DocumentISSN 1907-985047ISOLASI DAN IDENTIFIKASI SENYAWA AKTIF LARVASIDADARI BIJI MIMBA (Azadirachta indika A. Juss) TERHADAPLARVA NYAMUK DEMAM BERDARAH (Aedes aegypti)I W. Suirta, N. M. Puspawati, dan N. K. GumiatiJurusan Kimia FMIPA Universitas Udayana, Bukit JimbaranABSTRAKIsolasi dan identifikasi senyawa aktif larvasida terhadap larva nyamuk Aedes aegypti dari biji mimba(Azadirachta indika A.Juss) telah dilakukan. Ekstraksi dilakukan dengan metode maserasimenggunakan pelarutetanol. Hasil maserasi 1 Kg serbuk kering Biji Mimba diperoleh 30 g ekstrak kental etanol. Ekstrak kental etanoltersebut disuspensikan ke dalam campuran metanol air (7:3), kemudian dipartisi berturut-turut dengan n-heksana,kloroform, dan etilasetat. Penguapan pelarut dari masing-masing ekstrak tersebut diperoleh 6,52 g ekstrak n-heksana, 1,20 g ekstrak kloroform dan 0,89 g ekstrak etilasetat. Hasil uji aktifitas larvasida terhadap ketiga ekstrakkental tersebut ternyata ekstrak kental n-heksana memiliki paling tinggi dengan nilai LC50143, 97 ppm. Pemisahandengan kromatografi kolom, diperoleh 0,19 g isolat aktif anti larvasida (F ) yang berwarna coklat kekuningan. Hasil1uji fitokimiamenunjukkan fraksi F1tidak mengandung metabolit sekunder tetapi termasuk golongan asamkarboksilat dengan karakteristik gugus fungsi C-H stretching alifatik, C-H bending alifatik, dan gugus karbonil(C=O), serta menyerap sinar UV-vis padamax290,1 nm yang kemungkinan disebabkan karena adanya transisi n-*.Identifikasi denganGC-MS menunjukkan adanya 7 puncak senyawa dengan waktu retensi relatif berdekatandimana ke-7 puncak senyawa tersebut merupakan golongan asam-asam lemak yaitu asam palmitat, asam stearat,asam oleat, etil oleat, asam oktadekanoat, etil ester oktadekanoat, ester dioktil heksadioat.Kata kunci : isolasi, identifikasi, Aedes aegypti, Azadirachta indika A. Juss, MeliaceaeABSTRACTIsolation and identification of larvicidal active compounds towards Aedes aegypti from Mimba seed havebeen conducted.One kilogram dry powder of Mimba seed was extracted with ethanol at room temperature.Evaporation of ethanol gave 30 g of crude ethanol extract which showed activity against Aedes aegypti (LC50282.29).This extract was dissolved into methanol-water (7:3) and was then partitioned with n-hexane, chloroformand ethyl acetate respectively. The three extracts obtained i.e. n-hexane, chloroform and ethyl acetate were showedtheir activity against Aedes aegypti in which the-n-hexane extract was the most active with LC50of 143.97.Therefore the n-hexane extract was further purified using silica gel column chromatography with chloroform:n-hexane (9:1) as eluent. Three fractions was obtained i.e. F , F and F and they were all active against Aedes aegypti123with LC5078.45, LC50113.54and LC5058.70respectively. It can be seen that F was the most active fractions but3from TLC result, F showed the relatively pure compounds since it only gave one spot. Therefore F was further11identified using pyhtochemical testing, Uv-Vis, infrared and GC-MS. It was found that the larvicidal activecompounds F was belong to carboxylic acids groups,with1lmax 290.1 having functional groups such as methyl,methylene and carbonil. Identification using GC-MS indicated that the larvicidal active compounds F was assumed1to be a combination of 7 compounds derived from carboxylic acids including hexa-decanoic acid, etil-hexadecanoate,oleic acid, etyl-oleate ester, octadecanoic acid, etyl-octadecanoate and dioctyl-hexadioate.Keywords : insolation, identification, Aegypti Aedes, Azadirachta Indika A. Juss, Meliaceae. JURNAL KIMIA 1 (1), JULI 2007: 47-5448PENDAHULUANDewasa ini berbagai macam penyakittropis ditularkan oleh nyamuk.Penyakitmalaria misalnya ditularkan oleh nyamukAnoples dan demam berdarah ditularkanoleh nyamuk Aedes aegypti.Penyakit-penyakit ini masih merupakan endemik dilebih 100 negara dan setengah dari populasidunia terancam olehnya (Manuel, 1992).Di Indonesia masalah besar yangdihadapi akhir-akhir ini adalah banyaknyawargayangterjangkitvirusdemamberdarah. Awal tahun 2005, tercatat 28.224kasus demam berdarah terjadi di seluruhIndonesia, dengan jumlah kematian 348orang.Kasus ini meningkat hingga awalOktober 2005, dimana di 33 provinsi kasusini mencapai 50.196 kasus, dengan 701diantaranya meninggal dunia. Daerah yangterkenademamberdarahterbesardiIndonesia adalah DKI Jakarta (14.200 kasus)sementara kasus kematian tertinggi terjadi diJawa Barat(147 orang) (Rukmana, 2002).Akhir tahun 2006 hingga awal tahun 2007kasusdemamberdarahterjadilagidibeberapa daerah di Indonesia.Banyaknya kasus deman berdarah iniseiring dengan datangnya musim hujan yangmenyebabkanbanyaknyagenangan air.Deman berdarah ditularkan oleh nyamukAedes aegypti yang telah terjangkit virus.Berbagai alternatif sudah dilakukan untukmengatasipenyakitdemanberdarah,diantaranya dengan membasmi jentik-jentiknyamukpenyebabdemamberdarah.Pembasmianjentiknyamukumumnyadilakukan dengan menguras bak mandi,menutup tempat yang mungkin menjadisarang tempat berkembangbiaknya nyamuk,mengubur barang bekas yang menampungair. Cara lain yang dilakukan yaitu denganmembasmi larva nyamuk sebagai sumberpenularandenganmenggunakanbubukabate, namun cara ini kurang efektif karenahanyabertahan beberapaminggu danharganya cukup mahal. Untuk mengatasigangguan nyamuk dapat juga dilakukandengancarafoggingyangbertujuanmembasmi nyamuk dewasa dan dapat jugadilakukan dengan menyemprotkan obat antinyamukdisekitarrumahataudenganmengoleskan lotion anti nyamuk padabadan.Pencarian metode-metode baru untukmembasmisumberpenularanpenyakitdemamberdarahsangatpentingdanmendesak,karenapenyakitinitelahmenulari 200 juta orang dan membunuh 1jutaorangtiap tahundiseluruh dunia.Metode yang dikembangkan oleh WHOuntuk memerangi penyakit demam berdarahadalah sama seperti metode yang digunakanuntuk memerangi penyakit malaria yaitudengan membasmi sumberpenularannyayaitularvanyamuk(Manuel,1992).Penelitian senyawa aktif bahan alam yangdapat digunakan sebagai agen larvasidabelum banyak dilakukan. Krause, F., dkk(1992) telah mengisolasi senyawa aktif agenlarvasida golongan poliasetilen dari tanamanartemesia borealis yang termasuk familiastereaceae.Kemungkinan juga terdapatgolongansenyawalainnyayangaktifsebagai agen larvasida dari tanaman ininamun belum dilakukan penelitian lebihlanjut. (Manuel, 1992)Indonesiamerupakansalah satunegara berkembang yang mempunyai cukupsumber daya alam diantaranya sumber dayaalam hayati. Kondisi alam Indonesia yangcukup subur disebabkan letak geografis yangdilewatiolehgariskhatulistiwa,danmemiliki iklim tropis yang sangat cocokbagi tumbuh dan berkembangnya berbagaitanaman.Banyak tanaman saat ini yangtidak dikenal secara luas ternyata memilikimanfaat dan nilai ekonomis yang cukuptinggi, khususnya tanaman-tanaman yangmemilikikhasiat,baiksebagaiobattradisional maupun sebagai insektisida alami(Fornswort, 1966).ISSN 1907-985049Salah satu tanaman yang sangatpotensial untuk dikembangkan sebagai agenlarvasida adalah tanaman mimba. Tanamanmimbabanyak dijumpai di Bali danmanfaatnya sangat banyak bagi kehidupanmanusia. Manfaat tanaman mimba antaralain; mengembalikan kesuburan tanah yangterdegradasi, sebagai pakan ternak, pestisidaalami, obatanti nyamuk, pupuk, obatdiabetes, dan pasta gigi.Minyak mimbatelah digunakan secara turun-temurun olehmasyarakat di daerah tropis untuk mengobatipenyakit kulit seperti eksim, bisul, lukabakar, dan jerawat (Wiryowidagdo, 2002).Bahan aktif biji mimba bermanfaatuntukmengusirseranggapengganggu,mencegahhamapemakantanaman,menghalau larvadanseranggadewasa,mencegah terjadinya pergantian kulit larva,menurunkan produksi telor pada seranggabetina, dan mencegahseranggabetinameletakan telor. Senyawasenyawayangdiyakini sebagaibahan aktifinsektisidaadalahnimbin(nimbinen),nimbidin,meliantriol, azadirachtin dan salanin yangmerupakan senyawa kimia dari kelompokterpena. Ekstrak yang dibuat dari biji mimbadapatdigunakanuntukmengendalikanberbagai jenis hama seperti Helopeltis sp.,ulat jengkal, Aphis sp., Nilarvata sp., danSitophilus sp. (Wiryowidagdo, 2002).Bijimimbamengandung60%minyak atau lemakdari asamstearat,palmitat, oleat, linoleat, laurat, butirat dansejumlahkecilminyakatsiri(Wiryowidagdo, 2002). Kandungan senyawalain yang diketahui dari biji mimba adalahfenol, kuinon, alkaloid, triterpenoiddanflavonoid. Residu dari biji mimba mudahteruraimenjadi senyawatidak beracun,sehingga ramah dan aman bagi lingkungan(Eugene,1992).Dalam rangkamencari senyawa-senyawa alam baru sebagai agen larvasidatelah dilakukan uji pendahuluan untukmengetahui aktivitas biologi ekstrak etanolbiji mimba terhadap larva nyamuk demamberdarah Aedes aegyptidan jugaujipendahuluan fitokimia.Hasil uji pendahuluan menunjukkanekstrak etanol biji mimba aktif sebagai agenlarvasida dengan nilai LC50282,29 ppm.Hasil uji fitokimiamenyatakan ekstraketanol biji mimba mengandung senyawa-senyawametabolitsekundergolongantriterpenoid, flavonoid dan alkaloid.Berdasarkanlatarbelakangdanpemanfaatan secara tradisional serta dari ujipendahuluan,makaperludilakukanpenelitian untuk mengetahui senyawa aktifagen larvasidadari biji mimbadenganmenggunakanlarvanyamukdemamberdarah Aedes aegypti sebagai bioindikatorMATERI DAN METODEBahanBahanbahan kimia yang digunakandalam penelitian ini adalah etanol, metanol,kloroform, butanol, asam sulfat pekat, etilasetat,natriumhidroksida,aluminiumklorida, kalium bromida, plat silika gelGF254dan silika gel 60, n-heksana, asamasetat, dimetilsulfoksida, biji mimba, larvanyamuk Aedes aegypty.PeralatanAlatalat yangdigunakan dalampenelitian ini adalah ; pisau, blender, neracaanalitik, gelas beker, corong, erlenmeyer,pipetmikro,penguapputarvakum,desikator, pipet tetes, tabung reaksi, gelasarloji, seperangkat alat kromatografi lapistipis (KLT), seperangkat alat kromatografikolom (KK), lampu UV 254 dan 366 nm,spektrofotometer ultra violetvisible (UVvis),spektrofotometerinframerah(IR)(PERKIN ELMER FT/IR-5300), pelet KBr,dan spektrometer GC-MS.Prosedur KerjaJURNAL KIMIA 1 (1), JULI 2007: 47-5450Bahanyangdigunakandalampenelitian ini adalah biji tanaman mimbayang sudah tua (Azadirachta indika A. Juus )yangdikumpulkandariDesaKubuKarangasem.Penyiapan bahan penelitianyangdilakukan diantaranyadeterminasitanaman, pengumpulan bahan, pembersihan,pengeringan bahan dengan cara diangin-anginkan (tidak dibawah matahari langsung)dan penggilingan sampai menjadi serbukdengan menggunakan blender.Sebanyak 1000 g serbuk biji mimbadiekstraksi dengan cara maserasi denganmenggunakan20L etanol teknis sampaisemua komponen habis terekstraksi. Ekstraketanol yang diperolehdiuapkan denganpenguapputarvakumsampaikental.Ekstrak kental etanol dilarutkan dengan 100mL etanol-air dengan perbandingan (7:3).Ekstrak etanol air kemudian dipartisi dengann-heksana (10 x 50 mL) sehingga didapatkanekstrak etanol-air dan ekstrak n-heksana.Ekstrak etanol-air diuapkan sampai semuaetanol habis menguap kemudian ekstrak airyang tersisa dipartisi berturut-turut dengankloroform (7 x 50 mL), dan etil asetat (5 x50 mL).Masing-masingekstrak yangdiperolehyaituekstrakn-heksana,kloroform, dan etil asetat, diuji aktivitasbiologisnya terhadap larva nyamuk Aedesaegypti, sedangkan ekstrak airnyatidakdilakukan uji aktivitas biologisnya tarhadaplarva nyamuk Aedes aegypti. Fraksi yangpaling toksik kemudian dimurnikan dengankromatografi lapis tipis dan kromatografikolom. Hasil fraksi yang didapatkan daripemisahandengankromatografikolomselanjutnyadigabungkandenganmenggunakan KLT penggabungan. Fraksiyang didapatkan selanjutnya dilakukan ujitoksisitasterhadap larvanyamuk Aedesaegypti.Media larva nyamuk Aedes aegyptidibuat dengan mengisi ember dengan air.Telur dari larva nyamuk Aedes aegyptitersebut disimpan pada tempat yang lembabsampai telur dari larva nyamuk tersebutmenetasdansiapdigunakandalampengujian.sepuluh botol kecil disiapkanuntuk pengujian, dimana untuk masingmasing sampel dibutuhkan sembilan botolkecil dan satu botol sebagai kontrol.Ditimbang ekstrak pekat sebanyak 0.0200 gyang dilarutkan dengan 2 mL etanol. Larutandipipet sebanyak 500; 50; 5L. Masingmasing dimasukkan ke dalam botol kecil,pelarutnyadiuapkanselama24jam.Kedalam botol dimasukkan 2 mL air, 50Ldimetilsulfoksida, 10 ekor larva nyamukAedes aegypti. Kemudian larutan ekstrakditambahkan air sampai volumenya menjadi5 mL dalam konsentrasi 10; 100;1000 ppm.Untuk kontrol, ke dalam botol kecildimasukkan2mLair,50Ldimetilsulfoksida, 10 ekor larva nyamukAedes aegyptikemudian ditambahkan airsampai volumenya5mL. Pengamatandilakukan setelah 24 jam terhadap kematianlarva nyamuk. Analisis data dilakukan untukmencari konsentrasi kematian (LC ).50Setelahprosespemisahandanpemurnian terhadap isolat murni yang palingtoksik dilakukan maka dilanjutkan denganidentifikasi dengan menggunakan metodespektrofotometri UV-vis, spektrofotometriIR dan spektroskopi GC-MS.HASIL DAN PEMBAHASANEkstraksiHasil ekstraksi 1000 g biji mimbadengan cara maserasi menggunakan20 Letanol didapatkan ekstrak kental etanol yangberwarna coklat kehitaman sebanyak 30 g.FraksinasiEkstrak kental etanol selanjutnyadilarutkan dengan 100 mL etanol-air denganperbandingan 7:3.Setelah campuran inidipartisi berturut-turut mengunakan pelarutISSN 1907-985051n-heksana, kloroform dan etil asetat masing-masing diperoleh ekstrak kental n-heksanayang berwarna hijau kekuningan sebanyak6,52 g,ekstrakkental kloroform yangberwarnaorangesebanyak 1,20 g, danekstrak kental etil asetat yang berwarnacoklat kekuningan sebanyak 0,89 g. Ketigaekstrak hasil partisi di atas kemudian diujitoksisitasnya. Uji toksisitas masing-masingekstrak menunjukkanbahwa ekstrak n-heksana yang paling bersifat toksik terhadaplarva nyamuk Aedes aegypti dengan nilaiLC50143,97 ppm.Pemisahan dan PemurnianPemisahandanpemurniankomponen-komponen kimia pada ekstrakn-heksanadilakukandenganteknikkromatografi kolom.Sebelum dilakukanpemisahan dengan kromatografi kolom,terlebih dahulu dilakukan pemilihan eluenyang mampu memisahkan senyawa yangterdapat dalam ekstrak n-heksana denganmenggunakan KLT. Beberapacampuraneluen dengan polaritas yang berbeda telahdicobadalam KLT,untuk memisahkankomponen-komponen kimia pada ekstrak n-heksana. Eluen yang digunakan antara lain;kloroform, n-heksana (1:1), kloroform : n-heksana (7:3), kloroform : n-heksana (8:2),kloroform : etil asetat (7:3), kloroform : n-heksana (9:1). Penotolan cuplikan pada platKLT dilakukan dengan mengunakan pipetmikro dan diusahakandiameter totolansekecil mungkin karena jika diameter totolanbesar itu akan mengakibatkan terjadinyapenyebaran noda-noda dan timbulnya nodaberekor.Denganmengamatijumlahnoda/spot terbanyak dan jarak pemisahanantarnodacukup terpisah makadapatdigunakansebagaidasarpemilihancampuraneluenterbaikyangakanditerapkandalampemisahancampuransenyawa menggunakan kromatografi kolom.Eluenkloroform:n-heksana(9:1)memberikan pola pemisahan terbaik karenamampu memisahkan enam senyawa yangterkandung pada ekstrak kental n-heksanadenganjarakpemisahancukupjauh,sehingga dapat digunakan dalam pemisahanmenggunakan kromatografi kolom.Seberat 2,50 g ekstrak kental n-heksanadipisahkan dengan kromatografikolom, menggunakan sebanyak 100 g silikagel 60, dan fase gerak campuran kloroform :n-heksana (9:1). Kecepatan alir fase gerakyangdigunakan adalah kira-kira1mL/1menit.Eluat ditampung disetiap 3 mLsampai menghasilkan 151 fraksi. Keseratuslimapuluh satu botol eluat tersebut,dikromatografi lapis tipis. Berdasarkan polanodahasil analisisKLT, ke-151 eluattersebutdapatdigabungkandandikelompokan menjadi tiga kelompok fraksi.Ketigakelompokfraksi tersebutmasing-masing diuji toksisitasnya terhadaplarva nyamuk Aedes aegypti. Berdasarkanhasil uji toksisitas didapat ketiga fraksi,bersifat toksik terhadap larva nyamuk Aedesaegypti.Ketiga fraksi tersebut fraksi F3memiliki aktivitas paling toksik terhadaplarva nyamuk Aedes aegypti dengan LC50=58,70 ppm, namun fraksi F1yang palingmemungkinkan untuk dilanjutkan pada tahapanalisis berikutnya. Mengingat syarat isolatdapat diidentifikasi lebih lanjutdenganmetode spektroskopi itu harus relatif murnisecara KLT, yaitu paling tidak memiliki satunoda. Sedangkan fraksi F3pada saat KLTpenggabungan memiliki tiga noda artinyabelum murni secara KLT, selain juga jumlahfraksiF3sedikit,sehinggatidakmemungkinkan untuk dilakukan pemisahanlebih lanjut. Jadi dalam penelitian ini yangdilanjutkan untuk diidentifikasi lebih lanjutadalah fraksi F , karena fraksi F11relatifcukup toksik dengan LC50= 78, 45 ppm.Fraksi F1yang bersifat toksik danrelatif murni dari hasil uji toksisitas terhadaplarva nyamuk Aedes aegypti selanjutnyadiujikemurnianyamenggunakanJURNAL KIMIA 1 (1), JULI 2007: 47-5452kromatografi lapis tipis dengan beberapapelarutpengembangataueluenyangmemiliki tingkat kepolaran yang berbeda-beda.PemurnianSebelum dilakukan uji kemurnian,terlebih dahulu dilakukan pencucian denganmenggunakan akuades, dilanjutkan denganuji kemurnian secara KLT menggunakanbeberapacampuraneluendiantaranyakloroform : etil asetat (1:1); metanol :kloroform (7:3); kloroform : metanol (2:8);kloroform : eter (7:3) dengan polaritas yangberbeda-beda.HasilujikemurnianmenunjukkanbahwafraksiF1hanyamengandungsatusenyawa,yangditunjukkan dengan timbulnya satu nodadengan berbagai campuran eluen yangdigunakan.Hal ini menyatakan bahwafraksi F1relatif murni secara KLT. Ujifitokimia menunjukkan bahwafraksi F1tidakmengandungmetabolitsekundermelainkan hanya mengandung asam-asamlemak.Data spektrofotometri IRSpektrumserapanhasilanalisisspektrofotometer inframerah dari isolat aktifmenggunakan pelet KBr dipaparkan padaGambar 1.6 Gambar 1. Spektrum inframerah dari isolataktifDataspektrum inframerah isolatmenunjukkan adanya serapan tajam padadaerah bilangan gelombang 2921,5 cm1-dan2821,0 yang diduga adalah serapan darigugusC-Hstretchingalifatik,yangdiperkuat oleh adanya serapan pada daerahbilangan gelombang 1464,4 cm1-.Adanyagugus fungsi karbonil (C=O) diindikasikandengan munculnya serapan pada daerahbilangan gelombang 1712,4 cm1-.Sertamunculnya serapan pada daerah bilangangelombang 720,1 cm1-menunjukkan adanyagugus fungsi C-H bending (luar bidang.Hasil uji fitokimiamenunjukkan bahwaisolataktifantilarvasidamerupakansenyawa golongan asam karboksilat yangmempunyai karakteristik gugus fungsi C-Hstretching alifatik, C-H bending dan guguskarbonil (C=O).Gugus-gugus fungsi diatas menunjukkan ester dari asam lemak.Data spektrofotometri UV-visHasil analisis isolat menggunakanspektrofotometerUV-vismemberikanserapan maksimum pada panjang gelombang290,1nm. Serapan pada panjang gelombang290,1 nm diduga akibat adanya transisi n-*poleh suatu kromofor C=O. Dugaan inididukungdengan adanyapuncak yangmunculdenganintensitastajampadabilangangelombang1712,4cm1-padaspektra IR. Gambar 2. Spektrum Ultra violet - VisibelISSN 1907-985053Spektroskopi GC-MSKromatogram isolat F menunjukkan17 puncak dengan intensitas relatif cukupbesar seperti puncak senyawa dengan wakturetensi (tr)berturut-turut16,43; 16,78;18,13; 18,32; 18,41; 18,63; 20,39 menit,dimana ke-7 puncak tersebut menunjukkanasam-asam organik yaitu asam palmitat,asam stearat, asam oleat, ester oleat, asamoktadekanoat, etil ester oktadekanoat, esterdioktilheksadioat.Dari7puncakkromatogramyangdihasilkanmengindikasikan bahwa isolat relatif belummurni. Gambar3.Kromatogram gas isolat FraksiF1SIMPULAN DAN SARANSimpulan1.Hasil uji fitokimia menunjukkan fraksiF1yang bersifat toksik terhadap larvanyamuk Aedes aegypti dari biji mimbatidak mengandung senyawa metabolitsekunder.2.Isolat aktiflarvasidadari fraksi F1memiliki karakteristik gugus fungsi C-Hstretching alifatik,C-H bending dangugus karbonil C=O serta menyerapsinar UV-vis padalmax290,1 nm yangkemungkinan disebabkan karena adanyatransisi n-*p.3.Identifikasi isolat aktif anti larvasidasecara GC-MS mengandung 7 komponensenyawa yang merupakan asam-asamorganik yaitu asam heksadekanoat, asamstearat, asam oleat, etil oleat, asamoktadekanoat, etil oktadekanoat, dioktilheksadioat. Diduga senyawa-senyawa diatas bersifat antilarvasida terhadap larvanyamuk Aedes aegypti.Saran1.Perlu dilakukan pemisahan identifikasilebih lanjut padaisolataktifantilarvasida khususnya larva nyamuk AedesaegyptyuntukfraksiF1denganmenggunakan teknik spektroskopi yanglain seperti C-NMR dan H-NMR.1312.Perlu dilakukan pemisahan, pemurniandan identifikasikomponen-komponen senyawa yang terdapat dalamfraksi F2dan F dengan menggunakan3teknik kromatografi dan spektrofotometriIR, UV-vis, dan spektrometri GC-MSdan teknik spektroskopi lainya.UCAPAN TERIMA KASIHPadakesempataninipenulismengucapkan terima kasih kepada Ir. I GustiAyu Kunti Sri Panca Dewi, M.Si., Drs. IMade Siaka, M.Sc.(Hons), dan Ni LuhRustini,S.Si.,M.Si.atasmasukan-masukannyasehinggapenelitian sampaipenulisan dapat dikerjakan dengan baik.DAFTAR PUSTAKAEugene B. and Shultz, J. R., 1992, Neem ATree for Solving Global Problems,NationalAcademyPress,Washington, D.C.JURNAL KIMIA 1 (1), JULI 2007: 47-5454Fornswort, N. R., 1966, Biological andPhytomical Screening of Plant, J.,Pharm. Sci, 55,3, 225-276.Harborne. J. B., 1987, Metode Fitokimia,TerbitanKedua,PenerbitITB,Bandung.Manuel, F. B. and Douglas, K. A., 1992,Human Medicinal Agent From Plant,AmericanChemicalSociety,Washington.D.C..Robinson, T., 1995, Kandungan OrganikTumbuhan Tinggi, Penerbit ITB,Bandung.Rukmana, R. and Oesman Yuniarsih, Y.,2002, NimbaTanaman PenghasilPestisidaAlami,Kanisius,YogyakartaSudjadi, 1985, Penentuan Struktur SenyawaOrganik, Penerbit Gholia, Jakarta.Wiryowidagdo,2002,KimiadanFarmakologiBahanAlam,Universitas Indonesia, Jakarta.