya ko-eksistensi yang berkelanjutan.

Menurut hipotesis mengenai evolusi bersama antara tumbuhan dan endofit, sangat mungkin bahwa endofit berperan membantu tumbuhan dalam menyusun pertahanan kimia in planta dengan cara memproduksi bioaktif metabolit sekunder. Ada dua gagasan paralel yang menarik terkait dengan hal ini. Menurut teori “mosaic effect”, endofit akan melindungi tanaman inangnya dengan cara membuat komposisi kimiawi yang heterogen di dalam dan di antara organ tumbuhan dimana secara genetik seharusnya komposisi kimianya seragam. Sebagai akibatnya, organ-organ tumbuhan ini secara acak akan mempunyai rasa atau nilai yang berbeda terhadap hewan pemakan tumbuhan (herbivor) yang hendak memangsanya, sehingga hal ini akan membantu tumbuhan inang untuk menghadapi serangan patogen.

Teori lain menyatakan bahwa mikroba endofit mungkin membantu tumbuhan inangnya dengan menjadikan dirinya sebagai “sistem kekebalan tubuh” bagi tumbuhan tersebut. Hipotesis ‘‘xenohormesis’’ menyatakan bahwa sinyal dan stres yang diekspresikan oleh molekul tumbuhan dapat dideteksi oleh heterotrophs (binatang dan mikroba) yang telah mengembangkan kemampuan ini sepanjang jalur evolusinya. Heterotrophs mungkin masih memiliki kemampuan untuk mendeteksi tanda-tanda kimia pada tumbuhan untuk dapat kembali menghasilkan metabolit sekunder, meski sedikit demi sedikit sebenarnya mereka telah kehilangan kemampuan untuk melakukan biosintesis atas senyawa-senyawa ini.

Karena itu, sangat mungkin bahwa ada sekelompok gen yang relatif masih bersifat sama (homolog) sepanjang jalur evolusi pada tumbuhan, mikroba dan hewan, dan gen-gen tersebut dapat saja diaktifkan kembali oleh interaksi yang sesuai antara tumbuhan dan mikroba endofit dan mikroba endofit lainnya.


Sebagai contoh, belum lama ini terungkap bahwa mamalia dapat melakukan sintesis yang menghasilkan morfin, padahal anggapan sebelumnya adalah bahwa morfin hanya dapat dihasilkan oleh tanaman Papaver somniferum (candu). Hal ini merupakan bukti yang kuat bahwa senyawa yang tadinya diduga hanya dapat dihasilkan oleh tumbuhan ternyata juga dapat dihasilkan oleh mikroba endofit.

Produk alami yang dihasilkan oleh kapang endofit pada awalnya dianggap hanya dapat terjadi pada tumbuhan, tetapi sangat mungkin bahwa “metabolit tumbuhan” yang beragam itu sebenarnya merupakan produk biosintesis dari endofitnya. Suatu contoh penting dalam hal ini adalah produksi maytansinoid ansamitocin, sejenis antitumor kuat, yang pada awalnya diisolasi dari tanaman tinggi oleh Actinomycete, Actinosynnema pretiosum ssp., Auranticum.

Hasil penelitian menunjukkan adanya kemungkinan bahwa sumber sesungguhnya dari biosintesis maytansinoid adalah bakteri endofit. Transfer horisontal gen dapat menjelaskan produksi maytansinoids oleh tanaman, namun hal lain membuktikan bahwa maytansinoids lebih mungkin diproduksi oleh simbion (symbionts).

Crosstalk antara Spesies Tumbuhan dan Endofit

Crosstalk dapat didefinisikan sebagai transduksi sinyal. Sebagai contoh adalah rangkaian sinyal antarprotein (signaling cascade) di sitoplasma pada sel hewan. Interspecies crosstalk dapat didefinisikan sebagai bentuk komunikasi, transduksi sinyal antarspesies.

Mengingat bahwa endofit berdiam di dalam tanaman dan berinteraksi secara terus menerus dengan inangnya, dapat diduga bahwa tanaman akan memiliki pengaruh yang besar pada proses metabolisme in planta dari endofit. Sebagai contoh, tanaman homoserine dan asparagine berperan sebagai inang yang memberikan sinyal untuk mengaktifkan ekspresi gen yang mematikan pada galur patogen (virulent strains) Nectria hematococca yang hanya terjadi in planta. Lebih jauh lagi, ekspresi kelompok gen biogenesis lolitrem pada endofit Neotyphodium lolii yang hidup di dalam perennial ryegrass akan tinggi pada tanaman in planta, tetapi rendah, bahkan hampir tidak dapat dideteksi, pada kultur jamur yang dibudidayakan in vitro, sehingga mendukung pendapat bahwa pemberian sinyal dari tumbuhan dibutuhkan untuk mendorong terjadinya hal ini.


Contoh lain yang meyakinkan adalah adanya hubungan simbiosis antara tumbuhan dicotyledonous (Convolvulaceae) dan jamur di dalam rumput- rumputan yang berujung pada sintesis alkaloid ergot (ergoline alkaloids) oleh jamur, dan kemudian menimbulkan pertanyaan mengenai asal-usul senyawa ini pada tumbuhan. Belum lama ini juga terungkap bahwa endofit penghasil camptothecin, F. solani yang diisolasi dari C. acuminata, secara alami dapat menghasilkan prekursor untuk camptothecin. Tetapi, suatu enzim tanaman inang yang tidak dimiliki oleh jamur, strictosidine synthase, ternyata digunakan pada tumbuhan in planta sebagai komponen dasar dalam memproduksi camptothecin.

Hal tersebut merupakan alasan utama terjadinya pengurangan signifikan produksi camptothecin pada sub-kultur dengan kondisi aksenik (terbebas dari organisme hidup lainnya). Interaksi tumbuhan dan kapang semacam ini mendorong dilakukannya suatu peninjauan kembali apakah transfer horisontal gen (tumbuhan ke genome endofit atau sebaliknya) adalah satu- satunya mekanisme dimana endofit secara alami akan menghasilkan senyawa tumbuhan yang sejenis.

Crosstalk antar-Spesies Endofit – Endofit

Merupakan hal yang tidak umum bila suatu jenis tumbuhan hanya dikoloni- sasi oleh satu jenis mikroba endofit. Pada kenyataannya, ada berbagai mikroorganisme di dalam jaringan tumbuhan dan jelas sekali bahwa suatu endofit tertentu dapat berinteraksi, secara langsung maupun tak langsung, dengan endofit lain yang sejenis pada tumbuhan (kapang-kapang, kapang- bakteri, dan/atau bakteri-bakteri). Sejumlah penelitian yang dilakukan baru- baru ini memberikan bukti yang meyakinkan bahwa interaksi mikrobial dapat memegang peranan yang penting di awal produksi metabolit pada bakteri dan kapang (Gambar 4).


Keterangan Gambar:A → Jamur Endofit A → mendorong terjadinya metabolisme* → Jamur Endofit B → Senyawa WB → Jamur Endofit C → ¾ bakteri simbion → Senyawa XC → Jamur Endofit D ¾ Senyawa Y ¾ bakteri endofit → crosstalk ¾ Senyawa Z

Gambar 4. Gambaran Skematik dari Crosstalk antar Spesies kapang Endofit (Kusari S. dkk, 2012)

A. Menggambarkan crosstalk antar-kapang: Kapang endofit A menginduksi metabolisme kapang endofit B, menghasilkan zat W

B. Menggambarkan endosimbiosis antara kapang dan bakteri: Kapang endofit C mengandung bakteri simbion sehingga menghasilkan zat X

C. Menggambarkan crosstalk kapang-bakteri: Kapang endofit D menginduksi sinyal (crosstalk) pada bakteri endofit untuk menghasilkan komponen Z, bakteri endofit menginduksi sinyal pada kapang endofit D untuk menghasilkan komponen Y.


Pertemuan antara bakteri dan kapang dapat menghasilkan molekul yang memberi sinyal acak dan lemah, misalnya sinyal yang mendeteksi jumlah atau bentuk pemicu lain yang dapat mengaktifkan jalur biosentesis yang pada awalnya tidak aktif (diam). Walau demikian, kontak yang dekat antara kapang (dalam hal ini Aspergillus nidulans) dan bakteri (Streptomyces rapamycinicus) juga dapat terjadi.

Kontak yang dekat antara kapang dan bakteri tersebut dapat menyebabkan modifikasi epigenetik melalui Saga/Ada-mediated histone acetylasization pada metabolism sekunder kapang. Interaksi yang tak terduga ini dapat menghasilkan derivat polifenol dari asam orselinik (orsellinic acid), seperti cathepsin K inhibitor dan asam lekanorik (lecanoric acid).

Pengamatan yang dilakukan pada senyawa yang disebut terakhir itu amat menarik karena asam lekanorik merupakan model atau pola awal dari metabolit lichen. Berdasarkan pengamatan tersebut patut dicatat bahwa seluruh upaya untuk memperoleh berbagai produk alami dari endofit sejauh ini hanya dilakukan pada kondisi aksenik monokultur.

Evaluasi interaksi antar-endofit menjadi menarik untuk dipelajari secara lebih rinci. Fungsi metabolit sekunder dalam suatu lingkungan yang kompleks dapat pula ditemui pada endofit. Dalam komunitas mikroba, setiap produk alami berpotensi untuk mempengaruhi profil metabolisme dari mikroorganisme. Karena itu, interaksi antar-endofit dalam tanaman akan menghasilkan produk alami yang secara signifikan lebih beragam daripada yang dapat diamati pada suatu kultur aksenik yang terpisah dalam lingkungan laboratorium. Dari sudut pandang tanaman inang, juga harus dipertimbangkan pengaruh sinergi dari “antimikroba” yang dilepaskan tanaman, yang berperan dalam pertahanan dirinya.

Selain dari potensinya, peran kerjasama mikroorganisme yang menghasilkan metabolit, ada juga kemungkinan kompleksitas pada tingkat berikutnya yang seringkali diabaikan sampai saat ini. Hasil penelitian menunjukkan bahwa rhizoxin, yaitu agen yang menyebabkan terjadinya pembusukan pada bibit padi, ternyata bukan merupakan hasil proses biosintesis oleh jamur patogen Rhizopus microsporus sebagaimana diduga sebelumnya, melainkan merupakan endosimbiotik bakteri dari genus Burkholderia yang berdiam dalam sitosol kapang.

Hal yang menarik di sini adalah bahwa endosimbion tidak hanya menghasilkan


phytotoxin, tetapi juga dapat menghindari mekanisme pertahanan kapang mengendalikan diferensiasi dan sporulasi (proses pembentukan spora) pada inang kapang. Skenario serupa juga memungkinkan bagi kapang endofit (Gambar 4, Bagian B), dan ternyata proses simbiosis yang terkait dengan melibatkan kapang mycorrhizal memang terjadi.


BAB IIIisoLasi dan idEntifikasi

Mikroba Endofit

isoLasi Mikroba Endofit

Bagian tanaman, seperti ranting, daun, dan buah dapat digunakan sebagai sampel untuk memperoleh isolat endofit. Metode yang digunakan untuk isolasi endofit adalah dengan sterilisasi permukaan dan teknik tanam langsung.

Bagian tumbuhan yang akan digunakan dimasukkan ke dalam kantong plastik, dan kantong plastik tersebut dimasukkan ke dalam termos yang berisi es batu untuk mencegah kerusakan sampel. Sampel diupayakan secepatnya dibawa ke laboratorium untuk dilakukan proses sterilisasi permukaan. Skema sterilisasi permukaan dapat dilihat pada Gambar 5.

Bagian tumbuhan yang telah disterilisasi permukaannya dipotong mengunakan pisau. Potongan sampel berukuran 1‒1,5 cm kemudian di-cuci dengan air mengalir selama 10 menit guna menghilangkan kotoran yang ada di permukaan. Setelah itu, terhadap sampel yang telah bersih dilakukan sterilisasi dengan merendam secara berturut-turut di dalam etanol 75% selama 1 menit, natrium hipoklorit (NaOCl) 5,3% selama 5 menit, dan etanol 75% selama 30 detik. Sampel yang telah disterilkan dikeringkan di atas kertas saring, dan dilakukan pemotongan secara membujur dengan scalpel (pisau) yang telah disterilkan, di atas objek gelas (kaca benda) steril.

Potongan dari belahan membujur yang telah kering tersebut diletakkan pada dua medium yang berbeda. Sebagian potongan belahan membujur diletakkan pada medium Nutrien Agar yang telah diberi nistatin 0,01% (100mg/1000ml) yang dimaksudkan untuk menghambat pertumbuhan kapang. Sebagian belahan membujur lainnya pada medium PDA (Potato Dextrose Agar) yang telah diberi 0,005% (50mg/1000 ml) kloramfenikol guna menghambat pertumbuhan bakteri.


Setiap potongan yang akan diinkubasi tersebut diletakkan di atas permukaan agar dengan bagian dalam dari potongan menghadap langsung ke permukaan agar.

Untuk sampel daun, dipotong bagian kostanya dengan ukuran 0,5 cm x 0,5 cm. Sterilisasi permukaan sampel dilakukan sebagai berikut: sampel daun direndam di dalam alkohol 75% selama 1 menit, kemudian di dalam natrium hipoklorit 5,3% selama 5 menit. Setelah itu, potongan sampel daun diletakkan di atas medium dengan diberi tekanan, bagian luka potong berada di atas medium, kemudian diinkubasi.

Inkubasi dilakukan menggunakan inkubator yang sesuai. Untuk isolasi bakteri, inkubasi dilakukan selama 2 hari pada suhu 37oC, sementara untuk kapang selama 5‒7 hari pada suhu 27‒29oC. Selama inkubasi, pertumbuhan bakteri dan kapang diamati. Isolat endofit yang menunjukkan morfologi bakteri dipindahkan ke media Nutrient Agar; isolat mikroba yang menunjukkan sifat morfologi kapang dipindahkan ke media PDA.

Metode isolasi Lain

Isolasi mikroba endofit dapat pula dilakukan dengan menggunakan beberapa metode lain. Salah satu metode yang merupakan modifikasi dari metode dasar di atas adalah Metode Penanaman Langsung. Pada metode ini modifikasi dilakukan pada tahap sterilisasi. Berikut ini beberapa modifikasi yang telah terbukti memberikan hasil yang baik.

(i) Modifikasi yang paling sederhana adalah dengan melakukan perendaman sampel di dalam alkohol 75% selama 30 detik, setelah itu dilakukan pembilasan dengan aqua destilata steril 1‒2 kali untuk menghilangkan sisa antiseptik yang digunakan.

(ii) Modifikasi lain yang juga sederhana adalah dengan merendam potongan ranting yang masih segar di dalam alkohol 75% dan formalin 40%, masing-masing selama 3 menit, kemudian dibilas 3 kali dengan aqua destilata steril.

(iii) Modifikasi cara sterilisasi lainnya adalah dengan pencucian menggunakan air mengalir, diteruskan dengan perendaman dalam alkohol 70% selama 10‒20 menit. Setelah itu, sampel dicuci beberapa kali dengan air steril, direndam dalam larutan HgCl2 0,1% selama 1‒2 menit, dibilas kembali dengan air steril


sebanyak 3‒5 kali, dan diletakkan di dalam gelas piala (beaker glass) berisi aqua destilata steril.

(iv) Modifikasi yang lebih lengkap antara lain dilakukan terhadap sampel daun. Pada sterilisasi permukaan sampel daun, dilakukan perendaman di dalam etanol 70% selama 5 menit, dilanjutkan dengan perendaman di dalam larutan merkuri klorida 2% selama 30 detik. Kemampuan sterilisasi dari larutan antiseptik yang digunakan diuji dengan cara potongan daun digelindingkan atau diletakkan di atas medium TSA (Tryptic Soya Agar 0,1%), setelah itu diinkubasi (sebagai blangko).

Potongan daun yang telah disterilkan digerus dalam mortil steril dengan menambahkan larutan dapar fosfat saline. Sampel larutan dapar fosfat saline diinkubasi pada medium dengan kadar nitrogen yang rendah, dalam medium semi padat yang mengandung asam malat (5 g), K2HPO4 (0,5 g), MgSO4 7 H2O (0,2 g), NaCl (0,1 g), CaCl2 (0,02 g), biru bromtimol 0,5% dalam 0,2N KOH (2 ml), larutan Fe-EDTA (4ml) dan agar (2 g). Keasaman (pH) medium diatur menjadi 7,0 dengan penambahan KOH.

Untuk mengisolasi bakteri biakan dari media dengan kadar nitrogen yang rendah,

inokulasi dilakukan pada media TSA, kemudian diinkubasi pada suhu 34oC. Sementara itu, untuk mengisolasi kapang, inokulasi dilakukan pada medium PDA dan diinkubasikan pada suhu 27oC. Isolasi mikroba endofit tersebut menggunakan medium bebas nitrogen atau memiliki kandungan nitrogen yang rendah, karena secara alami mikroba endofit yang berada di dalam tanaman terbiasa dengan kondisi nitrogen rendah.

(v) Selain itu ada pula metode sterilisasi menggunakan acidic electrolyzed water (larutan NaCl encer yang pH-nya diturunkan dengan penambahan HCl dan dielektrolisis, sehingga terbentuk larutan sodium hipoklorit). Metode sterilisasi dengan modifikasi ini memberikan jumlah isolat yang lebih banyak secara signifikan dibandingkan dengan metode sterilisasi menggunakan larutan desinfektan konvensional, yaitu etanol-sodium hipoklorit.

Penggunaan acidic electrolyzed water juga menggurangi terjadinya perubahan warna atau tekstur dari jaringan sampel tanaman. Perubahan tekstur ini perlu mendapat perhatian, terutama pada sterilisasi permukaan daun, akar, dan bunga. Hal lain yang perlu diperhatikan, beberapa larutan pensteril seperti etanol dan sodium hipoklorit juga dapat menghambat pertumbuhan dari mikroba endofit


Contoh isolasi bakteri endofit dari daun adalah prosedur yang dilakukan oleh kelompok peneliti dari Universitas Orissa Utara. Menggunakan tanaman Suaveolens hiptis yang tumbuh di kebun percobaan Departemen Botani sebagai objek percobaan, para peneliti tersebut mengambil daun yang sehat, masih segar dan tidak ada tanda-tanda terinfeksi mikroorganisme. Sampel daun dimasukkan ke dalam plastik polietilen dan dibawa ke laboratorium untuk dicuci dengan air kran mengalir dan menggunakan teopol, kemudian dikeringkan dengan cara diangin-anginkan menggunakan kipas angin.

Pada proses isolasi bakteri endofit, simplisia daun yang telah kering dicuci. Setelah itu, dilakukan sterilisasi permukaan dengan merendamnya secara berurutan dalam 70% etanol selama 5 menit dan 1% natrium hipoklorida (NaOCl) selama 1 menit dan dibilas secara menyeluruh dengan air suling steril. Air berlebih dikeringkan dalam laminary air flow.

Sampel yang telah disterilkan permukaannya kemudian dipotong menjadi ukuran 0,5 cm2 (rata-rata) dalam kondisi aseptik. Uji sterilitas . permukaan dilakukan pada setiap sampel guna memastikan eliminasi mikroorganisme permukaan. Setiap fragmen kemudian ditempatkan pada media Nutrient Agar dalam cawan Petri dan diinkubasi dalam incubator BOD pada suhu 30 ± 1°C. Pertumbuhan bakteri pada cawan Petri diamati 3-5 hari setelah inkubasi. Koloni tunggal tumbuh dari fragmen yang diinokulasi dipilih berdasarkan karakteristik bentuk morfologi dan penampilan. Selanjutnya dilakukan pemisahan koloni menjadi isolat tunggal.

Untuk isolasi kapang endofit, sebagai contoh adalah adalah prosedur yang dilakukan oleh kelompok peneliti dari Visva-Bharati, Santiniketan, India. Sampel yang digunakan adalah daun tanaman Azadirachta indica yang dikumpulkan dari kebun percobaan di kawasan Santiniketan, Benggala Barat. Sampel daun segar yang sehat dibawa ke laboratorium dalam kantong plastik steril, menggunakan Ice Box.

Sampel daun yang akan digunakan dalam isolasi kapang dicuci dengan air mengalir, kemudian permukaannya disterilisasi dengan larutan natrium hipoklorida (NaOCl) 4% selama 3–4 menit dan dibilas setidaknya tiga kali dengan air suling steril dan, setelah itu, dicuci dengan alcohol 70%. Setelah alkohol menguap, daun dipotong kecil-kecil (0,5cm x 0,5cm) dan 300 potongan daun diletakkan pada permukaan malt-extract (ME) agar.

Pada setiap cawan Petri berisi ME agar yang telah diberi 150 μg/ml streptomisin


untuk mencegah kemungkinan kontaminasi bakteri diletakkan 4 potongan daun. Setelah 3-4 hari diinkubasi pada suhu 280C, miselia jamur yang tumbuh diambil dari sampel daun, dimurnikan dengan menggoreskan pada ME agar, kemudian disimpan di ME agar miring pada suhu di 40C untuk pemeriksaan lebih lanjut. Semua isolat jamur dikarakterisasi secara morfologis dengan mikroskop cahaya setelah pewarnaan dengan kapas biru dan lakto fenol. Setelah diperoleh isolat tunggal dilakukan untuk uji aktivitas.

Isolasi bakteri endofit dari akar tanaman

Tiap potongan akar dibersihkan dengan air lalu dikeringkan dengan kertas tisu dan ditimbang. Potongan akar yang digunakan kira-kira sebanyak 1 gram, dilakukan sterilisasi permukaan dengan merendam dalam NaOCl 5% selama 1 menit, setelah itu ditambahkan 0.01% Tween 20 dan dibilas air steril sebanyak 3 kali.

Untuk memastikan sterilisasi sudah berhasil, akar tersebut diinkubasi pada cawan Petri yang mengandung media Tryptic Soy Agar (TSA) 10%, pada suhu kamar, selama 48 jam. Apabila masih terdapat pertumbuhan mikroorganisme pada potongan akar tersebut, berarti sterilisasinya gagal, dan sterilisasi perlu diulangi dengan menggunakan potongan agar yang lain. Apabila tidak ada pertumbuhan, dinyatakan sterilisasi permukaan sudah berhasil dan isolasi bakteri endofit dapat diteruskan ke tahap berikutnya.

Akar yang telah steril dihomogenkan dengan menggerus dalam lumpang steril. Dibuat pengenceran 10–1 sampai 10–3 (1 ml ekstrak akar dicampurkan dengan 9 ml air steril dalam tabung sehingga diperoleh pengenceran 10–1) dan seterusnya samai diperoleh 10–3. Dari pengeceran terakhir diambil 0,1 ml lalu ditanam dalam TSA (10%) pada cawan Petri dan diinkubasi pada suhu kamar selama 48 jam. Koloni bakteri yang tumbuh dihitung jumlahnya dan dimurnikan dengan menanam kembali pada media TSA sampai didapat koloni tunggal. Koloni yang tunggal disimpan dalam air destilasi dalam tabung Eppendorf pada suhu 40C. Diamati karakteristik morfologis, antara lain bentuk fisual, warna tepi koloni, dan selanjutnya dilakukan identifikasi bakteri.


Gambar 5. Skema kerja isolasi mikroba endofit dengan metode sterisilisasi permukaan dan teknik tanam langsung

Sampel

Sampel bersih

Sampel Steril

Pencucian dengan air mengalir

Steril Permukaan• Perendaman pada alkohol 75% selama 1 menit• Perendaman pada NaOCL selama 5 menit• Perendaman pada alkohol 75% selama 30 detik

Dipotong menjadi dua bagian

Koloni Bakteri Koloni Kapang

Diinkubasi di Nutrient agar pada suhu 370C selama 1-2 hari

Diinkubasi di Corn Meal Malt agar pada suhu 270 - 300 C selama 5-7 hari


Media untuk Isolasi Endofit

Media yang digunakan untuk isolasi endofit bervariasi, tergantung dari jenis mikrobanya. Untuk isolasi kapang endofit dapat digunakan Corn Meal Malt Agar, Potato Dextrose Agar, atau Potato Dextrose Broth sebagai medium. Sementara itu, untuk isolasi bakteri endofit dapat digunakan Nutrient Agar.

Pada media pertumbuhan untuk isolasi tersebut dapat ditambahkan bagian dari tanaman inang, misalnya bagian dari ranting atau daun yang direbus. Air rebusan ini kemudian diencerkan dengan aqua destilata dan digunakan sebagai pengganti air yang terdapat di dalam komposisi media. Penambahan air rebusan tersebut dimaksudkan untuk membuat suasana yang hampir serupa dengan suasana di dalam tanaman inang.

Hal yang perlu diperhatikan adalah pH dari media pertumbuhan. Keasaman (pH) medium untuk kapang adalah sekitar 5,5–6,5, karena pada pH basa kemungkinan besar bakteri yang akan tumbuh. Selain itu, pada penambahan antibiotik perlu diperhatikan stabilitas antibiotika. Antibiotika yang tahan suhu tinggi dapat disterilkan bersama dengan medianya, tetapi antibiotika yang peka terhadap panas harus ditambahkan setelah sterilisasi media selesai dan dilakukan secara aseptis.

Pengamatan Koloni Mikroba Endofit

Setelah diperoleh pertumbuhan kapang atau bakteri endofit perlu dilakukan pemisahan antara satu dan lain koloni yang ada. Pemisahan ini didasarkan pada pengamatan terhadap morfologi koloni. Bentuk koloni yang sama dianggap sebagai isolat yang sama dan, sebaliknya, bila bentuk koloni berbeda dianggap sebagai isolat berbeda.

Setiap koloni dengan morfologi berbeda dipisahkan menjadi isolat tersendiri dan dipindahkan ke cawan Petri berisi medium baru untuk diinkubasi kembali. Setelah terjadi pertumbuhan, biasanya pada inkubasi selama 5–7 hari, kembali dilakukan pengamatan morfologi secara seksama. Bila masih ditemukan pertumbuhan koloni yang berbeda, kembali dilakukan pemisahan. Begitu seterusnya sampai diperoleh isolat murni, yaitu koloni yang hanya mempunyai satu bentuk morfologi yang sama. Masing-masing isolat disimpan di dalam tabung reaksi berisi medium padat yang sesuai, untuk biakan induk dan untuk biakan kerja.


(i) Biakan induk (stock culture) disimpan pada suhu 40 C sebagai cadangan. Apabila dalam penelitian biakan kerja ada masalah, terkontaminasi, atau habis terpakai, masih ada biakan induknya sehingga penelitian masih tetap dapat berjalan.

(ii) Biakan kerja (working culture) adalah biakan yang digunakan untuk penelitian yang sedang berjalan.

idEntifikasi Mikroba Endofit

Setelah diisolasi, terhadap isolat mikroba yang diperoleh dilakukan identifikasi bakteri dan kapang endofit. Identifikasi bakteri dilakukan secara konvensional atau dengan menggunakan kits untuk identifikasi mikroba, seperti Oxoid MicrobactTM GNB KITS atau Microgen(R) GN A + B- ID (Microgen Bioproducts), kit API, MALDI-TOF MS atau MIDI Sherlock Microbial Identification System (MIS), yang berdasarkan analisis kandungan asam lemak.

Identifikasi secara konvensional antara lain dilakukan dengan pewarnaan Gram. Sediaan bakteri berumur 18–24 jam yang telah direkat pada gelas objek dibubuhi larutan kristal violet selama 1 menit, kemudian dicuci dengan air mengalir dan diberi larutan Lugol. Setelah pemberian larutan Lugol selama 1 menit, diberi larutan pemucat selama 10-20 detik, dicuci dengan air, lalu dibubuhi larutan safranin selama 15 detik dan dicuci kembali dengan air dan dikeringkan dengan kertas saring. Setelah kering, dibubuhi minyak imersi dan dilakukan pengamatan di bawah mikroskop dengan pembesaran lensa objektif 100 kali.

Identifikasi bakteri dengan menggunakan Oxoid MicrobactTM GNB kit Identification.

Prinsipnya:Setiap kit terdiri atas 12 well (sumur): (12A.12B dan 12E atau 24 sumur

(24E) miniatur biokkimia. Identifikasi organisme berdasarkan perubahan pH dan pemakaian substrat.

Untuk pemeriksaan klinik digunakan Microbact GNB 12A (format strip) atau Mikrobact GNB 12 E (format microplate). Kit ini dapat digunakan tersendiri untuk identifikasi bakteri oksidasi negatif, nitrat positif, dan bakteri yang menghasilkan


fermetasi glukosa. Selain itu, kit ini juga dapat digunakan untuk uji penapisan bakteri enterobakteriase patogen.

Prosedur kerja untuk identifikasi:

(i) Terhadap biakan murni berumur 18-24 jam dilakukan uji oksidasi untuk menentukan pilihan kit yang akan digunakan. Diambil 1 sampai 3 isolat koloni dan dilarutkan dalam larutan saline (NaCl 0.9 %). Sementara itu, pada holding stray diletakkan tes strip atau microplate tray dan ditutup kembali seal-nya.

(ii) Ke dalam setiap sumur ditambahkan 4 tetes suspensi bakteri dan ke dalam lubang-lubang yang berwarna hitam ditambahkan 2 tetes mineral oil. Setelah itu ditempatkan lagi seal-nya dan diinkubasi pada suhu 350C ± 20C selama 18-24 jam.

(iii) Setelah selesai inkubasi ditambahkan reagen sesuai dalam petunjuk, dan dicacat hasilnya.

(iv) Hasil uji diinterprestasikan menggunakan MicrobactTM Indentification Package.

Identifikasi bakteri dengan menggunakan Microgen® GN A + B- ID (Microgen Bioproducts).

Prinsip:Microgen Bioproducts digunakan untuk identifikasi bakteri enterobakteriase

dan bakteri batang oksidasi positif. Hasilnya dapat diperoleh dalam waktu 48 jam. Semua hasilnya diinterpretasikan dengan menggunakan New Microgen - ID System Software.

Identifikasi Lanjut Isolat Bakteri Endofit Gram Positif

Terhadap bakteri endofit kokus Gram positif dilakukan uji identifikasi untuk membedakan Streptococcus dan Staphylococcus. Bakteri Streptococcus memiliki bentuk morfologi kokus, dengan rangkaian kokus berantai. Untuk membedakan Streptococcus a, β dan g dilakukan uji serologi.

Bakteri Staphylococcus juga berbentuk kokus, tetapi rangkaian kokusnya bergerombol seperti rangkaian buah anggur. Untuk membedakan Staphylococcus


aureus dengan Staphylococcus epidermidis dilakukan uji koagulase. Staphylococcus aureus memberikan hasil uji koagulase positif.

Untuk membedakan Staphylococcus epidermidis dengan Staphylococcus saprophyticus dilakukan uji identifikasi menggunakan novobiosin. Staphylococcus epidermidis sensitif terhadap antibiotika ini, sedangkan Staphylococcus saprophyiticus resisten.

Bakteri batang Gram positif perlu pula diidentifikasi secara konvensional dengan menggunakan media di dalam tabung Durham, dengan beragam gula sebagai sumber karbon. Uji reaksi biokimia (reaksi gula) didasarkan pada kemampuan bakteri melakukan metabolisme (peragian) terhadap jenis-jenis gula tertentu, yaitu glukosa, laktosa, maltosa, manit, dan sakarosa. Reaksi positif, atau terjadinya peragian, terhadap jenis gula tertentu menunjukkan bahwa bakteri tersebut memiliki enzim yang sesuai. Terjadinya peragian ditandai dengan perubahan warna indikator dan/atau pembentukan gas yang terlihat sebagai kantung udara pada media di dalam tabung Durham.

Secara umum, pemeriksaan bakteri endofit dapat menggunakan cara untuk identifikasi bakteri.

Skema identifikasi bakteri endofit seperti pada Gambar 6.

Identifikasi Kapang Endofit

Secara konvensional, identifikasi kapang dapat dilakukan dengan cara makroskopik dan mikroskopik. Selain itu, konfirmasi identitas kapang endofit dapat dilakukan dengan pendekatan molekular menggunakan analisis 16S rRNA.

Identifikasi kapang secara konvesional

Identifikasi kapang secara konvensional dilakukan dengan menggunakan medium MEA (Malt Extract Agar) sebagai medium untuk kultivasi dan karakteristik kapang atau medium MIURA sebagai medium untuk isolasi dan sporulasi kapang.

Pengamatan secara makroskopikDeskripsi dapat dibuat antara lain mencakup:


• Bentuk morfologi koloni (bentuk koloni yang halus, kasar, licin, rata, menggunung)

• Warna dan permukaan koloni (granular, seperti tepung, menggunung, licin, ada atau tidak tetes-tetes eksudat) Mikroba endofit 51

S. saprophyticus S. epidermidis

Gambar 6 : Skema identifikasi bakteri Endofit dari tanaman

Resistensi

S. epidermidis Stap. aureus

Gambar 6 : Skema identifikasi bakteri Endofit dari tanaman


• Garis-garis radial dari pusat koloni ke arah tepi koloni, ada atau tidak• Lingkaran-lingkaran konsentris, ada atau tidak.• Warna sebalik koloni (reverse side)• Diameter kapang

Prosedur kerja:Kapang dalam cawan Petri berumur 5 hari dipindahkan dengan cara mengambil

miselium dengan atau tanpa potongan agarnya dan diletakkan di atas medium MEA dan MIURA. Setelah diinkubasi pada suhu 27–290C selama 5–7 hari, dilakukan pengamatan terhadap bentuk koloni kapang.

Pengamatan secara mikroskopikIdentifikasi kapang secara makroskopik dapat dilakukan dengan pembuatan

preparat kapang menggunakan metode Slide Culture. Untuk pembuatan preparat kapang, digunakan biakan kapang berumur 5-7 hari, dengan cara kerja seperti berikut:

Kertas saring diletakkan pada dasar cawan Petri dan, di atas kertas saring, diletakkan batang gelas steril berbentuk ”U”. Kertas saring dibasahi dengan air sehingga suasana dalam cawan Petri menjadi lembab dan kaca objek diletakkan di atas batang gelas ”U” yang ada, kemudian cawan Petri tersebut disterilkan dalam autoklaf pada suhu 1210C selama 15 menit.

Setelah sterilisasi selesai, kaca objek ditetesi medium PDA steril dan didiamkan hingga dingin. Setelah dingin, diambil sedikit miselium kapang dengan menggunakan jarum dan diletakkan di atas medium PDA yang membeku. Kaca objek ditutup secara hati-hati dengan kaca penutup. Kemudian, setelah cawan Petri ditutup, dilakukan inkubasi pada suhu kamar selama 48 jam. Morfologi kapang diamati dengan menggunakan mikroskop medan terang pada pembesaran 400 kali.

Pengamatan mikroskopik preparat juga dapat dilakukan secara langsung:(i) Kaca objek dan kaca penutup dibersihkan menggunakan alkohol, kemudian

diletakkan setetes larutan lactofenol, atau laktofenol cotton blue, atau akuades di tengah kaca objek.

(ii) Miselium yang sudah bersporulasi diambil sedikit, atau sesuai dengan keperluan lalu diurai secara hati-hati menggunakan jarum preparat.

(iii) Setelah itu kaca penutup diletakkan di atas permukaan preparat dan kelebihan laktofenol diserap dengan kertas saring .


(iv) Preparat diperiksa di bawah mikrokop dengan menggunakan pembesaran kecil kemudian ditingkatkan dengan pembesaran yang lebih kuat.

Deskripsi dapat dibuat antara lain mencakup• Hifa berseptum atau tidak• Hifa berpigmentasi hialin (tidak berwarna) atau gelap• Hifa berbentuk seperti spiral, atau bernodul atau berbentuk rhizoid• Spora aseksual, berbentuk khusus atau seperti konidiospora atau tidak beraturan• Ukuran spora aseksual besar (20-100 mm) atau kecil (1-5 mm)

Identifikasi kapang endofit secara mikroskopik sangat bergantung pada spora yang dihasilkan oleh kapang tersebut. Namun, kebanyakan kapang endofit sulit menghasilkan spora meski telah digunakan berbagai media khusus.

Identifikasi kapang secara molekular

Untuk kapang yang sulit menghasilkan spora, identifikasi dilakukan dengan teknik yang lebih mutakhir, yaitu menggunakan metode DNA sequencing. Untuk identifikasi kapang, digunakan 16S rRNA

Identifikasi kapang (dan bakteri) menggunakan gen pengkode 16S rRNA, atau selanjutnya disebut gen 16SrRNA. Identifkasi mikroorganisme (kapang dan bakteri) dengan metode biologi molekuler pada sampel terdiri dari empat tahap:

1. Isolasi DNA2. Amplifikasi DNA pada gen 16S rRNA3. Sequencing4. Aligning menggunakan BLAST


1. isolasi dna

Prinsip: Isolasi DNA bakteri biasanya menggunakan kit yang di pasaran tersedia dalam berbagai merek. Isolasi melibatkan siklus pendinginan dan pemanasan sel (freeze/thawcycles) untuk merusak membran sel, agar isi sel keluar. Cairan sel tersebut kemudian dilarutkan ke dalam dapar dan disentrifugasi untuk memisahkan DNA dari materi sel lainnya. Kit dapat membantu pemisahan DNA dari berbagai kontaminan dan enzim inihibitor.

Penggunaan kit mensyaratkan jumlah sel maksimal materi awal yang dapat diisolasi. Untuk pemisahan DNA bakteri dengan The DNeasy Blood and Tissue Kit (Qiagen GmbH) misalnya, jumlah maksimal materi awal adalah 2 x 109 sel. Biasanya sampel awal diambil sejumlah maksimum tersebut untuk memperoleh jumlah DNA yang maksimal pula. Jumlah sel tidak boleh melebihi batas maksimal, karena kit akan menjadi rusak sehingga jumlah DNA produk menjadi jauh lebih sedikit dari yang diharapkan. Jumlah sel bakteri dapat diukur berdasarkan optical density suspensi bakteri dengan menggunakan densitometer.

Hasil isolasi DNA diukur kuantitas dan kualitasnya dengan spektrofotometer. Untuk sampel DNA biasanya digunakan spektrofotometer dengan sensitivitas tinggi dengan jumlah sampel minimum 1 µl, misalnya NanoDrop Spectrophotometer. Kuantitas DNA rantai ganda (double stranded DNA) diukur berdasarkan serapannya pada panjang gelombang 260 nm, dan kualitas kemurnian DNA diukur berdasarkan rasio serapan pada panjang gelombang 260/280 nm.

Untuk DNA murni, rasio 260/280 adalah ~ 1,8. Jika nilai rasio 260/280 kurang dari 1,8, kemungkinan isolat DNA terkontaminasi protein, dan kalau lebih dari 1,8 kemungkinan tercemar oleh RNA. Karena itu, selain pengukuran serapan dengan spektrofotometer, terhadap isolat DNA yang dihasilkan juga dilakukan elektroforesis guna menentukan adanya kontaminasi. Isolat DNA murni hanya memberikan satu pita elektrogram.

Prosedur:Beberapa koloni bakteri dari media disuspensi dalam media cair (misalnya NaCl

0,9% steril) hingga mencapai konsentrasi tertentu; konsentrasi suspensi bakteri diukur berdasarkan optical density dengan menggunakan densitometer. Suspensi kemudian disentrifugasi, supernatan dibuang dan pelet yang diperoleh disuspensi kembali dalam larutan dapar yang tersedia di kit. Selanjutnya, dilakukan proses


sesuai protokol dalam kit, yaitu siklus freeze/ thaw dan sentrifugasi, kemudian serapan hasil isolasi DNA diukur pada panjang gelombang 260/280 nm. Untuk memastikan adanya kontaminasi, terhadap isolat DNA dilakukan elektroforesis.

2. Amplifikasi DNA pada Region Gen 16S rRNA

Prinsip: Amplifikasi isolat DNA pada daerah gen 16S rRNA dengan Polymerase Chain Reaction (PCR). Daerah gen 16S rRNA merupakan subunit dari ribosom prokariot 30S. Terdiri dari 1542 bp1, daerah gen 16S rRNA biasanya digunakan untuk identifikasi bakteri dan studi filogenetik.

Ada tiga alasan mengapa Gen 16S rRNA yang diamplifikasi untuk identifikasi bakteri.

(i) Gen pengkode 16S rRNA terdapat pada hampir seluruh jenis bakteri, dalam bentuk kelompok multigen (multigene family), atau operon.

(ii) Fungsi gen 16S rRNA tidak berubah dari waktu ke waktu. Variasi dalam sequence gen 16S rRNA dapat digunakan untuk studi evolusi. Gen 16S rRNA antara lain memiliki peran seperti 23S rRNA, yaitu sebagai penanda posisi protein ribosom. Selain itu, ujung 3’ dari gen 16S rRNA mengandung anti-Shine-Dalgarno sequence yang mengikat kodon start AUG pada mRNA. Ujung 3’ gen ini mengikat protein S1 dan S21 yang terlibat dalam inisiasi sintesis protein. Gen pengkode 16S rRNA dapat menstabilkan pasangan kodon-antikodon pada situs A (situs pengikatan tRNA di ribosom) melalui ikatan hidrogen antara atom N1 adenine pada basa ke 1492 dan 1493 dengan gugus 2’OH mRNA.

(iii) Gen 16S rRNA (~1500 bp) cukup panjang untuk analisis bioinformatik. Analisis bioinformatik diperlukan untuk proses aligning menggunakan BLAST dan penyusunan phylogenetic tree.

Prosedur:Gen 16S rRNA pada bakteri diamplifikasi dengan PCR dengan primer yang

sesuai. PCR merupakan mesin thermal cycler yang dapat menaikturunkan suhu

1 Base pair


dalam waktu singkat. Proses amplifikasi DNA terdiri dari beberapa siklus. Satu siklus terdiri dari inisiasi (pengaktifan enzim DNA polimerase) pada suhu 94–960C selama 1–9 menit, denaturasi DNA pada suhu 94–980C selama 20–30 detik, annealing primer (menempelnya primer pada DNA cetak) pada suhu 50–650C selama 20–40 detik, ekstensi/elongasi pada suhu optimal enzim yang digunakan (untuk Taq polymerase 720C) dalam waktu yang sesuai dengan panjang daerah yang akan diamplifikasi. Siklus akan berulang tergantung dari jumlah siklus yang dikehendaki. PCR diakhiri dengan final hold dengan suhu 4–150C dengan waktu yang tak terhingga.

Setelah itu, produk PCR dapat dibersihkan dari primer berlebih dan nukletida sisa diaktivasi dengan menggunakan kit (misalnya ExoSAP- IT). Terhadap produk PCR dilakukan analisis dengan gel electrophoresis. Bila terdapat lebih dari satu pita pada elektroforesis, yang berarti terdapat kontaminan, diambil pita elektrogram dengan panjang nukleotida yang diinginkan dari gel dan dilakukan isolasi-ulang. Isolat DNA hasil isolasi-ulang kemudian diamplifikasi kembali menggunakan primer yang sama.

3. Sequencing

Prinsip: Sequencing merupakan teknik biologi molekuler untuk menentukan sequence (urut-urutan) suatu gen, kelompok gen, operon, satu kromosom dan seluruh genom. Terdapat setidaknya dua teknik sequencing, yaitu Metode Maxam-Gilbert dan, yang lebih umum digunakan, Metode Sanger. Selain itu, saat ini telah dikembangkan pula berbagai teknik yang lebih mutakhir, yaitu Shotgun Sequencing, Bridge PCR (Illumina), Massively Parallel Signature Sequencing (MPSS), Polony Sequencing, 454 Pyrosequencing, Illumina (Solexa) Sequencing, SOLID Sequencing, Ion Semiconductor Sequencing, DNA Nanoball Sequencing, Heliscope Single Molecule Sequencing, dan Single Molecule Real Time (SMRT) Sequencing.

Pada Metode Sanger, sequencing berdasarkan pada pengikatan dideoksinukelotida oleh DNA polimerase dalam replikasi DNA in vitro. Untuk melakukan sequencing suatu DNA dengan metode ini dibutuhkan DNA template, primer, enzim DNA polimerase, 4 deoksinukleotida (dATP, dCTP, dGTP dan dTTP), serta 4 dideoksinukleotida (ddATP, ddCTP, ddGTP, dan ddTTP).

Pada proses replikasi DNA, DNA polimerase memfasilitasi pembentukan rantai


DNA baru yang lebih panjang dengan mengkatalisis reaksi pembentukan ikatan fosfodiester antara gugus hidroksil atom C nomor 3 nukleotida pertama dengan gugus fosfat atom C nomor 5 pada nukleotida kedua. Sequencing didasarkan pada proses replikasi, tetapi dideoksinukleotida tidak memiliki gugus hidroksi pada atom C nomor 3, sehingga DNA polimerase tidak dapat memanjangkan rantai DNA-nya. Dideoksinukleotida ini diberi label dengan zat radioaktif yang dapat dikenali oleh mesin sequencer.

ProsedurSemua bahan yang diperlukan, yaitu DNA template, primer, enzim

DNA polymerase, 4 deoksinukleotida (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), dan 4 dideoksinukleotida (ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP), dicampur di dalam satu tabung (tube). Setelah itu, DNA template didenaturasi pada suhu 96oC untuk memisahkan dua rantainya. Primer akan menempel pada DNA template pada suhu sekitar 50oC, dan DNA polimerase mulai membentuk DNA baru dengan menguntai nukleotida yang komplementer dengan template pada suhu 60–72oC.

Namun demikian, ketika dideoksinukelotida menempel pada DNA template, DNA polimerase tidak dapat memanjangkan DNA baru. Reaksi pemanjangan DNA terjadi secara acak. Artinya, pemanjangan DNA baru dapat terhenti dimanapun, sehingga panjang DNA baru akan menjadi sangat beragam. Hasil pembentukan DNA baru yang acak tersebut ditransfer dari tabung ke gel poliakrilamida, dan gel kemudian dimasukkan ke mesin sequencer.

Mesin sequencer akan melakukan elektroforesis terhadap fragmen- fragmen DNA baru. Prinsip pemisahan fragmen DNA secara elektroforesis didasarkan pada ukuran panjang nukelotidanya. Elektroforesis dilakukan dengan mengalirkan listrik pada gel dari kutub negatif ke kutub positif. DNA yang bermuatan negatif akan cenderung bergerak ke kutub positif. Semakin pendek fragmen DNA, makin mudah fragmen DNA tersebut bergerak ke kutub positif. Dengan demikian, posisi fragmen terpendek akan paling dekat dengan ujung positif.

Mesin sequencer juga dapat membaca ujung dideoksinukelotida dari masing-masing fragmen dengan mendeteksi label radioaktifnya pada panjang gelombang tertentu. Pada sequencing, fragmen nukleotida terpendek akan dibaca paling dahulu oleh squencer. Mesin akan terus membaca secara berurutan sampai fragmen terpanjang, menghasilkan elektrogram yang mengandung puncak-puncak panjang gelombang yang merepresentasikan masing-masing nukelotida secara berurutan.


Dengan membaca nukleotida dari fragmen terkecil ke fragmen yang terbesar, akan diketahui sequence dari DNA template.

4. Aligning menggunakan basic Local alignment search tool (bLast)

Prinsip: Mencari padanan antara sequence nukleotida dari DNA template yang didapat dengan sequence nukleotida beragam DNA yang terdapat di database National Center for Biotechnology Information (NCBI). Pencarian padanan (aligning) dilakukan menggunakan BLAST, program bioinformatika yang dapat diakses secara online melalui http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/.

Program BLAST membandingkan sequence nukleotida DNA sampel dengan sequence nukleotida beragam DNA di dalam database dan menganalisis secara statistik tingkat homolog (kepadanan)-nya. Program BLAST dapat pula digunakan untuk menganalisis kesamaan fungsi dan evolusi antar-sequence serta mengidentifikasi anggota kelompok gen dari spesies tertentu.

Penyimpan kapang yang telah diindentifikasi

Penyimpanan secara khusus kapang yang telah diindentifikasi perlu dilakukan untuk penelitian lanjutan atau bagi industri memerlukan biakan murni dan stabil. Kegunaan preservasi atau pengawetan kapang antara lain:

(i) Untuk koleksi kapang dengan sifat yang khas yang telah diketahui,(ii) Untuk program skrining yang dapat menghasilkan produk baru,(iii) Sebagai pembanding untuk bidang taksonomi,(iv) Untuk pendidikan atau penelitian sifat-sifat genetik yang belum diketahui.

Pemeliharaan atau preservasi kapang dapat dilakukan dengan berbagai metode. Pemilihan metode pemeliharaan dilakukan berdasarkan faktor-faktor berikut:• Dapat menjamin kemurnian• Menjamin kestabilan sifat-sifat biakan• Seberapa sering biakan dipakai untuk beragam kegiatan dan pertukaran antar-

koleksi• Nilai dari biakan tersebut• Banyaknya biakan yang akan dipelihara


Metode pengawetan atau pemeliharaan kapang

1. Metode sub-kultur

a. Pemeliharaan pada agarMetode sub-kultur mudah, tetapi umumnya hanya digunakan jika jumlah biakan

yang harus diremajakan tidak terlalu banyak. Pada metode ini, biakan kapang yang telah tua dipindahkan ke medium baru yang sesuai dan diinkubasikan pada suhu yang sesuai. Bila sporulasi sudah cukup lebat (telah memenuhi hampir seluruh permukaan cawan Petri), biakan disimpan di dalam ruangan pendingin (4oC) atau dapat pula disimpan di dalam lemari es pada suhu 10oC. Setiap biakan harus diperhatikan waktu peremajaan kembalinya. Setelah diremajakan, setiap biakan harus diperiksa kembali kemurniannya sebelum disimpan.

b. Pemeliharaan pada agar dalam minyak parafinCara pemeliharaan biakan dalam minyak parafin dapat menghemat waktu

peremajaan. Biakan ditumbuhkan pada medium agar miring yang sesuai. Setelah pertumbuhannya baik dan sporulasinya cukup lebat, ke dalam tabung tersebut dituang minyak parafin yang sudah disterilisasi dua kali pada suhu 121oC selama 15 menit. Permukaan minyak sebaiknya berada 1 cm di atas permukaan titik pertumbuhan tertinggi dari fungi pada agar miring. Setelah itu disimpan pada suhu 15–20oC (ruangan ber AC) atau 10oC dalam lemari es atau suhu 4oC di kamar pendingin (cool room).

c. Pemeliharaan pada potongan agar dalam airCara ini juga banyak digunakan. Fungi ditumbuhkan pada medium agar yang

sesuai di cawan Petri. Kemudian bagian tepi dari pertumbuhan koloni dipotong, berukuran kurang-lebih sebesar 6 cm, dipindahkan ke botol McCartney yang berisi akuades steril, lalu ditutup secara aseptik, dan disimpan pada suhu kamar.

2. Metode kering-beku (freeze-drying)

Metode kering-beku, yang dikenal sebagai liofilisasi, banyak digunakan karena memiliki beberapa kelebihan, yaitu:• Lebih efisien biakan• Tidak perlu sering diremajakan• Sifat biakan yang disimpan terjamin stabil


• Tempat penyimpanan biakan liofilisasi lebih sederhana, tidak memerlukan tempat yang luas.

Cara kerja :Persiapan ampulNomor biakan dan tanggal melakukan pengawetan dicetak dengan tinta di

bagian luar ampul atau pada kertas yang ditempelkan bagian luar ampul. Ampul yang telah diberi penandaan kemudian ditutup dengan lint caps atau kapas dan disterilkan pada suhu 1800C selama 3 jam. Proses sterilisasi akan mengeringkan dan melekatkan tinta.

Persiapan inokulumSebanyak 10 ml dari suatu campuran susu skim (10% b/v) dan inositol (5%

b/v) dimasukkan ke dalam biakan yang bersporulasi pada medium agar. Setelah itu secara hati-hati spora dikerik dari koloni, dan dikocok perlahan.

Inokulasi ampulSebanyak 0,2 ml suspensi spora dimasukkan dengan pipet Pasteur steril ke

dalam ampul. Ampul-ampul tersebut dipasang pada suatu rak sentrifugasi dari alat pembekuan kering (menggunakan alat Edwards High Vacuum).

Prosedur pembekuan keringPrinsipnya, isi ampul dibekukan di dalam wadah (chamber) yang terdapat pada

alat pembeku-keringan (freeze-dryer), dan proses pengeringan dipercepat dengan memanaskan dinding dari wadah tersebut. Setelah suspensi kering, pemanasan dihentikan dan tekanan di dalam wadah dikembalikan ke tekanan atmosfir, kemudian ampul diambil dan disumbat dengan cotton-wool steril yang ditekan ke dalam sampai sedikit di atas permukaan suspensi kering. Ujung ampul dibakar dengan api yang kuat, kurang-lebih 1 cm di atas ujung sumbat cotton-wool, lalu ampul tersebut dimasukkan ke dalam desikator yang diisi dengan fosfor pentaoksida. Ampul-ampul yang ditutup pada kondisi vakum di titik konstriksi tersebut disimpan di dalam ruangan ber-AC pada suhu 15–200C.

Kontrol pekerjaanSetelah 3-4 hari, satu ampul diambil, dibuka lalu diteteskan 3-4 tetes akuades

steril dan dibiarkan 15-20 menit agar spora-spora menjadi lembab. Isi ampul kemudian digoreskan pada medium agar yang sesuai untuk diperiksa ada atau tidak pertumbuhan dan sporulasi fungi.


3. Metode Pembekuan

Prinsip: Pembekuan biakan di dalam medium agar miring pada suhu pada 20oC atau di dalam nitrogen cair.

Pada agar miring suhu –200C Biakan dipersiapkan dalam medium yang sesuai. Biakan yang telah bersporulasi

lebat kemudian dimasukkan ke dalam deep-freezer pada suhu–200C. Sebagian kecil koloni yang telah beku diambil dan ditempatkan ke dalam medium yang sesuai dan dibiarkan thawing pada suhu kamar. Sisa biakan beku segera dikembalikan ke dalam deep-freezer.

Dalam nitrogen cairAmpul dipersiapkan dengan pemberian kode tanggal pengerjaan, nama biakan,

kemudian dibungkus dengan aluminium foil dan dilakukan sterilisasi pada suhu 1800C selama 3 jam. Biakan yang telah tumbuh lebat pada medium agar yang sesuai dimasukkan ke dalam lemari es (4–70C) untuk melanjutkan pertumbuhan dan supaya agarnya lebih mengeras. Namun, sebagai catatan, tidak semua kapang dapat diperlakukan dengan cara ini.

Persiapan inokulumGliserol (10%b/v) sebagai krioprotektan dimasukkan ke dalam botol universal

dan diotoklaf selama 15 menit pada suhu 1210C, kemudian didinginkan dan disimpan di ruang kamar. Gliserol ditambahkan pada biakan, dan spora dikerik secara hati-hati atau dengan cara agitasi pelan.

Sebanyak 0,5 ml inokulum kapang dimasukkan ke dalam beberapa ampul steril, kemudian ditutup dengan cara pemanasan. Untuk mengetahui apakah tutup sudah sempurna dilakukan uji kebocoran dengan cara memasukkan ampul ke dalam suatu tempat berisi pewarna Erythrosine B. Selanjutnya, ampul-ampul ditempatkan pada rak-rak yang mudah diangkat atau dalam tabung aluminium dan dibekukan 10C per menit dalam fase gas suatu pendingin nitrogen cair (–350C selama 40–45 menit). Setelah itu, ampul- ampul tersebut dimasukkan ke dalam nitrogen cair pada suhu –1960C.

Prosedur pemeriksaan viabilitas biakan:Ampul diambil dari tempat penyimpanan dengan nitrogen cair dan dicelupkan

ke dalam water bath (penangas air) 370C. Suspensi spora yang telah cair


diinokulasikan pada medium agar yang sesuai, setelah itu diinkubasi dan diperiksa pertumbuhannya. Bila pertumbuhan biakan tidak baik, penggunaan gliserol sebagai krioprotektan dapat diganti dengan dimetilsulfida (DMSO) 10% atau campuran DMSO 5% dengan glukosa 8%.

4. Metode L-drying

Metode ini banyak digunakan untuk bakteri dan khamir. Bakteri yang telah disuspensi dikeringkan dengan cara vakum. Biakan tidak boleh sampai membeku, sehingga harus dikeringkan langsung dari fase cair.

Prosedur:Ampul yang telah disiapkan seperti pada proses liofilisasi digantung dengan

posisi vertikal menggunakan alat horizontal manifold. Ampul diisi dengan 0,1 ml suspensi yang pekat. Dua pertiga bagian dari ampul yang telah berisi suspensi konidia atau spora tercelup dalam suatu wadah dengan air bersuhu 200C. Alat horizontal manifold ini berhubungan dengan suatu klep diafragma dan trap P2O3 ke suatu pompa vakum. Secara perlahan, klep dibuka untuk mengeluarkan sebagian besar udara dari suspensi di dalam ampul, yang ditandai dengan terjadinya gelembung gas. Setelah 30 menit, isi ampul sudah kering, ampul dapat dilepas dari alat horizontal manifold. Selanjutnya, ampul berisi suspemsi diberi perlakuan yang sama dengan proses liofilisasi.

Metode ini umumnya digunakan untuk mikroorganisme yang peka terhadap pembekuan, seperti bakteri spiral, tetapi dapat juga untuk khamir dan kapang bersporulasi. Waktu pengeringan sekitar 1–2 jam; lama waktu ini relatif, tergantung pada volume suspensi yang harus dikeringkan.

Penyimpanan mikroba endofit

Kapang endofit yang sudah diisolasi dan diidentifikasi seharusnya disimpan dengan kondisi yang baik agar kapang tetap viable. Namun terkadang kapang tersebut tidak viabel lagi; hal ini ada kemungkinan karena kapang sudah berada di luar inangnya sehingga berada dalam kondisi yang berbeda.

Untuk mengatasi hal tersebut, isolat kapang endofit sebaiknya disimpan dalam

agar miring. Setelah sekitar 6 bulan, isolat kapang endofit tersebut ditanamkan


di Cawan Petri dan, setelah tumbuh, dipindahkan lagi ke agar miring lagi untuk disimpan kembali. Peremajaan ini diulangi setiap 6 bulan.

Untuk menghindari kontaminasi pada Kapang yang disimpan pada agar miring, tutup tabung diberikan larutan pengawet agar kapang tidak terkontaminasi dengan mikroorganisme lain selama penyimpanan. Larutan pengawet disiapkan dalam wadah botol gelas, kemudian tutup kapas ditetesi larutan tersebut dan setelah kering baru disimpan dalam lemarin stok kapang untuk proses selanjutnya.


fErMEntasi

Produk metabolit sekunder mikroba endofit dapat diperoleh dari hasil fermentasi. Terhadap produk tersebut dapat dilakukan pengujian berbagai aktivitas biologik.

Fermentasi berasal dari kata Latin ferfere, yang berarti mendidihkan. Istilah fermentasi sekarang digunakan untuk proses penguraian metabolik senyawa organik oleh mikroorganisme yang menghasilkan energi dan pada umumnya berlangsung dalam kondisi anaerob dengan pembebasan gas.

Sejarah Fermentasi

Fermentasi adalah suatu proses alami yang digunakan untuk menghasilkan suatu produk, seperti anggur, keju, dan bir, sebelum proses biokimia diketahui. Sekitar tahun 1850 dan 1860, Louis Pasteur menjadi orang pertama yang menyatakan bahwa fermentasi disebabkan oleh organisme hidup. Beberapa produk fermentasi selain bir atau anggur adalah beberapa makanan yang berasa asam karena mengandung asam laktat, seperti sauerkraut, yoghurt, roti yang memanfaatkan khamir sebagai pengembang, dan produk alkohol, termasuk biofuels.

teknik fermentasi

Berdasarkan jenis media, fermentasi dapat dibedakan menjadi dua, yaitu fermentasi media padat dan fermentasi media cair.

BAB IVuJi aktiVitas bioLoGi MEtaboLit

sEkundEr


Fermentasi media padat adalah proses fermentasi dengan substrat tidak larut dan tidak mengandung air bebas, tetapi cukup mengandung air untuk keperluan mikroba. Mikroorganisme ditumbuhkan pada permukaan media padat, sehingga fermentasi jenis ini disebut fermentasi permukaan. Fermentasi media padat digunakan untuk produksi enzim dan asam organik yang menggunakan kapang.

Fermentasi media cair adalah proses fermentasi dengan substrat yang larut atau tersuspensi dalam fase cair. Fermentasi media cair disebut fermentasi kultur terendam yang umumnya memerlukan aerasi dan agitasi. Sebagai inokulum pada fermentasi ini digunakan bakteri, kapang dan khamir.’

Untuk keberhasilan suatu proses fermentasi, medium yang sesuai sangat dibutuhkan. Pada umumnya, mikroba membutuhkan air, energi, sumber karbon, nitrogen dan mineral. Selain itu, media yang digunakan juga harus steril sehingga tidak ditumbuhi oleh mikroorganisme lain yang tidak dikehendaki.

Medium fermentasi

Untuk keberhasilan suatu proses fermentasi sangat dibutuhkan media yang sesuai, yang mengandung seluruh kebutuhan mikroba, yaitu air, energi, karbon, nitrogen, dan mineral. Media harus steril untuk mencegah kontaminasi oleh mikroorganisme lain yang tidak dikehendaki. Pada fermentasi dapat digunakan beragam media, sesuai jenis mikrobanya, misalnya Potato Yeast Extract (PDY) untuk kapang dan Potato Dextrose Broth (PDB) untuk bakteri. Agar diperoleh hasil fermentasi yang optimal, perlu diperhatikan beberapa faktor yang dapat mempengaruhi pertumbuhan mikroba, antara lain substrat dan nutrien, suhu, pH, aerasi, dan agitasi.

Pada proses fermentasi perlu dipertimbangkan apakah dilakukan dengan starter atau tanpa starter. Keuntungan menggunakan starter adalah kondisi awal untuk melakukan fermentasi sama.

Berdasarkan metodenya, fermentasi dibagi dua, yaitu fermentasi metode goyang dan metode diam.

Fermentasi metode goyangMetode fermentasi goyang menggunakan alat pengocok rotary atau orbital dan

reciprocating. Alat pengocok rotary lebih sering digunakan. Pada mesin pengocok


rotary, kultur berputar perlahan di dalam labu pada kecepatan 200–250 rpm. Sementara itu, pada mesin pengocok reciproacting, kultur bergerak ulang-alik, ke depan dan ke belakang sehingga, inilah kelemahannya, dapat menyebabkan percikan medium. Sebagai wadah fermentasi digunakan labu Erlenmeyer atau tabung reaksi besar.

Fermentasi metode diamMetode fermentasi diam menggunakan labu Erlenmeyer sebagai wadah, yang didiamkan selama masa inkubasi tanpa ada goncangan. Idealnya, media fermentasi yang diisikan ke dalam wadah fermentasi adalah 20% dari volume wadah tersebut.

faktor-faktor yang Mempengaruhi Proses fermentasi

Pembentukan produk hasil fermentasi mikroba dapat dipengaruhi oleh beberapa faktor, seperti substrat dan nutrien, suhu, pH, aerasi, dan agitasi.

Substrat dan nutrienMedium fermentasi harus menyediakan semua nutrien yang dibutuhkan oleh

mikroba untuk pertumbuhan dan memperoleh energi. Dalam fermentasi dibutuhkan substrat yang murah, mudah didapat, dan efisien penggunaannya. Beberapa substrat yang dapat digunakan sebagai sumber karbon adalah molase dan pati. Sementara itu, garam amonium, urea, nitrat, dan tepung kedelai dapat digunakan sebagai sumber nitrogen.

Keasaman (pH)Pengukuran pH dilakukan agar medium dapat dipertahankan berada pada pH

optimum selama fermentasi. Bakteri memiliki pH optimum 6,7– 7,5; pada pH di bawah 5,5 dan di atas 8,5, bakteri tidak dapat tumbuh dengan baik. Khamir dapat tumbuh pada pH 2,5–8,5. Sementara itu, kapang mempunyai pH optimum antara 5 dan 7, dan dapat tumbuh pada kisaran pH 3–8,5.

SuhuFermentasi dilakukan pada suhu dimana pertumbuhan sel atau produksi

metabolit tertinggi. Sebagian besar mikroorganisme hanya dapat tumbuh pada rentang suhu 20–30oC. Berdasarkan suhu pertumbuhan optimum, mikroorganisme yang digunakan dalam fermentasi tergolong mesofil dengan suhu optimum 20–45oC dan termofil dengan suhu optimum 45oC. Mikroorganisme yang memiliki laju


pertumbuhan yang baik pada suhu di bawah 20oC adalah tergolong psikrofil.Aerasi dan agitasiAerasi bertujuan agar pasokan oksigen cukup memadai, untuk mempertahankan

kondisi aerobik dan membuang gas karbon dioksida yang dihasilkan selama fermentasi. Agitasi juga bertujuan meratakan penyebaran mikrorganisme, nutrien, dan oksigen di dalam medium.

Untuk mendapatkan hasil metabolit sekunder yang optimal perlu medium dan teknik fermentasi yang sesuai dengan kondisi dari mikroorganisme endofit tesebut. Setiap mikroorganisme memiliki ciri yang sesuai dengan metabolisme sekunder yang akan dihasilkan. Namun, secara umum, metode goyang sesuai untuk digunakan pada kebanyakan mikroorganisme.

Cara Kerja Fermentasi

Untuk kapang, isolat mikroba diremajakan dengan menggunakan medium PDA (Potato Dextrose Agar) miring dan fermentasi dilakukan dengan teknik fermentasi cair menggunakan media PDY (Potato Dextrose Yeast Extract). Fermentasi dilakukan selama 14 hari pada suhu 27oC. Biomassa sel dipanen menggunakan sentrifus berpendingin dengan kecepatan 3000 rpm selama 20 menit, pada suhu 4oC. Untuk uji aktivitas biologik, misalnya uji efek sitotoksik terhadap sel kanker, pada uji aktivitas antimikroba dan lainnya digunakan supernatan.

Prosedur Melakukan fermentasi Cair

Kapang endofit berumur 5–7 hari pada medium PDA di dalam cawan Petri diambil dengan menggunakan alat pembolong gabus, cork borer, atau pisau. Sebanyak 5 potongan kapang dimasukkan ke dalam 50 ml medium fermentasi cair PDY. Setelah itu, dilakukan fermentasi dengan menggunakan orbital shaker incubator pada kecepatan 130 rpm, selama 14 hari. Untuk mendapatkan hasil fermenatsi, dilakukan sentrifugasi selama 20 menit dengan kecepatan 2000 rpm, pada suhu –4oC (Modifikasi Cheeptan) guna memisahkan biomassa dari supernatan.

Supernatan mengandung metabolit sekunder ekstraseluler, sementara pada biomassa terkandung metabolit sekunder intraseluler. Metabolit sekunder yang diteliti sesuai dengan tujuan penelitian. Skema alur penelitian dapat dilihat pada Gambar 7.


Pengujian aktivitas biologi metabolit sekunder produk fermentasi dapat dilakukan pada produk ekstrak kasar maupun ekstrak yang telah dipartisi. Sampel-sampel ekstrak mana yang diuji disesuaikan dengan tujuan dan rancangan penelitian.

Ekstraksi dan fraksinasi

Setelah diperoleh supernatan maupun biomassa dari metabolit sekunder kapang atau bakteri endofit perlu dilakukan ekstraksi. Ekstraksi adalah pemisahan komponen dari suatu bahan alam berdasarkan perbedaan kelarutan bahan. Ekstraksi dapat dilakukan dengan menggunakan beragam pelarut, mulai dari pelarut non-polar (heksana, eter), semi-polar (kloroform, dietilmetan) sampai polar (butanol, metanol). Metode ekstraksi dapat dilakukan dengan cara maserasi atau soxhletasi.

Teknik pemisahan komponen dapat didasarkan pada sifat kepolaran suatu bahan uji. Pemisahan komponen dalam suatu bahan disebut fraksinasi. Jumlah serta jenis senyawa yang dapat dipisahkan menjadi fraksi yang berbeda bergantung pada jenis tanaman atau bahan yang diuji.

Pemisahan kandungan senyawa dapat dilakukan dengan kromatografi kolom, dan hasilnya diteruskan dengan pemurnian. Untuk itu dapat digunakan teknik kromatografi lapis tipis (KLT) preparatif atau kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT).

Teknik kromatografi lain, liquid chromatography mass spectrometer (LCMS), dapat digunakan untuk penetapan komponen yang terkandung dan bersifat polar, serta tidak tahan pemanasan. Untuk analisis kualitatif dan kuantitatif komponen yang bersifat nonpolar, seperti menganalisis kandungan minyak cengkeh atau bahan tumbuhan berkhasiat lainnya yang bersifat mudah menguap, dapat digunakan gas chromatography mass spectrometer (GCMS).

Kromatografi

Prinsip kromatografi adalah pemisahan berdasarkan partisi cuplikan yang berada di antara fase bergerak dan fase diam. Fase diam berperan menahan secara selektif partisi cuplikan, sementara itu fase bergerak yang berfungsi membawa bahan yang dipisahkan dapat berbentuk padat atau cair.

Mikroba Endofit, Pemanfaatan Mikroba Endofit dalam Bidang Farmasi58 68 Mikroba endofit

Metabolit Sekunder

terpenoid Flavonoid Alkaloid glikosida Steroid

Metabolit sekunder dengan aktivitas yang diperoleh

Senyawa murni dengan aktivitas yang diinginkan

Dapat dikembangkan sebagai bahan baku obat dalam

industri farmasi

FERMENTASI

Uji sesuai dengan tujuan penelitian Uji AKTIVITAS FARMAKOLOgiK. (SitOTOKSiK, Uji ANTIMiKROBA, ANTIDIABETES, ANTIINFLAMASI).

Dilakukan pemisahan dan pemurnian KROMATOGRAFI LAPiS TiPiS (KLT) KROMATOGRAFI KOLOM HPLC LC-MS GC-MS NMR

Gambar 7. Skema alur penelitian

TUMBUHAN

Endofit

ISOLASIlASi

Bakteri Kapang Khamir

EKSTRAKSI-ISOLASI

Gambar 7. Skema alur penelitian


Kromatografi dapat digolongkan berdasarkan jenis fase diam dan fase gerak: Kromatografi cair-padat, gas-padat, cair-cair, dan gas-cair. Penggolongan lain adalah berdasarkan mekanisme pemisahan menjadi kromatografi serapan, partisi, penukar ion, dan kromatografi gel. Selain itu, kromatografi dapat digolongkan berdasarkan teknik pemisahan menjadi kromatografi kolom cepat, kolom lambat, dan bidang datar.

Kromatografi Lapis Tipis Kromatografi lapis tipis (KLT) merupakan bentuk kromatografi cair-padat. Fase

diam dapat berupa lempeng kaca atau logam yang dilapisi silika gel, aluminium oksida, kieselgur, serbuk selulosa, pati poliamida, atau Sephadex. Campuran yang akan dipisahkan ditotolkan, berupa bercak atau pita pada fase diam. Pekerjaan kromatografi dilakukan di dalam suatu bejana yang tertutup rapat berisi larutan pengembang dalam keadaan jenuh. Setelah pengembangan selesai, lempeng kromatogram diambil dan dikeringkan, kemudian disemprot dengan penampak bercak. Posisi bercak pada lempeng dinyatakan dengan harga Rf atau hRf (hRf = 100 x harga Rf). Faktor retensi (retention factor, Rf) adalah jarak yang digerakkan oleh senyawa dari titik asal dibagi dengan jarak yang digerakkan oleh pelarut dari titik asal.

KLT sering digunakan untuk mencari pelarut terbaik yang nantinya digunakan pada kromatografi kolom, menganalisis fraksi hasil kromatografi kolom, mengetahui arah reaksi, identifikasi dan isolasi senyawa murni skala kecil.

Kromatografi Kolom Kromatografi kolom (KK) merupakan kromatografi serapan yang dapat

digunakan untuk fraksinasi campuran senyawa dalam skala besar. Kolom berupa tabung kaca dengan kran pada ujung bagian bawah. Kolom ada dua jenis, yaitu kolom cepat (yang menggunakan vakum) dan kolom biasa.

Kolom dapat diisi dengan bahan penyerap, misalnya silika gel sebagai fase diam, dan dialiri pelarut sebagai fase gerak. Cairan pelarut kemudian dialirkan melalui bagian bawah sampai diperoleh fase tetap yang kompak, tidak terdapat udara yang terperangkap di dalamnya. Campuran senyawa yang diuji ditambahkan ke fase gerak dan dicampur dengan fase diam, diaduk sampai rata, kemudian dimasukkan ke dalam kolom. Setelah itu, dilakukan elusi dengan fase gerak.


Perbandingan tinggi kolom yang diisi dengan silika: 10 : 1 x diameter kolom. Fase gerak dimulai dari fase yang kurang polar ke fase yang paling polar. Perbandingan antara cuplikan dan kolom antara 1: 50 sampai 1 : 500.

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) adalah kromatografi khusus

menggunakan cairan tekanan tinggi. Alat utama: tandon pelarut, pipa, pompa, penyuntik, kolom, detektor, perekam KCKT analitik dan KCKT preparatif. Fase gerak biasanya terdiri dari campuran pelarut yang dapat bercampur dan berperan dalam daya elusi dan resolusi. Sementara itu fase diam terikat pada polimer berpori yang terdapat dalam kolom baja tahan karat.

KCKT berbeda dari kromatografi kolom karena memiliki sifat khas, yaitu kolom sempit dengan diameter antara 1–3 mm sehingga memungkinkan pemisahan dalam jumlah mikro. Ukuran partikel bahan adsorbsi di bawah 50 µm, sehingga tercapai bilangan dasar teoretik yang tinggi. Pelarut elusi dialirkan ke dalam kolom dengan tekanan untuk mengkompensasi tekanan arus dalam kolom.

uJi aktiVitas bioLoGik

Setelah selesai melakukan ekstraksi dan kromatografi, dapat dilakukan uji aktivitas biologik. Uji ini dilakukan untuk menetapkan aktivitas metabolit sekunder yang dihasilkan kapang atau bakteri endofit. Misalnya, untuk menetapkan aktivitas antibakteri, antikapang, antikanker, antioksidan, anti-inflamasi, imunostimulan, antidiabetik, dan antimalaria. Selain itu, uji aktivitas biologik dapat pula untuk menetapkan aktivitas enzim (seperti xylanase, selulase).

uJi bioaktiVitas MEtaboLit sEkundEr

1. Uji Antimikroba

Prinsip kerjaPada uji antimikroba yang diukur adalah pertumbuhan populasi mikroorganisme

terhadap agen antimikroba. Pada uji antimikroba secara in vitro ini ada tiga metode, yaitu metode difusi, dilusi, dan bioautografi.


Dari tiga metode tersebut, yang paling banyak digunakan untuk penapisan awal adalah difusi agar, karena metode ini cukup sederhana. Sebagai pecadang dapat digunakan cakram (kertas cakram), silinder dari gelas ataupun dari baja tahan karat, dengan teknik galian atau sumuran. Untuk mengetahui aktivitas antibakteri, bila diduga kandungan dari ekstrak tidak cukup tinggi, dapat digunakan dengan teknik galian atau sumuran

Ada beberapa faktor yang dapat mempengaruhi hasil uji aktivitas antimikroba secara in vitro, antara lain:(i) Keasaman (pH) lingkungan. Beberapa senyawa antimikroba lebih aktif pada pH asam.(ii) Komponen-komponen dalam perbenihan. Penambahan NaCl pada perbenihan akan meningkatkan pendeteksian

resistensi suatu senyawa antimikroba terhadap bakteri tertentu, seperti pada Staphylococcus aureus.

(iii) Stabilitas senyawa antimikroba. Beberapa senyawa antimikroba dapat kehilangan daya kerjanya pada suhu

pengeram.(iv) Ukuran inokulum. Pada umumnya, semakin besar inokulum bakteri, makin rendah “kepekaan”

organisme. Populasi bakteri yang besar, lebih lambat dan kurang lengkap hambatannya dibanding populasi yang kecil. Selain itu, mutan yang resisten lebih sering muncul pada populasi besar.

(v) Lama pengeraman. Mikroorganisme tidak dimatikan tetapi hanya dihambat setelah berhubungan

singkat dengan senyawa antimikroba. Semakin lama masa pengeraman berlangsung, makin besar timbulnya mutan resisten dan semakin besar juga kemungkinan mikroorganisme yang paling kurang peka untuk memulai berkembang biak, sementara kekuatan dari senyawa antimikroba akan berkurang.

(vi) Aktivitas metabolik mikroorganisme. Mikroorganisme yang aktif dan tumbuh cepat lebih peka terhadap daya kerja

senyawa antimikroba. Sebaliknya, mikroorganisme yang metabolismenya tidak aktif dapat bertahan lama terhadap pengaruh senyawa antimikroba.

Pengukuran terhadap hasil percobaan dengan metode difusi didasarkan atas besarnya zona (daerah) hambat yang terbentuk, yang dapat dikatagorikan dalam tiga kategori, yaitu:


• Zona hambat total, bila zona hambat yang terbentuk di sekitar pecadang terlihat jelas.

• Zona hambat parsial, bila di dalam zona hambat yang terbentuk masih terlihat adanya pertumbuhan beberapa koloni.

• Zona hambat nol, bila tidak ada zona hambat yang terbentuk di sekeliling pecadang.

Metode Difusi Cakram

Metode Kirby-Bauer dan Stokes biasanya digunakan untuk pengujian suseptibilitas antimikroba.

Prosedur Pelaksanaan Uji Difusi CakramPenyiapan biakan bakteri dilakukan sebagai berikut:

(1) Diambil tiga hingga lima koloni terpisah dari jenis morfologi yang sama dari biakan agar lempeng. Bagian atas setiap koloni disentuh dengan sebuah loop, lalu dipindahkan ke dalam sebuah tabung reaksi berisi 4 hingga 5 ml medium broth (kaldu) yang sesuai, biasanya digunakan kaldu pepton.

(2) Biakan kaldu diinkubasi pada suhu 350C hingga mencapai atau melebihi kekeruhan standar McFarland 0,5 (selama 2 hingga 6 jam).

(3) Turbiditas (kekeruhan) biakan kaldu yang tumbuh disesuaikan dengan menggunakan larutan garam normal atau kaldu untuk mendapatkan kekeruhan yang sama dengan standar McFarland 0,5. Dari perlakuan ini akan dihasilkan suatu suspensi yang mengandung 1–2 x 108 CFU/ml, misalnya untuk Escherichia coli ATCC 25922. Untuk melakukan tahap ini dengan benar, dapat digunakan alat fotometer, atau jika dilakukan dengan tepat, diperlukan cahaya yang adekuat untuk membandingkan tabung inokulum secara visual dengan standar McFarland 0,5 di atas sebuah kartu berlatar belakang putih dan bergaris hitam.

Inokulasi suspensi bakteri pada media agar lempeng(1) Untuk mendapatkan hasil yang optimal, dilakukan inokulasi dalam waktu 15

menit setelah penyesuaian kekeruhan suspensi biakan. Untuk itu, diambil batang lidi berkapas steril, dicelupkan ke dalam suspensi bakteri yang telah disesuaikan kekeruhannya dengan 0,5 McFarland, dan ditiriskan pada mulut tabung

(2) Kapas steril tersebut digoreskan pada permukaan agar secara merata ke seluruh bagian dari agar tersebut. Penggoresan dilakukan dua kali atau lebih, dengan memutar lempeng agar sekitar 600C guna memastikan inokulum menyebar rata.


Aplikasi cakram ke lempeng agar inokulasiCakram yang telah dijenuhkan dengan agen antimikroba diletakkan di atas

permukaan agar yang telah diinokulasi dengan biakan bakteri. Cakram tersebut diletakkan pada cawan Petri, secara manual atau eletronik, dengan menggunakan dispenser bertenaga baterai. Setiap cakram harus ditekan perlahan-lahan untuk memastikan cakram benar-benar bersentuhan dengan permukaan agar dan didistribusikan secara merata sehingga jarak dari pusat ke pusat tidak lebih dari 24 mm. Biasanya, tidak lebih dari 12 cakram yang diletakkan pada satu agar lempeng untuk cawan Petri berdiameter 150 mm, atau 5 cakram untuk cawan Petri 100 mm. Hal yang perlu diperhatikan, sebuah cakram tidak boleh dipindahkan jika telah bersentuhan dengan permukaan agar, karena sebagian obat telah menyebar.

Cawan Petri diletakkan dalam keadaan terbalik di dalam sebuah inkubator 350C dalam waktu 15 menit setelah cakram dipasang. Kecuali untuk Haemophilus spp., Streptococcus, dan N. gonorrhoeae, tidak boleh dilakukan inkubasi dengan CO₂ yang tinggi, karena standar-standar interpretasi dikembangkan menggunakan inkubasi udara ruang, dan adanya CO₂ akan mengubah ukuran zona inhibitor pada beberapa agen secara signifikan.

Setelah diinkubasi pada suhu 350C selama 24 jam, penghambatan pertumbuhan mikroorganisme oleh antimikroba terlihat sebagai daerah jernih di sekitar pertumbuhan mikroorganisme. Diamati ada tidaknya daerah hambat di sekitar cakram, dan diameter daerah hambat diukur dengan menggunakan jangka sorong.

Metode dilusiMinimum inhibitory Concentration (MiC) atau kadar Hambat Minimal (kHM)

Ada dua metode pengujian KHM:

(1) Metode dilusi kaldu Pada metode ini dilakukan pengenceran bahan uji dengan kaldu pepton.

(2) Metode dilusi agar Pada metode dilusi agar dilakukan pengenceran bahan uji dengan agar pepton.


Metode dilusi kaldu

Metode dilusi kaldu merupakan prosedur sederhana untuk pengujian isolat dalam jumlah kecil, bahkan untuk satu isolat saja. Keuntungan lain metode ini adalah karena tabung yang sama dapat juga digunakan untuk uji MBC (minimal bactericidal concentration) atau KBM (konsentrasi bunuh minimal).

BahanPipet steril bertingkat ukuran 10 ml, 5 ml, 2 ml, dan 1 ml, botol kecil bertutup ulir/

tabung ukuran 7,5 x 1,3 cm dengan tutup steril, pipet Pasteur, kultur kaldu berumur 24 jam untuk organisme uji dan organisme kontrol. Antibiotik yang diperlukan dalam bentuk serbuk (standar dilengkapi keterangan tentang aktivitasnya dalam mg/unit atau per ml). Pelarut yang diperlukan untuk antibiotik, air suling steril 500 ml, dan media kaldu nutrien yang sesuai. Untuk bahan uji disesuaikan.

Prosedur kerja:Dibuat seri pengenceran agen antimikroba pada medium cair yang ditambahkan

suspensi biakan mikroba uji. Larutan uji agen antimikroba pada kadar terkecil yang terlihat jernih tanpa adanya pertumbuhan mikroba uji ditetapkan sebagai KHM. Untuk menetapkan KBM, larutan KHM tersebut dilanjutkan dengan dikultur-ulang pada media cair tanpa penambahan mikroba uji ataupun agen antimikroba. Atau dapat juga dikultur-ulang dengan menggoreskan pada media agar lempeng. Setelah itu diinkubasi selama 18–24 jam. Media cair yang tetap terlihat jenih atau tidak ada pertumbuhan pada goresan agar lempeng setelah diinkubasi dinyatakan sebagai KBM.

teknik dilusi menggunakan microplate 96 (plat 96 sumur)

Teknik dilusi juga dapat menggunakan mikro-dilusi dengan plat 96-sumur. Teknik ini memiliki beberapa kelebihan, yaitu murah, memberikan hasil yang dapat direproduksi, lebih sensitif, memerlukan sampel yang lebih sedikit, dapat digunakan untuk jumlah sampel besar, dan waktu yang dibutuhkan lebih singkat.

Metode Bioautografi

Bioautrografi adalah teknik laboratorium sederhana yang sangat berguna karena cepat mendeteksi senyawa-senyawa yang mempengaruhi tingkat pertumbuhan organisme. Bioautografi memadukan KLT dengan bioassay secara in situ dan


memberikan peluang lokalisasi senyawa-senyawa aktif dalam bentuk fraksi atau ekstrak.

Bioautrografi dapat dikelompokkan menjadi bioautografi langsung, agar overlay/imersi, dan difusi agar/kontak. Metode yang paling sering digunakan adalah bioautografi langsung. Teknik agar-overlay (yang merupakan suatu hibrida dari metode langsung dan metode kontak) dapat digunakan ketika bioautografi langsung tidak dapat dilakukan. Zona inhibisi bioautografi dilihat melalui deteksi aktivitas dehidrogenase dengan menggunakan garam tetrazolium (MTT).

2. Uji Aktivitas Anti kapang

Prinsip kerja:Sama dengan uji antimikroba, tetapi mikroba ujinya adalah kapang.Kapang yang sering digunakan untuk uji coba adalah Aspergillus sp. Sementara,

khamir yang sering digunakan Candida albicans.

Metode yang digunakan: Uji difusi agar menggunakan cakram kertas dengan diameter 6 mm sebagai pecadang.

Suspensi jamur sebanyak 1ml dalam cawan petri steril, kemudian dimasukkan media agar SDA ( Sabaroud Dextrose Agar ) yang masih cair sebanyak 15 mL, dan media dibiarkan memadat. kertas cakram steril yang telah diteteskan 10µl larutan uji diletakkan di atas permukaan media menggunakan pinset. Stelah itu diinkubasi pada suhu 200C selama 72 jam. Kontrol positif yang digunakan adalah 10 µl Nistatin dan kontrol negatif yang digunakan adalah Pelarut ekstrak dari bahan Uji. Setelah 72 jam diamati ada tidaknya zona jernih disekitar kertas cakram. Zona jernih yang terbentuk diukur diameternya dengan jangka sorong. Adanya daerah zona jernih di sekeliling kertas cakram menunjukkan adanya aktivitas antijamur. Zona hambat = diameter zona jernih – diameter cakramPerhitungan hasil menggunakan ± SD (Standar Dviasi)

3. Uji Aktivitas Antivirus

Prinsip kerja :Bahan uji dipaparkan dengan inokulasi virus menggunakan kultur jaringan atau

dengan inokulasi telur berembrio pada jaringan hidup.


Prosedur kerja:Campuran antara suspensi virus dan larutan agen antimikroba uji dibuat dalam

seri pengenceran. Seri pengenceran dilakukan dengan menggunakan serum yang telah diinaktivasi, misalnya serum kuda, dan diinokulasikan pada kultur sel atau telur berembrio. Sebagai kontrol, digunakan larutan tanpa virus. Kontrol terhadap bahan uji juga dilakukan, karena bahan uji dapat pula toksik pada kultur jaringan atau telur. Seri pengenceran bahan uji dicampurkan dengan serum yang diinaktivasi dan diinokulasi ke dalam sel jaringan atau telur berembrio. Pengamatan dilakukan setiap hari, ada atau tidaknya kerusakan sel atau jaringan.

Selain menggunakan kultur sel atau telur, uji aktivitas antivirus juga dapat dilakukan pada hewan percobaan. Sebagai contoh, pada pengujian virus hepatitis B (HBV) yang tidak dapat ditumbuhkan pada kultur sel ataupun telur berembrio.

4. Uji Antidiabetes secara In Vitro

Uji aktivitas a-glikosidase

Prinsip kerja: Glukosa darah di dalam tubuh berasal dari makanan yang mengandung

karbohidrat, seperti pati, akan mengalami hidrolisis dengan bantuan enzim, seperti a-glikosidase dan a-amilase. Enzim a-glikosidase inhibitor (acarbose dan miglitol) akan menurunkan absorpsi gula di usus halus. Enzim a-amilase dan a-glikosidase inhibitor yang berasal dari alam memiliki efek hambatan yang kuat terhadap a-glikosidase sehingga dapat digunakan sebagai terapi hiperglikemik postprandial dengan efek samping yang lebih lemah.

Prosedur kerja1. Sediaan uji dibuat dengan berbagai konsentrasi, diambil 50 µl, kemudian

dicampur dengan 100 µl larutan dapar fosfat (pH 6,9) yang mengandung a-glikosidase (1 U/ml), lalu diinkubasi pada suhu 250C selama 5 menit.

2. Setelah diinkubasi, ditambahkan 50 µL larutan p-nitrofenil- a-D- glukopiranosida dalam larutan dapar fosfat 5 mM 0,1 M. Campuran ini diinkubasi pada suhu 250C selama 5 menit.

3. Sebelum dan sesudah diinkubasi, serapan diukur dengan ELISA Reader pada panjang gelombang 405 nm.

4. Sebagai kontrol digunakan 50 µl larutan dapar.


5. Aktivitas hambatan a-glikosidase diukur dengan menggunakan rumus:

Mikroba endofit 77

∆A Control ∆A Extract 405 405

∆A Control 405

Prinsip kerja: Glukosa darah di dalam tubuh berasal dari makanan yang mengandung

karbohidrat, seperti pati, akan mengalami hidrolisis dengan bantuan enzim, seperti -glikosidase dan -amilase. Enzim -glikosidase inhibitor (acarbose dan miglitol) akan menurunkan absorpsi gula di usus halus. Enzim -amilase dan -glikosidase inhibitor yang berasal dari alam memiliki efek hambatan yang kuat terhadap -glikosidase sehingga dapat digunakan sebagai terapi hiperglikemik postprandial dengan efek samping yang lebih lemah.

Prosedur kerja

1. Sediaan uji dibuat dengan berbagai konsentrasi, diambil 50 µl, kemudian dicampur dengan 100 µl larutan dapar fosfat (pH 6,9) yang mengandung -glikosidase (1 U/ml), lalu diinkubasi pada suhu 25°C selama 5 menit.

2. Setelah diinkubasi, ditambahkan 50 µL larutan p-nitrofenil- -D- glukopiranosida dalam larutan dapar fosfat 5 mM 0,1 M. Campuran ini diinkubasi pada suhu 25°C selama 5 menit.

3. Sebelum dan sesudah diinkubasi, serapan diukur dengan ELISA Reader pada panjang gelombang 405 nm.

4. Sebagai kontrol digunakan 50 µl larutan dapar. 5. Aktivitas hambatan -glikosidase diukur dengan menggunakan rumus:

% inhibition = x100

5. Uji Aktivitas untuk Antikanker

Uji aktivitas untuk senyawa antikanker dapat dilakukan dengan berbagai cara, antara lain:

Uji Sitotoksik dengan metoda MTT 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)- 2,5-diphenyltetrazolium bromide tetrazole Prinsip kerja: Garam MTT terlibat dalam kerja enzim dehidrogenase pada retikulum

endoplasma yang menghasilkan NADH atau NADPH, dan selanjutnya NADH akan mereduksi MTT menjadi formazan. Pada proses reduksi ini, suksinat merupakan donor elektron lemah untuk reduksi MTT pada mitokondria, dan proses produksi NADH ini melalui proses glikolisis dari respirasi. Intensitas warna ungu yang terbentuk berkolerasi langsung dengan jumlah sel yang aktif melakukan metabolisme, dengan demikian berkorelasi langsung dengan viabilitas sel.

Prosedur kerja:

5. Uji Aktivitas untuk Antikanker

Uji aktivitas untuk senyawa antikanker dapat dilakukan dengan berbagai cara, antara lain:

Uji Sitotoksik dengan metoda MTT 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)- 2,5-diphenyltetrazolium bromide tetrazole

Prinsip kerja:Garam MTT terlibat dalam kerja enzim dehidrogenase pada retikulum

endoplasma yang menghasilkan NADH atau NADPH, dan selanjutnya NADH akan mereduksi MTT menjadi formazan. Pada proses reduksi ini, suksinat merupakan donor elektron lemah untuk reduksi MTT pada mitokondria, dan proses produksi NADH ini melalui proses glikolisis dari respirasi. Intensitas warna ungu yang terbentuk berkolerasi langsung dengan jumlah sel yang aktif melakukan metabolisme, dengan demikian berkorelasi langsung dengan viabilitas sel.

Prosedur kerja:1. Sediaan uji berupa ekstrak/fraksi/isolat yang dilarutkan dalam 100 µL DMSO,

kemudian ditambahkan media sampai 1 ml. Larutan induk dengan konsentrasi 1 mg/ml yang didapat kemudian disterilkan dengan menggunakan membran filter steril dan dibuat larutan dengan konsentrasi bertingkat 1000 µg/ml, 200 µg/ml, 100 µg/ml, 20 µg/ml, 10 µg/ml, 2 µg/ml.

2. Suspensi sel lestari dengan kepadatan sel 5 x 104 sel/ 100 µl diambil sebanyak 100 µl dimasukkan ke dalam 96 sumuran dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 370C. Setelah 24 jam, ditambahkan 100 µl ekstrak uji pada berbagai peringkat konsentrasi, lalu diinkubasi selama 48 jam pada suhu 370C.

3. Setelah 48 jam, sel dipanen dan dilakukan pengecatan dengan MTT lalu


ditunggu selama kurang-lebih 4 jam untuk MTT bereaksi dengan sel. Setelah 4 jam, reaksi dihentikan dengan penambahan sulfat disuksida (SDS) lalu disentrifugasi selama 5 menit dan dihitung menggunakan ELISA reader. Sel yang hidup menyerap zat warna ungu, sementara sel yang mati tetap berwarna putih mengkilat.

Uji Sitotoksik dengan Metoda Biru Tripan

Prinsip kerja:Pengujian menggunakan dye exclusion method (trypan blue exclusion assay)

didasarkan pada perubahan permeabilitas membran dan kebocoran komponen sel ke dalam supernatan dan masuknya zat warna biru tripan ke dalam sel, yang tidak terjadi pada sel yang viable. Pada pemeriksaan dengan mikroskop cahaya, sel yang viable tidak terwarnai oleh tripan biru dan akan nampak sebagai sel yang berwarna terang. Sel yang mati dengan permeabilitas membran terganggu akan terlihat sebagai sel yang berwarna biru, karena biru tripan akan berikatan dengan protein intraseluler pada sel yang bocor.

Prosedur kerja:

1. Sediaan uji berupa ekstrak/fraksi/isolat yang dilarutkan dalam 100 µl DMSO, kemudian ditambahkan media sampai 1 ml. Larutan induk dengan konsentrasi 1 mg/ml yang didapat lalu disterilkan dengan menggunakan membran filter steril. Selanjutnya, dari larutan induk steril dibuat larutan dengan konsentrasi bertingkat 1000 µg/ml, 200 µg/ml, 100 µg/ml, 20 µg/ml, 10 µg/ml, 2 µg/ml.

2. Suspensi sel lestari dengan kepadatan 5 x 104 sel/ 100 µl sebanyak 100 µl dengan media yang sesuai didistribusikan ke dalam sumuran-sumuran microplate 96 dan diinkubasi selama 24 jam, pada suhu 370C. Setelah 24 jam, ditambahkan 100 µl ekstrak uji pada berbagai peringkat konsentrasi, lalu diinkubasi selama 48 jam, pada suhu 370C.

3 Viabilitas sel tumor masing-masing sumuran dihitung dengan menggunakan eksklusi trypan blue.


Uji Sitotoksik menggunakan Sel MCF-7

Prinsip kerja:Sediaan uji berupa ekstrak/fraksi/isolat dilarutkan dalam DMSO 10% (w/v) sebagai larutan stok dan larutan kerja (v/v). Untuk larutan kerja dibuat dengan melarutkan ekstrak dalam RPMI-1640, dan aktivitas antikanker ditetapkan menggunakan sel MCF-7. Ekstrak dengan aktivitas tertinggi berdasarkan aktivitas nilai IC50 diuji-ulang dengan sel MCF-7, pada berbagai konsentrasi, yaitu 25, 50, 100, 200, dan 400 mg/ml. Ekstrak yang paling aktif diuji dengan sel normal pada konsentrasi sama. DMSO digunakan sebagai kontrol negatif, sementara doxorubicin digunakan sebagai kontrol positif.

Prosedur kerja:1. Sebanyak 20 ml masing-masing larutan ditambahkan ke dalam micro plate

yang kemudian diisi dengan 100 ml sel kanker (7,5 × 104 sel / ml). Campuran diinkubasi selama 24 jam pada suhu 370C dalam inkubator 5% CO2. Sel yang bertahan ditentukan dengan menghitung menggunakan ELIZA reader pada 595 nm.

2. Data absorbansi dari ELISA yang dikonversi menjadi% penghambatan sel sesuai dengan persamaan:

{(Nilai Abs kontrol) – (Nilai abs sampel)}Penghambatan sel = ______________________________________ x 100% Nilai abs kontrol

3. Korelasi antara kematian sel dan konsentrasi ekstrak kemudian dianalisis dengan menggunakan uji garis regresi, sehingga diperoleh konsentrasi ekstrak yang menghasilkan 50% pertumbuhan sel kanker (IC50 ).

.


6. Teknik Bioassay antioksidan

Metoda uji ini untuk mengukur aktivitas antioksidan secara in vitro, dan yang diukur adalah aktivitas sediaan uji dalam menghambat enzim yang menyebabkan terbentuknya radikal bebas.

Metoda Uji In Vitro

Metoda dPPH Radical Scavenging AssayPada metoda ini, aktivitas scavenger radikal bebas dari sediaan uji diukur

melalui perubahan absorbansi DPPH (1,1-diphenyl-2picrylhydrazyl radical) pada λ 515 nm, dengan spektrofotometer.

Prinsip kerja:DPPH (1,1-diphenyl-2picrylhydrazyl radical) adalah radikal bebas yang

stabil, dapat menerima elektron atau radikal hidrogen dan membentuk molekul diamagnetik yang stabil. Aktivitas scavenger radikal bebas dapat diukur melalui penurunan absorbansi DPPH* pada λ 517 nm yang mereprentasikan bentuk tereduksi. 1,1-Diphenyl-2picrylhydrazyl (DPPH) berwarna kuning, dan dengan adanya donor elektron larutan dalam etanol akan berwarna ungu.

Prosedur kerja:1. DPPH dilarutkan dalam etanol sebanyak 95 µl, dicampurkan dengan 5µl sediaan

uji yang dilarutkan dalam DMSO di dalam sumuran, kemudian digoyang-goyangkan sampai campuran homogen dan disimpan di tempat gelap (paraffin film).


2. Konsentrasi akhir larutan DPPH 100–1000 µM sebagai standar, dan sebagai kontrol digunakan 5 µl DMSO.

3. Campuran pereaksi dan sediaan uji diinkubasi pada suhu 370C, selama 30 menit.4. Setelah inkubasi, serapan campuran diukur pada λ 515 nm menggunakan

spektrofotometer.5. Aktivitas radikal scavenger DPPH dan scavenger superoksida (%) dihitung

dengan menggunakan rumus:

% RSA = [100-(AS/AC) x 100]

RSA : aktivitas radikal scavenger AS : absorban radikal DPPH dengan adanya sampel AC : absorban radikal

DPPH tanpa adanya sampel

Metode tba

Prinsip kerja:Pada metode TBA, aktivitas antioksidan ditetapkan berdasarkan reaksi

penstabilan senyawa radikal dengan ikatan rantai samping asam lemak antara dua senyawa radikal lipid sehingga terbentuk senyawa yang tidak radikal. Pengukuran daya hambat antioksidan pada metode ini dilakukan pada hari ke 10 dari percobaan, dengan mengukur produk sekunder dari oksidasi asam linoleat secara termal.


Prosedur keja:1. Dibuat larutan sampel 0,05% b/v dalam etanol absolut. Sebanyak 2 ml larutan

sampel dimasukkan ke dalam botol yang telah disiapkan, kemudian ditambahkan 0,05% M asam linoleat sebanyak 10 ml dan dapar fosfat 0,1 M pH 7 sebanyak 8 ml. Campuran reaksi tersebut diinkubasi pada suhu 400C. Pengukuran dilakukan pada hari ke 10.

2. Sampel dipipet 2 ml ke dalam tabung reaksi, kemudian ditambahkan 2 ml TCA 20% dan 1 ml TBA 0,67%. Campuran dipanaskan di atas tangas air selama 10 menit, kemudian didinginkan dan disentrifugasi dengan kecepatan 3000 rpm selama 10 menit. Serapan larutan diukur pada panjang gelombang 532 nm menggunakan spektrofotometer UV- Vis.

7. Teknik Bioassay Antiinflamasi secara In Vitro

Sel IL-1, IL-6, dan TNF dilaporkan memproduksi pro-inflamasi sitokin dan kemokin (IL-8 dan MCP-1) sebagai respons terhadap perangsangan lipopolisakadarida (LPS). Sistem model in vitro ini menggunakan cell line THP-1 (bukan monosit manusia) guna meminimalkan variabilitas. Dengan sel-sel THP-1, ditemukan bahwa anion superoksida dan pelepasan IL-6 mengalami peningkatan di bawah kondisi hiperglikemik. Peningkatan ini terlihat pada monosit diabetik. Ditemukan bahwa cell line THP-1 paling cocok untuk sistem model in vitro untuk memahami biologi monosit/makrofag karena sel THP-1 berhubungan dengan penyakit manusia.

Prosedur kerja:1. Disiapkan microplate 96, kemudian dilakukan duplikasi pada dua pengujian

terpisah2. Dilakukan induksi dengan menggunakan agen pro-inflamasi buatan, dengan

LPS (E.coli O55:B5) selama 2 hingga 48 jam, sesuai dengan agen pro-inflamasi yang digunakan.

3. Dilakukan pemantauan terhadap kehidupan sel dengan menggunakan uji MTT4. Dilakukan pemilihan dosis tunggal atau dosis ganda (6 hingga 90 untuk

penetapan IC50)5. Untuk senyawa uji yang sukar larut dapat digunakan pelarut organik DMSO6. Persiapan senyawa uji dengan DMSO untuk membuat konsentrasi akhir di

bawah 1% dengan keberadaan sel.7. Kontrol terhadap kondisi: agen-agen anti-inflamasi seperti naproxen dan

dexamethason digunakan sebagai kontrol positif.


8. Media pembiakan dan vehicle: (pelarut yang digunakan untuk melarutkan senyawa uji) digunakan sebagai kontrol negatif.

8. Uji Aktivitas Antimalaria

Pengujian secara in vitro untuk mengetahui pengaruh bahan uji atau obat terhadap P. falciparum. Pada metoda ini, sampel darah penderita ditambahkan ke dalam microplate (mikroplat) yang mengandung bahan uji dengan beberapa dosis. Kelemahan teknik ini adalah hanya dapat mengamati parasit dalam stadium cincin yang bersirkulasi di dalam darah tepi. Kesimpulan diambil dengan mengukur hambatan maturasi pada stadium schizon dari parasit.

Metoda yang sering digunakan adalah dengan mengukur inkorporasi hipoksantin oleh parasit. Metoda ini sangat cepat, sensisitif dan objektif.

Metoda lain yang dapat digunakan untuk uji aktivitas antimalaria adalah dengan mengidentifikasi produksi laktat dehidrogenase parasit sebagai indikator pertumbuhan parasit. Metoda ini tidak memerlukan radioisotop dan dapat dipergunakan pada daerah endemik.

Strain (galur) Plasmodium yang dapat digunakan untuk pengujian secara in vitro antara lain: P. falciparum strain Dd2 asal Indocina yang resisten terhadap klorokuin, kuinin, pirimetamin dan sulfadoksin. Selain itu, dapat pula digunakan P. falciparum strain HB3 asal Honduras yang resisten terhadap pirimetamin.

Media kultur Kultur P. falciparum terdiri dari sel darah merah dan medium komplit, sehingga

hematokrit menjadi 2,5%. Kultur ini dibiakkan di dalam cawan Petri yang diletakkan dalam candle jar. Candle jar beserta isinya diinkubasi pada 370C selama 24 jam. Medium komplit diganti setiap 24 jam.

PelarutPelarut yang digunakan adalah etanol, air atau DMSO (untuk bahan uji yang

tidak larut di dalam etanol). Obat atau bahan uji dilarutkan ke dalam etanol absolut, kemudian ditambahkan air steril sampai konsentrasi 1 mg/ml. Untuk bahan uji yang larut dalam air, bahan uji tersebut dilarutkan dahulu dengan air steril baru ditambahkan etanol sampai konsentrasi 1mg/ml. Untuk obat yang larut dalam air,


obat dilarutkan dahulu dengan air steril, diikuti dengan penambahan etanol sampai konsentrasi yang sama.

Metode Pewarnaan GiemsaMetode dengan slide yang diwarnai dengan Giemsa merupakan metode yang

murah dan sebagai alternatif untuk senyawa uji yang jumlahnya sedikit.

Parasit dengan kepadatan tertentu yang telah disinkronisasi diinkubasi dengan bahan uji dengan peringkat dosis dan kontrol pelarut. Parasitemia dihitung setelah slide diwarnai dengan Giemsa; penghitungan dilakukan menggunakan mikroskop cahaya.

Prosedur kerja1. Ke dalam plat 96 sumur, 20 µl suspensi 10% eritrosit dengan parasitemia 1,0%

dan DMSO 0,1% dimasukkan ke dalam setiap sumur yang telah berisi medium RPMI dengan 10% serum dan 0,1% DMSO yang mengandung beberapa macam dosis obat yang diperiksa sehingga volume akhir 200 µl setiap sumur.

2. Ke dalam semua sumur yang telah terisi obat kemudian ditambahkan 20 µl suspensi parasit dengan 10% eritrosit dengan parasitemia 1,0%.

3. Setelah itu, plat 96 sumur dimasukkan ke dalam candle jar dan diinkubasi selama 18–24 jam, tergantung umur parasit pada awal inkubasi. Metoda ini didasarkan pada bentuk cincin (trofozoit muda) yang setelah 24 jam akan berubah menjadi preskizon dan skizon.

4. Evaluasi dilakukan setelah inkubasi selama 24 jam. Setelah inkubasi selama 24 jam atau 48 jam, plat 96 sumur dikeluarkan, suspensi bagian atas yang jernih dibuang, suspensi yang pekat dibuat sediaan apus darah, dan sediaan dikeringkan pada suhu kamar kemudian diwarnai dengan larutan Giemsa.

9. Uji Aktivitas Enzim

Beberapa mikroba endofit dapat menghasilkan enzim ekstraseluler yang tahan terhadap invasi patogen dari luar dan digunakan oleh mikroorganisme untuk mendapatkan makanan dari inangnya. Enzim yang dihasilkan antara lain amilase. pektinase, selulase, lipase, dan lakase.

Prinsip kerja:Untuk melihat apakah mikroba endofit menghasilkan enzim biasanya dilakukan


penanaman mikroba dengan media yang mengandung substratnya.

Inkubasi dilakukan selama 3–7 hari, pada suhu kamar. Terbentuknya daerah jernih di sekitar pertumbuhan koloni menandakan adanya aktivitas enzim.

Prosedur kerja:

Aktivitas enzim amilolitik:Untuk melihat aktivitas endofit penghasil enzim amilase, mikroba ditanam

pada Glukose Yeast Extract Peptone Agar (GYP). Setelah diinkubasi selama 45 hari, koloni mikroba pada cawan Petri digenangi dengan larutan iodin 1% dalam 2% kalium iodida. Aktivitas enzim dikatakan positif jika pada pengamatan terlihat daerah yang jernih di sekitar koloni.

Aktivitas enzim lipolitik:Untuk melihat aktivitas endofit penghasil enzim lipase, mikroba ditanam pada

Pepton Agar. Setelah diinkubasi, diamati adanya endapan di sekitar koloni yang menunjukkan aktivitas lipase.

Aktivitas pektinolitikUntuk melihat aktivitas endofit penghasil enzim pektinase, mikroba ditanam

pada media Pektin Agar. Setelah diinkubasi, koloni mikroba digenangi dengan larutan hexadecyl trimethyl ammonium bromide 1% dalam aquadest. Adanya daerah jernih di sekitar koloni menunjukkan aktivitas proteolitik.

Aktivitas selulaseUntuk melihat aktivitas endofit penghasil enzim selulase, mikroba ditanam pada

media Glukose Yeast Extract Peptone Agar (GYP). Inkubasi dilakukan selama 3–7 hari. Setelah inkubasi, cawan Petri berisi koloni mikroba digenangi dengan larutan congo red 2% dalam aquadest dan 1 M NaCl, selama 15 menit. Adanya daerah yang berwarna kuning di sekitar koloni menunjukkan aktivitas selulase.

Aktivitas proteolitikUntuk melihat aktivitas endofit penghasil enzim proteolitik, mikroba diinokulasi

pada media Glukose Yeast Extract Peptone Agar (GYP) Setelah diinkubasi, degradasi gelatin dapat diamati dengan adanya zona jernih yang berada di sekitar koloni. Untuk itu, cawan Petri digenangi larutan jenuh dari amonium sulfat sehingga terbentuk endapan keruh pada agar dengan zona jernih di sekitar koloni.


Aktivitas lakaseUntuk mengetahui aktivitas endofit penghasil enzim lakase, mikroba ditanam pada media Glukose Yeast Extract Peptone Agar (GYP). Setelah diinkubasi, dilihat adanya pertumbuhan koloni yang ditandai dengan perubahan warna pada medium menjadi biru.

10. Uji imunomodulator

Imunomodulator merupakan suatu senyawa yang memberikan efek terhadap sistem kekebalan. Ada dua jenis efek yang ditimbulkan, yakni imunostimulasi dan imunosupresi.• Imunostimulan terutama memiliki efek stimulan• Imunosupresan terutama memiliki efek supresan

Prinsip kerja:Metode pengujian yang dapat dilakukan, baik secara in vitro maupun in vivo,

mengukur pengaruh senyawa kimia terhadap fungsi dan kemampuan terstimulasi dari limfosit B dan T.

teknik Bioassay secara In Vitro

(1) Uji reduksi zat warna nitroblue tetrazolium (NBT). Makrofag (1x10⁵ sel/sumuran) diperlakukan dengan ekstrak selama 24 jam, pada

suhu 370C, di dalam sebuah inkubator dengan CO₂ 5%. Sel diinkubasi dengan zymosan A (5x10⁶ partikel/sumur) dan bahan pewarna NBT 3 mg/ml. Setelah inkubasi selama 60 menit, sel-sel yang melekat dicuci dengan menggunakan medium Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640, kemudian dicuci empat kali menggunakan metanol. Setelah dianginkan, ditambahkan 2 M KOH dan DMSO, kemudian absorbansi diukur pada 570nm, menggunakan sebuah microplate reader (Bio-Tek Instrument Inc., USA). Indeks fagositik (PI) diukur dengan menghitung rasio densitas optik sampel uji dengan dentitas kontrol.

(2) Uji aktivitas enzim lisosom sel Aktivitas enzim lisosom dalam sel digunakan untuk mengetahui aktivitas

fosfatase asam di dalam sel fagosit. Makrofag (1x10⁵sel/sumur) diperlakukan dengan ekstrak selama 24 jam, pada suhu 370C, dengan udara yang dilembabkan


menggunakan CO₂ 5%. Medium dilepaskan dengan aspirasi dan ditambahkan Triton X-100 0,1%, larutan p-NPP 10 mM, dan dapar sitrat 0,1 M (pH 5,0) ke dalam masing-masing sumur, kemudian dieramkan selama 30 menit, dan ditambahkan dapar borat 0,2 M (pH 9,8). Absorbansi diukur pada 450 nm, menggunakan sebuah microplate reader. Nilai PI dihitung dengan uji reduksi zat warna NBT.


Beberapa metabolit sekunder mikroba endofit bermanfaat di bidang kesehatan, khususnya farmasi. Lingkungan unik membuat kapang, khamir dan bakteri yang tumbuh di dalam tanaman inang tersebut mampu menghasilkan metabolit sekunder dengan bioaktivitas yang unik pula. Berikut beberapa contoh metabolit sekunder mikroba endofit yang memiliki bioaktivitas yang memungkinkan untuk dikembangkan menjadi obat.

taxol dan Metabolit sekunder antikanker Lain

Taxomyces andreanae, Pestalotiopsis, Altenaria sp., Monochaetia sp dan beberapa spesies kapang endofit yang tidak menghasilkan spora yang diisolasi dari pohon cemara Pasifik dan Nepal telah terbukti dapat menghasilkan taxol yang bersifat antikanker. Selain itu, telah berhasil pula dikembangkan pembuatan taxol semisintetik yang bersumber dari pohon cemara dan, dengan berkembangnya teknologi rekayasa genetik, dapat diperoleh taxol dalam jumlah yang diinginkan.

Lebih dari itu, saat ini taxol juga telah dapat diperoleh dari tanaman bukan jenis Taxus, melainkan tanaman lain yang berada dalam kondisi lingkungan yang sama dengan tanaman Taxus. Hal ini karena mikroba penghasil taxol dapat hidup di dalam tanaman selain Taxus.

Kapang endofit lain, Lasiodiplodia theobromae, yang diisolasi dari tanaman obat Morinda citrifolia, diketahui dapat menghasilkan metabolit sekunder yang memiliki aktivitas antikanker menyerupai taxol. Hasil dari penelitian lain menunjukkan, senyawa derivat canthin-6-one dan derivat bruceosin yang dihasilkan oleh kapang endofit Fusarium chlamydosporum yang diisolasi dari tanaman Brucea javanica L (Merr) memiliki aktivitas sitotoksik terhadap sel Leukemia L1210. Pada tanaman

BAB VPEManfaatan Mikroba Endofit


yang sama juga diperoleh kapang endofit Botryosphaeria parva yang menghasilkan metabolit sekunder dengan aktivitas sitotoksik terhadap sel kanker MCF 7 dan T47D.

Senyawa lain yang prospektif untuk dikembangkan menjadi obat antikanker adalah 2,14-dihydroxy-7-drimen -12,11-olide. Metabolit sekunder dari kapang Aspergilus glaucus yang diisolasi dari daun Ipomoea batatas ini memiliki aktivitas antioksidan, aktivitas antitumor sedang terhadap Hep-G2, dan aktivitas antitumor kuat terhadap cel MCF-7.

Dari kapang endofit Cephalotheca faveolata berhasil diisolasi sclerotiorin. Pigmen berwarna kuning jingga dari kelompok azaphilone yang banyak ditemukan pada kapang berfilamen ini dinamakan scelotiorin karena pada awalnya diisolasi dari kapang Penicillium sclerotiorum. Sclerotiorin memiliki aktivitas antiproliferasi terhadap sel kanker dan diketahui dapat menginduksi apoptosis pada kanker usus. Induksi apoptosis atau kematian sel terprogram oleh sclerotiorin (HCT-116) diperkirakan karena kemampuan metabolit sekunder ini mengaktivasi BAX, menekan regulasi dari BCL-2, dan mengaktivasi caspase-3.

Hasil penelitian lain menunjukkan bahwa kapang endofit (EFB01) dan (EFB02) yang diisolasi dari daun Barringtonia acutangula memiliki aktivitas terhadap sel kanker (Human Colon Cancer Cell Lines HT29.). Identifikasi dengan ITS dan BLAST menunjukkan bahwa kapang endofit (EFB01) adalah Colletotrichum gloeosporioides.

Penelitian terhadap kapang endofit dari Cephalolotaxus mannii, Cepha- lolotaxus sinensis, Cephalolotaxus hainanensis, Cephalolotaxus oliveri dan Cephalolotaxus harringtonia varietas nana menunjukkan bahwa berbagai tanaman obat yang banyak ditemukan di Cina Selatan dan Thailand utara tersebut menghasilkan harringtonine, isoharringtonine, homoharringtonine, dexoharringtonine, dan cephalezomines. Saat ini, metabolit sekunder golongan alkaloid ini telah dikembangkan menjadi obat leukemia di sejumlah rumah sakit.

Selain aktivitas antikanker, penelitian lain juga telah memperoleh aktivitas lain dari metabolit sekunder yang berasal dari kapang endofit.


Berbagai Enzim dari Mikroba Endofit

1. Enzim xylanase Mikroba endofit pada sejenis rumput-rumputan dapat menghasilkan enzim

xylanase dan pektinase, karena mikroba tersebut memerlukan xylan dan pektin sebagai sumber karbon untuk tumbuh dan berkembang di dalam jaringan tanaman inang. Xylanase yang merupakan metabolit sekunder mikroba endofit ini dapat dimanfaatkan sebagai bleaching pada industri pulp dan kertas.

Penggunaan xylanase sebagai pengganti klorin tersebut dapat mengurangi pencemaran lingkungan. Selain itu, xylanase juga dapat dimanfaatkan untuk mengubah xylan menjadi xylosa, yang dapat digunakan sebagai pemanis buatan bagi penderita diabetes.

Hasil penelitian lain menemukan bahwa kapang endofit yang diisolasi dari tanaman obat di Laboratorium MARDI di Sessang, Sarawak, menghasilkan senyawa yang dapat menghidrolisis selulase, xylan, dan mannan.

2. Enzim Ekstraselular Tyrosinase Kapang endofit yang diisolasi dari Azadirachta indica dan Ocimum tenuiflorum

diketahui dapat menghasilkan enzim tyrosinase. Metabolit sekunder yang dihasilkan kapang endofit dari kedua tanaman tersebut lebih banyak dibandingkan hasil produksi kapang endofit dari Ocinum tenuiflorum dan Lantana camara.

Enzim tyrosinase juga dapat dihasilkan oleh kapang endofit dari Ocimum sp. Selain itu, kapang endofit ini juga menghasilkan enzim amilase dan protease lain.

Kapang endofit penghasil enzim tyrosinase umumnya dari filum basidiomycetes. Dengan demikian, dapat dikatakan bahwa kapang endofit mempunyai prospek yang baik sebagai sumber enzim tyrosinase.

3. Enzim ekstraselular pemecah polisakarida Kapang endofit yang diisolasi dari tanaman obat Alpinia calcarata Roscoe, Bixa

orellana L, Calophyllum inophyllum L dan Catharanthus roseus L diketahui menghasilkan berbagai enzim ekstraseluler, termasuk lipase, amilase, pektinase, selulase, dan lakase. Enzim-enzim ini banyak digunakan dalam industri makanan dan minuman, tekstil, dan penyamakan kulit. Enzim yang dihasilkan dari kapang endofit lebih stabil dibandingkan dengan enzim yang dihasilkan sumber lain.


4. Enzim Penghambat alfa glukosidase TSC13 yang diperoleh dari ekstrak metanol metabolit sekunder kapang endofit

Colletotrichum sp yang diisolasi dari Taxus sumatrana menghasilkan senyawa penghambat enzim a glukosidase. Dari kapang endofit yang diisolasi dari tanaman obat Indonesia itu diperoleh tujuh isolat yang potensial menghasilkan metabolit sekunder untuk dikembangkan menjadi agen antidiabetes. Ketujuh kapang endofit yang memiliki aktivitas menghambat enzim a glukosidase tersebut adalah:• Kapang endofit A.Ap.3E , A.Ap.4F dan B.Ap.1F dari kapang endofit yang

diisolasi dari sambiloto (Andrograhia paniculata Ness).• Kapang endofit B.Os.1F dari tanaman Orthosiphon spicatus BBS• Kapang endofit A.Pc.1F, B.Pc.1F dan B.Pc.2F dari tanaman sirih merah

(Piper crocatum L)

Senyawa Antidiabetes dari Mikroba Endofit

Suatu senyawa non-peptida (L-783,281) yang merupakan metabolit sekunder dari kapang endofit Pseudomassaria sp telah berhasil diisolasi dari tanaman hutan di Kongo, sebuah negara di Afrika. Mekanisme kerja senyawa ini menyerupai insulin, tetapi tidak terurai oleh asam lambung sehingga berpotensi dikembangkan menjadi obat antidiabetes oral.

Senyawa Antimikroba dari Mikroba Endofit

Munumbicins A, B, C, dan D merupakan antibiotik spektrum luas yang diperoleh dari kapang Streptomyces NRRL 30562 yang diisolasi dari Kennedia nigriscans. Kandungan senyawa peptida yang mempunyai aktivitas antimikroba adalah asam amino (asam amino treonin, asparagine, glutamin, valin, dan prolin). Kapang endofit yang diisolasi dari tanaman Garcinia mangostana dan mikroba endofit dari tumbuhan Quisqualis indica L juga dapat menghasilkan metabolit sekunder yang memiliki aktivitas antimikroba.

Kapang endofit genus Colletotrichum dari tanaman Myciaria floribunda yang berada di Brasilia dapat menghasilkan senyawa antimikroba. Kapang endofit lain Cladosporium sp, Aspergillus flavus, Aspergillus sp dan Curvularia lunata yang diisolasi dari tanaman obat Kigelia africana (Lam) Benth diketahui memiliki aktivitas antibakteri terhadap Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, dan Escherichia coli. Sementara itu, kapang Colletotrichum sp. yang diisolasi dari daun Pandanus


amaryllifolius Roxb. diketahui menghasilkan colletotride, senyawa macrolide yang aktif terhadap bakteri Mycobacterium tuberculosis, Gordinia terrae, Staphylococcus aureus, dan Escherichia coli.

Pandanus amaryllifolius, tanaman yang hidup di daerah tropis itu, mengandung alkaloid. Elusidasi struktur senyawa yang diperoleh dari mikroba endofit tanaman ini memberikan empat senyawa makrolida baru, yaitu senyawa colletotriolide dari kapang Colletotrichum sp., tyrosol dari kapang Colletotrichum gloeosporioides, serta dothiorelone C dan cytosporone dari kapang Chaetomium globosum.

Sementara itu, ekstrak etil asetat dari kapang Cordyceps memorabilis yang diisolasi dari tanaman obat Trichilia elegans A Juss memiliki aktivitas antimikroba terhadap Enterococcus hirae, Micrococcus luteus, dan E. Coli. Senyawa bioaktif dari kapang endofit Phomopsis sp dapat menghambat pertumbuhan M. luteus, Enterococcus hirae, dan S. typhi. Senyawa bioaktif lain yang diekstraksi dari Dothideomycetes sp dan G8-25 dapat menghambat M. luteus, E. hirae.

Sejumlah kapang yang diisolasi dari beberapa tanaman yang berasal dari daerah Himalaya bagian barat diketahui menghasilkan metabolit sekunder dengan aktivitas antimikroba. Sebagai contoh, metabolit sekunder kapang K4 (Trichophaea abundans yang diisolasi dari Pinus sp), PR4 (Diaporthe phaseolorum yang diisolasi dari Picorhisa sp), dan art4 (Fusarium redolens yang diisolasi dari Artemisia sp) dapat menghambat pertumbuhan S. aureus. Kapang yang diisolasi dari Sesbania grandiflora (L) Pers. dapat menghambat pertumbuhan bakteri uji Staphylococcus aureus ATCC 25923, Bacillus subtilis ATCC 6633, Escherichia coli ATCC 25922 dan Pseudomonas aeriuginosa ATCC 278530. Kapang endofit lain, yaitu yang diisolasi dari Ocimum species (Tulsi), memiliki aktivitas antimikroba terhadap P. aeruginosa, Mycobacterium smegmatis, Salmonella typhimurium, dan Candida albicans, serta dapat menghambat pertumbuhan Penicillum chrysogenum.

Kapang yang diisolasi dari Taxus baccata (kulit batang dari cemara Himalaya) menghasilkan metabolit sekunder yang aktif terhadap bakteri patogen, yaitu Klebsiella pneumoniae, Shigella flexneri, E. coli, serta fungi C. albicans dan C. tropicalis. Identifikasi menggunakan teknik analisis molekuler BLAST menunjukkan bahwa kapang endofit tersebut adalah kapang Fusarium solani (Mart) dan penetapan struktur dengan GC-MS menunjukkan bahwa senyawa bioaktif yang paling dominan adalah 1-tetradecende, 8-octadecanone, 8-pentadecanone, octylcyclohexane dan 10-nonadecanone.


Metabolit sekunder lain, yaitu metabolit dari kapang endofit yang diisolasi dari tanaman obat Orthosiphon stamineus Benth, juga diketahui memiliki aktivitas sebagai antimikroba terhadap bakteri patogen. Sementara itu, ekstrak kasar metabolit sekunder Papulaspora immersa dan Apiospora montagnei Sacc dalam bentuk Arthrinium dan kapang endofit yang diisolasi dari akar tanaman Smallanthus sonchifolius (Yacon) mempunyai aktivitas antibakteri terhadap S. aureus, Kocuria rhizophila, P. aeruginosa, dan E. coli.

Dari kapang Fusarium sp yang tumbuh di dalam tanaman Mirabilis jalapa L dapat diisolasi metabolit sekunder yang memiliki aktivitas terhadap bakteri Gram positif dan Gram negatif. Kapang Aspergillus sp dari tanaman yang sama menghasilkan metabolit sekunder yang lebih memiliki aktivitas terhadap bakteri Gram positif, seperti terhadap bakteri S. aureus, S. epidermidis, dan B. subtilis.

Kapang endofit lain, yang diisolasi dari tanaman Tabebuia argentea, menunjukkan aktivitas antimikroba yang lebih luas. Dari 13 isolat Aspergillus niger dan Alternaria alternata, misalnya, diperoleh naphthoquinone (lapachol alami), metabolit sekunder dengan aktivitas terhadap bakteri dan kapang. Tabebuia argentea, tanaman inang berupa pohon besar dengan bunga berwarna kuning dari familia Bignoniaceae, diketahui mengandung banyak senyawa yang memiliki bioaktivitas unik, termasuk senyawa-senyawa golongan fenolik yang memiliki aktivitas sitotoksik terhadap sel kanker melalui penghambatan topoisomerase yang bekerja pada replikasi DNA.

Kapang endofit AFR1, AFR4, AFR7 yang diisolasi dari akar tanaman obat Aloe vera L di bagian utara Maharashtra, India, terbukti memiliki efek penghambatan yang kuat terhadap bakteri uji S. typhi. Kapang endofit yang diisolasi dari tanaman obat yang banyak tumbuh di Indonesia, yaitu daun dan rimpang Zingiber offensii Val (Ghost Bangle), mempunyai aktivitas terhadap bakteri Staphylococcus aureus dan E. coli. Senyawa bioaktif lain, yaitu yang terkandung dalam ekstrak etil asetat dari metabolit sekunder kapang endofit Kabatiella caulivora var B yang diisolasi dari Alyxia reinwardtii BL (pulasari) dari daerah Purwodadi Botanical Garden, Pasuruan, Jawa Timur, mempunyai aktivitas antibakteri terhadap Bacilus subtilis, Staphylococcus aureus, Salmonella thypi, E. coli dan Pseudomonas aeruginosa, serta aktif terhadap Candida albicans.

Selain dari kapang, metabolit sekunder dengan aktivitas antimikroba dapat pula diperoleh dari bakteri endofit. Salah satunya adalah bakteri yang diisolasi dari Brugulera gymnorrhiza, sejenis tanaman bakau (mangrove) yang diambil dari


beberapa lokasi di Jawa Barat. Selain itu, bakteri endofit yang diisolasi dari tanaman Paederia foetida L dari familia Rubiaceae, menghasilkan metabolit sekunder sebagai antimikroba terhadap bakteri Staphylococcus aureus, Escherichia coli, dan Klebsiella pneumonia. Bakteri endofit dari tanaman obat tradisional ini mempunyai prospek untuk dikembangkan menjadi senyawa bioaktif antimikroba.

Bakteri ME-2 yang diisolasi dari cabang mulberry menghasilkan metabolit sekunder dengan aktivitas antimikroba. Hasil identifikasi dengan analisis 16s rRNA menunjukkan bahwa bakteri endofit ini adalah Bacillus subtilis, dengan metabolit sekunder yang dapat menghambat pertumbuhan B. thuringiensis, E. coli, S. aureus, B. Bassiana, dan Mycoid bacillus. Bakteri endofit ini juga berpotensi menghasilkan enzim, antara lain enzim fibrinolitik, pectate lyase, dan serine protease yang dapat digunakan dalam makanan. Bakteri endofit yang diisolasi dari cabang tanaman Mulberry ini dapat dikembangkan sebagai zat pengawet untuk makanan dan produk farmasi.

Senyawa Antifungi dari Mikroba Endofit

Nigrospora oryzae, Colletrotrichum truncatum, Fusarium proliferatum, Chaetomium sp, Guignardia comellia, dan Alternaria destruens adalah kapang endofit yang hidup dalam tanaman Jatropha curcas yang diketahui dapat menghambat pertumbuhan kapang. Selain itu, ditemukan pula senyawa antikapang yang poten, Oocydin A, dari galur Serratia marcescens yang diisolasi dari tanaman Rhyncholacis pedicillata.

Kapang endofit yang diisolasi dari beberapa tanaman yang berasal dari daerah Himalaya bagian barat menghasilkan metabolit sekunder dengan aktivitas antikapang, terutama terhadap C. albicans. Kapang endofit tersebut termasuk dalam genus Talaromyces sp, Giberella sp, Cochliobolus sp, Fusarium sp, dan Alternaria sp.

Metabolit sekunder lainnya, 3-methylcarbazoles, diketahui memiliki aktivitas antifungi. Metabolit sekunder yang dihasilkan kapang Streptomyces sp galur LJK109 yang diisolasi dari Alpinia galanga (L) Wild. ini dapat menghambat pertumbuhan kapang Phytopatogenik, termasuk Alternaria porri, Colletotrichum gloeosporioides, Colletotrichum musase, Fusarium oxysporum, dan Curvularia sp.

Sementara itu, metabolit sekunder beberapa bakteri endofit KB4 yang diisolasi dari akar tanaman obat Pongamia glabra vent (familia Leguminoseae), NB6 dari ranting tanaman obat Eucalyptus globulus Dehnh (Myrtaceae), dan HB3 dari


rimpang Curcuma longa L (Zingiberaceae) memiliki aktivitas sebagai antifungi. Fungi yang dihambat pertumbuhannya oleh metabolit sekunder tersebut antara lain Aspergillus niger, Aspergillus avamori, Trichoderma koningii, Fusarium oxysporium, dan Penicillium fumicalsuri.

Penghambat Proliferasi Lymphocytes dari Mikroba Endofit

Senyawa K1 dan K7 (metabolit sekunder Petriella sp dan Ulocladium sp yang diisolasi dari Pinus roxbergii), senyawa DEF4 (metabolit sekunder Cochliobolus spicifer yang diisolasi dari Cedrus deodara), serta senyawa Art3 dan Art4 (metabolit sekunder Sordaria superba dan Fusarium redolens yang berasal dari tanaman Artemisia sp) diketahui memiliki aktivitas imunosupresif dan dapat menghambat proliferasi sel limfosit. Berbagai kapang endosit ini berasal dari daerah Himalaya bagian barat.

Kapang endofit lain yang menghasilkan metabolit sekunder dengan aktivitas imunosupresif adalah Fusarium subglutinans yang diisolasi dari tanaman T. wilfordii. Senyawa bioaktif tersebut diketahui sebagai diterpene- pyrone subglutinol A dan B

Antivirus dari Mikroba Endofit

Metabolit sekunder Kapang Emericella sp yang diisolasi dari Aegiceras corniculatum, sejenis pohon bakau, terbukti memiliki aktivitas antivirus. Metabolit sekunder tersebut, derivat isoindolone, dapat menghambat pertumbuhan virus influenza A .

Antioksidan dari Mikroba Endofit

Metabolit sekunder kapang endofit Chaetomium sp yang diisolasi dari Nerium oleander (Apocynaceae) ditemukan memiliki aktivitas sebagai antioksidan. Analisis kualitatif menunjukkan bahwa senyawa bioaktif tersebut adalah phenolic (asam fenolat dan derivat fenol).

Senyawa lain yang terbukti memiliki aktivitas antioksidan adalah naphthoquinone. Senyawa lapachol alami ini merupakan metabolit sekunder yang dihasilkan Aspergillus niger dan Alternaria alternata, kapang endofit yang diisolasi dari Tabebuia argentea.


Anti-inflamasi dari Mikroba Endofit

Salah satu metabolit sekunder yang terbukti memiliki aktivitas anti-inflamasi adalah ergoflavin. Senyawa pigmen ini dihasilkan oleh kapang endofit yang diisolasi dari Mimosops elengi (Bakul). Senyawa bioaktif lain yang juga berkhasiat anti-inflamasi adalah phomol, poliketide laktone, metabolit sekunder kapang endofit yang diisolasi dari tanaman Erythrina crista-galli.

Sementara itu, Actinomycetes endofit Streptomyces sp LJK 109 yang diisolasi dari Alpinia galanga Swartz, familia Zingeberacease, dapat menghasilkan senyawa 3-methylcarbazoles, senyawa bioaktif lain yang memiliki aktivitas antiinflamasi, selain antifungi.

Antimalaria dari Mikroba Endofit

Metabolit sekunder yang telah terbukti berkhasiat antimalaria adalah artemisinin, senyawa yang diperoleh dari hasil biotransformasi galur bakteri endofit AT12 yang diisolasi dari tanaman Artemisia annua.

Pemanfaatan bakteri Endofit dibidang pertanian

Bakteri endofit dapat bertindak sebagai agen hayati terhadap nematoda parasit Pratylenchus brachyurus pada tanaman Nilam. Mekanisme pengendalian dilakukan oleh beberapa bakteri endofit (Achromobacter xylosoxidans TT2, Bacillus subtilis NJ57, Alcaligenes faecalis NJ16, Bacillus cereus MSK, dan Pseudomonas putida EH11 dengan menggunakan metode split root system, yaitu sebagian akar diinokulasi dengan Pratylenchus brachyurus (109/pot tanaman) dan sebagian lagi diinokulsi dengan Pratylenchus brachyurus (100 ekor /pot tanaman).

Pada penelitian untuk membuktikan aktivitas bakteri endofit tersebut digunakan metode dengan rancangan acak lengkap (RAL) enam perlakuan dan tujuh ulangan. Pengamatan dilakukan terhadap populasi nematoda yang mempenetrasi akar, kadar asam salisilat, fenol, indol acetic acid, dan peroksidase pada tanaman yang dianalisis dengan menggunakan metode HPLC dan spektrofotometer.

Hasil penelitian menyatakan mekanisme kerja bakteri endofit dalam mengendalikan Pratylenchus brachyurus adalah menginduksi ketahanan tanaman dengan peningkatan produksi senyawa kimia penginduksi ketahanan, seperti asam


salisilat, peroksidase, dan fenol oleh bakteri endofit A xylosoxidans TT2, A faecalis NJ16 dan Putida EH11. Selain itu, bakteri endofit juga mempunyai kemampuan untuk memicu tanaman melalui peningkatan indol acetic acid, terutama pada perlakuan dengan Bacillus cereus MSK.

Bakteri endofit dapat digunakan sebagai agensia untuk pengendalian penyakit pada tanaman, termasuk untuk mengendalikan nematoda parasit Meloidogyne incognita penyebab penyakit kuning pada tanaman lada. Bakteri yang berperan diperoleh dari akar tanaman lada , yaitu bakteri endofit EH11, TT2, Trichoderma, HEN yang dapat menurunkan puru pada akar dan populasi larva nematoda Meloidogyne incognita di dalam tanah sampai 90%.

Bakteri endofit dari tanaman kopi Bacillus sp PG76 dalam bentuk formula Bionematisida (molase, kompos dan talc) diketahui dapat memberikan perlindungan terhadap infeksi nematoda puru akar (Meloidogyne sp.). Selain itu, bionematisida Bacillus sp PG76 dapat pula meningkatkan pertumbuhan tanaman kopi. Bakteri endofit lainnya—PG 132, PG76, dan LW 15 yang diisolasi dari akar tanaman kopi—dapat menekan nematoda Pratylenchus coffeae sehingga dapat meningkatkan pertumbuhan tanaman kopi.

Metabolit sekunder yang dihasilkan oleh mikroba endofit serta tanaman inangnya dapat dilihat pada Lampiran 1.


BAB VIProsPEk Mikroba Endofit

Mikroba endofit merupakan salah satu tantangan di masa kini untuk sumber bahan baku obat

Eksplorasi endofit untuk memperoleh bioaktif metabolit sekunder yang diinginkan dapat dimulai dengan melakukan isolasi dan identifikasi mikroba endofit dari tanaman inangnya. Pada metode konvensional seringkali hanya ditemukan sedikit atau bahkan tidak ada endofit yang memiliki potensi yang diinginkan. Biasanya, endofit yang “tidak kompeten” itu langsung disingkirkan, tidak diselidiki lebih lanjut. Dengan demikian, sejumlah produk yang mungkin dapat dihasilkan dalam suatu lingkungan yang lebih sesuai dengan habitat alami mikroba endofit tersebut menjadi kehilangan peluang untuk ditemukan.

Namun, dengan teknologi yang lebih baru, potensi kehilangan dari metode konvesional tersebut dapat ditekan. Penggunaan metode sekuensing genome-utuh, misalnya, memungkinkan jumlah gen yang ditemukan pada biosintesis enzim berbagai kapang dan bakteri lebih besar dari metabolit sekunder yang diketahui dari mikroorganisme tersebut. Hal ini menunjukkan bahwa mikroba endofit yang secara konvensional disingkirkan karena tidak ditemukan berpotensi hanya menggambarkan sebagian kecil dari biosintesis gen berdasarkan kondisi standar in vitro laboratorium, sehingga hanya sejumlah kecil dari potensi biosintesis sesungguhnya yang telah dimanfaatkan. Ada kemungkinan kuantitas metabolit alami yang dihasilkan suatu mikroba endofit terlalu kecil untuk dideteksi, apalagi di tengah matriks pembiakan yang kompleks.

Pemahaman yang lebih utuh sangat diperlukan untuk dapat memahami dan mengungkap interaksi kimiawi ekologi dari endofit agar potensi yang nyaris tanpa


batas dari produk biosintesis alaminya dapat dimanfaatkan sepenuhnya.

optimasi Proses fermentasi

Salah satu cara untuk meningkatkan hasil metabolit sekunder mikroba endofit adalah dengan mengoptimalkan proses fermentasi. Siklus hidup mikroba endofit yang singkat merupakan suatu keunggulan dalam mencari senyawa baru, karena senyawa yang dihasilkan dapat diproduksi dalam skala besar melalui proses fermentasi. Media fermentasi menjadi salah satu kunci keberhasilan untuk mendapatkan senyawa bioaktif dari metabolit sekunder mikroba endofit. Selain itu, metabolit sekunder yang lebih aktif dan spesifik dapat diperoleh dengan menumbuhkan mikroba endofit di dalam biotop yang spesifik sehingga, ketika melakukan fermentasi, bagian dari tanaman (daun, cabang, atau ranting) dapat ditambahkan ke dalam medium agar kondisi sistem fermentasi menyerupai kondisi di dalam tanaman inangnya.

Pertimbangan Masa Depan: Menjawab Tantangan Masa Kini

Interaksi antara mikroba endofit dengan tanaman inangnya serta mikroba endofit lainnya merupakan sesuatu yang adaptif, sehingga perbedaan yang kecil dalam kondisi budidaya in vitro dapat berpengaruh terhadap jenis dan cakupan metabolit sekunder yang dihasilkan. Hal yang juga telah diketahui adalah proses metabolisme mikroorganisme sangat bergantung pada parameter pembiakannya.

Sebagai contoh, tanaman dari jenis Paraphaeosphaeria quadriseptata akan menghasilkan enam metabolit sekunder baru ketika air yang digunakan sebagai media diganti, yang semula menggunakan air keran diganti dengan air suling. Selain itu, penggantian media dari padat menjadi cair pada Chaetomium chiversii akan menyebabkan kapang endofit ini menghasilkan radicicol, bukan lagi chaetochromin A seperti yang dihasilkan sebelumnya.

Perbedaan pada kondisi pembiakan itu komposisi media, aerasi, suhu, bahkan bentuk dari bejana kultur dapat berpengaruh pada metabolit sekunder berbagai jamur dan actinomycetes. Karena itu, dalam merancang suatu sistem pembiakan sebaiknya dipilih kondisi yang sesuai, yang dapat memicu atau merangsang terjadinya interaksi endofit yang kompleks sehingga dapat menghasilkan produk yang optimal, sesuai harapan.


Manipulasi Genetik

Manipulasi genetik juga merupakan salah satu cara untuk mendapatkan metabolit sekunder yang diinginkan dari mikroba endofit. Dengan menggunakan metode molekuler seperti PFGE (Pulsed Field Gel Electrophoresis), amplifikasi PCR (Polymerase Chain Reaction), dan pengurutan gen rRNA, akan diperoleh isolat yang murni. Isolat murni ini dapat disimpan untuk dikembangkan lebih lanjut. Mikroba dapat pula disimpan dalam jangka waktu lama, sehingga tidak perlu lagi mengisolasi dari tanaman inangnya bila akan digunakan untuk memperoleh senyawa aktif dengan skala produksi.

Ada kemungkinan mikroba yang diperoleh dari tanaman yang sama ditemukan kembali pada waktu yang berbeda, karena belum diketahuinya secara pasti keberadaan mikroba di dalam tanaman inangnya. Selain itu, untuk mendapatkan hasil metabolit sekunder dalam jumlah besar dan dengan aktivitas yang lebih poten daripada senyawa yang dihasilkan oleh tanaman inangnya dapat dilakukan dengan manipulasi genetik.

Pada manipulasi genetik dilakukan penyisipan gen yang potensial untuk mendapatkan hasil yang lebih baik dari tanaman inangnya, sehingga dimungkinkan untuk mendapatkan hasil yang sesuai dengan tujuan penelitian. Namun, di samping manfaat tersebut, perlu dipertimbangkan kemungkinan terjadinya hal yang merugikan. Pada manipulasi genetik kemungkinan terbentuk mikroba yang resisten terhadap lingkungan, sehingga dapat mengganggu ekosistem dan menimbulkan masalah baru.

Dengan kemajuan inovatif di bidang bioteknologi dan bioinformatika, di masa mendatang dapat dilakukan pengaturan biakan mikroba dengan suatu sistem biakan bersama. Dengan menggunakan evolutionary, comparative, dan community genomics, proteomics NGS technologies, metabolomics, secretomics, transcriptomics, high-throughput serta next-generation sequencing akan diperoleh pemahaman komprehensif mengenai interaksi molekuler endofit serta transduksi sinyal, ekspresi gen antarspesies, dan switch-on/off dari aliran gen yang diperlukan (cascade). Semua ini akan memperjelas rangkaian parameter yang optimal, memungkinkan pemanfaatan jalur biosintesis antarspesies (atau multispesies) dari endofit dalam suatu biakan bersama untuk memperoleh produk metabolit sekunder yang diinginkan secara optimal.


Harapan ke depan

Indonesia merupakan negara yang kaya akan berbagai jenis tumbuhan tropis dan keragaman mikroba. Namun, sampai saat ini belum seluruh kekayaan hayati tersebut diteliti, terutama terkait mikroba endofit yang dapat menghasilkan metabolit bioaktif yang bermanfaat di bidang farmasi.

Mempertimbangkan potensi mikroba endofit, harapan dan langkah yang dapat dilakukan antara lain perlunya dikembangkan pangkalan data (database) sebagai wadah hasil penelitian mikroba endofit yang telah dilakukan oleh para peneliti dari berbagai institusi. Hal ini penting agar para peneliti tidak melakukan penelitian yang sama (duplikasi), tetapi mengerjakan penelitian lanjutan guna mendapatkan senyawa yang berkhasiat sebagai obat.

Pemanfaatan mikroba endofit dapat membuka peluang bagi industri farmasi untuk pengembangan bahan baku obat yang memanfaatkan kekayaan alam dari bumi Indonesia. Selain itu, di bidang pertanian, mikroba endofit juga berpotensi untuk digunakan menjaga tanaman dari serangan nematoda yang dapat merusak.

Di antara mikroba endofit, kapang endofit belum dimanfaatkan secara optimal. Namun ditinjau dari segi klinis, kapang endofit telah diaplikasi dengan pendekatan molekuler. Studi molekuler kapang endofit dapat membantu meningkatkan aktivitas di bidang penelitian obat. Saat ini, metabolit sekunder dari kapang endofit telah digunakan untuk pengobatan kanker, TBC, malaria, diabetes mellitus, dan banyak penyakit lain.

Kapang endofit dapat meniru fungsi dan perilaku tanaman inangnya serta mampu menghasilkan metabolit sekunder sebagai senyawa baru. Prosedur fermentasi yang berbeda dapat membuat kapang endofit menghasilkan senyawa metabolit sekunder dengan bioaktivitas berbeda.

Di bidang pertanian, formulasi pupuk hayati berbasis kapang endofit dapat digunakan untuk meningkatkan kesuburan tanah dan hasil panen. Pemanfaatan bakteri endofit dapat pula meningkatkan prospek dalam mengembangkan senyawa lain yang bermanfaat bagi pertanian, terutama senyawa untuk pengendalian optimal nematoda perusak tanaman pertanian, termasuk tanaman rempah. Nanopartikel kapang endofit dapat digunakan untuk meningkatkan pertumbuhan tanaman dan kesehatan tanaman dengan teknik canggih.


Di bidang lingkungan, kapang endofit dapat digunakan dalam degradasi plastik, sumber terbesar polusi lingkungan, dengan menggunakan teknologi rDNA. Dengan demikian, penelitian kapang endofit diyakini merupakan penelitian masa depan di bidang mikrobiologi. Kapang endofit memiliki sistem adaptasi yang unik di alam. Sumber kapang endofit seperti rumput, tanaman obat, bakau, dan biota laut yang menjadi topik terkini yang paling banyak diteliti.

Mikroba Endofit, Pemanfaatan Mikroba Endofit dalam Bidang Farmasi 93100 Mikroba endofit

LAMPIRAN

Lampiran 1 : Prosedur sterilisasi permukaan dalam bentuk gambar

gambar : Prosedur sterilisasi permukaan

LaMPiranLampiran 1 : Prosedur sterilisasi permukaan dalam bentuk gambar

gambar : Prosedur sterilisasi permukaan


Lampiran 2 : Struktur molekul senyawa yang dihasilkan oleh metabolit sekunder kapang endofit

Ergoflavin

Taxol

Derivat isoindolon


Artemisin

Oocydin

Harringtonine, 4-methyl-2-

hydroxy-2-(3-hydroxy-3-

methylbutyl)butanedioate

102 Mikroba endofit

Artemisin

Oocydin

O OH

O OH OH O

Harringtonine, 4-methyl-2-hydroxy-

2-(3-hydroxy-3-methylbutyl)butaned

ioate

HO O

O

HO O

O O O

O

N

Homoharringtonine

, 1-((1S,3aR,14bS)-2-Methoxy-1,5,6,8,9,14b-

hexahydro-4H- cyclopenta(a)(1,3)dioxolo(4,5-h)pyrrolo(2,1-b)(3)benzazepin-1-yl) 4-methyl (2R)-2- hydroxy-

2-(4-hydroxy-4-methylpentyl)butanedioate

102 Mikroba endofit

Artemisin

Oocydin

O OH

O OH OH O

Harringtonine, 4-methyl-2-hydroxy-

2-(3-hydroxy-3-methylbutyl)butaned

ioate

HO O

O

HO O

O O O

O

N

Homoharringtonine

, 1-((1S,3aR,14bS)-2-Methoxy-1,5,6,8,9,14b-

hexahydro-4H- cyclopenta(a)(1,3)dioxolo(4,5-h)pyrrolo(2,1-b)(3)benzazepin-1-yl) 4-methyl (2R)-2- hydroxy-

2-(4-hydroxy-4-methylpentyl)butanedioate

Homoharringtonine, 1-((1S,3aR,14bS)-2-Methoxy-1,5,6,8,9,

14b-hexahydro-4H- cyclopenta(a)(1,3)dioxolo(4,5-h)pyrrolo(2,1-b)(3)

benzazepin-1-yl) 4-methyl (2R)-2- hydroxy-2-(4-

hydroxy-4-methylpentyl)butanedioate


Pestacin

Isopestacin

Cajaninstilbene acid

Glutinol-A


Cyclosporine-A

Mycophenolic acid

Naphthalene

Nodulisporic acid


Alantryleunone

Phomoxanthones A

Phomoxanthones B

A polyketide citrinin


5-hydroxyramulosin

7-amino-4-methylcoumarin

Ergosta-5,7,22-trienol

Cytonic acid A


Cytonic acid B

Hinnuliquinone

Tenuazonic acid

Epiepoxydon


Alternariol

Sclerotiorin


Fusarium chlamydosporum. Kapang endofit yang diisolasi dari buah tanaman Buah Makassar (Brucea javanica (L) Merr.

Khasiat: antikanker.

Reverse side

Reverse side

Botryosphaeria parva.Kapang endofit yang diisolasi dari buah tanaman Buah Makassar (Brucea javanica (L) Merr.

Khasiat: antimikroba

Lampiran 3 : Beberapa kapang endofit yang telah berhasil diisolasi dari tanaman, dan menghasilkan metabolit sekunder yang bermanfaat dalam bidang kesehatan dan khususnya farmasi.


Aspergillus flavusKapang endofit yang diisolasi dari tanaman obat Kigelia africana, Memiliki aktivitas sebagai antibakteri dan aktif terhadap bakteri uji Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Escherichia coli

Kapang endofit yang diisolasi dari Zingiber spp, memiliki aktivitas antimikroba

Kapang endofit (EFB01) yang diisolasi dari daun tanaman Barringtonia acutangula, memiliki aktivitas sitotoksik.

Kapang endofit (EFB02) yang diisolasi dari daun tanaman Barringtonia acutangula, memiliki aktivitas sitotoksika


Isolat kapang endofit dari tanaman Cepalotaxus mannii, berkhasiat sebagai antileukemia Galur kapang belum dapat terindetifikasi

Isolat kapang endofit dari tanaman Cepalotaxus mannii yang berkhasiat sebagai antileukemia: Botrytis sp

Isolat kapang endofit dari tanaman Cepalotaxus mannii yang berkhasiat sebagai antileukemia: Geotrichun sp

Isolat kapang endofit dari tanaman Cepalotaxus mannii yang berkhasiat sebagai antileukemia: Botrytis sp.


Isolat kapang endofit dari tanaman Cepalotaxus mannii yang berkhasiat sebagai antileukemia: Acremonium sp.

Isolat kapang endofit dari tanaman Cepalotaxus mannii yang berkhasiat sebagai antileukemia. Galur belum dapat diidentifikasi.

Isolat kapang endofit dari tanaman Cepalotaxus mannii yang berkhasiat sebagai antileukemia: Geotrichun sp

Isolat kapang endofit dari tanaman Cepalotaxus mannii yang berkhasiat sebagai anti leukemia: Fusarium sp.


Isolat kapang endofit dari tanaman Cepalotaxus mannii yang berkhasiat sebagai antileukemia: Botrytis sp.

Aspergillus sp.Kapang endofit yang diisolasi dari tanaman obat Kigelia africana, memiliki aktivitas antibakteri, aktif terhadap bakteri uji Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Escherichia coli.

Cuvularia lunata:Kapang endofit yang diisolasi dari tanaman obat Kigelia africana, memiliki aktivitas seabgai antibakteri dan aktif terhadap bakteri uji Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Escherichia coli

Cladosprium sp.Kapang endofit yang diisolasi dari tanaman obat Kigelia africana, mempunyai aktivitas sebagai antibakteri dan aktif terhadap bakteri uji Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Escherichia coli


Lampiran 4 : Komposisi dan cara pembuatan media :

na (nutrient agar) oXoid

Komposisi : Lab – lemco 1,0 g Yeast extract 2,0 g Pepton 5,0 g NaCl 5,0 g Agar 15,0 g

pH 7,4 ± 0,2

Pembuatan:Ditimbang 28 gram bahan, lalu dilarutkan dalam air suling, dan dipanaskan sampai larut. Setelah itu, medium disterilkan dengan autoklaf pada suhu 1210 C selama 15 menit

Penggunaan:Sebagai medium pertumbuhan bakteri.

Pda (Potato dextrose agar) oXoid

Komposisi : Potato extract 4,0 g Dextrose 20,0 g Bacto Agar 15,0 g pH 5,6 ± 0,2

Pembuatan:Ditimbang 39g bahan, lalu dilarutkan dalam air suling, dan dipanaskan sampai larut. Setelah itu medium disterilkan dengan autoklaf dan dipanaskan pada suhu 1210C selama 15 menit

Penggunaan:Sebagai medium pertumbuhan kapang.


Pdb (Potato dextrose broth) difCo

Komposisi : Potato Starch 4,0 gram Dextrose 20,0 gram pH 5,1 ± 0,2

Pembuatan:Ditimbang 39g bahan, lalu dilarutkan dalam air suling, dan dipanaskan sampai larut. Setelah itu medium disterilkan dengan autoklaf pada suhu 1210C selama 15 menit


RPMI 1640 (GIBCO)

Komposisi : RPMI 1640 0,82 gram NaHCO3 0,2%

Pembuatan:Serbuk RPMI 1640 sebanyak 0,82 gram dilarutkan dalam 50 ml air suling, ditambahkan NaHCO3 0,2 % lalu pH diukur dan disesuaikan sampai diperoleh pH 7,2–7,4. Setelah itu, medium disterilkan dengan cara filtrasi.

M199

Komposisi : RPMI 1640 0,82 gram NaHCO3 0,2 % Tripsin 0,5 %

Pembuatan:Serbuk RPMI 1640 sebanyak 0,82 gram dilarutkan dalam 50 ml air suling, ditambahkan NaHCO3 0,2 % dan tripsin 0,5%, lalu pH diukur dan disesuaikan sampai diperoleh pH 7,2–7,4. Setelah itu, medium disterilkan dengan filtrasi.


(CMM) Corn Meal Malt (difCo)

Komposisi : Com meal malt 3,4 gram Malt Extract 4,0 gram Yeast Extract 0,4 gram Air Suling 2000 ml

Pembuatan:Serbuk corn meal malt, malt extract dan yeast extract dilarutkan dalam 2000 ml air suling, keasaman (pH) diatur 6-7,0. Setelah itu, medium disterilkan dengan autoklaf pada suhu 1210C selama 15 menit.


PdY (Potato dextrose Yeast extract)

Komposisi : Potato Dextrose Broth 24,0 gram Yeast Extract 4,0 gram CaCO3 5,0 gram

Pembuatan:Serbuk potato dextrose broth dan yeast extract dilarutkan dalam air suling sampai 1000 ml, pH diatur 6,0. Setelah itu, medium disterilkan dengan autoklaf pada suhu 1210C selama 15 menit.

Penggunaan:Sebagai medium fermentasi kapang.

MEa (Malt Extract agar)

Komposisi : Malt Extract 20,0 gram Agar 20,0 gram Air Suling 1000 ml


Pembuatan:Serbuk malt extract dan agar dilarutkan dalam air suling sampai 1000 ml. Setelah itu, medium disterilkan dengan autoklaf pada suhu 1210C, selama 15 menit.

Penggunaan:Sebagai medium untuk kultivasi dan karakteristik kapang.

Miura

Komposisi : Glukosa 1,0 gram KH2PO4 1,0 gram MgSO4 7H2O 0,2 gram KCl 0,2 gram NaNO3 2,0 gram Yeast extract 0,2 gram Agar 20,0 gram

Pembuatan:Serbuk glukosa, KH2PO4, MgSO47H2O, KCl, NaNO3, yeast extract dan agar dilarutkan dalam air suling sampai 1000 ml. Setelah itu, medium disterilkan dengan autoklaf pada suhu 1210C, selama 15 menit.

Penggunaan:Sebagai medium untuk isolasi dan sporulasi kapang.

Media yang digunakan untuk uji aktivitas enzim :

Glucose Yeast Extract (GYP) medium Glukosa 0,1 g Yeast extract 0,1 g Peptone Agar 0,5 g Agar 16 g Air Suling 1 L Larutan Pati 0,2 % pH 6,0


Kegunaan:Untuk uji aktivitas amilolitik

Pepton Agar medium Pepton 10 g NaCL 5 g CaCl2 2H2O 0,1 g Agar 16 g Air Suling 1 L pH 6,0 Tambahkan Tween 20 (disterilkan terpisah) 0,1 % pada media.

Kegunaan:Uji aktivitas lipolitik.

Pektin agar medium Pektin 5 g Yeast extract 1 g Agar 15 g Air suling 1 L pH 5,0

Kegunaan:Uji aktivitas pektinolitik

Glucose Yeast Extract (GYP) medium (ditambahkan Carboxy- methylcellulose) Glucose 1,0g Yeast extract 0,1g Peptone Agar 0,5g Agar 16 g Air suling 1 L Ditambahkan: Carboxy-methylcellulose 0,5 % Larutan pati 0,2% pH 6,0

Kegunaan:Uji aktivitas selulose


Glucose Yeast Extract (GYP) medium (ditambahkan gelatin) Glucose 1 g Yeast extract 0,1g Peptone agar 0,5g Agar 16 g Air suling 1 L Ditambahkan Gelatin 0,4% (pH 6,0) Larutan gelatin 0,8 % (disterilkan terpisah) Ditambahkan 5 ml/100 ml

Kegunaan:Uji aktivitas proteolitik

Glucose Yeast Extract (GYP) medium (ditambahkan napthol) Glucose 1 g Yeast extract 0,1g Peptone agar 0,5g Agar 16 g Air suling 1 L Napthol 0,05 g/ml pH 6,0

Kegunaan:Uji aktivitas lakase.

Larutan Pengawet Akua destilata 200 mL HgCl2 4g Etanol 96% 250 mL Glyserin 16 mL Karmin pewarna qs Kegunaan : Untuk tutup kapas tabung isolat kapang


Tum

buha

n in

ang

Mik

roba

End

ofit

Seny

awa

akti

vita

s Pu

stak

a

Poho

n ce

mar

a Pa

sifik

Mor

inda

citr

ifolia

Bruc

ea ja

vani

ca L

(Mer

r)

Bruc

ea ja

vani

ca L

(Mer

r)

Ipom

oea

bata

tas

Pen

icill

ium

scl

erot

ioru

m

Bar

ringt

onia

acu

tang

ula

Taxo

myc

es a

ndre

anae

, P

esta

lotio

psis

, Alte

naria

sp.

, M

onoc

haet

ia s

p

Lasi

odip

lodi

a th

eobr

omae

Fusa

rium

chl

amyd

ospo

rum

Bot

ryos

phae

ria p

arva

Asp

ergi

lus

glau

cus

Cep

halo

thec

a fa

veol

ata

Col

leto

trich

um g

loeo

spor

ioid

es

Taxo

l

Taxo

l

Der

ivat

Can

thin

-6-O

ne

dan

Der

ivat

bru

ceos

in

Belu

m d

iket

ahui

2,14

-dih

ydro

x-7-

drim

en-1

2,11

-olid

e

Scle

rotio

rin

Belu

m d

iket

ahui

Antik

anke

r

Antik

anke

r

Antik

anke

r

Antik

anke

r

Antit

umor

Antik

anke

r

Antik

anke

r

Petri

ni O

, et a

l. N

atur

al

Toxi

n.19

92 ;

185-

196.

Pand

i M, e

t al.

Afric

an J

ourn

al

of B

iote

chno

logy

. 201

1; 1

0 (8

) :1

428-

1435

.

Kum

ala

S, e

t al R

esea

rch

Jour

nal

of M

icrob

iolo

gy 2

007;

2(8)

: 625

-631

.

Kum

ala,

S.,

et a

lIn

tern

atio

nal J

ourn

al o

f Pha

rmac

y an

d Ph

arm

aceu

tical

Sci

ence

s.

2010

; 2:

80-

83.

Aske

r MM

S, e

t al

Inte

rnat

iona

l Jou

rnal

of P

harm

Te

ch. R

esea

rch.

201

3; 5

(2):

391-

397.

Giri

dhar

an P

, et a

lIn

dian

Jou

rnal

Exp

erim

enta

l Bi

olog

y.20

12; 5

0(7)

: 464

-468

.

Laks

hmi P

J, e

t al

Int.

J. C

urr.

Mic

robi

ol. A

ppl.

Sci.

2013

; 2

(2):

44-5

5.

Lam

pira

n 5.

Met

abol

it se

kund

er d

ari M

ikro

ba e

ndofi

t yan

g da

pat d

ikem

bang

kan

seba

gai b

ahan

bak

u ob

at

Mikroba Endofit, Pemanfaatan Mikroba Endofit dalam Bidang Farmasi114C

epha

lolo

taxu

s m

anni

i, C

epha

lolo

taxu

s si

nens

is,

Cep

halo

lota

xus

hain

anen

sis,

C

epha

lolo

taxu

s ol

iver

i dan

C

epha

lolo

taxu

s ha

rrin

gton

ia

var n

ana

Asp

ergi

llus

para

sitic

us

Cyt

ospo

ra s

p.

Xyl

aria

sp.

, Pho

mop

sis

Tect

ona

gran

dis

Api

ospo

ra m

onta

gnei

Asp

ergi

llus

nige

r

Tana

man

oba

t yan

g be

rada

di T

haila

n ut

ara

dan

di C

ina

Sela

tan.

Seq

uoia

sem

perv

irens

Con

ocar

pus

erec

ta

Licu

ala

spin

osa.

,sp.

Pol

ysip

honi

a vi

olac

ea

Cyn

odon

dac

tylo

n

Antik

anke

r

Anti

Kank

er

Anti

Kank

er

Anti

Kank

er

Anti

Kank

er

Anti

Kank

er

Saith

ong

P, e

t al

Int. J

. Sci.

Tec

hnol.

2010

; 4(0

3): 4

46-4

53.

Stie

rle e

t al.

(199

9)Ph

ytoc

hem

Rev

.Sp

ringe

r Sci

ence

+ B

usin

ess

Med

ia

Dor

dre

cht 2

012

Brad

y et

al.

(200

0)Ph

ytoc

hem

Rev

.Sp

ringe

r Sci

ence

+ B

usin

ess

Med

ia

Dor

dre

cht 2

012

Isak

a et

al.

(200

1)Ph

ytoc

hem

Rev

.Sp

ringe

r Sci

ence

+ B

usin

ess

Med

ia

Dor

dre

cht 2

012

Klem

ke e

t al.

(200

4)Ph

ytoc

hem

Rev

.Sp

ringe

r Sci

ence

+ B

usin

ess

Med

ia

Dor

dre

cht 2

012

Song

et a

l. (2

004)

Phyt

oche

m R

ev.

Sprin

ger S

cien

ce +

Bus

ines

s M

edia

D

or d

rech

t 201

2

Har

ringt

onin

e,

isoh

arrin

gton

ine,

ho

moh

arrin

gton

ine,

de

xoha

rring

toni

ne

and

ceph

alez

omin

es

Sequ

oiat

ones

A (2

0)

(C23

H30

O)

Cyt

osky

rinA

(21)

(C

30H

22O

12)

Cyt

osky

rin B

(22)

(C30

H22

O13

)

Phom

oxan

thon

eA (2

3)(C

38H

38O

16),

Phom

oxan

thon

eB (2

4)

(C38

H38

O16

)

Epie

poxy

don

(25)

(C7H

8O4)

Rub

rofu

sarin

B (2

6)(C

16H

14O

5)


Kral

j et a

l. (2

006)

Phyt

oche

m R

ev.

Sprin

ger S

cien

ce +

Bus

ines

s M

edia

D

or d

rech

t 201

2

Tele

s et

al.

(200

6)Ph

ytoc

hem

Rev

.Sp

ringe

r Sci

ence

+ B

usin

ess

Med

ia

Dor

dre

cht 2

012

Turb

yville

et a

l. (2

006)

Phyt

oche

m R

ev.

Sprin

ger S

cien

ce +

Bus

ines

s M

edia

D

or d

rech

t 201

2

van

der S

ar e

t al.

(200

6)Ph

ytoc

hem

Rev

.Sp

ringe

r Sci

ence

+ B

usin

ess

Med

ia

Dor

dre

cht 2

012

Wan

g et

al.

(200

6)Ph

ytoc

hem

Rev

.Sp

ringe

r Sci

ence

+ B

usin

ess

Med

ia

Dor

dre

cht 2

012

Anti

Kank

er G

u et

al.

(200

7)Ph

ytoc

hem

Rev

.Sp

ringe

r Sci

ence

+ B

usin

ess

Med

ia

Dor

dre

cht 2

012

Zhan

et a

l. (2

007)

Phyt

oche

m R

ev.

Sprin

ger S

cien

ce +

Bus

ines

s M

edia

D

or d

rech

t 201

2

Anti

Kank

er

Anti

Kank

er

Anti

Kank

er

Anti

Kank

er

Anti

Kank

er

Anti

Kank

er

Anti

Kank

er

Emin

dole

DA

(27)

(C28

H39

NO

)

Peric

onic

inB

(28)

(C20

H28

O4)

Rad

icic

ol (2

9)(C

18H

17C

lO6)

Spiro

mam

akon

eA (3

0)(C

19H

12O

5)

Cha

etop

yran

in (3

1)(C

19H

24O

4)

Dal

dino

ne (3

2)(C

20H

16O

5)

Beau

veric

in (3

3)(C

45H

57N

3O9)

Em

eric

ella

nid

ulan

s

Per

icon

ia a

tropu

rpur

ea

Eph

edra

fasc

icul

ate

Myc

elia

ste

rilia

Pol

ysip

honi

a ur

ceol

ata

Hyp

oxyl

on tr

unca

tum

F. o

xysp

orum

Med

iterr

anea

n gr

een

alga

Xyl

opia

aro

mat

ica

Cha

etom

ium

chi

vers

ii

Kni

ghtia

exc

elsa

C. g

lobo

sum

Arte

mis

ia a

nnua

Eph

edra

fasc

icul

ate

Mikroba Endofit, Pemanfaatan Mikroba Endofit dalam Bidang Farmasi116C

ylin

drop

untia

ec

hino

carp

us

Pol

ygon

um

sene

gale

nse

Pla

tycl

adus

orie

ntal

is

Pes

talo

tiops

is

phot

inia

e

Sal

via

offici

nalis

Cyn

odon

dac

tylo

n

Hyp

eric

um p

erfo

ratu

m

F. o

xysp

orum

Alte

rnar

ia s

p.

Phy

llost

icta

spi

naru

m

Roy

ston

ea re

gia

Cha

etom

ium

sp.

A. f

umig

atus

Thie

lavi

a su

bthe

rmop

hila

Bika

verin

(34)

(C20

H14

O8)

Alte

rnar

iol (

35)

(C14

H10

O5

Taur

anin

(36)

(C22

H30

O4)

Phot

inid

es A

–F

Coc

hlio

dino

l (37

)(C

32H

30N

2O4)

9-D

eace

toxy

fu

mig

acla

vine

(38)

(C21

H28

N2O

)

Emod

in (3

9)(C

15H

10O

5)

Anti

Kank

er

Anti

Kank

er

Anti

Kank

er

Anti

Kank

er

Anti

Kank

er

Anti

Kank

er

Anti

Kank

er

Zhan

et a

l. (2

007)

Phyt

oche

m R

ev.

Sprin

ger S

cien

ce +

Bus

ines

s M

edia

D

or d

rech

t 201

2

Aly

et a

l. (2

008)

Phyt

oche

m R

ev.

Sprin

ger S

cien

ce +

Bus

ines

s M

edia

D

or d

rech

t 201

2

Wije

ratn

e et

al.

(200

8)Ph

ytoc

hem

Rev

.Sp

ringe

r Sci

ence

+ B

usin

ess

Med

ia

Dor

dre

cht 2

012

Din

g et

al (

2009

)Ph

ytoc

hem

Rev

.Sp

ringe

r Sci

ence

+ B

usin

ess

Med

ia

Dor

dre

cht 2

012

Deb

bab

et a

l. (2

009)

Phyt

oche

m R

ev.

Sprin

ger S

cien

ce +

Bus

ines

s M

edia

D

or d

rech

t 201

2

Ge

et a

l. (2

009)

Phyt

oche

m R

ev.

Sprin

ger S

cien

ce +

Bus

ines

s M

edia

D

or d

rech

t 201

2

Kusa

ri et

al.

(200

9c)

Phyt

oche

m R

ev.

Sprin

ger S

cien

ce +

Bus

ines

s M

edia

D

or d

rech

t 201

2


Etli

nger

a lit

tora

lis

Licu

ala

spin

osa

Man

grov

e

Glo

riosa

sup

erba

Eug

enia

jam

bola

na

Sej

enis

Rum

put2

an

Eut

ypel

la s

p.

Xyl

aria

sp.

Hal

oros

ellin

ia s

p. a

nd

Gui

gnar

dia

sp.

Asp

ergi

llus

sp.

Cep

halo

thec

a fa

veol

ata

Acr

emon

ium

, atk

inso

nella

an

d B

alan

sia

Spe

cies

Euty

pellin

A

Erem

ophi

lano

lides

(40)

(C15

H22

O2)

Anth

race

nedi

one

(41)

(C16

H12

O3)

6-M

ethy

l-1,2

,3-tr

ihy-

drox

y-7,

8-c

yclo

hept

a-9,

-die

ne -1

1- o

ne -5

, 6,

7,8-

tetra

lene

-7-

acet

amid

e (4

2)(C

18H

19N

O5)

Scle

rotio

rin (4

3)(C

21H

23C

lO5)

Belu

m d

iket

ahui

Anti

Kank

er

Anti

Kank

er

Anti

Kank

er

Anti

Kank

er

Anti

Kank

er

Enzi

m X

ylan

ase

Isak

a I

saka

et a

l. (2

009)

Phyt

oche

m R

ev.

Sprin

ger S

cien

ce +

Bus

ines

s M

edia

D

or d

rech

t 201

2

Isak

a et

al.

(201

0)Ph

ytoc

hem

Rev

.Sp

ringe

r Sci

ence

+ B

usin

ess

Med

ia

Dor

dre

cht 2

012

Zhan

g et

al.

(201

0a,2

010b

) Ph

ytoc

hem

Rev

.Sp

ringe

r Sci

ence

+ B

usin

ess

Med

ia

Dor

dre

cht 2

012

Budh

iraja

et a

l. (2

012)

Phyt

oche

m R

ev.

Sprin

ger S

cien

ce +

Bus

ines

s M

edia

D

or d

rech

t 201

2

Giri

dhar

an e

t al.

(201

2)Ph

ytoc

hem

Rev

.Sp

ringe

r Sci

ence

+ B

usin

ess

Med

ia

Dor

dre

cht 2

012

Whi

te J

F, e

t al

Myc

olog

ia. 1

991;

83

: 601

-610

.

Mikroba Endofit, Pemanfaatan Mikroba Endofit dalam Bidang Farmasi118A

lpin

ia c

onch

iger

a

Aza

dira

chta

indi

ca d

an

Oci

mum

tenu

iflor

um

Alpi

nia

calc

arat

a R

osco

e, B

ixa

orel

lana

L,

Cal

ophy

llum

inop

hyllu

m

L da

n C

atha

rant

hus

rose

us L

Taxu

s su

mat

rana

Sam

bilo

to (A

ndro

grah

is

pani

cula

ta N

ess)

.

Kum

is k

ucin

g (O

rthos

ipho

n sp

icat

us

BBS)

Sirih

mer

ah (P

iper

cr

ocat

um L

)(J)

Tana

man

hut

an d

i C

ongo

Bel

um d

iket

ahui

Jeni

s ka

pang

dal

am fi

lum

ba

sidi

omyc

etes

Bel

um d

iket

ahui

Col

leto

trich

um s

p

A A

p.3E

, A

Ap.

4F d

an B

. A

p.1F

B. O

s.1F

A. P

c. 1

F, B

. Pc.

1F d

an

B.P

c.2F

Pseu

dom

assa

ria s

p

Belu

m d

iket

ahui

Belu

m d

iket

ahui

Belu

m d

iket

ahui

TSC

13

Belu

m d

iket

ahui

Belu

m d

iket

ahui

Belu

m d

iket

ahui

Seny

awa

non-

pept

ida

(L-7

83,2

81)

Enzim

cel

lulo

se,

man

nana

se d

an

Xyla

nase

Enzy

m

Tyro

sina

se;

Enzy

m y

ang

mem

ecah

po

lisak

arid

a

Enzy

m a

lfa

gluc

osid

ase

Antid

iabe

tes

Antid

iabe

tes

Ant

idia

bete

s

Anti

diab

etes

Jeffr

ey L

SH, e

t al

J. T

rop.

Agr

ic, a

nd F

d, S

c. 2

008;

36

(1):

121-

126

.

Zaid

i KU

, et a

lAn

nual

Rev

iew

and

Res

earc

h in

Bi

olog

y 20

13; 3

(4) :

389-

396

Suni

tha

VH, e

t al.

Wor

ld J

ourn

al o

f Agr

icul

tura

l Sc

ienc

es. 2

013;

9(1

): 01

-09

Arta

nti N

, et a

l.Pa

kist

an J

ourn

al o

f Bio

logi

cal

Scie

nces

. 201

2; 1

5(14

) : 6

73-6

79.

Dom

peip

en E

, et a

l.As

ian

Jour

nal o

f Bio

chem

istry

. 20

11; 6

(6) :

465

-47

1

Zhan

g B,

et.a

lSc

ienc

e.19

99;2

84: 9

74-9

81.


Cas

tillo

UF,

et a

lM

icrob

iolo

gy. 2

002;

148

: 26

75-2

85.

Rad

ji M

, et a

l.Af

rican

Jou

rnal

of

Biot

echn

olog

y.20

11; 1

0(1)

:103

-107

Wah

yudi

P. e

t al

Jurn

al Ilm

u Ke

farm

asian

200

3; 1

:15-

18.

Vaz

ABM

, et a

l.Af

rican

Jou

rnal

of M

icro

biol

ogy

Res

earc

h. 2

012;

6(1

3): 3

173-

85.

Idris

Al-m

ahi ,

et a

l.Eg

ypt.

Acad

. J. B

ilog,

Sci

, 201

3;

5(1)

: 1-9

Bung

ihan

ME,

et a

lPh

ilippi

nes

Scie

nce

Lette

rs. 2

013;

5(

1): 5

7-73

Rho

den

SA, e

t al.

Jour

nal o

f App

lied

Phar

mac

eutic

al

Scie

nce.

201

2; 0

2 (0

8): 5

7-59

.

Qad

ri M

, et a

l.Sp

ringe

rPlu

s.20

13;2

(8).

http

://w

ww

.sp

ringe

rplu

s.co

m/c

onen

t /2/

1/8:

1-14

Antim

ikro

ba

Antim

ikro

ba

Antim

ikro

ba

Antim

ikro

ba

Antim

ikro

ba

Antim

ikro

ba

Antim

ikro

ba

Antim

ikro

ba

Mun

umbi

cins

A, B

, C,

dan

D

Belu

m d

iket

ahui

Belu

m d

iket

ahui

Belu

m d

iket

ahui

Belu

m d

iket

aui

Seny

awa

colle

totri

olid

e Ty

roso

lD

othi

ore-

lone

C d

an

Cyt

ospo

rone

Belu

m d

iket

ahui

Belu

m d

iket

ahui

Stre

ptom

yces

NR

RL

3056

2

Bel

um d

iket

ahui

Bel

um d

iket

ahui

Gen

us C

olle

totri

chum

Cla

dosp

oriu

m s

p. A

sper

gillu

s fla

vus,

Asp

ergi

llus

sp d

an

Cur

vula

ria lu

nata

Col

leto

trich

um s

p C

olle

totri

chum

glo

eosp

orio

ides

da

n C

haet

omiu

m g

lobo

sum

.

Cor

dyce

ps m

emor

abili

s P

hom

opsi

s sp

Dot

hide

omyc

etes

sp

dan

G8-

25

K4

Tric

hoph

aea

Abu

ndan

s P

R4

(Dia

porth

e ph

aseo

loru

m)

art4

(Fus

ariu

m re

dole

ns)

Ken

nedi

a ni

gris

cans

Gar

cini

a m

ango

stan

a

Qui

squa

lis in

dica

L

Myr

ciar

ia fl

orib

unda

Kig

elia

afri

cana

(Lam

) B

enth

Pan

danu

s am

aryl

lifol

ius

Rox

b

Tric

hilia

ele

gans

A J

uss

Pin

us s

p,

Pic

orhi

za s

p A

rtem

isia

sp

Mikroba Endofit, Pemanfaatan Mikroba Endofit dalam Bidang Farmasi120Po

wth

ong

P. e

t al

Int J

. Pha

rm B

iom

ed,

Res

.201

2;3(

2):1

32-1

36.

Pavi

thra

N, S

athi

sh L

, Ana

nda

K.

Antim

icro

bial

and

enz

yme

activ

ity

of e

ndop

hytic

fung

i iso

late

d fro

m

Tuls

i. Jo

urna

l of P

harm

aceu

tical

an

d Bi

omed

ical

Sci

ence

s (J

PBM

S).

2012

; 16

(issu

e 16

): 1-

6.

Tayu

ng K

, et a

l.M

ycos

pher

e. 2

011;

2 (3

), 20

3-21

3.

Tong

WY,

et a

l.Jo

urna

l of M

edic

inal

Pla

nts

rese

arch

. 201

1; 5

(5):

831-

836.

Ram

os H

P, e

t al.

Arch

ives

of B

iolo

gy a

nd

Tech

nolo

gy.2

010;

53(

3): 6

29-6

32

Dev

araj

u R

, et a

l.AS

IAN

J. E

XP B

IOL.

SC

I. 20

11;

2(1)

:. 75

-79

Sada

nand

a TS

, et a

l. Jo

urna

l of

Med

icin

al P

lant

s R

esea

rch.

201

1;5

(6):

3643

-365

2.

Antim

ikro

ba

Antim

ikro

ba

Antim

icro

bial

ac

tycl

ohex

a-ne

mik

roba

Antim

ikro

ba

Antim

ikro

ba

Antim

ikro

ba

Antim

ikro

ba

Sito

toks

ikte

rhda

p se

l ka

nker

.

Bel

um d

iket

ahui

Bel

um d

iket

ahui

Fusa

rium

sol

ani (

Mar

t)

Belu

m d

iketa

hui

Papu

lasp

ora

imm

ersa

dan

Ap

iosp

ora

mon

tagn

ei S

acc

dala

m b

entu

k Ar

thrin

ium

Fusa

rium

sp

Aspe

rgillu

s sp

Asp

ergi

llus

nige

r dan

A

ltern

aria

alte

rnat

a

Sesb

ania

gra

ndifl

ora

(L)

Per

s.

Oci

mum

spe

cies

(Tul

si)

Taxu

s ba

ccat

a (c

emar

a H

imal

aya)

Orth

osip

hon

stam

ineu

s B

enth

Akar

dar

i Sm

alla

nthu

s so

nchi

foliu

s

Mira

bilis

jala

pa L

Tabe

buia

arg

ente

aFa

milia

Big

noni

acea

e

Belu

m d

iket

ahui

Belu

m d

iket

ahui

1-te

trade

cend

e,

8-oc

ta, d

ecan

one,

8-

pent

adec

anon

e,

octyl

ceclo

hexa

ne

dan

10-n

on-a

deca

none

.

Belu

m d

iketa

hui

Belu

m d

iketa

hui

Belu

m d

iketa

hui

naph

thoq

uino

ne (n

atur

al

lapa

chol

) Ph

enol

oic,

pol

ioph

enol

ic


Jalg

aow

ala

RE

et a

l.In

tern

atio

nal J

ourn

al o

n Ph

arm

aceu

tical

and

Bio

med

ical

R

esea

rch

(IJPB

R) 2

010;

1(5

):136

-41.

Nov

erita

, et a

l.Ju

rnal

Far

mas

i Ind

ones

ia. 2

009;

4

(4) :

171

-176

.

Sugi

jant

o N

E, e

t al.

Proc

eedi

ng In

tern

atio

nal

conf

eren

ce o

n Ph

arm

acy

and

Adva

nced

Pha

rmac

eutic

al

Scie

nces

.,Yog

yaka

rta. I

ndon

esia

, 20

09; 1

5-17

.

Uta

mi U

.In

tern

atio

nal J

ourn

al o

f Aca

dem

ica

Res

earc

h. 2

011;

3 (1

): 18

7-19

4.

Pal A

, et a

l.In

tern

atio

nal J

ourn

al o

f Cur

rent

Ph

arm

aceu

tical

Res

earc

h.20

12;

4(5)

:123

-127

.

Wu

QY,

et a

l.Af

rican

jour

nal o

f Mic

robi

olog

y R

esea

rch

. 201

2;6

(35)

: 646

2-64

67.

Wan

g et

al.

2012

Phyt

oche

m R

ev.

Sprin

ger S

cien

ce +

Bus

ines

s M

edia

D

or d

rech

t 201

2

Antim

ikro

ba

Antim

ikro

ba

Antim

ikro

ba

Antim

ikro

ba

Antim

ikro

ba

Antim

ikro

ba

Antim

ikro

ba

Belu

m d

iketa

hui

Belu

m d

iketa

hui

Belu

m d

iketa

hui

Belu

m d

iketa

hui

Belu

m d

iketa

hui

Belu

m d

iketa

hui

a-te

tralo

ne d

eriva

tive

(3S)

-3,6

,7- t

rihyd

roxy

-a-

tetra

lone

toge

ther

w

ith c

erco

spor

amid

e,

b-sit

oste

rol,

and

trich

oder

min

AFR

1,A

FR4,

AFR

7

Belu

m d

iket

ahui

Kab

atie

lla c

auliv

ora

var B

Belu

m d

iket

ahui

Belu

m d

iket

ahui

Bak

teri

Bac

illus

sub

tilis

Pho

ma

sp.

Alo

e ve

ra L

Zing

iber

offe

nsii

val

(Gho

st B

angl

e),

Aly

xia

rein

war

dtii

BL

(Pul

asar

i)

Brug

uler

a gy

mno

rrhiz

ase

jeni

s m

angr

ove

Pae

deria

foet

ida

L.

(Rub

iace

ae) t

anam

an

obat

trad

isio

nal

Mul

bery

Aris

aem

a er

ubes

cens

Mikroba Endofit, Pemanfaatan Mikroba Endofit dalam Bidang Farmasi122G

inkg

o bi

loba

Par

is p

olyp

hylla

var

. yu

nnan

ensi

s

Man

grov

e pl

ant,

Son

nera

tia a

lba

Arte

mis

ia m

ongo

lica

Nee

m

Jatro

pha

curc

as

Rhy

ncho

laci

s pe

dici

llata

Xyl

aria

sp.

YX

-28

Glio

mas

tix m

uror

um P

pf8

Alte

rnar

ia s

p.

Col

leto

trich

um

gloe

ospo

rioid

es

Chl

orid

ium

sp.

Nig

rosp

ora

oryz

ae,

Col

letro

trich

um tr

unca

tum

, Fu

sariu

m p

rolif

erat

um,

Cha

etom

ium

sp

Gui

gnar

diac

omel

lia d

an

Alte

rnar

ia d

estru

ens.

Belu

m d

iket

ahui

7-am

ino-4

met

hylco

umar

in

(C10

H9N

O2)

Ergo

sta-

5,7,

22-

trien

-3-

ol a

nd 2

,3-d

ihyd

ro-5

-hy

drox

y-a,

a-d

imet

hyl-2

-be

nzof

uran

met

hano

l

Xana

lteric

acid

s I a

nd II

, Al

tenu

sin (

C15

H14

O6)

Col

leto

tric

acid

Antib

acte

rial

naph

thaq

uino

ne

Java

nicin

(C15

H14

O6)

Belu

m d

iketa

hui

(Ooc

ydin

A)

Antim

ikro

ba

Antim

ikro

ba

Antim

ikro

ba

Antim

ikro

ba

Antim

ikro

ba

Antif

ungi

Antif

ungi

Liu

et a

l. 20

08Ph

ytoc

hem

Rev

.Sp

ringe

r Sci

ence

+ B

usin

ess

Med

ia

Dor

dre

cht 2

012

Zhao

et a

l. 20

12a,

bPh

ytoc

hem

Rev

.Sp

ringe

r Sci

ence

+ B

usin

ess

Med

ia

Dor

dre

cht 2

012

Kjer

et a

l. 20

09Ph

ytoc

hem

Rev

.Sp

ringe

r Sci

ence

+ B

usin

ess

Med

ia

Dor

dre

cht 2

012

Zou

et a

l. 20

00Ph

ytoc

hem

Rev

.Sp

ringe

r Sci

ence

+ B

usin

ess

Med

ia

Dor

dre

cht 2

012

Khar

war

et a

l. 20

08Ph

ytoc

hem

Rev

.Sp

ringe

r Sci

ence

+ B

usin

ess

Med

ia

Dor

dre

cht 2

012

Kum

ar S

, et a

l.Pl

os o

ne/w

ww

.plo

sone

.org

. 20

13;(8

):2 :e

5620

2

Stro

bel G

, et a

l.Pl

ant P

atho

logy

Jou

rnal

200

5; 4

(2):

161-

176


Qad

ri M

, et a

l.ht

tp://

ww

w.s

prin

gerp

lus

.com

/con

ent

/2/1

/8:

Taec

how

isan

T, e

t al.

Jour

nal

of A

pplie

d Ph

arm

aceu

tical

Sc

ienc

e.20

12;0

2(03

): 12

4-12

8.

Jalg

aow

ala

RE,

et a

l.In

tern

atio

nal J

ourn

al o

n Ph

arm

aceu

tical

and

Bio

med

ical

R

esea

rch

(IJPB

R) 2

010;

1(5

) :13

6-14

1.

Sant

iago

et a

l. 20

12Ph

ytoc

hem

Rev

.Sp

ringe

r Sci

ence

+ B

usin

ess

Med

ia

Dor

dre

cht 2

012

Silv

a et

al.

2006

Phyt

oche

m R

ev.

Sprin

ger S

cien

ce +

Bu

sine

ss M

edia

Dor

dre

cht 2

012

Silv

a et

al.

2010

Phyt

oche

m R

ev.

Sprin

ger S

cien

ce +

Bu

sine

ss M

edia

Dor

dre

cht 2

012

Antif

ungi

Antif

ungi

Antif

ungi

Antif

ungi

Antif

ungi

Antif

ungi

Belu

m d

iketa

hui

3-m

ethy

lcarb

azol

es

1-m

etho

xy-3

-met

hyl

carb

azol

e

Belu

m

dike

tahu

i

5-hy

drox

y-ra

mul

osin

(C

10H

14O

4)

Cadin

ane

sesq

uiter

pene

s 3,

9,12

-trihy

-dro

xyca

lame-

nene

s; 3,

12-d

ihydr

oxy-

calam

enen

e; 3

,12-

dih

ydro

xyca

dalen

e, a

nd

3,11

,12-

trihyd

ro xy

cada

-len

e

pres

ilphi

perfo

lane

se

squi

terp

enes

Tala

rom

yces

sp,

Gib

erel

la s

p, C

ochl

iobo

lus

sp,

Fusa

rium

sp

dan

Alte

rnar

ia s

p.

Stre

ptom

yces

sp

galu

r LJ

K109

Bakt

eri e

ndofi

t KB4

Bak

teri

endo

fit N

B6 B

aket

ri en

dofit

N

HB3

Phom

a sp

.

Phom

opsi

s ca

ssia

e

Xyla

ria s

p.

Tana

man

oba

t dar

i H

imal

aya

Alpi

nia

gala

nga

(L) W

ild

Akar

tana

man

oba

t Po

ngam

ia g

labr

a ve

nt

(fam

ilia L

egum

inos

eae)

, R

antin

g ta

nam

an o

bat

Euca

lypt

us g

lobu

lus

Deh

nh (M

yrta

ceae

), da

n R

impa

ng C

urcu

ma

long

a L

(Zin

gibe

race

ae)

Cin

nam

omum

m

ollis

sim

um

Cas

sia

spec

tabi

lis

Pipe

r adu

ncum


Man

grov

e

Mel

ia a

zeda

rach

Pin

us ro

xber

gii

Ced

rus

deod

ara

, A

rtem

isia

sp,

T. W

ilfor

dii

Fusa

rium

sp.

Pho

mop

sis

sp.

ZSU

H76

A. f

umig

atus

LN

-4

Pes

talo

tiops

is fo

edan

Cry

ptos

porio

psis

cf.

quer

cina

Pet

riella

sp

dan

Ulo

clad

ium

sp

Coc

hlio

bolu

s sp

icife

r S

orda

ria s

uper

ba d

an

Fusa

rium

redo

lens

Fusa

rium

Sub

glut

inan

s

fusa

rielin

A (C

25H 38

O4)

fu

sarie

lin B

(C20

H 40O

5),

fusa

rielin

C (C

25H 38

O3),

an

d D

Phom

opsin

A, B

, C a

nd

know

n cy

tosp

oron

e B

(C18

H26

O5)

and

Cyt

ospo

rone

C

12b-

hydr

oxy-

13a-

met

hoxy

-ver

rucu

loge

n TR

-2, a

nd 3

-hyd

roxy

-fu

miq

uina

-zol

ine

A

isobe

nzof

uran

ones

Pe

stap

htha

lides

A, B

(C

11H

12O

5) an

d

Cry

ptoc

andi

n (C

15H

82N

8O17

)

Seny

awa

K1 d

an K

7D

EF4

Art3

dan

art4

Dite

rpen

e py

robn

e su

bglu

tinol

A d

an B

Koba

yash

i et a

l. 19

95Ph

ytoc

hem

Rev

.Sp

ringe

r Sci

ence

+ B

usin

ess

Med

ia

Dor

dre

cht 2

012

Hua

ng e

t al.

2008

Phyt

oche

m R

ev.

Sprin

ger S

cien

ce +

Bus

ines

s M

edia

D

or d

rech

t 201

2

Li e

t al.

2012

Phyt

oche

m R

ev.

Sprin

ger S

cien

ce +

Bus

ines

s M

edia

D

or d

rech

t 201

2

Stro

bel e

t al.1

999

Phyt

oche

m R

ev.

Sprin

ger S

cien

ce +

Bus

ines

s M

edia

D

or d

rech

t 201

2

Qad

ri M

, et a

l.ht

tp://

ww

w.s

prin

gerp

lus

.com

/con

ent

/2/1

/8: 1

-14

Jose

ph B

and

Priy

a R

.Am

eric

an jo

urna

l of B

ioch

emis

try

and

Mol

ecul

ar B

iolo

gy.2

011;

1(3

) :

201-

309.

Antif

ungi

Antif

ungi

Antif

ungi

Antif

ungi

Antif

ungi

Men

gham

bat

prol

ifera

si li

mfo

sit

Imun

o-su

pres

ive

Imun

osup

resi

ve.


Lee

et a

l. 19

95 P

hyto

chem

Rev

.Sp

ringe

r Sci

ence

+ B

usin

ess

Med

ia

Dor

dre

cht 2

012

Bent

ley

2000

Lars

enet

al. 2

005

Phyt

oche

m R

ev.

Sprin

ger S

cienc

e +

Busin

ess

Med

ia

Dor

dre

cht 2

012

Bore

l and

Kis

, 199

1Ph

ytoc

hem

Rev

.Sp

ringe

r Sci

ence

+

Busi

ness

Med

ia D

or d

rech

t 201

2

Ren

et a

l. 20

08Ph

ytoc

hem

Rev

.Sp

ringe

r Sci

ence

+ B

usin

ess

Med

ia

Dor

dre

cht 2

012

Zhan

g G

, et a

l. Ph

ytoc

hem

istry

. 20

11; d

oi:1

0.10

16/ J

.Phy

toch

em.

2011

,04.

014.

(arti

cle

in p

ress

).

Hua

ng W

Y, e

t al

J.M

icro

biol

Bio

tech

nol.

2007

; 23

: 12

53-1

263.

Sada

nand

a TS

, et a

l. Jo

urna

l of

Med

icin

al P

lant

s R

esea

rch.

201

1:5

(6):

3643

-365

2.

Imun

omod

ulat

or

Imun

omod

ulat

or

Imun

omod

ulat

or

Imun

omod

ulat

or

Imun

omod

ulat

or

Imun

omod

ulat

or

Antiv

irus

Antioksidan

Antioksidan

Sub-

glu

tinol

-A

(C27

H38

O4)

Subg

lutin

ol-B

Cyc

losp

orin

e-A

(C62

H11

1N11

O12

)

Myc

ophe

nolic

ac

id (C

17H

20O

6)

Cyc

losp

orin

e

Col

lute

lin A

Der

ivat I

soin

dolo

ne

Seny

awa

phen

olic

(a

sam

feno

lat d

an

deriv

at fe

nol)

Nap

htho

qui-n

one

(nat

ural

lapa

chol

)

Fusa

rium

sub

glut

inan

s

Pen

icill

ium

, Asp

ergi

llus,

B

ysso

chla

mys

and

Sep

toria

Toly

pocl

adiu

m in

flatu

m C

olle

totri

chum

dem

atiu

m

Em

eric

ella

sp

Cha

etom

ium

sp

Asp

ergi

llus

nige

r dan

A

ltern

aria

alte

rnat

a

Trip

tery

gium

wilf

ordi

i

Pte

rom

isch

um s

p.

Aegi

cera

s co

rnicu

latu

m,

seje

nis

poho

n M

angr

ove.

Ner

ium

ole

ande

r

Tabe

buia

arg

ente

a

Mikroba Endofit, Pemanfaatan Mikroba Endofit dalam Bidang Farmasi126Te

rmin

alia

mor

oben

sis

Term

inal

ia

mor

oben

sis

Sina

rund

inar

ia n

itida

Trac

helo

sper

mum

ja

smin

oide

s

Caj

anus

caj

an

Pes

talo

tiops

is m

icro

spor

a

Pes

talo

tiops

is m

icro

spor

a

Cep

halo

spor

ium

sp.

AL0

31

Cep

halo

spor

ium

sp.

IFB-

E001

Fusa

rium

Pest

acin

C15

H14

O4,

1,3-

dihy

dro

isobe

nzof

uran

Isop

esta

cin (

C15

H12

O5)

isobe

nzof

uran

one

deriv

ative

4,6

- di

hydr

oxy-

5-m

eth-

oxy

-7- m

ethy

lpht

halid

e

4,5,

6-tri

hydr

oxy-

7-

met

hyl -

1,3

dihy

droi

sobe

nzof

uran

4,6-

dihy

drox

y-5-

met

hoxy

-7

-met

hyl-1

,3-

dihy

droi

sobe

nzof

uran

and

4,5,

6-tri

-hyd

roxy

-7-

met

hylp

htha

lide

Gra

phisl

acto

ne A

Caj

anin

stilb

ene

acid

(C

12H

22O

4) (C

SA), 3

- hy

drox

y- 4-

pre

nyl -

5-m

etho

xys-

tilb

ene-

2-ca

rbox

ylic

acid

Antioksidan

Antioksidan

Antioksidan

Antioksidan

Antioksidan

Antioksidan

Antioksidan

Antioksidan

Term

inal

ia m

orob

ensi

sPh

ytoc

hem

Rev

. Spr

inge

r Sci

ence

+

Busi

ness

Med

ia D

or d

rech

t 201

2

Stro

bel e

t al.

2002

Phyt

oche

m R

ev. S

prin

ger S

cien

ce +

Bu

sine

ss M

edia

Dor

dre

cht 2

012

Hua

ng e

t al.

2012

Phyt

oche

m R

ev. S

prin

ger S

cien

ce +

Bu

sine

ss M

edia

Dor

dre

cht 2

012

Song

et a

l. 20

05Ph

ytoc

hem

Rev

. Spr

inge

r Sci

ence

+

Busi

ness

Med

ia D

or d

rech

t 201

2

Zhao

et a

l. 20

12a,

b

Phyt

oche

m R

ev. S

prin

ger S

cien

ce +

Bu

sine

ss M

edia

Dor

dre

cht 2

012


Liu

et a

l. 20

07Ph

ytoc

hem

Rev

. Spr

inge

r Sci

ence

+

Busi

ness

Med

ia D

or d

rech

t 201

2

Hua

ng e

t al.

2007

Phyt

oche

m R

ev.

Sprin

ger S

cien

ce +

Bus

ines

s M

edia

D

or d

rech

t 201

2

Des

hmuk

h SK

, et a

l.C

hem

istry

and

Bio

dive

rsity

. 200

9;

(6):

784-

789.

Web

er D

, et a

lJ.

Ant

ibio

t. 20

04; 5

7 (9

): 55

9-56

3.

Taec

how

isan

T, e

t al.

Adva

nces

in M

icro

biol

ogy,

201

2: 2

: 98

-103

.

Sim

anju

ntak

P, e

t al.

Maj

alah

Far

mas

i Ind

ones

ia 2

004;

15

(2):

68-7

4.

Nel

a Za

hara

, Bon

ny P

oern

omo

Wah

yu S

oeka

rno*

, Abd

ul M

unif,

Ju

rnal

Pat

olog

i Ind

ones

ia V

olum

e 14

, N

omor

1, J

anua

ri 20

18H

alam

an 1

5–22

DO

I: 10

.146

92/jfi

.14.

1.15

Antio

ksid

an

Antio

ksid

an

Antii

nflam

asi

Antii

nflam

asi

Antii

nflam

asi

Anti

mal

aria

Anti

mik

roba

te

rhad

ap

Aspe

rgillu

s fla

vus.

Phen

olics

and

fla

vono

id

Flav

onoi

ds a

nd p

heno

lic

acid

Ergo

flavin

Phom

ol s

uatu

sen

yaw

a po

liket

ide

lakt

one

3 –m

ethy

l-car

bazo

les,

Arte

misi

nin

Belu

m d

iketa

hui

Xyl

aria

sp.

Cha

etom

ium

sp.

Bel

um d

iket

ahui

Bel

um d

iket

ahui

Akt

inom

ycet

es

Stre

ptom

yces

sp

LJK

109

galu

r bak

teri

endo

fit A

T12

BE

2B2-

1, B

E2B

2-2,

dan

B

E2B

2-5

bertu

rut a

dala

h E

nter

obac

ter s

p., B

acill

us

sp.,

dan

Aci

neto

bact

er s

p.

Spe

sies

Ent

erob

acte

r sp

Gin

kgo

bilo

ba

Ner

ium

ole

ande

r

Mim

osop

s el

engi

(B

akul

)

Ery

thrin

a cr

ista

-gal

li.

Alp

inia

gal

anga

S

war

tz fa

mili

a Zi

ngeb

erac

ease

,

Arte

mis

ia a

nnua

Kac

ang

tana

h (A

rach

is h

ypog

eae)

Mikroba Endofit, Pemanfaatan Mikroba Endofit dalam Bidang Farmasi128Ip

sita

Das

a, M

runm

aya

Kum

ar

Pand

aa ,

Cha

ndi C

. Rat

hb,

Kum

anan

da T

ayun

gc*,

Jour

nal o

f App

lied

Phar

mac

eutic

al

Scie

nce

Vol.

7 (0

8), p

p. 1

31-1

36,

Augu

st, 2

017.

Ava

ilabl

e on

line

at h

ttp://

ww

w.ja

pson

line.

com

D

OI:1

0.73

24/J

APS.

2017

.708

18

ISSN

223

1-

Dar

atil

Khoi

ri M

ukhl

is1)

, Roz

irwan

2),

dan

Muh

amm

ad H

endr

i2)

MAS

PAR

I JO

UR

NAL

Jul

i 201

8,

10(2

):151

-160

Fitri

ani e

t al.,

201

5 di

kutip

dar

i Pra

mod

Kum

ar

Pand

ey1,

2*, S

iddh

arth

a Si

ngh2

, M

ayan

glam

bam

Cha

ndra

kum

ar

Sing

h2, A

mit

Kum

ar S

ingh

2, P

ratib

ha

Pand

ey3,

Aja

i Kum

ar P

ande

y2,

Mah

esh

Path

ak4,

Muk

ul K

umar

2,

Ram

esh

Cha

ndra

Sha

kyw

ar2

and

Rag

hubi

r Kum

ar P

atid

ar2

Int.J

.Cur

r.Mic

robi

ol.A

pp.S

ci (2

017)

6(

6): 3

3-41

Nith

ya a

nd M

uthu

mar

y 20

10,

Phyt

oche

m R

ev.

Sprin

ger S

cien

ce +

Bus

ines

s M

edia

D

or d

rech

t 201

2

Antim

icro

bial

age

nt

Antib

akte

ri te

rhad

ap

E. c

oli d

an S

. au

reus

.

Antib

acte

rial

Antib

akte

ri

Belu

m d

iketa

hui

Belu

m d

iketa

hui

Qui

nolin

ecar

boni

trile

an

d bo

ric a

cid

Terp

enoi

d

Bac

illus

am

ylol

ique

faci

ens

and

Pse

udom

onas

spe

cies

Fusa

rium

sp.

, Pen

icill

ium

sp.

da

n A

sper

gillu

s sp

.

She

wan

ella

sp.

and

P

seud

omon

as s

p

Pho

mop

sis

sp.

Leaf

tiss

ues

of

Hyp

tis s

uave

olen

s

Man

grov

e (a

kar,

bata

ng d

an d

aun)

.

Age

ratu

m c

onyz

oide

s

Plu

mer

ia a

cutif

olia


Zhao

et a

l. 20

10Ph

ytoc

hem

Rev

.Spr

inge

r Sci

ence

+

Busi

ness

Med

ia D

or d

rech

t 201

2

Tayu

ng e

t al.

2011

Phyt

oche

m R

ev.

Sprin

ger S

cien

ce +

Bus

ines

s M

edia

Dor

dre

cht 2

012

Cui

et a

l. 20

08Ph

ytoc

hem

Rev

.Spr

inge

r Sci

ence

+

Busi

ness

Med

ia D

or d

rech

t 201

2

Dem

ain

2000

Phyt

oche

m R

ev. S

prin

ger S

cien

ce

+ Bu

sine

ss M

edia

Dor

dre

cht 2

012

Dai

sy e

t al.

2002

a, b

Phyt

oche

m R

ev. S

prin

ger S

cien

ce

+ Bu

sine

ss M

edia

Dor

dre

cht 2

012

Antib

akte

ri

Antib

akte

ri

Antib

akte

ri

Inse

ktis

ida

Inse

ktis

ida

Inse

ktis

ida

Inse

ktis

ida

Inse

ktis

ida

Ergo

sta-

5,7,

22-

trien

ol)

(C28

H44

O),

5a,8

a-ep

idi-

oxye

rgos

ta-6

, 22-

dien

-3b-

ol (

C28

H44

O3),

er

gost

a-7,

22-d

ien-

3b,5

a,6b

-trio

l (C

28H

46O

3),

and

helvo

lic a

cid

(C32

H44

O8)

1-te

trade

cene

, 8-o

cta-

deca

-non

e, 8

-pen

ta-

deca

none

, oct

ylcyc

lo-

hexa

ne, a

nd

cyclo

(pro

-Thr

),

Pera

min

e (C

12H

17N

O5),

a

pyrro

lopy

-razi

ne a

lkalo

id

Nap

htha

lene

(C10

H8)

Pic

hia

guill

erm

ondi

i Ppf

9

F. s

olan

i

Pen

icill

ium

sp.

093

5030

Neo

typh

odiu

m c

oeno

phia

lum

Neo

typh

odiu

m lo

lii

Epi

chol

e fe

stuc

ae

Epi

chol

e ty

phin

a

Mus

codo

r viti

genu

s

Par

is p

olyp

hylla

var

. yu

nnan

ensi

s

Taxu

s ba

ccat

a

Acr

ostic

hum

are

na

Ste

m a

nd le

af o

f tal

l fe

scue

, rye

gras

s an

d ot

her g

rass

es

Pau

llina

pau

llino

ides

Mikroba Endofit, Pemanfaatan Mikroba Endofit dalam Bidang Farmasi130B

ontia

dap

hnoi

des

Mur

raya

pani

cula

ta

Achn

athe

rum

ineb

rians

Van

illa

albi

ndia

(B

lum

e)

Nod

ulis

poriu

m s

p.

Gau

lther

ia p

rocu

mbe

ns

Eup

enic

illiu

m s

p.

Cla

vice

pspu

rpur

ea a

nd

Cla

vicep

scha

e-to

miu

m

Phom

opsis

arc

heri

Pho

mop

sis

sp.

Nod

ulisp

oric

acid

(C

43H

55N

O6)

(nov

el in

dole

di

terp

ene)

5-hy

drox

y-2-

(10-

hydr

oxy-

50-m

ethy

l-40-

hexe

nyl)

benz

ofur

an (C

15H

18O

3) an

d 5-

hydr

oxy-

2-(1

0-ox

o-

50-m

ethy

l-40-

hexe

nyl)

benz

ofur

an

Alan

tryph

enon

e (C

30H

25N

5O3),

Al

antry

pine

ne

(C21

H16

N4O

2),

and

Alan

tryle

unon

e (C

27H

27N

5O3)

Belu

m d

iketa

hui

Arom

atic

sesq

uite

rpen

esph

omoa

rche

rins

A –

C

nove

l xan

thon

e di

mer

s Ph

omo-

xant

hone

s A

and

B (C

38H

38O

16)

Inse

ktis

ida

Inse

ktis

ida

Inse

ktis

ida

Inse

ktis

ida

Antip

aras

it

Antip

aras

it

Dem

ain

2000

Phyt

oche

m R

ev. S

prin

ger S

cien

ce

+ Bu

sine

ss M

edia

Dor

dre

cht 2

012

Find

lay

et a

l. 19

97Ph

ytoc

hem

Rev

.Sp

ringe

r Sci

ence

+ B

usin

ess

Med

ia

Dor

dre

cht 2

012

Fabi

o et

al.

2005

Phyt

oche

m R

ev.

Sprin

ger S

cien

ce +

Bus

ines

s M

edia

D

or d

rech

t 201

2

Zhan

g et

al.

2010

a, b

Phyt

oche

m R

ev.

Sprin

ger S

cien

ce +

Bus

ines

s M

edia

D

or d

rech

t 201

2

Hem

tasi

n et

al.

2011

Phyt

oche

m R

ev.

Sprin

ger S

cien

ce +

Bus

ines

s M

edia

D

or d

rech

t 201

2

Isak

a et

al.

2001

Phyt

oche

m R

ev.

Sprin

ger S

cien

ce +

Bus

ines

s M

edia

D

or d

rech

t 201

2


Sapp

apan

et a

l. 20

08Ph

ytoc

hem

Rev

.Sp

ringe

r Sci

ence

+ B

usin

ess

Med

ia

Dor

dre

cht 2

012

Tans

uwan

et a

l. 20

07Ph

ytoc

hem

Rev

.Sp

ringe

r Sci

ence

+ B

usin

ess

Med

ia

Dor

dre

cht 2

012

Cam

pos

et a

l. 20

08Ph

ytoc

hem

Rev

.Sp

ringe

r Sci

ence

+ B

usin

ess

Med

ia

Dor

dre

cht 2

012

Mar

inho

et a

l. 20

05Ph

ytoc

hem

Rev

.Sp

ringe

r Sci

ence

+ B

usin

ess

Med

ia

Dor

dre

cht 2

012

Mar

tinez

-Lui

s et

al.

2012

Phyt

oche

m R

ev.

Sprin

ger S

cien

ce +

Bus

ines

s M

edia

D

or d

rech

t 201

2

Antip

aras

it

Antip

aras

it

Antip

aras

it

Antip

aras

it

Antip

aras

it

Antip

aras

it

11-h

ydro

xy-m

onoc

erin

(C

16H

20O

7) a

new

ana

logu

e of

m

onoc

erin

(C16

H20

O6)

12-h

ydro

xy-m

onoc

erin

nove

l ben

zoqu

inon

e m

etab

olite

s 2-

chlo

ro-5

-m

etho

xy-3

- met

hylcy

clo-

hexa

-2,5

-die

ne-1

,4-d

ione

(C

8H7C

lO3)

and

xyla

riaqu

inon

e A

viz.

coc

hlio

quin

one

A (C

30H

44O

8) an

d is

ococ

hlio

quin

one

A

A po

lyket

ide ci

trinin

(C

13H 14

O5)

preu

ssom

erin

EG

1,

palm

arum

ycin

CP2

, pa

lmar

umyc

in C

P17,

pa

lmar

umyc

in

CP1

8, C

J-12

,37,

pa

lmar

umyc

in C

P19

and

5-m

ethy

loch

raci

n

Exs

eroh

ilum

rost

ratu

m

Xyl

aria

sp.

Lei

sh- m

ania

and

Tr

ypan

osom

e

Coc

hlio

bolu

s sp

. (U

FMG

CB

-555

)

Pen

icill

ium

jant

hine

llium

Ede

nia

sp.

Ste

mon

a sp

.

Pip

tade

nia

adia

ntoi

des

Mel

ia a

zeda

rach

Pet

rea

volu

bilis


Vig

uier

a ar

enar

ia

the

leav

es o

f Oak

tree

s (Q

uerc

us c

occi

fera

)

Uni

dent

ified

tree

on

Jian

feng

Mou

ntai

n,

Chi

na

Gar

cini

a sp

.

Myc

osph

aere

lla s

p. a

nd

Psy

chot

ria h

oriz

onta

lis

Pho

mop

sis

sp.

Scy

tona

ema

sp.

endo

phyt

ic fu

ngi

Pul

lula

ria s

p.

BC

C 8

613

Pes

talo

tiops

isth

eae

Pho

mop

sis

sp.

cerc

ospo

rin

3,4-

dim

ethy

l-2-(4

0-hy

drox

y-30

,50-

dim

e-th

oxyp

heny

l) -5

-met

hoxy

-te

trahy

drof

uran

Cyt

onic

acid

A (

C32

H36

Hin

nuliq

uino

ne

(C32

H30

N2O

4)

Pullu

larin

s A–

D

(cyc

lohe

xa-

deps

ipep

tides

)

Pest

alot

heol

C

Phom

oxan

thon

e A

and

B

Antip

aras

it

Antip

aras

it

Antiv

iral

Antiv

iral

Antiv

iral

Antiv

iral

Antit

uber

cula

r

Mor

eno

et a

l. 20

11Ph

ytoc

hem

Rev

.Sp

ringe

r Sci

ence

+ B

usin

ess

Med

ia D

or d

rech

t 201

2

Verz

a et

al.

2009

Phyt

oche

m R

ev.

Sprin

ger S

cien

ce +

Bus

ines

s M

edia

Dor

dre

cht 2

012

Guo

et a

l. 20

00Ph

ytoc

hem

Rev

.Sp

ringe

r Sci

ence

+ B

usin

ess

Med

ia

Dor

dre

cht 2

012

Sing

h et

al.

2004

Phyt

oche

m R

ev.

Sprin

ger S

cien

ce +

Bus

ines

s M

edia

D

or d

rech

t 201

2

Isak

a et

al.

2007

Phyt

oche

m R

ev. S

prin

ger S

cien

ce +

Bu

sine

ss M

edia

Dor

dre

cht 2

012

Li e

t al.

2008

a, b

Phyt

oche

m R

ev.

Sprin

ger S

cien

ce +

Bus

ines

s M

edia

D

or d

rech

t 201

2

Isak

a et

al.

2001

Phyt

oche

m R

ev.

Sprin

ger S

cien

ce +

Bu

sine

ss M

edia

Dor

dre

cht 2

012


Ruk

acha

isiri

kul e

t al.

2008

Phyt

oche

m R

ev.

Sprin

ger S

cien

ce +

Bus

ines

s M

edia

D

or d

rech

t 201

2

Sona

imut

hu e

t al.

2011

Phyt

oche

m R

ev.

Sprin

ger S

cienc

e +

Busin

ess

Med

ia D

or d

rech

t 201

2

Bung

ihan

et a

l. 20

11Ph

ytoc

hem

Rev

.Sp

ringe

r Sci

ence

+ B

usin

ess

Med

ia

Dor

dre

cht 2

012

Antit

uber

cula

r

Antit

uber

cula

r

Antit

uber

cula

r

Phom

oena

mid

e an

d Ph

omon

itroe

ster

Tenu

azon

ic a

cid

(C10

H15

NO

3)

Benz

opyr

anon

es

diap

orth

eone

A

and

B

Pho

mop

sis

sp.

Dia

porth

e sp

.

Gar

cini

a du

lcis

Alte

rnar

ia a

ltern

ata

Pan

danu

s am

aryl

lifol

ius


1. Anonim.http://bisnisfarmasi.wordpress.com/2008/10/13/bahan-baku-farmasi-90%impor.

2. Direktorat Jenderal pengawasan Obat. Materia Medika Indonesia. Jakarta, Departemen Kesehatan Republik Indonesia. 1977; xi, 24.

3. Radji M. Peranan bioteknologi dan mikroba endofit dalam pengembangan obat herbal. Majalah Ilmu Kefarmasian. 2005; II(3): 113-126.

4. URL: http://www. Atmosukarto I. Pengakuan untuk pemburu mikroba. Diakses 10 Februari 2005.

5. Basuki T, Kardono LBS, Wahyuni WT, Dewi RT dan Tachibana S. Isolasi kapang endofitik penghasil Taxol dari tanaman Taxussumatrana (Miquel) Laubenfels. Tumbuh di Kebun Raya Cibodas Jawa Barat. Dalam Seminar Nasional ke-V jaringan kerja sama kimia, 26-27 Maret 2001.

6. Kusari S, Hertweck C, Spiteller M. Chemical Ecology of Endophytic Fungi: Origins of Secondary Metabolites. Cell Press. Chemistry & Biology 2012; 19(7) : 792-798.

7. Song Y, Isolation and cultivation of endophytic fungi, Proceeding of International Conference on Asian network on Microbial Researches. Feb’98 GMU Yogyakarta, Indonesia; 255 – 258.

8. Taechowisan T, Wanbanjob A, Tuntiwachwuttikul P and Liu J. Anti- inflammatory activity of lansais from endophytic Streptomyces sp SUCI in LPS –induced RAW 264.7 cells. Food and Agricultural Immunology. 2009; 20 (1): 67-77.

9. Wahyudi P. Teknik Skrining terhadap mikroba endofitik penghasil antibiotik baru. Dalam : Prosiding temu ilmiah jaringan kerjasama kimia Indonesia. Seminar Nasional II Kimia dalam Pembangunan Jaringan Kimia Indonesia, 5-6 Mei 1998, Yogyakarta. 316-325.

10. Petrini O, Sieber TN,TotiL, Viret O. Ecology, metabolite production, and substrate ultilization in Endophytic fungi. Natural Toxin.1992; 185-196.

daftar ruJukan


11. Weber D, Sterner O, Anke T, Gorzalczancy S, Martino V, and Acevedo C. Phomol, a new antiinflamatory metabolite from an endophyte of medicinal plant Erythrina crista-galli. J. Antibiot. 2004; 57 (9):559-563.

12. Tong WY, Darah I, and Latiffah Z. Antimicrobial activities of endophytic fungal isolates from medicinal herb Orthosiphon stamineus Benth. Journal of Medicinal Plants research. 2011; 5(5): 831-836.

13. Pelczar MJ Jr, Chan ECS, Krieg NR. Microbiology Concepts and applications. Mc Graw-Hill.Inc. New York. 1993; 66-68

14. Fardiaz S. Mikrobiologi Pangan I. Diterbitkan bekerja sama dengan Pusat Antar Universitas Pangan dan Gizi Institut Pertanian Bogor. Jakarta: Penerbit PT GramediaPustakaUtama; 1992. :97-117 dan 180- 226.

15. Gandjar I, Sjamsuridzal W dan Oetari A. Mikologi Dasar dan Terapan. Editor Roosheroe IG, Sjamsuridzal W. Penerbit : Yayasan Obor Indonesia, Jakarta, 2000;1-7, dan 170-177.

16. Rekha, Jyoti K, Bala M and Arya V. Endophytic fungus : a potential source of biologically synthesized nanoparticle. Basic Research Journal of Microbiology. 2013;(1) 1-7.

17. Markham SA and Pirelli G. Endophyte Toxins in Grass Seed Fields and Straw. EM 8598,june 1995. Diakses 7/9/2003. http://www.forages.css. orst.edu/Tropics/Pastures/Species/Grasses/Animal_issue/Endophyte

18. http://www.aboutrtf.com/endophyte_leaf.html diakses 3-januari-201419. Selim KA, El-Beih AA, AbdEL-Rahman TM and El-Diwan AI. Biodiversity

and antimicrobial activity of endophytes associated with Egyptian medicinal plants. Mycosphere. 2011; 2(6): 669-678.

20. Freeman DW, Pratt PW, and Woods RL. Fescue Toxicity and horses, Current report, Oklahoma Coorperative Extension service (OCU)39917-1 – 4.

21. ftompson FN and Stuedemann. Pathophysiology of Fescue toxicosis. Agriculture, Ecosystems and environment. 1993; (44) : 263-281.

22. Latch Garrick CM.Physiological Interactions of endophytic fungi and their hosts Biotic stress tolerance imparted to grasses by rndophytrs. Agriculture, Ecosystems and environment. 1993; (44): 143-156.

23. Stone JK, Bacon CW, White JF. An Overview of Endophytic Microbes: Endophytism Defined. in Microbial Endophytes. Editor: Bacon CW, White JF. Marcel Dekker Inc. New Jersey. 2000 ; 3-29.

24. Cappuccino JG, Sherman N. Micrbiology A Laboratory Manual. Eighth Edition. Pearson Benjamin Cummings, San Francisco. 2008;73-78, 283-292.


25. Strobel GA, Hess WM, Ford E, Sidhu RS, and Yang X.Taxol from fungal endophytic and the issue of biodiversity. Journal of Industrial Microbiology. 1996; 17 : 417-423.

26. Strobel GA. Microbial gifts from rain forest: Symposium contribution, Can J Plant Pathol.2003;24 : 14-20.

27. Judoamidjojo M, Darwis A A, Said EG. TeknologiFermentasi, Bogor. PAU, Biotechnologi IPB.1992; 45 – 56, 79 - 147.

28. Pratiwi ST. Mikrobiologi Farmasi, Penerbit Erlangga. Jakarta, 2008; 120 – 134.

29. Torsell KBG, Natural product chemistry. a mechanistic and biosynthetic approach to secondary metabolism, New York; John Wiley and Sons Limited. 1983;1–25.

30. Willey JM, Sherwood LM, Woolverton CJ. Prescott ’s Principles of Microbiology. MC Gra-Hill, Higher Education. 2009;370-374.

31. Luckner M. Secondary metabolism in microorganisms, plants, and animal, Springer-verlag Second edition.1984;2 – 24.

32. Rosa LM, Tabanca N, Techen N, Pan Z, Wedge DE and Moraes RM. Antifungal activity of extract from endophytic fungi associated with Smallanthus maintained in vitro as autotrophic cultures and as pot plants in the green house. Can. J Microbiol. 2012; 58: 1202-1211.

33. Strobel GA and Long DM. Endophytic microbes embody pharmaceutical potential. ASM news. 1998; 64(5): 263-268.

34. Bacon CW. Procedure for isolating the endophytic from Tall Fescue and screening isolates for ergot alkaloid. Appl. Env.Microbial. 1988; 54:126,2615 -2618.

35. Lu H, Zou WX, Meng JC, Hu J. and Tan RX, New bioactive metabolites produced by Colletotrichum sp. An endophytic fungus in Artemisia annua . Plant Science. 2000;51: 67 – 73.

36. Pavithra N, Sathish L, Ananda K. Antimicrobial and enzyme activity of endophytic fungi isolated from Tulsi. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Sciences (JPBMS). 2012; 16 (issue 16): 1-6.

37. Bandara WMMS, Seneviratne D, and Kulasooriya SA. Interactions among endophytic and fungi : effects and potentials. J. Biosci. 2006. 31 (5): 645-650.

38. Saithong P, Panthavee W, Stonsaovapak S, Congfa L. Isolation and primary identification of endophytic fungi from Cephalotaxus manii trees. Maejo Int. J. Sci. Technol. 2010; 4(03): 446-453.


39. www.Oxoid.com. OXOID MICROBACTTM GNB KITS40. Microgen Bioproducts LTD Microgen® GNA + B –ID. An identification

system for all currently recognized enterobacteriaceae and an extensive range of oxidase- positive bacilli. www.microgenbioproducts.com. Diaksestanggal 21 agustus 2013

41. Lay BW. Analisismikroba di laboratorium. Jakarta: PT. Raja Grafindo Persada. 1994; 113 – 118.

42. Ganjar I, Samson RA, Tweel-Vermeulen Kvd, Oetari A, Santoso I. Pengenalan Kapang Tropik Umum, Yayasan Obor Indonesia. 1999:1-7.

43. Gao XX, Zhou H, Xu DY,Yu CH, Chen YQ, Qu LH. High diversity of endophytic fungi from the pharmaceutical plants, Heterosumilax japonica Kunth revealed by cultivation - independent approach.FEMS Microbiology Letters. 2005. http://dx.doi.org/10.1016/j.femsle.2005. 06.017 (diambil dari IRJP 2013;4(6).

44. Robert Kranz, Kathleen Weston-Hafer, and Eric Richards. Identifying Unknown Bacteria Using Biochemical and Molecular Methods. 2006. Diakses dari http://www.nslc.wustl.edu/elgin/genomics/bio3055/idunknbacteriah06.pdf?. Tanggal 7 Mei 2013.

45. Qiagen. DNeasy Blood and Tissue Handbook - English (PDF). 2013 [cited 2013 September 3]; Available from: http://www.qiagen. com/Products/Catalog/Sample-Technologies/DNA-Sample-Technologies/ Genomic-DNA/DNeasy-Blood-and-Tissue-Kit. 18, 28-30, 44.

46. Janda MJ and Abbott SL. 16S rRNA Gene Sequencing for Bacterial Identification in theDiagnostic Laboratory: Pluses, Perils, and Pitfalls. Journal. Of Clinical Microbiology. 2007; 4;5(9): 2761-2764.

47. Sanger F, Coulson AR “A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase”. J. Mol. Biol.1975; 94 (3): 441–448.

48. Sanger F, Nicklen S, Coulson AR). “DNA sequencing with chain- terminating inhibitors”. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1977; 74 (12): 5463–5467.

49. Cold Spring Harbor Laboratory. Cycle Sequencing Animation Library. 2013. Diambil dari http://www.dnalc.org/resources/animations/cycseq.html diakses tanggal 7 Mei 2013.

50. National Library of Medicine. BLAST program selection guide. 2013. Diambil dari: URL: http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?CMD=Web&P AGE_TYPE=BlastDocs&DOC_TYPE=Prog Selection Guide Diakses tanggal 7 Mei 2013.


51. Roosheroe IG, Sjamsuridzal W dan Oetari A. Mikologi dasar dan Terapan. Edisi Revisi. Penyunting Roosheroe IG. Penerbit: Yayasan Pustaka Obor Indonesia, Jakarta, 2014; 173 – 180.

52. Rahman A. Teknologi Fermentasi, PAU Pangan dan Gizi, IPB, Bogor. 1989; 1 – 9.53. Stanbury PF and Whitaker A . Principles of fermentation Technology,

Pergamon Press .1984; 1 - 9, 74-90.54. Cheepthan N., Phay N., Hugashiyama T, Fukushi E., Matsuura H, Mikawa T,

et al. Studies on antifungi antibiotic from Ellisiodothisinguinamas L1588-A8; ftai J Biotechnol. 1999; 9 : 37-45.

55. Harbone BJ. Metodefitokimia, penuntuncara modern menganalisa tumbuhan, cet ke 2 Penerbit ITB. 1996;1 – 40.

56. Fried B, Sherman J, Chromatographic Science series vol 66 ftin Layer Chromatography Technique & Applications, ftird ed. New York. Rusted and expected. Easton Pensylvania. 1994; 3-12.

57. Skoog DA and Leary JJ. Principles of Instrumental Analysis. Saunders College Publishing, Fourth edition. 1992; 628 – 669.

58. Jawetz, Melnick&Adelberg’s,. Medical Microbiology, 23th edition, Appleton and Lange Medical Book. Editors. Brooks GF, Butels JS, Morse SA. International Edition. New York. 2004; 167-68.

59. Syamsudin. Teknik Bio assay untuk pengembangan obat bahan alam. UniversitasPancasila Jakarta. 2012; 23-24; 35-37;72-74; 90-91; 97- 104; 109-112;117-119.

60. http://aguskrisnoblog.wordpress.com/2011/01/14/pemanfaatanMikroorgan ismesebagaiIndikatorUji diakses 19-11-2013

61. Sunitha VH, Devi D N, and Srinivas C. Extracellular enzymatic of endophytic fungal strain isolated from Medicinal Plants. World Journal of Agricultural Sciences. 2013; 9(1) : 01-09.

62. Pandi M, Kumaran RS, Choi YK, Kim HY, and Muthumary J. Isolation and detection of Taxol, an anticancer drug produced from Lasiodiplodiatheobromae, an endophytic fungus of the medicinal plant Morinda citrifolia. African Journal of Biotechnology. 2011; 10 (8):1428- 1435.

63. Kumala S, Utji R, Sudarmono P and Kardono LBS. Cytotoxic secondary metabolite from fermentation broth of Brucea javanica endophytic fungus 1.2.11. Research journal of Microbiology. 2007; 2(8): 625-631.

64. Kumala, S., Septisetyani EP, Meiyanto E. Cytotoxic Effect of Secondary


Metabolites produced by Endophytic Fungi 1.3.11, 1.1.6, 1.2.6.Isolated from the fruit of Tanaman Buah Makassar (Brucea javanica (L) Merr on in-vitro T47D and MCF7 Intact cell and identification of the fungus 1.3.11 by Ribosomal DNA sequence analysis. International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences. 2010 ; 2 : 80-83.

65. Asker MMS, Mohamed SF, Mahmoud MG, El Sayed OH, Antioxidant and antitumor activity of a new sesquiterpene isolated from endophytic fungus Aspergillus glaucus. International Journal of Pharm Tech. Research. 2013; 5 (2): 391-397.

66. Giridharan P, Verekar SA, Khanna A, Mishra PD and Deshmukh SK. Anticancer activity of scelotiorin isolated from an endophytic fungus Cephalotheca faveolata Yaguchii, Nishim and Udagawa. Indian Journal Experimental Biology.2012; 50(7): 464-468.

67. Lakshmi PJ, Selvi KV. Anticancer potentials of secondary metabolites from endophytes of Barringtonia acutangula and its molecular characterization. Int. J. Curr. Microbiol. Appl. Sci. 2013; (2): 44-55.

68. White JF, Breen JP, and Jones GM, Substrate ultilization selected Acremonium, Atkinsonella and Balansia Species. Mycologia. 1991; (83): 601-610.

69. Jeffrey LSH, Son R, and Tosiah S. Preliminary screening of endophytic fungi isolated from Medicinal plants at MARDI Sessang, Serawak for their bioactivity. J. Trop. Agric, and Fd, Sc, 2008; 36(1):121- 126.

70. Zaidi KU, Mani A, Ali AS, and Ali SA. Evaluation of Tyrosinase Producing Endophytic Fungi from Calotropis gigantea, Azadirachta indica, Ocimum tenuiflorum and Lantana camara. Annual Review and research in Biology. 2013;. 3(4):389-396.

71. Artanti N, Tachibana S, kardono LBS, and Sukiman H. Isolation of a glucosidase inhibitors produced by an Endophytic Fungus, Colletotrichum sp. TSC13 from Taxus sumatrana. Pakistan Journal of Biological Sciences. 2012; 15(14): 673-679.

72. Dompeipen E, Srikandace Y, Suharso WP, Cahyana H and Simanjuntak P. Potential Endophytic microbes selesction for Antidiabetic bioactive compounds production. Asian Journal of Biochemistry. 2011; 6(6): 465-471.

73. Zhang B, Salituro G, Szalkowski D et al. Discovery of small molecule insulin mimetic with antidiabetic activity in mice. Science. 1999; (284): 974-981.

74. Castillo UF, Strobel GA, Ford EJ, et al. Munumbicins, wide–spectrum antibiotics produced by Streptomyces NRRL 30562, Endophytic on Kennedia


nigriscans. Microbiology. 2002; (148) : 2675-2685.75. Radji M, Sumiati A, Rachmayani R, and Elya B. Isolation of fungal endophytes

from Garcinia mangostana and their antibacterial activity. African Journal of Biotechnology. 2011; 10.(1) : 103-107.

76. Wahyudi P dan Hendriana M. Isolasi mikroba endofitik dari tumbuhan Quisqualis indica L dan uji potensinya dalam menghasilkan senyawa antimikroba. Jurnal Ilmu Kefarmasian. 2003; 1(1) : 15-18.

77. Vaz ABM, Brandao LR, Vieira ML, Pimenta RS, Morais PB et al. Diversity and antimicrobial activity of fungal endophyte communities associated with plants of Brazilian savanna ecosytems. African Journal of Microbiology Research. 2012 6(13): 3173-3185.

78. Idris Al-mahi, Al-tahir I and Idris E, Antibacterial activity of endophytic fungi extracts from the medicinal plant Kigelia Africana. Egypt. Acad. J.Biolog, Sci, 2013; 5(1): 1-9.

79. Bungihan ME, Tan MA, Takayama H, Edison TE, Cruz dela and Nonato MG. A new macrolide isolated from the endophytic fungus Colletotrichum sp. Philippine Science Letters. 2013;5 (1):57-73.

80. Rhoden SA, Garcia A, Bongiorno VA, Azevedo JL and Pamphile JA. Antimicrobial activity of crude extract of Endophytic fungi Isolated from Medicinal Plana Trichilia elegans A. Juss. Journal of Applied Pharmaceutical Science. 2012; 02 (08): 57-59.

81. Qadri M, Johri S, Shah BA, Khajuria A, Sidiq T, Lattoo SK, Abdin MZ et al. Identification and bioactive potential of endophytic fungi isolated from selected plants of the western Himalayas. Springer Plus.2013; 2(8):1-14. http://www.springerplus.com/conent /2/1/8 .

82. Powthong P, Jantrapanukorn B, ftongmee A and Suntornthiticharoen P. Evaluation of endophytic fungi extract for their antimicrobial activity from Sesbania grandiflora (L) Pers. Int J. Pharm Biomed, Res.2012;3(2):132-136.

83. Tayung K, Barik BP, Jha DK, Deka DC. Identification and characterization of antimicrobial metabolite from an endophytic fungus, Fusarium solani isolated from bark of Hamalayan yew. Mycosphere. 2011;2 (3): 203-213.

84. Ramos HP, Braun GH, Pupo MT and Said S. Antimicrobial activity from Endophytic fungi Arthrinium state of Apiospora montagnei Sacc and Papulaspora immerse. Brazilian Archives of Biology and Technology.2010; 53(3):629-632.

85. Devaraju R, Satish S .Endophytic mycoflora of Mirabilis jalapa L, and studies


on antimicrobial activity of its endophytic Fusarium sp. ASIAN J. EXP BIOL. SCI.2011; 2(1): 75-79.

86. Sadananda TS, Nirupama R, Chaithra K, Govindappa M, Chandrappa CP and Vinay RB. Antimicrobila and antioxidant activities of Endophytes from Tabebuia argentea and identification of anticancer agent (lapachol). Journal of Medicinal Plants Research. 2011;5 (6): 3643-3652.

87. Jalgaonwala RE, Mohite BV and Mahajan RT. Evaluation of endpphytes for their Antimicrobial activity from Indigenous Medicinal Plants belonging to Nort Maharashtra region India. . International Journal on Pharmaceutical and Biomedical Research (IJPBR)2010; 1(5):136-141.

88. Noverita, Fitria D, Sinaga E. Isolasi dan Uji aktivitas antibakteri jamur endofit dari daun dan rimpang. Jurnal Farmasi Indonesia. 2009. 4 (4) : 171-176.

89. Sugijanto NE, Anggraeny D dan Zaini NC. Isolation and antimicrobial activity of endophytic fungi Kabatiella caulivora var B isolated from Alyxia reinwardtii BL. Proceeding International conference on Pharmacy and Advanced Pharmaceutical Sciences, Yogyakarta. Indonesia, 2009; 15-17.

90. Utami U. Isolation, identification and antimicrobial activities selection of endophytic bacterial from Mangrove plantation Brugulera gymnorrhiza. International Journal of Academica Research. 2011; 3 (1): 187-194.

91. Pal A, Chattopadhyay A ,Paul AK. Diversity and antimicrobial spectrum of endophytic bacteria isolation from Paederia foetida L. International Journal of Current Pharmaceutical Research. 2012; 4( 5):123-127.

92. Wu QY, Jia JQ, Tan GX, Yan H, and Gui ZZ. Isolation and characterization of an antimicrobial endophytic bacterium ME-2 from Mulberry twig in China. African journal of Microbiology Research . 2012;6 (35): 6462-6467.

93. Kumar S, Kaushik N. Endophytic fungi isolated from oil-seed crop Jatropha curcas produces oil and exhibit antifungal activity. Plos one/ www.plosone.org. 2013;(8)2:e56202.

94. Strobel G, Daisy B, Castillo U. fte biological promise of microbial endophytes and their natural products. Plant Pathology Journal 2005; 4(2): 161-176.

95 . Taechowisan T, Chanaphat S, Ruensamran W, Phutdhawong WS. Antifungal activity of 3-methylcarbazoles from Streptomyces sp LJK109; an endophyte in Alpinia galanga. Journal of Applied Pharmaceutical Science. 2012; 2(3): 124-128.

96. Joseph B and Priya R M., Bioactive compounds from endophyt and their potential in pharmaceutical effect : A review.American journal of Biochemistry


and Molecular Biology.2011. 1(3) : 291-309.97. Zhang G, Sun S, Zhu T, Lin Z, Gu J, et al. Antiviral isoindolone derivatives from

an endophytic fungus Emericella sp associated with Aegiceras corniculatum. Phytochemistry 2011; doi:10.1016/J. Phytochem.2011,04-014. (article in press).

98. Huang WY, Cai YZ, Hyde KD, Corke H, Mei S. Endophytic fungi from Nerium Oleander L ( Apocynaceae ) : main constituents and antioxidant activity. World J. Microbiol Biotechnol. 2007; 23 : 1253-1263.

99. Deshmukh SK, Mishra PD, Almeida AK, Verekar S, Sahoo MR, et al. Anti-imflammatory and anticancer activity of ergoflavin isolated from an endophytic fungus. Chemistry and Biodiversity. 2009; (6) : 784-789.

100. Taechowisan T, ChanaphatS, Ruensamran W and Phutdhawong WS. Anti-inflammatory effect of 3-Methylcarbazoles on Raw 254,7 cells stimulated with LPS, Polyinosinic –Polycytidylic Acid and Pam 3 CSK. Advances in Microbiology. 2012; 2: 98-103.

101. Simanjuntak P, Bustanussalam, Otovina DM, Rahayuningsih M. dan Said EG. Isolasi dan identifikasi artemisin dari hasil kultivasi mikroba endofit dari tanamanan Artemisia annua. [Studi mikroba endofitik tanaman Artemisia spp.(3)]. Majalah Farmasi Indonesia 2004; 15(2):68- 74.

102. Scherlach K and Hertweck C. Triggering cryptic natural product biosynthesis in microorganisms. Org Biomol, Chem 2009; 7:1753- 1760.

103. http://mot.farmasi.ugm.ac.id/file/29reviewendophyte.pdf.diakses September 2011.

104. Bader j, Mast-Gerlach E, Popovic MK, Bajpai R and Stahl U. Relevance microbial coculture fermentation in biotechnology. Journal of applied Microbiology.2010; (109): 371-387.

105. Harni R dan Supramana dan Supriadi. Potential use of endophytic bacteria to control Pratylenchus brachyurus on Patchouli. Indonesian Journal of Agricultural science 13(2).2012: 86-95.

106. Harni R, Supramana, Sinaga MS, Giyanto dan Supriadi. Mekanisme bakteri endofit mengendalikan nematoda Pratylenchus brachyurus pada tanaman Nilam. Bul.Litro.Vol.23 No.1, 2012,102-144.

107. Munif A dan Harnin R. Keefektifan bakteri endofit untuk mengendalikan nematoda parasit Meloidogyne incognita pada lada. Buletin RISTRI. Vol 2 (3) 2011

108. Harni R dan Samsudin. Pengaruh formula Bionematisida bakteri endofit


Bacillus sp terhadap infeksi nematoda Meloidogyne sp. pada tanaman kopi. J. TIDP 2(3),143-150 November, 2015.

109. Harni R dan Khaerati. Evaluasi bakteri endofit untuk pengendalian nematoda Pratylenchus coffeae pada tanaman kopi.Buletin RISTRI 48(2):109-116.

110. Zahara N, Soekarno PW*, Munif A. Metabolit Bakteri Endofit Asal Tanaman Kacang sebagai Penghambat Pertumbuhan Aspergillus flavus. Jurnal Patologi Indonesia Volume 14, Nomor 1, Januari 2018. Halaman 15–22. DOI:10.14692/jfi.14.1.15

111. Das I, Panda MK, Rath CC, Tayung K*. Bioactivities of bacterial endophytes isolated from leaf tissues of Hyptis suaveolens against some clinically significant pathogens. Journal of Applied Pharmaceutical Science Vol. 7 (08), pp. 131-136, August, 2017. Available online at http://www.japsonline.com. DOI: 10.7324/JAPS.2017.70818. ISSN2231- 3354.

112. Mukhlis DK, Rozirwan, dan Hendri M. Isolasi dan Aktivitas Antibakteri Jamur Endofit pada Mangrove Rhizophora apiculata dari Kawasan Mangrove Tanjung Api-Api Kabupaten Banyuasin Sumatra Selatan. MASPARI JOURNAL Juli 2018, 10(2):151-160.

113. Pandey PK*, Singih S, Singih MC, Singih AK, Pandey P, Pandey AK, Pathak M, Kumar M, Shakywar RC and Patidar RK. Inside the Plant : Bacterial Endophytes and their Natural Products. Int.J.Curr.Microbiol.App.Sci (2017) 6(6): 33-41.

114. Kaul S, Gupta S, Ahmed M, Dhar MK. Endophytic fungi from medicinal plants : a treasure hunt for bioactive metabolites Phytochem Rev . Published online 2017.

115. Chatterjee S, Ghosh R, Mandal NC. Production of bioactive compounds with bactericidal and antioxidant potential by endophytic fungus Alternaria alternata AE1 isolated from Azadirachta indica A. Juss. PLOS ONE | https://doi.org/10.1371/journal.pone.0214744 April 4, 2019 1 / 18.

116. Minarni, Artika I M, Julistiono H, Bermawie N, Riyanti E I, Hasim, Hasan AE Z. Anticancer activity test of ethyl acetate extract of endophytic fungi isolated from soursop leaf (Annona muricata L.) Asian Pacific Journal of Tropical Medicine. journal homepage: http://ees.elsevier.com/apjtm Original research http://dx.doi.org/10.1016/j.apjtm.2017.06.004.

117. Mane RS and Vedamurthy AB The fungal endophytes: Sources and future prospects. Journal of Medicinal Plants Studies 2018; 6(2): 121-126. ISSN (E): 2320-3862 ISSN (P): 2394-0530 NAAS Rating: 3.53 JMPS 2018; 6(2): 121-


126 © 2018 JMPS.118. Das I, Panda MK , RathCC, Tayung K. Bioactivities of bacterial endophytes

isolated from leaf tissues of Hyptis suaveolens against some clinically significant pathogens. Journal of Applied Pharmaceutical Science Vol. 7 (08), pp. 131-136, August, 2017. Available online at http://www.japsonline.com. DOI: 10.7324/JAPS.2017.70818. ISSN 2231-3354.

119. Amir Hassan, and Himayat Ullah. Antibacterial and Antifungal Activities of The Medicinal Plant Veronica biloba. Hindawi. Journal of Chemistry Volume 2019, Article ID 5264943, 7 pages. https://doi.org/10.1155/2019/5264943.

120. Suganda AG, Sukandar EY, dan Rahman AA. Aktivitas Antibakteri dan Antifungi Ekstrak Etanol Daun Allamanda cathartica L. dan Allamanda neriifolia HOOK. Jurnal Bahan Alam Indonesia 2003. vol.2, No.3 : 85 –88


Symbols16S rRNA 48α-glikosidase 74

A

Acamptothecin 33Acidic electrolyzed water 43 Acremonium 20, 21Acremonium coenophiliam 30Acremonium sp 29Actinomycetes 15, 96Acuminata 33Aegiceras corniculatum 92Agar-overlay 73Aktivitas lakase 82Aktivitas proteolitik 82Aktivitas selulase 82Aktivitas untuk anti kanker 75 Alfa glukosidase 88Aloe vera L 90Alpinia calcarata Roscoe 87 Alpinia galanga (L) 91 Alternaria alternata 21, 90, 93Alternaria destruens 91Alternaria porri 91Alternaria sp 91Alyxia reinwardtii BL 90

indEX

Amilase 23Andrograhia paniculata Ness 88 Angiosperma 20Antagonisme berimbang 32Antibakteri 23, 89Antidiabet 23Antiinflamasi 23Antijamur 23Antikanker 23Antiserangga 29Apiospora montagnei Sacc 90Artemisia annua 93Artemisia sp 89, 92Arthipyrenia plumbaria 22Ascomycetes 21Ascomycetous 20Ascomycota 17, 19Aspergillus avamori 92Aspergillus flavus 88Aspergillus nidulans 38Aspergillus niger 90, 92, 93Aspergillus sp 88, 90Aspergilus glaucus 86Azadirachta indica 87

B

Barringtonia acutangula 86


Basidiomycota 18, 19Bacillus subtilis, 89Bignoniaceae 90Bixa orellana L 87 Botryosphaeria parva 86 Brucea javanica L (Merr) 86 Brugulera gymnorrhiza 91Bryophyta 21Burkholderia 38

C

C. albicans 89, 91 Calophyllum nophyllum L 87 Camptotheca acuminata 33 Camptothecin 33 Catharanthus roseus L 87 Cathepsin K inhibitor 38 Cephalolotaxus hainanensis 86Cephalolotaxus harringtonia 86Cephalolotaxus mannii 86Cephalolotaxus oliveri 86Cephalotheca faveolata 86Chaetomium chiversii 96Chaetomium sp 91, 92Chytridiomycota 18Cladosporium sp 88Cladosporium spp 21Cladosporium tenuissimum 21Claviceps purpurea 22Clavicipitaceae 19, 21Cochliobolus sp 91Cochliobolus spicifer 92Collectotrichum gloeosporioides 86, 89, 92

Colletotrichum musase 92Colletotrichum sp 89Colletotride 89Colletrotrichum truncatum 91Cordyceps memorabilis 89C. tropicalis 89 Curcuma longa L 92 Curvularia lunata 88 Curvularia sp 91

D

Deuteromycota 18Diaporthe phaseolorum 89Difusi Cakram 70Dothideomycetes sp 89Dothiorelone C dan cytosporone dari kapang Chaetomium globosum 89DPPH (1,1-diphenyl- 2picrylhydrazyl radical) 77, 78

E

Emericella sp 92Enzim amilolitik 82 Enzim lisosom sel 83 Enzim xylanase 87Enzyme lipolitik 82Epichloë festucae 33Epicocum purpurascens 21Erythrina crista-galli 93Escherichia coli 89Eucalyptus globulus 92


F

Fase log 25Fase stationary 25Fermentasi 61, 63, 64, 65Fermentasi diam 63Fermentasi goyang 63Fescue toxicosis 22Festuca arundinacea Schreb 22Fusarium chlamydosporum 86Fusarium moniliforme 21Fusarium oxysporium 92Fusarium proliferatum 91Fusarium redolens 92Fusarium solani 33, 89Fusarium sp 91

G

Garcinia mangostana 88Giberella sp 91Graminacoccus 21Guignardia comellia 91

H

Haemophilus spp 71Homoserine 35

I

Ipomoea batatas 86

K

Kabatiella caulivora var B 90 Kapang Endofit 16Kennedia nigriscans 89Kigelia africana (Lam) Benth 88

L

Lantana camara 87Lapachol 93Lasiodiplodia theobromae 85Lecanoric acid 38Lichenes 21Lolium perenne 33

M

Maytansinoids 35McFarland 0,5 70Metabolit primer 26Metabolit Sekunder 93 Metoda biru tripan 74 Metode Bioautografi 73Metode dilusi 72Microgen(R) GN A + B- ID 47 Microsclerotia 20Mimosops elengi 93 Mirabilis jalapa L 90 Monochaetia sp 85Morinda citrifolia 85MTT 75Mulberry 91


Myciaria floribunda 88Mycorrhizae 15Mycorrhizal 38

N

Naphthoquinone 93 Naphthoquinone (lapachol alami) 90 Nectria hematococca 34Neoryphodium spp 21Neotyphodium lolii 36Nerium oleander 92N. gonorrhoeae 73Nigrospora oryzae 91Nycoglaena subcoerulescens 22

O

Ocimum species 89Ocimum tenuiflorum 87Ophiorrhiza japonica 34Orthosiphon spicatus 88

P

Paederia foetida L 91Pandanus amaryllifolius 89Papulaspora immersa 90Paraphaeosphaeria quadriseptata 96 PCR (Polymerase Chain Reaction) 97 Pektinolitik 82

Pembeku-keringan 58Penicillium fumicalsuri 92Penicillium sclerotiorum 86Pestalotiopsis 85Petriella sp 92Pewarnaan Giemsa 80P. falciparum 80PFGE (Pulsed Field Gel Electrophoresis) 97Phanoceros laevis 21Phomopsis sp 89Phytopatogenik 91Picorhisa sp 89Pinus roxbergii 92Piper crocatum L 88Pongamia glabra vent (familia Legu- minoseae) 92Pseudocercosporella trichachincola 21Pseudomassaria sp 88

Q

Quisqualis indica L 88

R

Rhizomatous Tall Fescue 19Rhizopus microsporus 38Rhizoxin 38Rhyncholacis pedicillata 91


S

Sclerotiorin (HCT-116) 86Selulase 23Sesbania grandiflora (L) Pers 89 Signaling cascade 35Smallanthus sonchifolius (Yacon) 90Sordaria superba 92Staphylococcus aureus 89Sterilisasi permukaan 41streptococcus 71Streptomyces rapamycinicus 38Streptomyces sp 91,93

T

Tabebuia argentea 90, 92, 116, 118, 125Talaromyces sp 91, 117Tanam langsung. 41Taxol 85, 101, 113Taxomyces andreanae 85Taxus baccata 89Teknik Bioassay anti inflamasi 79 Teknik Bioassay Antioksidan 77 Trichachne insularis 21Trichilia elegans A Juss 89Trichophaea abundans 89Trycoderma koningii 92T. wilfordii 92 Tyrosinase 87

U

Uji Aktivitas Anti kapang 73 Uji aktivitas antimalaria 79 Uji Aktivitas Antivirus 74 Uji aktivitas enzim 81Uji aktivitas untuk anti kanker 75 Uji antidiabetes 74Uji Antimikroba 66, 69, 73Uji imunomodulator 83Ulocladium sp 92, 118

X

Xylanase 23

Z

Zat warna nitroblue tetrazolium (NBT) 83Zingiber offensii val 90, 116Zygomycota 18, 28

Mikroba Endofit 2 - univpancasila.ac.id

Documents

Transcript of Mikroba Endofit 2 - univpancasila.ac.id