KAR,AKTERISASI ENZIM KATEPSIN DARI IKAN PATIN (Ponsosius sp)

f,lrcmmod Zokiyul Fikri, lmo Wiioyonti, Noni Nur'qenoh, Sofrino Dyoh Hordiningtyos,Elizobeth Juleni Topotubun

Deportemen Teknologi Hosil Peroiron, Fokultos Perikonon don Ilmu Kelouton, IPB

Abstrsk

I':im kotepsin merupokon enzim penting yong berperon dolom proses pelunokon: : ; - I i< on selomo proses kemunduron mutu. Aktivitos enzim ini songot berpengoruhn ':::o proses kemunduron mutu ikon . Oleh koreno itu, perhr diketohui korokteristik enziri"i

i ::-':clom proses kemunduron mutu sehinggo dopot mengombil longkoh yong tepot:: :* :erongonon don pengolohon ikon. Tuiuon penelition iri odoloh mengekstrok enzim: ::: - :ori ikon potin don menentukon korokter enzim kot,rpsin yong berosql dori ikon: )e'elition ini dilokukon duo tohop yoitu ekstroksi en;,im kosor don pengendopon:- . : - c.nmonium sulfot. Hosil penelition ekstrok kosor (c'ude ekstrok) enzim kotepsin

-:'-- -((:rn oktivitos spesifik 0,457 U/^g, enzim tersebut dopot diendopkon dengon- -'

= I --c(on ommonium sulfot 6070. Pengendopon dengon renggunokon ommonium sulfot-:-:-:: iion oktivitss spesifik 0,23 koli. Enzim kotepsin memprnyoi suhu optimum 50 "C don- :''*-T 6, konsentrosi substrot optimum 670 dengon niloi crktivitos 0,8167 U/ml. Berot

enzim kotepsin kosor hosil SDS-PAGE 12,97-55,49 kDA don berot molekul enzim: ;-go mempunyoi oktivitos proteolitlk podo onolisis zym,rgrom odoloh 28,88 kDo.

-: : enzim, kotepsin, korokteristik, ikon potin

,T H U LUAN

: 3' n merupokon ienis ikon konsumsi oir towor osli lndonesio yong tersebor di

:- .viloyoh Sumoters don Kolimonton. Doging ikon potin memiliki kondungon kolori

':'e n yong cukup tinggi, roso dogingnyo khos, eno<, lezot don gurih sehinggo

:' :leh mosyorokot. lkon potin diniloi lebih omon untuk kesehoton koreno kodor

'.'/a rendoh dibondingkon dengon doging hewon 'ernok. Seloin itu ikon potin

:eberopo kelebihon loin, yoitu ukuron per indiv dunyo besor don di olom

;-: r biso mencopoi 120 cm (Susonto don Amri, 2OO2).

"':1urut doto stotistik perikonon budidoyo tohun 2O('1, produksi ikon potin (dori

.: kolom, kerombo don ioring opung, serto sowoh) odoloh sebesor I l.l I8 ton.

: <rn potin noik meniodi 32.375 ton podo tohun 2005, tetopi podo tohun 2006 turun

: 3' .490 ton (Anonim 2OO7). Berbogoi tontongon yong dihodopi dolom pemosoron

::' - hosil budidoyo ontoro loin odoloh odonyo hom >oton menyongkut mutu don

:-:'pongon. Hol ini disebobkon koreno ikon polin secerti holnyo sifot ikon podo

- . : ' oitu cepot mengolomi kemunduron mutu ikon.

re.urunon mutu ikon teriodi segero seteloh ikon dito rgkop otou moti. Kecepoton

,-:'mutu dipengoruhi oleh bonyok foktor, ontoro loin ienis kelomin, ienis ikon, ukuron

.:-o si lingkungon, perlokuon fisik, iumloh iosod renik, dor oktivitos enzim (Ridwonsyoh

I Prosiding Pertemuon llmioh don Semincr Nosionol MPHPI 20'i I 2l

2oo2)' soloh sotu ienis enzim yong berperon penting dorom proses kemunduron mufu ikonodoloh enzim-enzim penguroi protein (enzim proteoritik) yong menguroikon protein meniodipepton' polipeptido' don osom-osom omino (Kreuzer r 965) Hidrorisis protein oreh suotuproteose seperti kotepsin colpoin don kologenose dopot menyebobkon timburnyo okumurosimetobolit' perubohon citoroso, don pelunokon tekstur, terbentuknyo komponen vorotire sertopeningkoton iumloh bokteri yong okhirnyo menimbulkon kebusukon.Proteqse odoloh enzim yong mompu menghidrolisis ikoton peptide podo protein.Enzim ini untuk melokukon oktivitosnyo membutuhkon oir sehinggo dikerompokkon dorom keloshidrolose (Roo ef o/' I998)' secoro umum proteose dopot dibogi dorom duo gorongon, yoituproteinose don peptidose' Berdosorkon sifot kimio don sisi okt;fnyo dikenor empot gorongonprofeose yoitu serin, sistein, osportot don metollo endopeptidqse (otto don schirmeisfer

jilll;.t'ttein proteose merupokon kelompok besor enzim, termosuk korepsin risosomor don

Kofepsin ditemukon di lisosom serot doging don di sel fogosit. Lisosom merupokonintroseluler orgonel yong bonyok mengondung enzim hidrolitik don berperon dorompencernoon dolom sel' Kotepsin odoloh osom proteose terretok di risosom. Mereko mungkinterbeboskon ke keduo sitoplosmo don ruong introseruror sebogoi konsekuensi dori gongguonlisosomol yong teriodi seteloh kemotion sel okibot penurunon pH (Duston r 9g3 diocu dolomCherer 2OO7).

Beberopo tipe kotepsin teloh diidentifikosi dengon osom omino yong berbedo di sisioktifnyo' Kotepsin B don Kotepsin L keduonyo merupokon sistein proteinose yongkemungkinon poling penting dolom kemunduron tekstur doging (Aoki er cr. 2ooo;Kolodzieisko don sikorski 1996)' Aktivitosnyo berbedo-bedo tiop froksi doging don spesiesikon' Aktivitos opfimum diloporkon podo suhu 4o-so oc don oktivitosnyo menurun dengonpenurunon suhu' Kotepsin secoro umum bekerio podo pH 3-4 don beberopo kotepsin iugomempunyoi oktivitos tinggi podo pH 6-6,5 (Aoki ef ot. 2ooo; Korodzieisko don sikorski1996).

Aktivitos kotepsin songot berpengoruh terhodop tekstur doging ikon koreno kotepsindopot menurunkon fleksibilitos (kekenyolon) sehinggo doging ikon meniodi t,dok elostic donioringon doging ikon melunok (lembek)' Pelunokon doging ini merupokon soroh sotu sumbermosoloh podo industri surimi koreno kotepsin dopot menurunkon kemompuon pembentukongel podo proses pembuoton surimi dori doging ikon okibot degrodosi protein myofibrir yongdopot mengurongi elosfisitos don kekuoton gel surimi. Jenis kotepsin B, D, L don H telohdiketohui memiliki efek ge/ soffenrng podo proses pembenrukon ger surimi (Hoord 2ooo).

I Prosiding pertemuon llmioh don Seminor N.*r, *rrfllO, ZZ

fir*egr dori penelition ini odoloh untuk mengetohui korokterisosi don purifikosi enzim kofepsin

r *on Potin dengon presipitosi ommonium sulfot.

:TO'I}E PENELITIAN

Eil don Alot

Bohon yong digunokon terdiri dori bohon utqmo berupo ikon potin dolom keodoon

bohon-bohon untuk ekstroksi kosor (buffer Tris HCI 0,1 M pH 2,4), presipitosi

rsrm,urium sulfot teknis), uii oktivitos kotepsin (hemoglobin, buffer tris HCI 0,1 M pH 7,4,

- ::rodes, TCA Soh,folin, HCI I N), uii kodor protein (pereoks Brodford, bovine serum

* - Alot yong digunokon ontoro loin incubotor, sentrifuse suhu Jingin, spektrofotometer,

r, - *:'i', kertos soring whotmon no.'l , tobung reoksi, don erlenmeyer '

irr .':r,si Kotepsin Kqsor

i<stroksi dilokukon dengon presipitosi sompel untuk merrperoleh ekstrok kosor

n:: - cengon coro ikon dimotikon, kemudion doging ikon dibedoh dengon cepot don

.: ---,6 menghilongkon dorqh. Tohopon ekstroksi kotepsin kosor ;eloniutnyo berdosorkon

". :' :, 2002).

:,'erisosi Suhu

. c.okterisosi suhu dilokukon dengon melokukon voriosi st,hu inkubosi podo soot

.- :- oktivitos kotepsin dengon suhu 20, 30, 40,50, 60 dan 70 oC. Podo woktu

.- r-, hemoglobin sebogoi substrotnyo dibuot dengon konsenlrosi 2oh pH 2. Aktivitos

: - .:'epsin kosor di ukur berdosorkon (Dinu ef ol.2OO2)-

: ,'erisosi pH

.: crokteriscsi pH dilokukon dengon menggunokon substro" hemoglobin 2o/o yong

:.-" ::do berbogoi voriosi pH yoitu 4, 5, 6, don 7. Seloin i'u, buffer Tris HCI yong

: - -:.3n iugo diotur podo voriosi pH yong somo yoitu 4, 5, 6, don 7. Aktivitos enzim

:-: - <osor di ukur berdosorkon (Dinu el ol.2OO2l.

ir : :*'erisosi Konsenirqsi Subslrqt

< crqkterisosi konsentrosi substrot dilokukon dengon menguboh konsentrosi substrot

-*:: rcln dengon berbogoi voriosi konsentrosi yoilvz 3o/o,4oh, !;oh don 60/o (b/vl pH 2.

:: enzim kotepsin kosor di ukur berdosorkon (Dinu et ol.2OO2)'

i"+: : tosi Enzim Kotepsin Kosor

<r.otepsin semi murni diperoleh dengon mengendopkon esktrok kosor kotepsin

-,-.I,-ckon ommonium sulfot dengon tingkot keienuhon 5Oo , 600/0, 7ooh, don 807o.

* -:- --^ sulfot ditombohkon sedikit demi sedikit ke dolom supernoton don seloniutnyo

I Prosiding Pertemuon llmioh don Seminor No,ionol MPHPI 20 11 23

disentrifuse podo '12000xg selomo 30 menit. Pelet yong diperoleh dqri hosil sentrifuse

dilorutkon dolom buffer Tris HCI 0,1 M pH7,4.

Aktivitos Kotepsin

Aktivitos proteolitik dori kotepsin diuii menggunokon hemoglobin sebogoi substroinyo

dengon konsentrosi 2o/o pH 2. Aktivitos kotepsin diukur menurut metode Dinu et o/. (2002).

Penetuon Konsenlrqsi Protein

Konsentrosi protein ditentukon dengon menggunokon metode Brodford dengon bovin

serum olbumin (BSA) sebogoi stondor (Brodford 1976).

Penenluon Berot Molekul dengon SDS-PAGE don Zimogrom

Penentuon berot molekul dilokukon dengon metode SDS-PAGE dengon komposisi gel

penohon (stocking gel) sebesor 4o/o don gel pemisoh (gel okrilomid) sebesor 8o%. Anolisis SDS

don zimogrom dilokukqn berdosorkon (Loemmli I970).

HASIL DAN PEMBAHASAN

Ekstroksi Enzim Kolepsin

Ekstroksi enzim kotepsin kosor dori doging ikon potin dilokukon dengon mengombil

bogion doging ikon yong sudoh memosuki tohop posf-rigor. Berdosorkon hosil penelition

Fentiono (2009), podo f ose ini oktivitqs kotepsin berodo podo oktivitos tertinggi

dibondingkon podo fose-fose sebelumnyo, sehinggo dihoropkon rendemen kotepsin yong

dihosilkon tinggi.

Seloniutnyo doging ikon dilorutkon dolom qkuodes dengon perbondingon l:'l don

dihomogenisosi. Menurut Correno (2000), kotepsin bonyok ditemukon podo lisosom don sel

pogosit. Proses homogenisosi ini bertuiuon untuk mengeluorkon enzim kotepsin dori bogion

lisosom don mitokondrio.

Hosil pemecohon sel dengon proses homogenrsosi dipisohkon dengon sentrifugosi

metode diferensiol sebonyok tigo koli. Penelition yong dilokukon Dinu el o/. (2OO2l

menyebutkon bohwo podo sentrifugosi tingkot pertomo dilokukon sentrifugosi podo

kecepoton 600x g selomo l0 menit. Sentrifugosi tingkot keduo dilokukon podo kecepoton'10000x g selomo '10 menit. Sentrifugosi tohop ketigo dilokukon podo kecepoton 4000x g

selomo I0 menit.

Sentrifugosi metode differensiosi diowoli dengon sentrifugosi tingkot pertomo, dimono

supernoton yong dihosilkon diombil untuk kemudion dilokukon sentrifugosi keduo podo

kecepoton tinggi untuk memisohkon portikel yong berukuron sedong. Pelet yong dihosilkon

podo sentrifugosi keduo dilorutkon dengon buffer Tris-HCl 0,1 M pH7,4 dengon iumloh yong

somo dengon okuodes yong digunokon untuk proses homogenisosi.

T

I Prosiding Pertemuon llmioh Jon Seminor Nosionol MPHPI 201 1 24

: r -:u'nyo disentrif ugosi kemboli untuk memperoleh supe rnoion yong merupokon

:::' dqri kotepsin. Buffer Tris-HCl pH7,4 yong digunokon ;ebogoi pelorut berfungsi

-;ungi enzim dori seiumloh besor osom yong dileposkon dori vokuolo podo soot

:e . rlol ini seloros dengon pendopot Whittoker (1994} /ong menyotokon bohwo

=-:'n- seboiknyo menggunokon buffer untuk mengontrol pH dekot dengon 7,5 don

:- 0,1-0,5.

' ."ros ekstrok kosor enzim kotepsin ditentukon dengon rrenggunokon hemoglobin

-ssirctnyo dengon konsentrosi 2o/o pH 2. Hosil penguiion menuniukon ekstrqk kosor

'=csin memiiki oktivitos spesifik sebesor O,45706 lJ/ry1 dengon kodor protein.. - 2202 mgf ml. Niloi oktivitos enzim kotepsin dipengort hi oleh ienis ikon, kondisi

":-c'ongon gonod, umur, don temperotur lingkungon. Aktivitos spesifik ekstrok

* kctepsin dori ikon bondeng (Chonos chqnos Forskol) mencopoi 0,8598 U/-g

-:'l , 9,4 Ufmg podo ikon mockerel don 4,5 U/^g prdo milkfish (Jiong ef o/.

- ' : J/^g podo ikon mos (Liu ef o/. 2008). Beordrrll don Johnston (1985)

':- cchwo oktivitos enzim kotepsin podo ikon soithe (Po//:chius virens L.) meningkot

: !? on'ro kondisi lopor. Podo ikon solmon lOncorhyncl'us kefo L.) menuniukkon

:':'eolitik cothepsin L tinggi selomo migrosi pemiiohon (Yomoshito el o/. .l990).

- :, A<fivitos kotepsin podo otot meningkot cepot selom,r musim pemiiohon ikon

--:-: n. pi/chordus) (Gomez-Guillen don Botiso 1997).

:: Enzim Kosqr

i':-'c\, (qsqr yqng diperoleh seloniutnyo di presipitosi menggunokon qmmonium sulfot

'-l{c- keienuhon 5Oo/o,6Oo/n,7Ooh, don 807o dengon tuiu:n untuk memisohkon don

,:- e-:im kotepsin dori protein-protein loin yong terdopot :odo ekstrok kosor enzim

3r lihon tingkot ke[enuhon ommonium sulfot podo rento rg 5O%-8Ao didosorkon

: - : : c :t Bisswonger (2004) yong menyotokon bohwc tiop presipitosi protein

-ck'eristik podo konsentrosi reogen yqng berbedo. Pres pitosi dengon omrnonium

-: se cng konsentrosi 20-1A0o dionggop cukup untuk pre;ipitosi protein. Berbogoi

-sr yong dopot digunokon podo proses presipitosi diorforonyo ommonium sulfot,

:::e" polietilen glikol (PEG), otou loruton orgonik seperti oseton otou olkohol

I ?a diocu dolom Kumor ef o/. 2003). Nomun pe nilihon ommonium sulf ot

, :- p,:rdo pendopot Jovois (.l999) yong menyotokon bohwo ommonium sulfot

: : ::pct don muroh.

-"'."ic; enzim kotepsin ikon potin yong teloh mengolorri pengendopon dengon

-- :;rf ot dopot dilihot podo Gombor l.

I Prosiding Pertemuon llmioh don Seminor Nosionol MPHPI 201 I 25

ti .!-,

li ;

l! lr ,

).,

ti'

Gombor 'l Aktivitos enzim kotepsinommonium sulfot.

€sen 4*16 66$+ *ft*6 1*#.i+

lqoc***ntra*[ arftsatgm fi{.+{f *t

setelqh pengendopon dengon berbogoi konsentrosi

Aktivitos enzim podo pelet lebih besor dibondingkon dengon oktivitos enzim podo

supernoton. Aktivitos optimum enzim kotepsin podo pelet diperoleh dengon pengendopon

ommonium sulfot podo tingkot keienuhon 600/o dengon niloi 0,21 62 unitfml don oktivitos

enzim menurun toiom dengon semokin tingginyo tingkot keienuhon qmmonium sulfot. Aktivitqs

enzim kotepsin podo supernoton cenderung mengolomi p.nrrunon dengon semokin

meningkotnyo tingkot keienuhon ommonium sulfot. Presipitosi menggunokon gqrom odoloh

coro pengendopon protein berdqsorkon kemompuon ion gorom dolom mempengoruhi

kelorufon protein. lon gorom dori gorom ommonium sulfot, yoitu ion NHr+ don SO+2-. Pqdo

konsentrosi rendoh, ion-ion gorom tersebut okon mengelilingi protein don mencegoh

bersotunyo molekul-molekul ini, sehinggo protein lorut. Peristiwo ini disebut solfing in. Pqdo

konsentrosi yong finggi, teriodi peningkoton muoton listrik disekitor protein yong okon

menorik moteri oir dori koloid protein. Interoksi hidrofobik diontoro sesomo molekul protein

podo suoson yong tinggi qkon menurunkqn keloruton protein (Suhortono 1989).

Koroklerislik Suhu Ekstrok Kosor Enzim Kotepsin

Suhu merupokon soloh sotu foktor yong mempengoruhi oktivitos enzim. Pengoruh suhu

terhodop oktivitos enzim kotepsin kosor disoiikon podo Gombar 2. Aktivitos enzim meningkot

dengon odonyo peningkoton suhu dori 40 oC meniodi 50 oC, nomun peningkoton suhu

sompoi 60 'C menyebobkon oktivitos enzim menurun. Suhu optimum ekstrok kosor enzim

kotepsin odqloh podo suhu 50 "C dengon niloi oktivitos 0,0749 U/ml.

Podq perubohon suhu, kecepoton reoksi yong dikotolisis oleh enzim mulo-mulo

meningkot koreno odonyo peningkoton suhu. Energi kinetik okon meningkot podo kompleks

enzim don substrot yong bereoksi. Nomun, peningkoton energi kinetik oleh peningkotqn suhu

mempunyqi botos yong optimum. Jiko botos tersebut terlewoti, moko energi tersebut dopot

memutuskon ikoton hidrogen don hidrofobik yong lemoh yong mempertohonkon struktur

sekunder-tersiernyo. Podo suhu ini, denoturosi yong disertoi dengon penurunon oktivitos

L

v

4ry

26I Prosiding Pertemuon llmioh don Seminor Nosionol MPHPI 20l I

L_

F -togtoi kotolis okon teriodi suhu optimol enzim bergontung podo lomonyo

Fh kodor yong dipokoi untuk menentukonnyo. Semokin lomo suotu enzim

Fh-H- podo suhu dimono strukturnyo sedikit lobil, moko semokin besor kemungkinonpur mengolomr denoturosi.

i i,:Snilat

t Gombor 2 Pengoruh suhu terhodop oktivitos enzim kotepsin kosor.

L=-=--=-] $crot pgo merupokon sqloh sotu foktor yong mempengoruhi loiu reoksi enzim.

I*, dd dengon kosentrosi enzim yong lebih sedikit dibondingkon subsrrot, penembohon

Fa frr rreningkotkon loiu reoksi. Peningkoton loiu reoksi ini teriodi secoro lineor. jiko

]- rtcrot don enzim seimbong, loiu reoksi okon relotif konston. pengoruh kosentrosi

Jfr':*roaop oktivitos spesifik enzim dopot dilihot podo Gombor 3. Kosenrrosi substrot

lFF.5 lerhodop qktivitos spesifik enzim yong dihosilkqn. Jiko kosenrrosi substrot

l*- noko oktivitos spesifik enzim okon sompoi podo tifik tetentu. Kosentrosi substrot

F- 616 merupokon kosentrosi substrot yong poling tinggi oktivitos spesifik enzim kotepsin

lF Joi sebesor 0,81 67 (U/ml) tetopi tidok biso dikorokon bohwo 60% merupokon

]ffi optimol untuk enzim kotepsin koreno dengon dinoikkon kosentrosi substrotnyo

lr.OX lernr.rngkinon okon menemuksn iumloh kosentrosi optimol untuk enzim ini.

0.90

= 0.80

€ o.zof,- 0.60.5 o.soE o.+o

$ o.:oE o.zo< 0.10

0.00

K3% K4% K50/o K6%

Konsentrasi substrat

l:-c:r 3 Pengoruh kosentrosi substrot terhodop oktivitos spesifik kotepsin.

?,=€ *.+3 ;

c

*;LT=i\J{

I Prosiding Pertemuon llmioh don Seminor Nos onol MpHpl 20l 1 27

----rE

Semokin bonyok molekul substrot yong tersedio, semokin sering molekul-molekul

tersebut memosuki sisi qktif molekul enzim. Akon tetopi, terdopot keterbotoson dolom

memqcu kecepoton reoksi dengon corq menombohkon lebih bonyok logi substrqt ke suotu

kosentrqsi enzim yong tetop. Pqdo suotu titik tertentu, kosentrosi substrot itu qkon meniodi

cukup tinggi sehinggo semuo sisi oktif podo semuo molekul sudoh ditempoti oleh susbtrot.

Segoro seteloh produk meninggolkon sisi oktif, molekul substrot yong loin okon mosuk. Pqdq

kosentrosi substrot seperti ini, enzim ifu dikotokon mengolomi keienuhon don loiu reoksi

ditentukon oleh kecepoton sisi oktif menguboh substrot meniodi produk. Ketiko suotu enzim

teloh ienuh, sotu-sotunyq corq untuk meningkotkon produktivitos oioloh menombohkon lebih

bonyok logi enzim (Compbell 2OO2l.

Pengoruh pH

Semuq reoksi enzim dipengoruhi oleh pH medium tempot reoksi feriodi. Setiop enzim

memiliki pH optimum yong khos, yoitu pH yong menyebobkon oktivitos moksimol. Profil

oktivitos pH enzim menggomborkon pH podo soot pemberi don penerimo proton yqng

penring podo sisi kotolitik enzim berodo podo tingkot ionisosi yong diinginkon. Nomun podo

pH tertentu (ekstrim) dopot menyebobkqn enzim terdenoturosi yong menyebobkon enzim

kehilongon oktivitos biologisnyo (Lehninger I 993).

Niloi pH songot berpengoruh terhodop oktivitos spesifik enzim kotepsin. Niloi pH

yong memberikon oktivitos spesifik terboik, ditompilkon oleh pH 6 yoitu 0,6660 U/ml. Jiko

pH kurong qtou lebih dori 6, menyebobkon teriodinyo penurunqn oktivitos spesifik dori enzim

korepsin (Gombor 4). Aktivitos spesifik kotepsin yong lebih tinggi podo pH 6 iugo ditemukon

podo ikon nilo (Sherekor el ol. 1988) don doging ikon mos (Horo ef ol. 1988).

pH

Gombor 4 Pengoruh pH terhodop ok.ivitos spesifik kotepsin.

Bobot Molekul Kotepsin

Penentuon bobot molekul dilokukon dengon nrenggunokon teknik SDS-PAGE (Sodium

dedocyl Su/phofes-Poliocrylomido gel E/ekfroforesis). Pcdo metode ini terdopot duo mocom gel

yoitu gel pemisoh (resolving) don gel penohon (sfocking gel) yong mengondung SDS, APS

a s.ffisE

H n.arym

EE m"4+*$a,

E s&mil

E *.uwo

Prosiding Pertemuqn llmioh dqn Seminor Nosionol MPHPI 201 I

:--cnium perisulfot), okrilomido don TEMED serto sompel yorg okon ditentukqn berot

- : .<.J nyo yoitu ekstrok kosor enzin, kotepsin.

i.osil onoliso berot molekul dengon SDS-PAGE dopot dilihot podo Gombor 5. Morker

:-: cigunokon podo onoliso ini berosol dori pormocio. Morker pqrmocio menggunokon

':-:sr LMW (Low Moleculorweight). Podo morker pormocio terlilot odo 6 bond/pito yong

:'rr.)e dituniukkon podo Tobel 2, sedongkon podo ekstrok kqsor terdopot 5 pito.

97 kDo 4i

66 kDo

14,4 kDq*

Morker Enzim kosor

-:-::r 5, Hosil onolisis SDS-PAGE ekstrok kosor enzim kotepsin ik:n potin. M = Mqrker, E=ekstrok kosor

Tqbel I Jenis stondor, berot molekul don niloi Rf stondor pormocio

45 kDo

30 kDq

20,1 kDq

-r'1w (14400-97000) BM Log BMJqrok migrosi Bond

(cm) (cm) Rf

llrcsphorylose b

ADqninOvolbumin

ffionic onhydrose

Trypsin inhibitor

r-Loclolbumin

97000 4,98677266000 4,81954445000 4,65321330000 4,47712120100 4,3031 9614400 4,158362

5

5

5

5

5

5

112

119

2,3

2rg

3r3

4,4

O,24

0,38O,46

0,560,660,88

3erot molekul ekstrok kosor ditentukon berdosorkon personroon regresi lineor ontoro

: ij con logoritmo berot molekul podo stondor (Gombor 6), Persomoon regresi linier

:: :- ! = -1,372x + 5,293 dimono y = log berot molekul norker (kDo), sedongkon

= -:tr ltos relotif protein (cm). Ekstrok kosor enzim kotepsin memiliki berot molekul sebesor

- ' - . )a,21,51 kDo, 29,50 kDo,43,10 kDo, don 55,49 kDo (Tot,el 1).

I Prosiding Periemuon llmioh don Seminor Nrrsionol MPHPI 201 1 29

- -=-

0

E!o

:.Igo5

tbroTD0

6

5

{3

2

I0

Y='1,3718xt 5'X9$9&r * fr.$$43

s.l 0,! t,3 0,4 s"5 0.$ s-? t8 s,$ IRf

Gombor 6. Kurvo stondor SDS-)AGE

Tobel 2 Perhitungon berot molekul ekstrok kosor e nzim kotepsin ikon potin

PoniongBqnd

5

5

5

5

PoniongBond (cm

2

2.4

3

3.5

Log BM BM BM Kd

,l

2

3

4

0.4 -1.372 5,293

0.48 -1.372 5,293

0.6 -1.372 5,293

0.7 -1.372 5,293

55488,12 55,49

43096,3 43,10

29498,5 29,5O

2 t 508 21 ,51

4,74424,634444,46984,3326

Untuk melihot qktivitos enzim dilokukon uii zimogr<rm dengon elektroforesis. Anolisis

zimogrom hompir somo dengon SDS-PAGE, perbedoonnyo podo gel ditomboh substrot yong

somo dengon uii oktivitos dengon spektrofotometri. Sompel podo zimogrqm tidok mengolomi

pemorrosqn seperti podo SDS-PAGE. Seloin itu podo zim!)grom terdopot proses pemulihon

protein dengon coro inkubosi. Hosil onoliso zimogrom dopot dilihot podo gombor 7. Podo

ekstrok kosor terdopot bond bening yong menunfukon :donyo oktivitos enzim kotepsin.

Morker yong digunokqn berupo pormocio dengon kurvt regresi y = -1,160x + 5,266

(Gombor 8). Berot molekul dori bond bening tersebut Jihitung berdosorkon persomoon

regresi dori stondor don diperoleh niloi sebesor 28,28 kDo (Tobel 2). Penelition yong

dilokukon Krouse ef ol. (2010) mennuniukkon bqhwo kotecsin D yong berqsol dori doging

ikon osfrich memiliki bobot molekul 29,1 kDo. Penelition loir yong dilokukon oleh Jiong ef ol.

(1997) mengenoi kotepsin D ikon tongkol don ikon bondetg, menuniukkon bahwo kotepsi D

podo ikon tongkol terestimosi sebesor 5l kDo don podo ikrn bondeng sebesor 54 kDo.

I Prosiding Pertemuon llmioh don l,eminor Nosionol MPHPI 2OI I 30

97 kDa

66 kDo

45 kDo

30 kDq

20.1 kDo

8,88 kDo

14,4kDo re€.Morker Hasil pengendapan

ammonium sulfat

Gombor 6 Zimogrom enzim kotepsin ikon potin.

ur5l

I

41

3

2

1

0.0.

./= -1.1607x + 5.2661R2 = 0.9461

lI

I+-,00 0.20 0.40 0.60 0.80 'r.00 1.20

Rf

Gombor 7 Kvrvo regresi lineor Zimogrom stondur pormocio.

Tobel 3 Perhitungon berot molekul enzim yong men"punyoi oktivitos

lgoE

E(,.oo)o

Ponionglo nd Migrosi

(cm)

PoniongBond Rf(cm)

q b [ogBM Brvr rlJlri':-":,( kosor 3.3 0.702128 -'r.r 6 5,266 4,451532 28283,42 28,28

( "i -pulon

-os l penelition ekstrok kqsor (crude eksfrok) enzim kotepsin menuniukkon oktivitos

:; :. ),a57 U/^g, enzim tersebut dopot diendopkon dengrn menggunokon ommonium

':' :lr :: Enzim kotepsin mempunyoi suhu optimum 50 'C dor pH optimum 6, konsentrosi

: ":- opi,mvm 60/o dengon niloi oktivitos 0,8167 U/ml. Berot nolekul enzim kotepsin kosor

ilS-PAGE 12,97-55,49 kDA don berot rnolekul enzim yong didugo mempunyoi oktivitos

4.7

I Prosiding Pertemuon llmioh don Semino. Nosionol MPHPI 201 1 3l

proteolitik podo onolisis zymogrom odoloh 28,88 kDo. )engendopon dengon menggunokon

ommonium sulfot menghosiikon oktivitqs spesifik 0,23 koli

DAFTAR PUSTAKA

Anonim. 2007. Stofistik Ke/oufon don Perikonon Tohun 2006. Pusot Doto Stotistik don

lnformosi. Deportemen Kelouton dqn Perikonsn. Bodon Pusot Stotistik Republik

lndonesio

Aoki T. Yomoshito T. Ueno R.2OOO. Dislribution of cofhe psins in red ond white muscles omong

fish species. J. Agric. Food Chem . 43 t 327 -330

Beordoll C. Johnston lA. ,l985. Lysosomol enzyme oc'ivities in muscle following storvotion

ond refeeding in the soithe Pol/ochius Virens l.E r. J.Cell Bio/.39''l 12-117.

Bisswonger H. 2004. Procticol Enzymology. Germony: \Viley-VCH'

Brodford MM. ,|976. A Ropid ond sensitive method for rluontificotion of microgrom quontities

of protein utilizing the principle of protein dye binding. Ano/ Biochem72r234-254.

Cheret R, Lodrot CD, Anton M de Lombollerie, Bogni ' YY.2OO7. Colpoin ond cothepsin

octivities in posf morlem fish ond meot muscles. f cod Chemislry'l0l: I474-1479

Dynnor N. 20l l. Pemurnicn don korokterisosi enzim Iotepsin dori ikon bondeng (Chonos

chonos Forskoll). [Skripsi]. Fokultos Perikonqn don llmu Kelouton. lnstitut Pertonion

Bogor.

Dinu D, Dumitru lF, Neichfor MT. 2OO2.lsoloiion ond c[ orocierizotion of two chotepsin f rom

muscle of corrqsius ourotus gibelio. Roum. Biolec'tol. Lelf.7(3),753-758.

Fentiono N. 2009. Peronon Enzim Proteose Jeroon lk< n Bondeng (Chonos chonos) dolom

proses kemunduron mutu. [skripsi]. Bogor: De portemen Teknologi Hosil Peroiron,

Fokultos Perikoncrn don llmu Kelouton, lnstitut Pe rtonion Bogor.

Gc mez-Guille'n MC, Botiso l. 1997. Seosonol chonge s ond preliminory chorocterizoton of

cothepsin D-like octivity in sordine (Sordinr: pi/chordus) muscie' int. J. Food Sci.

Technol., 32 255-264.

Hoord NF. 2OOO. Seofood enzymes: the role of odoptc tion ond onother introspesific foctor.

Dolcm: Hqord NF, Simpson BK, editor. Seofooc Enzymes : lJtilizqtion ond Influence on

Posfhorvest Seofc,od Quo/itiy. New York: Morcei Dekker. lnc. hlm 531-547

Jiong ST, Her YH, Lee JJ, AND Wong JH. 1993. Iomporison of the cothepsin D f rom

Mockerel (Scomber ousfro/osicus) ond Milkfish (Chonos chonos) muscle. Bioscience,

Biolechnology, Biochemislry 57 (4): 57 1 -577.

Jovois JC. .|999.

lmmunocylochemico/ Method ond Profoc:/s. New Jersey: Hurnono Press lnc.

Krouse l, Shonisoni C, Tshidino, Tomohiso O, Yosuhoru, /oughon, Bensh S, Muromoto K, Ryno

JN.2010. Iurificotion qnd portiol chorocterizot on of ostrich skeletol muscle cothepsin

D ond its octivity during meot moturotion. J. Me:lScience.87(3): 196-201.

Kreuzer R. ,1965. The Technology of Fish tJtitizofion. Englond : Fishing News (Books) Ltd,

Ludgote House I l0 Fleet Street London ECa.

Ku.nor A, lgor Y, Goloev, Bo M. 2003. /so/ofion ond t'urificolion Protein New York: Morcel

Dekker lnc.

Loemmli UK. 1970. Cleovoge of structurol protein riuring the sssembly of the heot of

bocteriopho ge 14. Nofure 227(10): 680-685'

I Prosiding Pertemuon llmioh con Seminor Nosionol MPHPI 2011 32

t_

lil H, Yin L, Zhong N, Li S, Mo C. 2008. lsolotion of cothepsin B from the muscle of silvercorp (Hypophtholmichlhys molilrixl ond comporison of cothepsins B ond L octions onsurimi gel softening. Food Chemistry I I 0: 3l 0-31 8.

Ono HH, Schirmeister T. '1997. Sislem Profeoses ond their inhibifors. Chem. Rev g7(l\ "133-172

Edwonsyoh. 2OO2. Pengoruh Konsenfrosi Hidrogen Peroksrdo don lomo perendomon lerhodopMutu lkan Kembung yong di Pindong. USU Librory : Universitos Sumotrs Utoro.

loo MB, Tqnksole ASM, Ghotgote MS, Deshponde W. I998. Moleculor ond BiotechnologicolAspecls of Microbiol Proteoses. Microb. Mol. Biol. Revw. 62: 1092-2171

lrorto, H don Amri, K. 2OO2. Budi Doyo lkqn Potin. Penebor Swodoyo. Jokorto. 90 hol.

lftortono MT. 1989. Enzim don bioteknologi. Bogor : Pusot Antor Universitos.

Ulftoker JR. 1994. Principles of Enzymology for lhe Food Science. Second Edition. New York:Morcel Dekker, lnc.

lqro*rito M, Konogoyo S. 1990. Porticipotion of cothepsin L into extensive softening of themuscle of chum solmon cought during spowning migrotion. Nippon Surson Gokkoishi,5621271-1277.

I Prosiding Pertemuon llmioh don Seminor Nosionol MPHPI 20I I 33i