IDENTIFIKASI KERAGAMAN GEN CALPASTATIN DOMBA LOKAL (Ovis aries) DENGAN METODE PCR-RFLP DAN

HUBUNGANNYA DENGAN BOBOT BADAN

SKRIPSI

ROHMAT DIYONO

PROGRAM STUDI TEKNOLOGI PRODUKSI TERNAK FAKULTAS PETERNAKAN

INSTITUT PERTANIAN BOGOR 2007

IDENTIFIKASI KERAGAMAN GEN CALPASTATIN DOMBA LOKAL (Ovis aries) DENGAN METODE PCR-RFLP DAN

HUBUNGANNYA DENGAN BOBOT BADAN

ROHMAT DIYONO

D14103024

Skripsi ini merupakan salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Peternakan pada

Fakultas Peternakan Institut Pertanian Bogor

PROGRAM STUDI TEKNOLOGI PRODUKSI TERNAK FAKULTAS PETERNAKAN

INSTITUT PERTANIAN BOGOR 2007

IDENTIFIKASI KERAGAMAN GEN CALPASTATIN DOMBA LOKAL (Ovis aries) DENGAN METODE PCR-RFLP DAN

HUBUNGANNYA DENGAN BOBOT BADAN

Oleh

ROHMAT DIYONO

D14103013

Skripsi ini telah disetujui dan disidangkan di hadapan Komisi Ujian Lisan pada tanggal 16 Mei 2007

Pembimbing Utama Pembimbing Anggota Dr. Ir. Cece Sumantri, MAgr.Sc. Dr. Ir. Achmad Farajallah, M.Si

NIP. 131 624 187 NIP. 131 878 947

Dekan Fakultas Peternakan

Institut Pertanian Bogor

Dr. Ir. Ronny R. Noor, MRur.Sc. NIP. 131 624 188

RINGKASAN

ROHMAT DIYONO. 2007. Identifikasi Keragaman Gen Calpastatin Domba Lokal (Ovis aries) Dengan Metode PCR RFLP dan Hubungannya dengan Bobot Badan. Skripsi. Program Studi Teknologi Produksi Ternak. Fakultas Peternakan. Institut Pertanian Bogor. Pembimbing Utama : Dr. Ir. Cece Sumantri, M.Agr.Sc Pembimbing Anggota : Dr. Ir. Achmad Farajallah, M.Si Domba lokal di Indonesia mempunyai produktivitas yang rendah, terutama sifat pertumbuhan dan kualitas daging. Peningkatan produktivitas domba tersebut dapat dilakukan melalui upaya seleksi berdasarkan pada penciri DNA yang disebut dengan Marker Assisted Selection (MAS). Calpastatin merupakan gen yang berfungsi untuk menghambat proses degradasi protein sel otot. Gen calpastatin diduga terkait dengan sifat pertumbuhan otot dan keempukan daging pada mamalia. Penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi keragaman gen calpastatin pada domba lokal (Ovis aries) dan menganalisis hubungan antara genotipe gen calpastatin dengan bobot badan. Sampel darah domba yang digunakan berjumlah 288 sampel yang terdiri dari Domba Ekor Tipis (DET) Jonggol (36), domba Garut Ciomas (29), domba Garut Margawati (29), Domba Ekor Gemuk (DEG) Indramayu (43), DEG Madura (43), 46 DEG Donggala (46), DEG Sumbawa (26), dan DEG Rote (36). Amplifikasi gen calpastatin dilakukan dengan Teknik PCR, sedangkan untuk menentukan genotipenya dilakukan dengan teknik Restriction Fragment Length Polymorphisms (RFLP) dengan enzim restriksi MspI. Analisis hubungan antara genotipe gen calpastatin dengan bobot badan domba dilakukan dengan metode General Linear Model SAS 6.12. Gen calpastatin yang bisa terpotong sempurna menjadi 336 dan 286 pb disebut dengan genotipe MM dan yang tidak terpotong disebut dengan genotipe NN, sedangkan yang tidak terpotong sempurna disebut genotipe MN. Gen calpastatin domba lokal bersifat polimorfik pada semua populasi domba lokal, kecuali domba Rote. Tipe gen calpastatin pada domba Rote semuanya adalah NN atau monomorfik. Frekuensi alel M tertinggi ditemukan pada populasi domba Garut Ciomas (29%) dan terendah pada populasi Domba Ekor Gemuk di Sumbawa dan Madura masing-masing 4%. Frekuensi alel M untuk domba Margawati, Jonggol, Indramayu, dan Donggala secara berturut-turut yaitu 24, 16, 13 dan 12%. Keragaman genetik yang ditunjukkan dengan nilai heterosigositas, juga bervariasi antara subpopulasi dan berkisar antara 8% pada populasi domba Sumbawa dan Madura, sampai 43% pada populasi domba Garut Ciomas. Nilai heterosigositas domba Margawati, Jonggol, Indramayu, dan Donggala secara berturut-turut yaitu 37, 28, 23 dan 21%. Genotipe gen calpastatin berhubungan dengan bobot badan domba jantan (P=0,017) tetapi tidak berhubungan dengan bobot badan domba betina (P=0,847). Rataan bobot badan domba jantan dengan genotipe MN lebih tinggi dibandingkan dengan genotipe NN. Kata-kata kunci ; domba lokal, calpastatin, keragaman genetik, RFLP, bobot badan

ABSTRACT

Detection of Ovine Calpastatin Gene Polymorphisms within Indonesian Local Sheep Population Using PCR-RFLP and Its Effect on Body Weight

Diyono, R., C. Sumantri, and A. Farajallah

Genetic improvement of Indonesian Local Sheep can be gained through selection for traits having economic interest, i.e., meat and growth traits. Calpastatin (CAST) play an essential role in inhibiting muscle protein degradation and responsible for muscle hypertrophy. DNA polymorphisms within the calpastatin gene may lead to the phenotypic differences of sheep growth traits. A 622 bp of Indonesian local sheep calpastatin gene successfully amplified using Polymerase Chain Reaction (PCR) technique. An MspI restriction enzyme cut the PCR product into two different length fragments that are 336 bp and 286 bp and revealed two alleles system, M and N and two genotypes MN and NN. All of Indonesian local sheep population are polymorphic in calpastatin gene, except, Rote Fat Tailed Sheep Population. The highest M allele frequency was found in Garut Ciomas Thin Tailed Sheep population (29%) and the lowest one was found in Sumbawa and Madura Fat Tailed Sheep Population (4%). The allele M frequencies of Margawati, Jonggol, Indramayu, and Donggala Sheep population are 24, 16, 13 and 12%, respectively. The observed heterosigosity was different among population. The highest heterosigosity was found in the Ciomas Sheep (43%) and the lowest one was found in Sumbawa and Madura Sheep population (8%). The observed heterosigosities of Margawati, Jonggol, Indramayu, and Donggala were 37, 28, 23 and 21%, respectively. This research showed that there is an association beetwen calpastatin genotipe and body weight of male sheep (P=0,017) but not for female sheep (P=0,847). Male sheeps with MN genotype have higher body weight compared to NN genotipe. Keywords : sheep, calpastatin , genetic polymorphims, RFLP, body weight

RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan pada tanggal 11 Juli 1985 di Temanggung Jawa Tengah.

Penulis adalah anak keempat dari empat bersaudara dari pasangan Bapak Brahim dan

Ibu Wagini (Almh).

Pendidikan dasar diselesaikan pada tahun 1997 di SDN Prangkokan,

pendidikan lanjutan menengah pertama diselesaikan pada tahun 2000 di SLTP

Negeri 2 Candiroto, dan pendidikan lanjutan menengah atas diselesaikan pada tahun

2003 di SMU Negeri 1 Parakan, Temanggung. Penulis diterima sebagai mahasiswa

IPB pada Program Studi Teknologi Produksi Ternak, Departemen Ilmu Produksi dan

Teknologi Peternakan, Institut Pertanian Bogor (IPB) melalui jalur Undangan Seleksi

Masuk IPB (USMI) pada tahun 2003.

Selama mengikuti pendidikan, penulis aktif di Badan Eksekutif Mahasiswa

(BEM) Fakultas Peternakan IPB periode 2004-2005. Selain aktif dalam

keorganisasian intra kampus, penulis juga aktif di organisasi mahasiswa daerah yaitu

Paguyuban Mahasiswa Temanggung Makukuhan (PMTM) dan terpilih sebagai ketua

umum periode 2004-2005. Dalam bidang akademik, penulis pernah menjadi asisten

dosen mata kuliah Matematika I dan Kalkulus I pada program Tingkat Persiapan

Bersama (TPB) tahun ajaran 2004/2005.

KATA PENGANTAR

Puji dan syukur penulis senantiasa panjatkan kepada Alloh Swt., karena atas

segala rahmat dan karunia-Nya, penulisan skripsi ini dapat terselesaikan. Skripsi ini

berjudul Identifikasi Keragaman Gen Calpastatin Domba Lokal (Ovis aries) dengan

Metode PCR-RFLP.

Domba lokal di Indonesia masih mempunyai produktivitas yang rendah

khususnya sifat pertumbuhan dan kualitas daging. Beberapa upaya telah dilakukan

untuk meningkatkan produktivitas domba diantaranya perbaikan pakan dan

manajemen pemeliharaan, seleksi, persilangan, dan kombinasi antara seleksi dan

persilangan. Akhir-akhir ini, seleksi dapat dilakukan dengan menggunakan penciri

DNA, yaitu dengan memanfaatkan hubungan antara keragaman DNA dengan sifat

kuantitatif. Selanjutnya seleksi hanya dilakukan terhadap ternak-ternak yang

mempunyai tipe DNA (alel) tertentu yang terkait dengan sifat produksi unggul.

Salah satu tujuan penulisan skripsi ini untuk memberikan informasi tentang

keragaman gen calpastatin pada domba lokal, yaitu gen yang terkait dengan sifat

pertumbuhan dan kualitas daging. Informasi keragaman gen calpastatin tersebut,

selanjutnya diharapkan menjadi dasar seleksi berdasarkan penciri DNA (marker

assisted selection) untuk meningkatkan sifat pertumbuhan dan kualitas daging domba

lokal. Penulis berharap semoga skripsi ini dapat memberikan sumbangan terhadap

pembangunan peternakan di Indonesia. Amiin.

Bogor, Mei 2007

Penulis

DAFTAR ISI

Halaman RINGKASAN…………………………………………………………... i

ABSTRACT…………………………………………………………….. ii

LEMBAR PERNYATAAN…………………………………………….. iii

LEMBAR PENGESAHAN…………………………………………….. iv

RIWAYAT HIDUP………………………………...…………………… v

KATA PENGANTAR………………………………………………….. vi

DAFTAR ISI…………………………………………………………..... vii

DAFTAR TABEL……………………………………………………..... ix

DAFTAR GAMBAR…………………………………………………… x

DAFTAR LAMPIRAN………………………………………………..... xi

PENDAHULUAN……………………………………………………… 1

Latar Belakang………………………………………………….. 1 Tujuan…………………………………………………………... 1

TINJAUAN PUSTAKA………………………………………………... 2

Domba Lokal di Indonesia……………………………………… 2 Domba Ekor Tipis Jawa………………………………… 2 Domba Priangan (Domba Garut)……………………….. 3 Domba Ekor Gemuk…………………………………… 3

Polymerase Chain Reaction - Restriction Fragment Length Polymorphism (PCR RFLP)............................................. 4 Keragaman Gen Calpastatin ....................................................... 4 Hubungan Antara Sistem Calpain-Calpastatin dengan Sifat Pertumbuhan …………………………………………………… 5

METODE ……………...……………………………….......................... 7

Lokasi dan Waktu………………………………………………. 7 Materi…………………………………………………………… 7

Sampel Darah…………………………………………… 7 Primer……………………………………....................... 7

Prosedur …………………...…………………………………… 7 Ekstraksi DNA dari Sampel Darah dalam Etanol 95%... 7

Amplifikasi Gen Calpastatin (CAST)dengan Teknik Polymerase Chain Reaction (PCR) ..................................

8

Identifikasi Genotipe Gen Calpastatin dengan Metode Restriction Fragment Lenght Polymorphisms (RFLP).....

8

Elektroforesis dan Pewarnaan Perak ............................... 8 Pendeteksian Keragaman Gen calpastatin........................ 9

Analisis Data................................................................................. 9

HASIL DAN PEMBAHASAN………………………………………..... 11

Amplifikasi Gen Calpastatin........................................................ 11 Pendeteksian Keragaman Gen Calpastatin dengan RFLP ........... 12 Keragaman Genetik Gen Calpastatin Domba Lokal ................... 14

Keragaman Genetik Domba Ekor Tipis (DET)................ 15 Keragaman Genetik Domba Ekor Gemuk (DEG)............ 16 Hubungan antara Genotipe Gen Calpastatin dengan Bobot Badan Domba .................................................................... 16

KESIMPULAN DAN SARAN………………………………………..... 19

Kesimpulan……………………………………………………... 19 Saran…………………………………………………………...... 19

UCAPAN TERIMAKASIH…………………………………………...... 20

DAFTAR PUSTAKA…………………………………………………... 21

LAMPIRAN…………………………………………………………...... 24

DAFTAR TABEL

Nomor Halaman

1. Nilai Frekuensi Genotipe, Frekuensi Alel, Standar Eror Frekuensi Alel (SE), dan Nilai Heterosigositas (ĥ) Lokus CAST-MspI Domba Lokal Indonesia........................................................ 14

2. Rataan Bobot Badan Domba ( X ) dan Simpangan Baku Rataan (SE) antara Genotipe MN dan NN.......................................... 17

DAFTAR GAMBAR

Nomor Halaman

1 Estimasi Struktur Gen Calpastatin Domba.................................. 11

2 Sekuen Nukleotida Gen Calpastatin Lokus CAST-MspI ............. 11

3 Perbedaan Sekuen Nukleotida Gen Calpastatin pada Lokus CAST-MspI......................................................................... 12

4 Pola Pita Gen Calpastatin Domba dalam Gel Poliakrilamid 6%..................................................................................... 13

DAFTAR LAMPIRAN

Nomor Halaman

1 Analisis Ragam Respon Genotipe Gen Calpastatin terhadap Bobot Badan Domba Jantan dan Hasil Uji Lanjutan (Uji Duncan)…………………………………………………………. 24

2 Analisis Ragam Respon Genotipe Gen Calpastatin terhadap Bobot Badan Domba Betina…………………………………….. 24

PENDAHULUAN

Latar Belakang

Populasi domba lokal di Indonesia tergolong masih rendah, yaitu sekitar

8.307.000 ekor, sedangkan produksi daging domba hanya 66.500 ton (3,15%) dari

total produksi daging dalam negeri (DJBPP, 2005). Domba-domba lokal Indonesia

diberi nama sesuai dengan daerah dan karakteristiknya, seperti domba Donggala,

domba Garut, domba Kisar, Domba Ekor Gemuk, Domba Ekor Tipis Jawa dan

Domba Ekor Tipis Sumatera. Domba lokal mempunyai beberapa keunggulan, antara

lain mampu beradaptasi dengan baik pada lingkungan tropis, tidak mengenal musim

kawin, bersifat prolifik, dan kebal terhadap beberapa macam penyakit dan parasit.

Namun demikian, domba lokal mempunyai produktifitas yang rendah. Peningkatan

produktifitas domba lokal dapat dilakukan dengan cara seleksi. Seleksi pada domba

lokal dilakukan terhadap sifat-sifat yang mempunyai nilai ekonomis tertentu. Salah

satu sifat yang mempunyai nilai ekonomis tinggi adalah sifat pertumbuhan.

Kemajuan dalam bidang biologi molekuler memungkinkan upaya seleksi

dapat dilakukan pada tingkat DNA, yaitu dengan cara mencari keragaman gen yang

mengontrol sifat ekonomis. Pemetaan lokus terkait dengan sifat kuantitatif (QTL)

dan pencarian tipe DNA (alel) yang terkait dengan sifat unggul merupakan dasar

penerapan program MAS (Marker Assisted Selection). Metode seleksi ini dapat

digunakan untuk mendeteksi sifat unggul dari seekor ternak dalam waktu yang relatif

lebih cepat. Calpastatin merupakan sebuah gen yang berfungsi untuk menghambat

degradasi protein sel-sel otot. Peningkatan aktivitas calpastatin menyebabkan

terjadinya pertambahan massa otot (hyperthropy) dan penurunan keempukan daging.

Keragaman gen calpastatin diduga terkait dengan sifat pertumbuhan domba lokal.

Identifikasi keragaman gen calpastatin dapat dilakukan dengan metode Polymerase

Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism (PCR-RFLP).

Tujuan

Penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi keragaman gen calpastatin

domba lokal (Ovis aries) lokus CAST-MspI dan menganalisis hubungan antara

genotipe gen calpastatin dan bobot badan domba.

TINJAUAN PUSTAKA

Domba Lokal di Indonesia

Domba merupakan hewan ruminansia yang berkuku belah dan termasuk

dalam subfamili Caprinae dari famili Bovidae. Semua domba termasuk dalam genus

Ovis dan yang terdomestifikasi adalah Ovis aries (Blakely dan Bade, 1991). Domba-

domba terdomestifikasi yang ada sekarang memiliki komposisi genetik dari domba

Argali (Ovis ammon) yang berkembang di Asia Tengah, domba Urial (Ovis vignei) di

Asia, domba Moufflon (Ovis musimon) di Asia Kecil dan Eropa (Devendra dan

McLeroy, 1982).

Menurut Diwyanto (1982), domba lokal Indonesia dapat digolongkan

menjadi tiga kelompok, yaitu Domba Ekor Tipis (DET), Domba Ekor Sedang (DES)

dan Domba Ekor Gemuk (DEG). Domba Ekor Tipis mempunyai lebar pangkal ekor

kurang dari 4 cm, Domba Ekor Sedang 4 - 8 cm, dan Domba Ekor Gemuk lebih dari

8 cm. Domba Ekor Tipis banyak dijumpai pada daerah-daerah yang relatif basah

seperti di Jawa Barat, sedangkan Domba Ekor Gemuk terutama tersebar pada daerah-

daerah kering seperti di Jawa Timur dan Nusa Tenggara (Sutana, 1993 ; Doho,

1994).

Domba Ekor Tipis Jawa

Domba Ekor Tipis Jawa memiliki ekor tipis dan pendek. Sekitar 80 – 85%

jenis domba ini terdapat di daerah Jawa Tengah dan Jawa Barat dan sisanya

merupakan Domba Priangan. Jenis domba ini berukuran kecil. Bobot badan betina

dewasa bervariasi dari 25- 35 kg dengan tinggi badan rata-rata 57 cm. Bobot badan

domba jantan dewasa berkisar antara 40 – 60 kg dengan tinggi badan rata-rata 60

cm. Pada umumnya domba ini mempunyai bobot potong 19 kg (Devendra dan

McLeroy, 1982). Domba Ekor Tipis Jawa memiliki warna dominan putih dan

terdapat belang hitam di sekeliling mata, hidung, dan kadang-kadang diseluruh

tubuhnya. Bagian ekornya tidak menunjukkan adanya deposisi lemak. Domba jantan

memiliki tanduk yang melengkung, sedangkan domba betina biasanya tidak

bertanduk. Domba Ekor Tipis Jawa mempunyai telinga ukuran sedang dan wool

yang kasar (Mason, 1980).

Domba Priangan (Domba Garut)

Domba Priangan merupakan domba ekor tipis yang tersebar di daerah Jawa

Barat, terutama di daerah Garut sehingga disebut domba Garut (Gatenby, 1991).

Domba Priangan mulai dikembangkan pada tahun 1864 melalui persilangan tiga

bangsa domba, yaitu Domba Ekor Tipis Jawa, domba Merino dan domba Cape yang

diduga berasal dari Afrika Selatan. Domba Priangan mempunyai ukuran tubuh yang

lebih besar dibandingkan dengan Domba Ekor Tipis Jawa. Jenis domba ini

mempunyai bentuk muka yang cembung dan sering ditemukan domba dengan telinga

rumpung (tidak mempunyai daun telinga). Warna wool bermacam-macam yaitu

hitam, abu-abu, putih dan belang-belang hitam. Pada bagian pangkal ekornya

terdapat sedikit timbunan lemak. Domba betina tidak bertanduk, sedangkan domba

jantan memiliki tanduk yang melengkung. Bobot badan Domba Priangan betina

sebesar 35 – 40 kg, sedangkan bobot domba jantan mencapai 50 – 60 kg. Domba

Priangan termasuk domba yang prolifik, interval beranak yang pendek, dan jumlah

anak yang dihasilkan pertahun rata-rata sebesar 1,7. Domba Priangan banyak

digunakan untuk meningkatkan komposisi genetik (upgrading) domba lokal yang

terdapat pada daerah tersebut (Devendra dan McLeroy ,1982).

Domba Ekor Gemuk.

Domba Ekor Gemuk merupakan domba khas daerah Jawa Timur. Populasi

Domba pada awalnya banyak dijumpai di Pulau Madura kemudian menyebar ke

daerah Jawa Timur lainnya (Edey, 1983). Domba Ekor Gemuk dapat ditemukan di

pulau-pulau wilayah timur Indonesia, seperti Lombok, Sumbawa, Kisar dan Rote.

Domba jenis ini juga terdapat di bagian selatan Pulau Sulawesi, yaitu di daerah

Donggala. Domba Ekor Gemuk yang terdapat di Donggala kemudian disebut dengan

domba Donggala. Ciri-ciri kusus domba ekor gemuk adalah berbulu kasar, tidak

bertanduk, warna putih dan telinga sedang (Mason, 1980). Domba jantan kadang-

kadang bertanduk tetapi ukurannya kecil (Edey, 1983). Panjang ekor normal 15-18

tulang vertebrae, berbentuk huruf S dan menyimpan lemak dalam jumlah besar.

Bobot badan domba ekor gemuk jantan unggul dapat mencapai 43 kg, betina 40 kg

dan rataan bobot potong 24 kg. Domba betina sangat prolifik dengan selang beranak

hanya 8 – 9 bulan, umur pertama kali beranak antara 11-17 bulan, dan dapat

menghasilkan 2,34 anak sapihan pertahun (Devendra dan McLeroy, 1982).

Polymerase Chain Reaction - Restriction Fragment

Length Polymorphism (PCR – RFLP)

Metode Polymerase Chain Reaction (PCR) merupakan suatu metode yang

dapat digunakan untuk memperbanyak segmen DNA secara in vitro (Ausubel, 1995).

Segmen DNA tersebut kemudian dapat diketahui runutan nukleotidanya, salah

satunya yaitu dengan menggunakan enzim restriksi. Enzim restriksi dapat memotong

DNA secara spesifik dan terbatas pada situs yang dikenalinya (Lewin, 1994).

Perbedaan pola pemotongan DNA dari jenis gen yang sama antar beberapa ternak

disebut Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP). Pada prinsipnya, RFLP

merupakan semua mutasi yang menghilangkan atau menciptakan sekuen rekognisi

baru bagi enzim restriksi. Penyisipan (insersi), penghilangan (delesi), maupun

subtitusi nukleotida yang terjadi pada daerah rekognisi suatu enzim restriksi

menyebabkan tidak lagi dikenalinya situs pemotongan enzim restriksi dan terjadinya

perbedaan pola pemotongan DNA (Lewin, 1994). Metode RFLP telah diterapkan

untuk mendeteksi Quantitative Traits Loci (QTL) pada ternak. Pendeteksian RFLP

telah dikembangkan dan digunakan untuk studi linkage pada ternak seperti sapi,

ayam dan babi. Pendeteksian RFLP dilakukan pada sekuen DNA yang telah

diketahui fungsinya, misalnya gen (penyandi protein), dan juga pada sekuen DNA

yang belum jelas fungsinya (Montgomery dan Kinghorn, 1997).

Keragaman Gen Calpastatin

Gen calpastatin terletak pada kromosom domba nomer 5 (Hediger et al.,

1991) sedangkan pada ternak sapi (Bos taurus) terletak pada kromosom nomer 7

(Bishop et al., 1993; Kappes et al., 1997). Gen calpastatin dengan simbol CAST

terletak diantara dua penciri apit mikrosatelit MCM527 dan BMS1247 pada posisi

lokus 5q15 – q21 antara 96,057-96,136 Mb. Hasil analisis Quantitative Traits Loci

(QTL) menunjukkan bahwa gen calpastatin berasosiasi kuat dengan sifat

pertumbuhan pada domba silang balik antara DET dengan domba Merino

(Margawati, 2005).

Palmer et al. (1998) melaporkan bahwa terdapat keragaman gen calpastatin

domba Dorset pada bagian ekson 1C, intron 1 dan ekson 1D (no.akses GenBank

AF016006 dan AF016007). Hasil pemotongan produk PCR dengan enzim restriksi

MspI dan NcoI menghasilkan dua alel, yaitu alel M dan N. Enzim restriksi MspI

menghasilkan produk 336 dan 286 bp sedangkan NcoI menghasilkan potongan

produk 374 dan 248 bp. Beberapa penelitian serupa juga telah dilakukan pada ternak

sapi. Lonergan et al. (1995) menemukan keragaman DNA gen bovine calpastatin

pada lokus BamHI dan EcoRI. Chung et al. (1999) menemukan keragaman gen

calpastatin dengan metode PCR-SSCP. Primer yang didesain dari domain I cDNA

bovine calpastatin (nomor akses GenBank : L14450), berhasil mengamplifikasi lokus

CAST1 sepanjang 500 pb dan menghasilkan dua alel, yaitu alel A dan B. Keragaman

gen calpastatin tersebut terkait erat dengan sifat pertumbuhan sapi Angus jantan.

Sapi Angus dengan genotipe BB mempunyai bobot badan lebih tinggi dari pada sapi

dengan genotipe AB dan AA.

Hubungan Antara Sistem Calpain-Calpastatin dengan Sifat Pertumbuhan

Pertumbuhan adalah peningkatan ukuran tubuh dan perubahan komposisi

tubuh seiring dengan semakin bertambahnya umur anak domba. Sifat pertumbuhan

pada anak domba dipengaruhi oleh banyak faktor. Beberapa diantaranya yang adalah

tingkat pemberian pakan, genotip, jenis kelamin, kesehatan dan manajemen

pemeliharaan (Gatenby, 1991). Pada tingkat sel pertumbuhan hewan ternak dapat

didefinisikan sebagai hyperplasia yaitu pertambahan jumlah sel melalui proses

mitosis, dan hypertropi yaitu bertambahnya ukuran atau volume sel-sel otot

(Hossner, 2005). Menurut Chung et al. (1999), kejadian hypertropi ini erat kaitanya

dengan sistem calpain-calpastatin yang terdapat dalam jaringan tubuh.

Calpain merupakan sebuah enzim proteolytic terkait dengan ion kalsium

(Ca2+), yang ada dalam dua bentuk, yaitu μ-calpain dan m-calpain. μ-calpain

merupakan calpain yang memerlukan ion Ca2+ dalam konsentrasi rendah, sedangkan

m-calpain merupakan calpain yang memerlukan ion Ca2+ dalam konsentrasi tinggi.

Calpain berfungsi untuk mendegradasi protein sel-sel otot (myofibril) di dalam

jaringan otot (Goll et al., 1992). Selanjutnya dinyatakan oleh Killefer dan

Koohmaraie (1993) bahwa aktivitas calpain dalam jaringan otot postmortem dapat

menyebabkan struktur protein sel otot menjadi lemah. Hal ini berakibat pada kualitas

daging yang menjadi lebih empuk. Selain μ-calpain dan m-calpain, dalam sistem

calpain juga terdapat calpastatin. Calpastatin ini merupakan inhibitor spesifik

terhadap fungsi μ-calpain dan m-calpain. Morgan et al. (1993) melaporkan bahwa

ketika aktivitas degradasi protein pada jaringan otot hewan hidup menurun, maka

aktivitas calpastatin meningkat.

Aktivitas calpastatin yang tinggi dapat ditemukan pada domba yang

mempunyai fenotipe callipyge. Kejadian hipertropi ini disebabkan oleh kandungan

DNA otot yang tinggi sehingga dapat meningkatkan kapasitas sintesis protein otot.

Kejadian hipertropi terjadi setelah hewan dilahirkan sehingga tidak menyebabkan

kesulitan beranak (dystocia). Selain itu hipertropi pada domba callipyge juga

disebabkan oleh menurunnya degradasi protein otot sebagai akibat dari

meningkatnya aktivitas calpastatin (Koohmaraie et al., 1995).

METODE

Lokasi dan Waktu

Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Zoologi, Departemen Biologi

Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.

Penelitian ini dilakukan selama 6 bulan, yaitu dari bulan Juli - Desember 2006.

Materi

Sampel Darah

Sampel darah yang digunakan adalah sampel darah dalam Etanol 95%

koleksi Dr.Ir.Cece Sumantri, MAgr.Sc., Departemen IPTP Fakultas Peternakan IPB.

Sampel darah domba yang digunakan berjumlah 288 yang berasal dari Ciomas (29),

Jonggol (36), Indramayu (43), UPTD BPPTD Margawati (29) , Madura (43),

Donggala (46), Sumbawa (26) dan Rote (36). Domba Ciomas merupakan domba

Garut tipe tangkas, sedangkan domba Margawati merupakan domba tipe pedaging.

Domba Garut dan Jonggol merupakan Domba Ekor Tipis (DET). Domba Indramayu

(domba asal Jawa Timur), Madura, Donggala, Rote dan Sumbawa merupakan bangsa

Domba Ekor Gemuk (DEG). Domba yang diambil sampel darahnya mempunyai

catatan bobot badan (kg) dan ada tiga kelompok umur yang berbeda, yaitu umur

kurang dari 1 tahun, 1-2 tahun dan 3-4 tahun.

Primer

Primer adalah molekul pendek utas tunggal DNA yang akan menempel pada

DNA cetakan pada tempat yang spesifik. Sekuen primer yang digunakan dalam

penelitian ini berdasarkan pada Palmer et al. (1998), yaitu primer foward (AF33) 5’

TGGGGCCCAATGACGCCATCGATG 3’ (ekson 1C) dan primer reverse (AF34)

5’ GGTGGAGCAGCACTTCTGATCACC 3’ (ekson 1D).

Prosedur

Ekstraksi DNA dari Sampel Darah dalam Etanol 95%

Sampel darah total yang disimpan dalam etanol 95% disentrifugasi 3500 rpm

selama 5 menit. Endapan sel-sel darah yang diperoleh dicuci dengan bufer TE

sebanyak dua kali. Sekitar 100 µl sel-sel darah yang telah bebas dari etanol

disuspensikan dengan 1 x STE sampai volume mencapai 350 µl. Sel-sel darah

kemudian dilisis dengan 20 µl proteinase K (10 mg/ml) dan 40 µl 10% SDS.

Campuran ini dikocok pelan-pelan selama 2 jam pada suhu 55 °C.

Pemurnian DNA dilakukan degan metode fenol-kloroform, yaitu dengan

menambahkan 1/10 volume 5 M NaCl, 1 x volume larutan fenol dan 1 x volume

kloroform : iso amil alkohol (24:1), kemudian dikocok pelan pada suhu ruang selama

2 jam. Fase DNA dipisahkan dari fase fenol dengan sentrifugasi pada kecepatan 7000

rpm selama 5 menit. Molekul DNA diendapkan dengan menambahkan 1/10 x

volume 5 M NaCl dan 2 x volume etanol absolut. Endapan DNA yang dihasilkan

dicuci dengan 70% etanol kemudian diendapkan lagi pada kecepatan 7000 rpm

selama lima menit. Sisa etanol dibuang dan diuapkan dengan menggunakan pompa

vakum. DNA kemudian dilarutkan dengan 80 µl 80% bufer TE.

Amplifikasi Gen Calpastatin (CAST)dengan Teknik Polymerase Chain Reaction (PCR) Volume pereaksi amplifikasi DNA adalah 25 µl yang terdiri dari 10-100 ng

DNA, pasangan primer masing-masing 25 pmol, 0.87 unit enzim Taq polymerase

dan buffernya (New England BioLabs), 2 mM dNTP, dan 2,5 mM MgCl2. Inkubasi

dilakukan pada mesin thermocycler (TaKaRa PCR Thermal Cycler MP4). Kondisi

PCR yang digunakan terdiri dari denaturasi awal pada suhu 94 oC selama 4 menit, 30

siklus yang terdiri dari denaturasi pada suhu 94 oC selama 10 detik, penempelan

primer pada suhu 48 oC selama 1 menit, dan tahap pemanjangan pada suhu 72 oC

selama 2 menit. Pemanjangan akhir molekul DNA dilakukan pada suhu 72 oC selama

7 menit.

Identifikasi Genotipe Gen Calpastatin dengan Metode Restriction Fragment Lenght Polymorphisms (RFLP)

Produk PCR kemudian dipotong dengan enzim restriksi MspI (New England

BioLabs) yang mengenali situs C|CGG. Kondisi pemotongan mengikuti petunjuk

produsen, yaitu 2 µl produk PCR dicampur dengan 1-2 Unit MspI dalam 1 x bufer

(New England BioLabs), dan diinkubasi pada suhu 37 oC selama semalam.

Elektroforesis dan Pewarnaan Perak

Visualisasi fragmen DNA produk PCR yang telah dipotong dilakukan dengan

teknik elektroforesis gel poliakrlamida 6 % yang diikuti dengan pewarnaan perak

(Tegelstrom, 1992). Gel dibuat dengan cara mencampurkan 12 ml air destilata; 4 ml

5 x TBE ; 4 ml akrilamida 30 % ; 15 µl TEMED, dan 160 µl APS 10 %. Sebanyak

2 µl produk inkubasi dicampur dengan Loading dye + 6µl (Bromthymol blue 0,01%,

Xylene Cyanol 0,01% dan gliserol 50%). Elektroforesis dilakukan pada tegangan

konstan 220 mVolt selama 30 menit atau setelah pewarna bromthymol blue

mencapai bagian bawah gel. Setelah elektroforesis selesai, gel diambil untuk

dilakukan pewarnaan perak.

Tapan pewarnaan perak yaitu gel dimasukkan ke dalam larutan CTAB 0,2

gram /200 ml air destilata selama delapan menit sambil digoyang. Kemudian dicuci

dengan air destilata selama 2 x 2 menit. Air tersebut di buang dan ditambahkan

larutan NH4OH (2,4 ml NH4OH/200 ml air destilata) selama 6 menit sambil

digoyang-goyang. Kemudian dilanjutkan dengan larutan perak nitrat (AgNO3)

selama 10 menit sambil digoyang-goyang. Kemudian gel dicuci kembali dengan air

destilata 2 x 2 menit. Untuk memunculkan pita, gel direndam dalam larutan yang

terdiri atas Na2CO3 dan formadehid 378%. Setelah pita muncul larutan asam asetat

dituangkan untuk menghentikan aktifitas oksidasi perak oleh formadehid.

Pendeteksian Keragaman Gen Calpastatin

Setiap pita DNA yang muncul dibandingkan ke marker untuk mengetahui

panjangnya. Setiap pita DNA dari setiap sampel diperbandingkan untuk menentukan

genotipe pita DNA. Satu posisi migrasi yang sama dianggap sebagai satu tipe atau

alel.

Analisis Data

Keragaman genotipe tiap-tiap individu dapat ditentukan dari pita-pita DNA

gen yang ditemukan. Masing-masing sampel dibandingkan berdasarkan ukuran

(marker) yang sama dan dihitung frekuansi alelnya. Frekuensi alel dihitung

berdasarkan rumus Nei (1987) :

Xi = (2nij + ∑nij)/(2n)

Keterangan :

Xi = frekuensi alel ke-i

nij = jumlah individu yang bergenotipe ii

nii = jumlah individu yang bergenotipe ij

n = jumlah sampel

Derajat heterozigositas (ĥ) dihitung berdasarkan frekuensi alel pada tiap lokus

DNA dengan rumus Nei (1987) :

ĥ = 2n (1 - ∑Xi2)/(2n – 1)

Keterangan :

Xi = frekuensi alel

ĥ = nilai heterozigositas lokus

Analisis hubungan antara genotipe gen calpastatin dengan bobot badan

dilakukan dengan metode General Linear Model (GLM) dengan program SAS 6.12,

dengan model sebagai berikut :

Yijkl = μ + Gi + Uj + Dk + G*Uij + G*Dik + Eijk Keterangan :

Y ijk = respon bobot badan

μ = nilai tengah umum

Gi = pengaruh genotipe ke-i

Uj = pengaruh umur ke-j

Dk = pengaruh kelompok daerah ke-k

G*Uij = pengaruh interaksi antara genotipe dan umur

G*Dik = pengaruh interaksi antara genotipe dan daerah asal

Eijk = pengaruh galat perlakuan pada pengamatan ke-ijk

HASIL DAN PEMBAHASAN

Amplifikasi Gen Calpastatin

Metode Polymerase Chain reaction (PCR) digunakan untuk mengamplifikasi

gen calpastatin lokus CAST-MspI pada domba lokal. Struktur gen calpastatin domba

lokal yang telah teramplifikasi dapat dilihat pada Gambar 1. Primer yang digunakan

berhasil mengamplifikasi ruas gen calpastatin sebesar 622 pb (Gambar 2). Suhu

penempelan primer dalam penelitian ini adalah 48°C. Kondisi ini berbeda dengan

suhu penempelan primer yang disarankan oleh Palmer et al. (1998) yaitu 62°C.

GenBank : OAU66320 GenBank : OAU66320

UTR Ex. 1C intron 1 Ex. 1D UTR

3’ 5’ 1 243 951 / 1 61 534 611/ 1089 2 416 2604 GenBank : AF016006

Gambar 1. Struktur gen calpastatin domba tctacctaca tagaggaact gggtaaaaga gaagtcacac ttcctccaaa atatagggaa cttttgaata aagaagaagg gatcgcaggg cctcctccag

actcctcgaa acccctgggg cccaatgacg ccatcgatgc cttgtcatca

AF 33

gacttcacct gcagttcccc tacagctgat gcaaagaaaa ctgagaaaga ggtattgttt ttaatgcact cagggaaact tgttagaaac tacctcccac tttaagacaa caactttttt ttaaacttta tttttgactt cgctgggtct tcattgctgt gttcgggctt tctctagttg gggcaagcga gggctattct ctagttgcga tgtgcagcct tctgcaggtg gcttctcttg ttgcagagcc ggggctctgg gtgcacaggc ttcagttgtt gtgacttgag agctctagag cacaggctca gtggtcgtgg ctcacaggct tactccacgg catgtgggat cttccctggc cagggagcga acccgtgtcc cctgcgttgc aaggcggcct cttaaccact ggccaccagg gaagccccaa gatgccaagg ctttttactt ctggttctta ccgtctggtt aatacatttc cttcatctgc cagtcaaacc ttcttttgta tttcattttt cagaaatcta cagaagaggc tttaaaagct cagtcagctg gggtgatcag aagtgctgct ccacccaaag agaaaagaag

aaaagtggaa gaggatacca tgactgagca agccctggag gccctgtctg cctccctggg cacccggaag ccaaggccag agctcgaccc cagctccatt

AF 34

Gambar 2. Sekuen nukleotida gen calpastatin lokus CAST-MspI, AF33 dan AF34 masing-masing merupakan primer foward dan primer reverse ( Sumber : www. ncbi.nlm.nih.gov)

Persentase keberhasilan primer dalam mengamplifikasi gen calpastatin lokus

CAST-MspI dalam penelitian ini hanya sekitar 70%. Sebanyak 201 sampel berhasil

teramplifikasi dari total 288 sampel. Menurut Palumbi (1996) keberhasilan dalam

mengamplifikasi DNA tergantung pada interaksi komponen campuran PCR. Al-Soud

dan Radstrom (2001) menyatakan bahwa keberhasilan amplifikasi juga dipengaruhi

oleh adanya haemoglobin yang dapat menghambat kerja enzim taq polymerase.

Dalam hal ini, diduga bahwa koleksi darah utuh dalam etanol yang sebelumnya tanpa

dilakukan pemisahan sel-sel darah memungkinkan kontaminasi haemoglobin dalam

sampel DNA (Prasetyo, 2005).

Pendeteksian Keragaman Gen Calpastatin dengan RFLP

Metode Restriction Fragment Length Polymorphisms (RFLP) digunakan

untuk mengidentifikasi keragaman gen calpastatin domba lokal. Enzim restriksi

yang digunakan yaitu MspI yang mengenali situs pemotongan empat basa C│CGG,

yang terletak di daerah intron 1 antara ekson 1C dan 1D. Keragaman gen calpastatin

domba disebabkan oleh adanya mutasi titik yang terjadi pada posisi basa ke-261

nomor akses GenBank AF016006. Terjadinya subtitusi basa (transisi) G – A

(Gambar 3) menyebabkan situs pemotongan untuk enzim restriksi MspI berubah.

Produk PCR gen calpastatin sepanjang 622 pb berhasil dipotong dan menghasilkan

dua alel, yaitu alel M dan N.

Alel M (AF016006) : -------------TTGCAGAGCC│GGGGCTCTGG-------- Alel N (AF016007) : -------------TTGCAGAGCC│AGGGCTCTGG--------

Gambar 3. Perbedaan sekuen nukleotida gen calpastatin pada lokus CAST-MspI

yang disebabkan karena subtitusi basa G – A . Alel M mempunyai nukleotida G pada posisi basa ke-261, sedangkan alel N mempunyai nukleotida A (Nomor akses GenBank : AF016006 dan AF016007) Sumber : www. ncbi.nlm.nih.gov

Pada lokus CAST-MspI, ternak domba dikatakan mempunyai genotipe MM

apabila terdapat dua fragmen (pita) DNA dengan panjang 336 dan 286 pb. Genotipe

MN ditunjukkan dengan tiga fragment DNA yaitu 622, 336 dan 286 pb. Genotipe

NN ditunjukkan dengan terdapatnya satu fragmen DNA yaitu 622 pb (Gambar 4).

Ternak domba dengan genotipe homosigot (MM atau NN) berarti bahwa kedua tetua

masing-masing menyumbangkan gen (alel) yang sama. Domba dengan genotipe

heterosigot (MN) merupakan kombinasi gen yang berbeda dari kedua tetuanya.

Dalam penelitian ini, dari total sampel 201 domba yang berasal dari delapan daerah

tidak ditemukan ternak domba dengan genotipe MM.

Pada penelitian lain dilaporkan adanya keragaman gen calpastatin lokus yang

sama yang diidentifikasi dengan metode Polymerase Chain Reaction-Single Strand

Conformation Polymorphisms (PCR-SSCP) (Palmer et al., 1999b). Identifikasi

dengan metode PCR-SSCP pada gen calpastatin menghasilkan tiga jenis alel yaitu

alel A, B, dan C. Berdasarkan referensi nomor akses GenBank AF016006, alel M

pada penelitian ini sama dengan alel A. Nomor akses GenBank AF016007

menunjukkan bahwa alel N sama dengan B. Alel C yang ditunjukkan dengan nomor

akses GenBank AF016008 tidak dapat teridentifikasi dengan metode PCR-RFLP

pada penelitian ini.

336286

622

Gambar 4. Pola pita gen calpastatin domba dalam gel poliakrilamid 6%. MN dan NN = Genotipe. Genotipe MN ditunjukkan dengan adanya tiga pita dengan ukuran 622, 336, dan 286 pb. Genotipe NN ditunjukkan dengan satu pita 622 pb. Huruf A = marker.

Identifikasi keragaman gen calpastatin juga telah dilakukan dengan metode

PCR-SSCP. Palmer et al. (1999b) melaporkan adanya tiga jenis alel yaitu alel A, B

dan C dengan tiga genotipe yaitu AA, AB dan AC. Frekuensi alel A, B dan C

masing-masing 77, 16 dan 6% sedangkan frekuensi genotipe AA, AB dan AC

masing-masing 55, 32 dan 13%. Palmer et al. (1999a) melaporkan adanya tiga

genotipe pada Sapi Angus yaitu AA, AB dan BB untuk lokus CAST1 dan CAST5.

Sedangkan untuk lokus CAST10 terdapat genotipe AA, BB, CC, AB, AC dan BC.

Kurly et al. (2003) telah melaporkan adanya keragaman gen calpastatin pada ternak

babi Stambeek (dengan metode PCR-RFLP) dengan menggunakan enzim restriksi

HinfI, MspI dan RsaI.

Keragaman Genetik Gen Calpastatin Domba Lokal

Nei dan Kumar (2000) menyatakan bahwa keragaman genetik terjadi apabila

terdapat dua alel atau lebih dalam suatu populasi (biasanya lebih dari 1%). Menurut

Nei (1987), keragaman genetik dapat diukur secara akurat dengan Nilai

heterosigositas (ĥ). Heterosigositas disebut juga sebagai keragaman genetik. Nilai

Heterosigositas dipengaruhi oleh jumlah sampel, jumlah alel dan frekuensi alel.

Frekuensi genotipe, frekuensi alel dan nilai heterosigositas gen calpastatin domba

lokal dapat dilihat pada Tabel 1.

Tabel 1. Nilai Frekuensi Genotipe, Frekuensi Alel dan Nilai Heterosigositas (ĥ) Lokus CAST-MspI Domba Lokal Indonesia

Daerah

Jumlah sampel

(n)

Genotipe frekuensi genotipe

Frekuensi Alel

Heterosigositas (ĥ)

MM - MN 7 (0,58) Ciomas

(DET) 12 NN 5 (0,42)

M = 0,29 N = 0,71 0,43

MM - MN 7 (0,32) Jonggol

(DET) 22 NN 15 (0,68)

M = 0,16 N = 0,84 0,28

MM - MN 14 (0,48) Margawati

(DET) 29 NN 15 (0,52)

M = 0,24 N = 0,76 0,37

MM - MN 9 (0,25) Indramayu

(DEG) 36 NN 27 (0,75)

M = 0,13 N = 0, 87 0,23

MM - MN 10 (0,24) Donggala

(DEG) 41 NN 31 (0,76)

M = 0,12 N= 0,88 0,21

MM - MN 2 (0,07) Madura

(DEG) 28 NN 26 (0,93)

M = 0,04 N = 0,96 0,08

MM - MN 1 (0,08) Sumbawa

(DEG) 13 NN 12(0,92)

M = 0,04 N = 0,96 0,08

MM - MN - Rote

(DEG) 20 20 (1,00)

M = 0,00 N = 1,00 0,00

NN

Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa gen calpastatin lokus CAST-MspI

bersifat polimorfik (beragam) yaitu pada populasi domba Ciomas, Jonggol,

Margawati, Indramayu, Madura, Donggala dan Sumbawa. Gen CAST-MspI pada

populasi domba Rote bersifat monomorfik (seragam). Polimorfisme pada gen

calpastatin juga telah dilaporkan pada berbagai ternak meliputi domba Dorset Down,

domba Hoggets, Dorset Down x Coopworth sheep, domba Kurdi, domba Corridale,

domba Karakul, serta pada sapi Angus dan babi (Chung et al.,1999; Palmer et al.,

1999a; Nassiry, 2005; Shahroudi et al., 2006).

Frekuensi alel adalah frekuensi relatif dari suatu alel dalam populasi atau

jumlah suatu alel terhadap jumlah total alel yang terdapat dalam suatu populasi (Nei

dan Kumar, 2000). Populasi domba lokal di Indonesia mempunyai frekuensi alel N

yang lebih tinggi dibandingkan alel M pada semua subpopulasi. Hasil penelitian ini

berlawanan dengan beberapa penelitian sebelumnya yang dilakukan terhadap

populasi domba di luar negeri. Palmer et al.(1999b) melaporkan bahwa genotipe

calpastatin pada domba Corridale yaitu MM, MN dan NN, dengan frekuensi alel

untuk alel M dan N masing-masing 79 dan 21%. Hasil yang sama juga diperoleh

Shahroudi et al.(2006) yang melakukan penelitian serupa pada domba Karakul di

Iran. Nassiry (2005) menemukan frekuensi alel sebesar 88% untuk alel M dan 12%

untuk alel N dan frekuensi genotipe MM, MN dan NN masing-masing 76, 24 dan

0%, serta nilai heterosigositas 36% pada populasi domba Kurdi Iran.

Keragaman Genetik Domba Ekor Tipis (DET)

Gen calpastatin pada populasi DET bersifat polimorfik pada semua daerah.

Frekuensi genotipe MN dan NN untuk domba Ciomas yaitu 58 dan 42%, dengan

nilai heterosigositas 43%. Frekuensi Genotipe MN dan NN domba Margawati yaitu

48 dan 52%, dengan nilai heterosigositas 37%. Frekuensi genotipe MN dan NN

untuk domba Jonggol yaitu masing-masing 32 dan 68% dengan frekuensi alel M

16% dan nilai heterosigositas 28%. Frekuensi alel M terbesar terdapat pada populasi

domba Ciomas dan domba Margawati masing-masing sebesar 29 dan 24%. Populasi

domba dari kedua daerah ini merupakan domba Garut. Domba Ciomas dan

Margawati mempunyai nilai heterosigositas yang berbeda, hal ini kemungkinan

disebabkan karena perbedaan sejarah seleksi yang dilakukan terhadap kedua jenis

domba tersebut. Domba Margawati merupakan domba Garut tipe pedaging,

sedangkan domba Ciomas merupakan domba Garut tipe tangkas. Secara umum nilai

heterosigositas DET lebih tinggi dibandingkan dengan nilai heterosigositas DEG.

Secara umum, populasi domba di bagian barat wilayah Indonesia mempunyai

frekuensi alel M yang lebih tinggi dibandingkan dengan populasi domba di bagian

timur. Frekuensi genotipe domba Ciomas dan Margawati mempunyai frekuensi

genotipe MN yang tinggi masing-masing 58 dan 48% dibandingkan dengan domba-

domba dari daerah lain. Elyasi et al. (2005) melaporkan hasil yang hampir sama

yaitu frekuensi genotipe MN yang tinggi pada domba Arkhamerino (47,62%) dan

domba persilangan Ghezel x Arkhamerino (46,67%). Hal ini kemungkinan

disebabkan terdapatnya darah domba Merino baik pada domba Ciomas, domba Garut

Margawati, domba Arkhamerino, dan domba Persilangan Ghezel x Arkhamerino.

Keragaman Genetik Domba Ekor Gemuk (DEG)

Pada umumnya populasi DEG mempunyai frekuensi alel M yang rendah.

Frekuensi alel M untuk populasi bangsa domba ekor gemuk (DEG) bervariasi antar

subpopulasi. Bangsa DEG yang terletak dibagian timur wilayah Indonesia cenderung

mempunyai frekuensi alel M yang lebih kecil. Frekuensi genotipe MN dan NN untuk

domba Indramayu, Donggala, Madura dan Sumbawa secara berurutan yaitu ; 25 dan

75% ; 24 dan 76% ; 7 dan 93%, serta 8 dan 92%. Frekuensi alel M pada domba

Madura dan Sumbawa mempunyai nilai yang sama kecilnya yaitu 4%. Frekuensi alel

M pada domba Indramayu dan Donggala masing-masing sebesar 13 dan 12%. Lebih

tingginya frekuensi alel M pada domba Indramayu kemungkinan disebabkan telah

adanya usaha seleksi untuk sifat pertumbuhan. Domba Donggala kemungkinan telah

mengalami persilangan dengan domba lokal sehingga frekuensi alel M relatif lebih

tinggi dibandingkan dengan domba ekor gemuk lainnya yaitu domba Madura dan

Sumbawa. Berbeda dengan bangsa DEG lainnya, gen calpastatin domba Rote

bersifat monomorfik. Nilai Heterosigositas tertinggi pada bangsa DEG ditemukan

pada populasi domba Indramayu yaitu 23% dan terendah pada populasi domba Rote

yaitu 0%. Nilai heterosigositas untuk populasi domba Donggala yaitu 21%,

sedangkan untuk populasi domba Sumbawa dan Madura mempunyai nilai

heterosigositas yang sama yaitu 8%.

Hubungan Antara keragaman Gen Calpastatin dengan Bobot Badan Domba

Data genotipe yang digunakan untuk analisis hubungan antara genotipe

dengan bobot badan hanya 99 yang terdiri dari 45 data genotipe domba jantan dan 54

data genotipe domba betina. Data genotipe tersebut berasal dari Ciomas, Jonggol,

Margawati dan Indramayu. Data genotipe domba Donggala tidak digunakan untuk

analisis hubungan antara genotipe dengan bobot badan karena faktor lingkungan

pemeliharaan yang masih beragam. Data genotipe domba dari daerah Madura,

Sumbawa dan Rote tidak memungkinkan untuk dilakukan analisis hubungan dengan

bobot badan. Hal ini disebabkan karena tingkat polimorfisme genotipe gen

calpastatin dari ketiga daerah tersebut sangat rendah.

Hasil analisis ragam (Lampiran 1 dan 2) menunjukkan bahwa genotipe gen

calpastatin berpengaruh nyata terhadap bobot badan domba jantan (P=0,017) tetapi

tidak berpengaruh nyata terhadap bobot badan domba betina (P=0,847). Hasil Uji

lanjut menunjukkan bahwa rataan bobot badan domba jantan dengan genotipe MN

lebih besar dibandingkan dengan genotipe NN (Tabel 2). Berdasarkan hasil analisis

tersebut, alel M kemungkinan terkait dengan sifat bobot badan yang lebih unggul.

Rendahnya frekuensi alel M dan tidak terdapatnya genotipe MM kemungkinan

sebagai akibat dari seleksi negatif terhadap sifat bobot badan unggul yang terjadi

pada populasi domba lokal di Indonesia.

Tabel 2. Rataan Bobot Badan Domba ( X ) dan Simpangan Baku Rataan (SE) antara Genotipe MN dan NN

Genotipe Jumlah sampel (ekor)

X + SE (kg)

MN 15 43,4 + 4,0a

NN 30 35,1 + 2,9b

Keterangan : Superskrip (a,b) yang berbeda menyatakan berbeda nyata (P<0,05)

Penelitian lain menunjukkan bahwa genotipe gen calpastatin terkait dengan

sifat pertumbuhan. Nassiry et al. (2005) melaporkan adanya hubungan antara

genotipe gen calpastatin domba Kurdi Iran (metode PCR-SSCP) dengan sifat

pertumbuhan. Genotipe AB terkait dengan pertambahan bobot badan domba harian

prasapih dan pertambahan bobot badan harian dari umur 9 bulan sampai umur 1

tahun (AB>AA>AC). Hasil yang sama juga dilaporkan oleh Tahmoorespour (2005)

yang melaporkan bahwa genotipe AB>AA>AC terkait dengan pertambahan bobot

badan harian prasapih pada domba Baluchi. Berbeda dengan Palmer et al.(1999b)

yang melaporkan bahwa domba dengan genotipe AC memiliki keunggulan dalam

sifat produksi dibandingkan dengan genotipe AA. Domba dengan genotipe AC

memiliki bobot badan hidup lebih besar 12-17%, memiliki bobot karkas yang lebih

besar 15-18%, tetapi lebih rendah tingkat keempukan dagingnya 4-12%. Pada daerah

amplifikasi lain, Chung et al. (2001) menyatakan bahwa sapi dengan genotipe BB

mempunyai bobot badan yang lebih tinggi dibandingkan dengan genotipe AB dan

AA.

Penelitian ini merupakan yang pertama dilakukan untuk mengetahui

keragaman gen calpastatin pada populasi domba lokal di Indonesia. Informasi yang

tersedia masih sangat sedikit untuk dapat dijadikan sebagai perbandingan. Hasil

penelitian ini memberikan informasi bahwa gen calpastatin bersifat polimorfik dan

dapat digunakan untuk studi keragaman populasi domba lokal di Indonesia. Selain

itu, informasi keragaman ini dapat digunakan dalam penelitian berikutnya untuk

menganalisis hubungan antara genotipe gen calpastatin dengan sifat pertumbuhan

dan keempukan daging domba lokal. Hasil analisis ragam dalam penelitian ini

menunjukkan bahwa terdapat hubungan antara genotipe gen calpastatin dengan

bobot badan. Seleksi terhadap bobot badan dapat dilakukan terhadap ternak yang

mempunyai alel M. Namun demikian, perlu dilakukan penelitian lain dengan materi

ternak yang lebih banyak dan lebih seragam baik dari faktor lingkungan maupun

umur, untuk mengetahui hubungan antara gen calpastatin dengan parameter sifat

pertumbuhan lainnya serta dengan kualitas daging.

KESIMPULAN DAN SARAN

Kesimpulan

Gen calpastatin lokus CAST-MspI pada populasi domba lokal di Indonesia

bersifat polimorfik (beragam), kecuali pada populasi domba Rote. Identifikasi

keragaman gen calpastatin dengan teknik Restriction Fragment Lenght

Polymorphisms (RFLP) menghasilkan dua alel yaitu M dan N, serta dua genotipe

yaitu MN dan NN. Frekuensi alel M tertinggi ditemukan pada populasi Domba Garut

Ciomas (29%) dan terendah pada populasi Domba Ekor Gemuk di Sumbawa dan

Madura masing-masing 4%. Frekuensi alel M untuk domba Margawati, Jonggol,

Indramayu, dan Donggala secara berturut-turut yaitu 24, 16, 13 dan 12%. Nilai

heterosigositas bervariasi antara subpopulasi dan berkisar antara 8% pada populasi

domba Sumbawa dan Madura, sampai 43% pada populasi domba Garut Ciomas.

Nilai heterosigositas domba Margawati, Jonggol, Indramayu, dan Donggala secara

berturut-turut yaitu 37, 28, 23 dan 21%. Genotipe gen calpastatin dalam penelitian

ini berhubungan dengan bobot badan domba jantan (P=0,017) tetapi tidak

berhubungan dengan bobot badan domba betina (P=0,847). Domba jantan dengan

genotipe MN mempunyai rataan bobot badan lebih tinggi dibandingkan dengan

genotipe NN.

Saran

Seleksi domba terhadap bobot badan unggul dapat dilakukan terhadap domba

yang mempunyai alel M pada gen calpastatin. Namun demikian, perlu dilakukan

penelitian lebih lanjut untuk melakukan analisis hubungan antara gen calpastatin

dengan parameter sifat pertumbuhan lainnya serta dengan kualitas keempukan

daging, dengan menggunakan domba dalam jumlah yang lebih banyak dan lebih

seragam dalam hal faktor lingkungan dan umur. Penelitian lanjutan tersebut

sebaiknya menggunakan populasi domba dengan keragaman gen calpastatin yang

tinggi yaitu domba Garut, domba Jonggol, domba Indramayu, dan domba Donggala.

UCAPAN TERIMA KASIH

Alhamdulillahirabbilal’alamin, puji dan syukur penulis panjatkan kehadirat

Allah SWT atas segala limpahan rahmat dan karunia-Nya sehingga penulisan skripsi

ini dapat terselesaikan. Rasa hormat dan bangga, serta ucapan terimakasih yang

sebenarnya tidak cukup hanya dengan kata-kata, penulis sampaikan kepada Bapak

dan Ibu (Almh) yang telah berjuang untuk menyekolahkan anak-anaknya hingga

pendidikan tinggi, dan atas segala do’a, nasehat, bimbingan, motifasi, serta dukungan

baik moril maupun materil.

Penulis mengucapkan rasa terimakasih yang sebesar-besarnya kepada Dr. Ir.

Cece Sumantri, MAgr.Sc. dan Dr. Ir. Achmad Farajallah, MSi selaku pembimbing

utama dan anggota, atas segala bimbingan, perhatian, saran, dan arahan, serta atas

materi penelitian yang telah diberikan. Rasa terimakasih penulis sampaikan kepada

Dr. Ir. Supraptini Mansjoer dan Dr. Ir. Asep Sudarman, MRur.Sc. selaku dosen

penguji yang telah memberikan saran dan masukan dalam penulisan skripsi ini. Rasa

terimakasih juga penulis sampaikan kepada Ir. Rukmiasih, Msi selaku pembimbing

akademik atas segala perhatian dan bimbingannya selama penulis menjalani studi di

IPB. Ucapan terimakasih tak lupa penulis sampaikan kepada Dr. Ir. Bambang

Suryobroto sebagai Kepala Bagian Zoologi atas izin dan kesempatannya melakukan

penelitian di Bagian Zoologi FMIPA, IPB.

Rasa terimaksih penulis sampaikan kepada Pak Adi dan rekan-rekan di Lab.

Zoologi : Ogi, Astri, Wildan, Lusi, Nico, Ruth, Mbak Ani, Mbak Anifa, Mbak Zul,

dan Indra atas kebersamaanya, serta kepada seluruh kelurga besar zoologi atas

suasana kekeluargaannya. Ucapan terimakasih juga penulis sampaikan kepada Mas

Rizal yang telah memberikan arahan dan bimbingan selama penulis tinggal di Graha

Ar-Rahman. Terakhir, kepada teman-teman TPT 40 yang tidak dapat disebutkan satu

persatu penulis ucapkan terimakasih atas semangat persahabatannya.

Bogor, Mei 2007

Penulis

DAFTAR PUSTAKA

Al-Soud, W.A dan P. Radstrom. 2001. Purification and characterization of PCR inhibitory components in bloods cells. J. Clin. Microbiol. : 485-493

Ausubel. 1995. Short Protocol in Molecular Biology. 3rd edition. New York

Bishop, M.D., M. Koohmaraie, J.Killefer, and S. Kappes.1993. Restriction fragment length polymorphisms of the bovine calpastatin gene. J. Anim. Sci. 71:2277.

Blakely, J. dan D.H. Bade. 1991. Ilmu Peternakan Edisi ke-4. Terjemahan. Gadjah Mada University Press, Yogyakarta.

Chung, H.Y., M.E Davis, H.C. Hines, D.M. Wulf. 1999. Effect of the calpain proteolysis and calpain genotype on meat tenderness of Angus bulls. J. Anim. Sci. 77: 31-38

Delgado, E.F., G.H. Geesink, J.A. Marchello, D.E. Goll, and M. Koohmaraie. 2001. The calpain system in three muscle of normal and callipyge sheep. J. Anim. Sci. 79:398-412

Devendra, C dan G.B. McLeroy. 1982. Goat and Sheep Production in The Tropics. Longman Group Limited, London.

DJBPP. 2005. Buku Statistik Peternakan. Departemen Pertanian RI.

Doho, S.R. 1994. Parameter fenotipik beberapa sifat kualitatif dan kuantitatif pada Domba Ekor Gemuk. Thesis. Fakultas Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor. Bogor

Diwyanto, K. 1982. pengamatan fenotip domba priangan serta hubungan antara beberapa ukuran tubuh dengan bobot badan. Tesis. Fakultas Pasca Sarjana, Institut Pertanian Bogor. Bogor

Edey, T.N. 1983. Tropical Sheep and Goat Production. Australian Universities. International Development Program (AUIDP), Canberra, Australia.

Elyasi-zaringhabaee, G., J. Shodja, M.R. Nassiry, O. Pirahary, and A. Javanmard. 2005. Determination of ovine calpastatin gene polymorphisms using PCR-RFLP. In: Sharoudi, F.E., M.R.Nassiry, R.Valizadh, A.H.Moussavi, M.T. Pour, and H. Ghiasi (Editor). Genetic polymorphisms at MTNR1A, CAST, and CAPN loci in Iranian Karakul Sheep. Iranian J. Biotechnol. 4:117-122

Falconer, D.S., and T.F.C Mackay. 1996. Introduction to Quantitative Genetics. 4th edition Longman Group Ltd. Essex, England.

Gatenby, R.M. 1991. Sheep. Macmilalan Education Ltd. London

Goll, D.E., V.F. Thompson, R.G. Taylor, and J. A. Christiansen. 1992. Role of the calpain system in muscle growth. Biochimie. 74:225-237.

Hediger, R., H. A. Ansari, and G. F. Stranzinger. 1991. Chromosome banding and gene localizations support extensive conservation of chromosome structure between cattle and sheep. Cytogenet. Cell Genet. 57:127.

Hossner, K.L. 2005. Hormonal Regulation of Farm Animal Growth. http://www.cabi-publishing.org [8 Juni 2006]

Kappes, S.M., J.W. Keele, R.T. Stone, T.S.Sonstegard, T.P.L. Smith, R.A. Mcgraw, N.L.Lopezcorrales, and C.W.Beattie. 1997. A second-generation linkage map of the bovine genome. Genome Res. 7:235.

Killefer, J., and M. Koohmaraie. 1994. Bovine skeletal muscle calpastatin : clonning, squence analysis, and stady-state mRNA expression. J. Anim. Sci. 72 : 606

Koohmaraie, M., S.D. Shackelford, T.L. Wheeler, S.M. Lonergan, and M.E. Doumit. 1995. A muscle hypertrophy condition in lamb (callipyge): characterization of effects on muscle growth and meat quality traits. J. Anim. Sci. 73:3596–3607.

Kurly, J., W. Kapelanski, M. Pierzchala, S. Grajewska, and M. Bocian. 2003. Preliminary observation on the effects of calpastatin gene (CAST) polymorphisms in carcass traits in pigs. Anim.Sci.Paper and report. 2:87-95

Lewin,B. 1994. Genes V. Oxford University Press. New York

Lonergan, S.M., C.W. Ernst, M.D. Bishop, C.R. Calkins, and M. Koohmaraie. 1995. Relationship of restriction fragment length polymorphisms at the bovine calpaststin locus to calpastatin activity and meat tenderness. J. Anim. Sci. 73:3608-3612

Margawati, E.T. 2005. Pemetaan quantitative traits loci (QTL) sifat pertumbuhan pada populasi domba silang balik ekor tipis dan merino. Disertasi. Fakultas Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor. Bogor

Mason, I.L. 1980. Prolific Tropical Sheep. Food and Agriculture Organization of The United nation, Roma

Montgomery G.W and Kinghorn. 1997. Recent developments in gene mapping and progress towards marker-assisted selection in sheep. Aust. J. Agric. Res. 48:729-741.

Morgan, J .B., T.L.Wheeler, M. Koohmaraie, J. W. Savell, and J. D. Crouse. 1993. Meat tenderness and the calpain proteolytic system in the longissimus muscle of young bulls and steers. J. Anim. Sci. 71:1471.

Nassiry, M.R., A. Javadmanesh, M. Nosraty, A. Mohammadi, and A. Javanmard. 2005. Genetics polymorphisms of ovine calpastatin locus in Iranian Kurdi Sheep by PCR-RFLP. Proc. of 3rd Moscow International Congress, Biotechnology. State of art and prospects of development. P:291

Nei, M. 1987. Molecular Evolutionery Genetics. Columbia University Press, new York.

Nei, M and S. Kumar. 2000. Molecular Evolution and Phylogenetics. Oxford University Press, Inc., New York

Palmer,B.R., N. Roberts, J.G.H. Hickford, and R. Bickerstaffe. 1998. Rapid Communication : PCR- RFLP for MspI and NcoI in the ovine calpastatin gene. American Society of Animal Science

Palmer, B.,R. Morton, and J.D. Robert. 1999a. marker assited selection for meat quality and the ovine calpastatin gene. In: Sharoudi, F.E., M.R.Nassiry, R.Valizadh, A.H.Moussavi, M.T. Pour, and H. Ghiasi (Editor). Genetic polymorphisms at MTNR1A, CAST and CAPN loci in Iranian Karakul Sheep. Iranian J. Biotechnol. 4:117-122

Palmer, B.R., N. Robert, and M.P. Kent. 1999b. A candidate gene approach to animal quality traits. In: Sharoudi, F.E., M.R.Nassiry, R.Valizadh, A.H.Moussavi, M.T. Pour, and H. Ghiasi (Editor). Genetic polymorphisms at MTNR1A, CAST and CAPN loci in Iranian Karakul Sheep. Iranian J. Biotechnol. 4:117-122

Palumbi, S.R. 1996. Nucleic acids II: The polymerase chain reaction. In: D.M. Hillis, C. Moritz dan B.K.Mable (Editor). Molecular Systematics. 2nd Edition. Sinauer Associates. Inc., Massachusetts USA

Prasetyo, A. 2005. Metode ekstraksi DNA dan identifikasi gen kappa kasein (k-Kasein) pada sapi Friesian Holstein (FH) di peternakan rakyat. Skripsi. Fakultas Peternakan, Institut Pertanian Bogor. Bogor

Roberts, N., B. Palmer, J.G.H. Hickford, and R. Bickerstaffe. 1996. PCR-SSCP in the ovine calpastatin gene. Anim. Genet. 27:211-222.

Sambrok, J., F. Fritsch and T. Miniatis. 1989. Molecular Clooning Laboratory manual. 3rd Edition. Cold Spring Harbor laboratory press, New York

Sharoudi, F.E., M.R. Nassiry, R. Valizadh, A.H. Moussavi, M.T. Pour, and H. Ghiasi. 2006. Genetic polymorphisms at MTNR1A, CAST and CAPN loci in Iranian Karakul Sheep. Iranian J. Biotechnol. 4:117-122

Smith T. 2003. Genetic Selection for Tenderness. In: Margawati, E.T (Editor). 2005. Pemetaan quantitative traits loci (QTL) sifat pertumbuhan pada populasi domba silang balik ekor tipis dan merino. Disertasi. Fakultas Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor. Bogor

Sutana, I.K. 1993. Domba Ekor Gemuk di Indonesia: Potensi dan Permasalahannya. Prosiding sarasehan usaha ternak domba dan kambing menyongsong Era PJPT II. 13-14 Desember 1992. Diterbitkan oleh Ikatan Sarjana Peternakan Indonesia (ISPI) Cabang Bogor dan Himpunan Pengusaha Domba dan Kambing Indonesia (HKDI) Cabang Bogor, Bogor.

Tahmoorespour, M. 2005. Genetic polymorphism in calpain and calpastatin genes and association with growth traits in Baluchi sheep. In: Sharoudi, F.E., M.R.Nassiry, R.Valizadh, A.H.Moussavi, M.T. Pour, and H. Ghiasi (Editor). Genetic polymorphisms at MTNR1A, CAST and CAPN loci in Iranian Karakul Sheep. Iranian Journal. Biotechnol. 4:117-122

Tegelstrom, H. 1992. Mitochondrial DNA in natural population : An improved routine for screening of genetic variation based on sensitive silver stainning. Electrophoresis. 7:226-229

LAMPIRAN

Lampiran 1. Analisis Ragam Respon Genotipe Gen Calpastatin terhadap Bobot

Badan Domba Jantan dan Hasil Uji Lanjutan Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F Model 11 9638.97417793 876.27037981 16.53 0.0001 Error 33 1749.49826652 53.01509899 Total 44 11388.47244444 R-Square C.V. Root MSE BB Mean 0.846380 19.24758 7.28114682 37.82888889 Source DF Type III SS Mean Square F Value Pr > F GENOTIPE 1 337.41173869 337.41173869 6.36 0.0166 UMUR 2 4164.24960633 2082.12480317 39.27 0.0001 ASAL 3 2357.58230317 785.86076772 14.82 0.0001 GENOTIPE*UMUR 2 94.76473578 47.38236789 0.89 0.4188 GENOTIPE*ASAL 3 62.91516723 20.97172241 0.40 0.7570 Hasil Uji Duncan : Duncan Grouping Mean N GENOTIPE A 43.380 15 MN B 35.053 30 NN Keterangan : Duncan grouping dengan huruf berbeda menunjukkan

berbeda nyata (P<0,05)

Lampiran 2. Analisis Ragam Respon Genotipe Gen Calpastatin terhadap Bobot Badan Domba Betina

Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F Model 11 1607.34781413 146.12252856 12.18 0.0001 Error 41 491.80463870 11.99523509 Total 52 2099.15245283

R-Square C.V. Root MSE BB Mean 0.765713 13.44966 3.46341379 25.75094340 Source DF Type III SS Mean Square F Value Pr > F GENOTIPE 1 0.45140803 0.45140803 0.04 0.8471 UMUR 2 558.53717608 279.26858804 23.28 0.0001 ASAL 3 445.76017475 148.58672492 12.39 0.0001 GENOTIPE*UMUR 2 5.10590251 2.55295125 0.21 0.8092 GENOTIPE*ASAL 3 83.56657193 27.85552398 2.32 0.0892