KATA PENGANTAR

Puji syukur kehadirat Allah SWT yang telah melimpahkan rahmat dan

hidayah nya sehingga penulis dapat menyelesaikan tugas makalah ini tepat pada

waktu nya. Shalawat beserta salam tak lupa pula kita hadiahkan kepada nabi besar

kita yakni nya nabi besar Muhammad SAW. Yang telah membawa umat nya dari

zaman jahiliyah kepada zaman yang penuh ilmu pengetahuan yang kita rasakan

pada saat sekarang ini.

Makalah ini penulis buat untuk melengkapi tugas mata kuliah

Mikrobiologi dan Parasitologi mengenai “Identifikasi Bakteri dengan Pewarnaan

Gram , Nukleus dan Spora”

Dalam kesempatan ini penulis mengucapkan terima kasih kepada berbagai

pihak yang telah membantu penulis dalam menyelesaikan makalah ini. Semoga

menjadi ibadah dan mendapatkan pahala dari Allah SWT. Amin.

Penulis menyadari bahwa makalah ini masih jauh dari kesempurnaan.

Oleh karena itu penulis mengharapkan kritik dan saran dari pembaca,demi

kesempurnaan makalah ini.

Akhir kata penulis berharap semoga makalah ini dapat bermanfaat bagi

kita semua dan supaya kita selalu berada di bawah lindungan Allah SWT.

Padang, Februari 2014

Penulis

i

DAFTAR ISI

KATA PENGANTAR ................................................................................... i

DAFTAR ISI ................................................................................................. ii

BAB I PENDAHULUAN .............................................................................. 1

1.1 Latar Belakang .............................................................................. 1

1.2 Rumusan Masalah.......................................................................... 1

1.3 Tujuan ........................................................................................... 1

BAB II PEMBAHASAN ............................................................................... 3

2.1 Identifikasi bakteri dalam Pewarnaan........................................... 3

2.2 Pewarnaan Gram atau Diferensial ............................................. 7 2.3 Pewarnaan Spora........................................................................... 16

2.4 Faktor-faktor yang mempengaruhi pewarnaan bakteri............... 19

2.5 Teknik Pewarnaan Gram............................................................ 20

2.6 Teknik Pewarnaan Spora ........................................................... 21

2.7 Teknik Pewarnaan Nukleus......................................................... 22

BAB III PENUTUP ........................................................................................ 31

3.1 Kesimpulan ................................................................................. 31

3.2 Saran ........................................................................................... 31

DAFTAR PUSTAKA...................................................................................... 32

LAMPIRAN HASIL DISKUSI........................................................................ 33

ii

BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Bakteri  mempunyai morfologi, struktur dan sifat-sifat yang khas.

Bakteri merupakan mikroorganisme yang berukuran mikroskopik. Selain

mikroskopik, bakteri juga hampir tidak berwarna atau transparan dan kontras

dengan air. Sehingga melihat dan mengamati bakteri dalam kedaan hidup sangat

sulit. Untuk mengatasi hal tersebut maka dikembangkan suatu teknik pewarnaan

sel bakteri. Ini merupakan salah satu cara yang paling utama dalam penelitian-

penelitian mikrobiologi. Hal itu untuk mempernudah proses identifikasi  bakteri.

Untuk mengidentifikasi suatu biakan murni bakteri hasil isolasi mula-

mula diamati morfologi sel secara mikroskopik melalui pengecetan atau

pewarnaa, salah satunya adalah dengan pewarnaan gram.Pewarnaan gram

merupakan salah satu prosedur yang paling banyak digunakan untuk mencirikan

banyak bakteri. Dari pewarnaan gram dapat diketahui morfologi sel antara lain

sifat gram, bentuk sel, dan penataan sel. Pewarnaan gram atau metode gram

adalah suatu metode empiris untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua

kelompok besar, Gram positif dan gram negatif, berdasarka sifat kimia dan fisika

dinding sel mereka, metode ini diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan

denmark hans Christian gram 1884. Pewarnaan Gram dibagi menjadi dua yaitu

pewarnaan majemuk karena menggunakan lebih dari satu macam zat warna. Dan

pewarnaan diferensial karena pewarnaan ini mampu mengdeferensiasi atau

membedakan bakteri, sehingga bakteri dapat digolongkan menjadi dua yaitu

Gram negatif dan Gram positif.

1

1.2 Rumusan Masalah

1. Bagaimana mengidentifikasi bakteri dengan pewarnaan ?

2. Apa itu pewarnaan gram atau pewarnaan diferensial ?

3. Apa itu pewarnaan spora ?

4. Apa saja faktor-faktor yang mempengaruhi pewarnaan bakteri ?

5. Apa saja faktor-faktor yang mempengaruhi motivasi ?ss

6. Bagaimana terknik melakukan pewarnaan gram , spora dan nukleus?

1.3 Tujuan

1) Mengetahui cara identifikasi bakteri dengan pewarnaan

2) Mengetahui pewarnaan gram atau pewarnaan diferensial

3) Mengetahui pewarnaan spora

4) Mengetahui faktor-faktor yang mempengaruhi pewarnaan bakteri

5) Mengetahui teknik terknik melakukan pewarnaan gram , spora, dan

nukleus

2

BAB II

PEMBAHASAN

2.1 Identifikasi Bakteri dengan Pewarnaan

Bakteri berukuran sangat kecil dan tipis sehingga sukar dilihat struktur

tubuhnya walaupun dengan bantuan mikroskop. Sel bakteri dapat teramati

dengan jelas jika digunakan mikroskop dengan perbesaran 100x10 yang

ditambah minyak imersi. Jika dibuat preparat ulas tanpa pewarnaan, sel bakteri

sulit terlihat.

Pewarnaan bertujuan untuk memperjelas sel bakteri dengan

menempelkan zat warna ke permukaan sel bakteri. Zat warna dapat

mengabsorbsi dan membiaskan cahaya, sehingga kontras sel bakteri dengan

sekelilingnya ditingkatkan.

Zat warna yang digunakan bersifat asam atau basa. Pada zat warna basa,

bagian yang berperan dalam memberikan warna disebut kromofor dan

mempunyai muatan positif. Sebaliknya pada zat warna asam bagian yang

berperan memberikan zat warna memiliki muatan negatif.

Zat warna basa lebih banyak digunakan karena muatan negatif banyak

banyak ditemukan pada permukaan sel. Contoh zat warna asam antara lain

Crystal Violet, Methylene Blue, Safranin, Base Fuchsin, Malachite Green dll.

Sedangkan zat warna basa antara lain Eosin, Congo Red dll.

Untuk melihat morfologi bakteri secara lebih jelas dikembangkan teknik

pewarnaan bakteri.

Prinsip pewarnaan bakteri adalah pertukaran antara ion zat warna dengan

ion protoplasma sel. Terdapat dua kelompok zat pewarna bakteri, yaitu :

3

(1) bersifat Asam, berupa anion dan umum digunakan dalam bentuk garam

natrium.

(2) bersifat Alkali, berupa kation dan umum digunakan dalam bentuk

klorida.

Selain zat warna diperlukan zat tambahan yang berfungsi untuk

mengendapkan hasil rekasi zat warna dengan komponen dinding sel bakteri. Zat

tersebut dikenal dengan istilah zat Pematek yang akan melekatkan zat warna

pada plasma sel.

Teknik pewarnaan bakteri dapat dibagi menjadi dua jenis, yaitu :

Pewarnaan Sedehana atau Tunggal, dengan menggunakan satu macam

zat warna seperti : Metilen Blue, Karbol Violet dan Air Fucshin.

Pewarnaan Differensial dengan menggunakan dua atau lebih zat

warna. Pengamatan morfologi bakteri hasil pewarnaan dilakukan di

bawah pengamatan mikroskop.

Pada umumnya bakteri bersifat tembus cahaya, hal ini disebabkan karena

banyak bakteri yang tidak mempunyai zat warna (Waluyo, 2007) . Salah satu

cara untuk mengamati bentuk sel bakteri sehingga mudah untuk diidentifikasi

ialah dengan metode pengecatan atau pewarnaan. Hal tersebut juga berfungsi

untuk mengetahui sifat fisiologisnya yaitu mengetahui reaksi dinding sel bakteri

melalui serangkaian pengecatan.

Pewarnaan atau pengecatan terhadap mikroba banyak dilakukan baik

secara langsung (bersama bahan yang ada) ataupun secara tidak langsung

(melalui biakan murni). Tujuan dari pewarnaan tersebut ialah untuk :

4

1.    Mempermudah melihat bentuk jasad, baik bakteri, ragi, ataupun fungi.

2.    Memperjelas ukuran dan bentuk jasad.

3.    Melihat struktur luar dan kalau memungkinkan juga struktur dalam jasad.

4.    Melihat reaksi jasad terhadap pewarna yang diberikan sehingga sifat-sifat

fisik dan kimia yang ada akan dapat diketahui.

(Suriawiria, 1999)

Ada tiga macam prosedur pewarnaan, yaitu pewarnaan sederhana (simple

stain), pewarnaan diferensial (differential strain), dan pewarnaan khusus (special

strain) (Pratiwi, 2008).

1.  Pewarnaan sederhana

Pewarnaan sederhana merupakan teknik pewarnaan yang paling banyak

digunakan. Disebut sederhana karena hanya menggunakan satu jenis zat warna

untuk mewarnai organisme tersebut. Kebanyakan bakteri mudah bereaksi

dengan pewarnaan-pewarnaan sederhana karena sitoplasamanya bersifat

basofilik (suka dengan basa). Zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan

sederhana umumnya bersifat alkolin. Dengan pewarnaan sederhana dapat

mengetahui bentuk dan rangkaian sel-sel bakteri. Pewarna basa yang biasa

digunakan untuk pewarnaan sederhana ialah metilen biru, kristal violet, dan

karbol fuehsin yang mana pewarnaan sederhana ini dibagi lagi menjadi dua jenis

pewarnaan.

Tujuan dari pewarnaan sederhana adalah mengidentifikasi morfologi sel

bakteri dengan menggunakan zat warna tunggal. Prinsipnya yaitu  pewarnaan ini

5

hanya menggunakan satu macam zat warna saja. Sebelum zat warna difiksasi

terlebih dahulu pewarnaan ini dipakai untuk melihat bentuk-bentuk bakteri.

Zat warna yang di gunakan adalah Methylen blue, Crystal violet, basic

fuchin atau safranin. Fungsi zat warna: Crystal violet merupakan pewarna primer

(utama) yang akan memberi warna mikrioorganisme target. Crystal violet

bersifat basa sehingga mampu berikatan dengan sel mikroorganisme yang

bersifat asam (Sutedjo, 1991).

2.  Pewarnaan Diferensial (Gram)

Pewarnaan Gram atau metode bGram adalah suatu metode empiris untuk

membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, yakni gram positif

dan gram negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka. Metode

ini diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark Hans Christian

Gram (1853–1938) yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1884 untuk

membedakan antara pneumokokus dan bakteri Klebsiella pneumoniae.

Bakteri Gram-negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat

warna metil ungu pada metode pewarnaan Gram. Tujuan dari pewarnaan negatif

adalah untuk mengetahui bentuk mikroba dengan pewarnaan-pewarnaan tidak

langsung. Prinsip pewarnaan negatif adalah cara pengamatan mikrobiologi yang

dapat di lakukan untuk membedakan spesies kecil dan cairan optiknya.

Pewarnaan ini merupakan pewarnaan yang di gunakan untuk melihat

secara tidak langsung, karena yang diwarnai adalah latar belakangnya,

sedangkan bakterinya sendiri tidak mengalami pewarnaan. Pada pewarnaan ini

tidak di lakukan fiksasi karena itu dapat digunakan untuk melihat bentuk-bentuk

6

sel yang sesungguhnya dan untuk menentukan ukuran bakteri, karena bakteri

praktis tidak mengalami perubahan. Berbeda dengan pewarnaan lain, pewarnaan

negatif memungkinkan bakteri terlihat transparan dan tampak jelas.

Fungsi zat warna: Safranin merupakan pewarnaan tandingan atau pewarna

skunder, zat ini berfungsi untuk mewarnai sel-sel yang telah kehilangan warna

utama dengan kata lain memberikan warna pada bakteri non target (Pelczar,

2007).

Bakteri gram positif akan mempertahankan zat warna metil ungu gelap

setelah dicuci dengan alkohol, sementara bakteri gram negatif tidak. Pada uji

pewarnaan Gram, suatu pewarna penimbal (counterstain) ditambahkan setelah

metil ungu, yang membuat semua bakteri gram negatif menjadi berwarna merah

atau merah muda. Pengujian ini berguna untuk mengklasifikasikan kedua tipe

bakteri ini berdasarkan perbedaan struktur dinding sel mereka.

3.Pewarnaan Khusus

Pewarnaan khusus merupakan metode pewarnaan untuk mewarnai

struktur khusus atau tertentu dari bakteri seperti bagian spora, kapsul, flagel dsb.

Contoh pewarnaan khusus : Pewarnaan Endospora Anggota dari genus

Clostridium, Desulfomaculatum, dan Bacillus adalah bakteri yang memproduksi

endospora dalam siklus hidupnya. Endospora merupakan bentuk dorman dari sel

vegetatif, sehingga metabolismenya bersifat inaktif dan mampu bertahan dalam

tekanan fisik dan kimia seperti panas, kering, dingin, radiasi, dan bahan kimia.

7

Tujuan dilakukannya pewarnaan endospora adalah membedakan

endospora dengan sel vegetatif, sehingga pembedaannya tampak jelas.

Endospora tetap dapat dilihat di bawah mikroskop meskipun tanpa pewarnaan

dan tampak sebagai bulatan transparan dan sangat refraktil. Namun jika dengan

pewarnaan sederhana, endospora sulit dibedakan dengan badan inklusi (Aditya,

2010)

Pada pewarnaan sederhana hanya digunakan satu macam zat warna untuk

meningkatkan kontras antara mikroorganisme dan sekelilingnya. Prosedur

Pewarnaan sederhana mudah dan cepat, sehingga pewarnaan ini sering

digunakan untuk melihat bentuk ukuran dan penataan pada mikoorganisme

bakteri pada bakteri dikenal bentu yang bulat (coccus), batang (basil), dan

spiral(Lay, 1994).

Pewarnaan bakteri yang menggunakan lebih dari satu zat warna seperti

pewarnaan gram dan pewarnaan tahan asam.

Tahap-tahap yang harus dilakukan pada teknik pewarnaan, adalah sebagai

berikut :

1. Menyiapkan kaca objek: menghapus lemak atau minyak untuk

membersihkan kacadengan menggunakan air hangat atau serbuk penggosok,

selanjutnya dengan suatu campuran air dan alkohol (alkohol 95%), kemudian

kaca dikeringkan dan disimpan di atas lap laboratorium sampai siap untuk

digunakan.

8

2. Pembuatan apusan: menghindari apusan yang tebal dan rapat adalah

penting secara mutlak. Suatu apusan yang baik merupakan selapis tipis. Apusan

dapat dibuat dari kultur kaldu atau medium kultur padat dengan berbagai cara.

3. Dari kultur kaldu, pengambilan satu atau dua loop kultur sel dapat

langsung dipindahkan ke kaca objek dengan loop inokulasi steril dan sebarkan

secara merata kira-kira sebesar uang logam.

4. Dari medium padat: mikroorganisme yang diambil dari medium padat

menghasilkan pertumbuhan yang tebal dan rapat, tidak dapat langsung

dipindahkan ke atas kaca objek. Pemindahan sel dari kultur dilakukan dengan

menggunakan jarum inokulasi steril. Hanya ujung jarum yang menyentuh kultur,

untuk mencegah pemindahan sel terlalu banyak.

Pengenceran dilakukan dengan memutar ujung jarum di atas tetesan air,

sampai kelihatan semitransparan. Sebelum proses selanjutnya , apusan dibiarkan

kering. Jangan ditiup,biarkan kering di udara.

Fiksasi panas: tanpa difiksasi, apusan bakteri akan tercuci selama

memasuki prosedur pewarnaan. Fiksasi panas dibutuhkan selama protein bakteri

mengalami koagulasi dan melekat di atas permukaan kaca objek. Fiksasi panas

dilakukan dengan melalukan secara cepat apusan kering, sebanyak dua atau tiga

kali di atas lidah api bunsen

9

Langkah-langkah utama dalam teknik pewarnaan antara lain:

a. Pembuatan olesan bakteri, olesan bakteri tidak boleh terlalu tebal atau

tipis.

b. Fiksasi, dapat dilakukan secara pemanasan atau dengan aplikasi bahan

kimia seperti sabun, formalin, fenol.

c. Aplikasi zat warna tunggal, atau lebih dari 1 zat warna.

Pewarnaan gram pada praktikum ini dilakukan dalam 4 tahap yaitu:

a. Pemberian cat warna utama (cairan kristal violet) berwarna ungu.

b. Pengintesifan cat utama dengan penambahan larutan mordan JKJ.

c. Pencucian (dekolarisasi) dengan larutan alkohol asam.

d. Pemberian cat lawan yaitu cat warna safranin.

Stuktur bakteri terbagi menjadi dua yaitu :

1. Struktur dasar (dimiliki hamper semua jenis bakteri )Meliputi : dinding

sel, membrane plasma, sitoplasma, ribasom, DNA, dan granula penyimpanan.

2. Struktur tambahan (dimiliki oleh jenis bakteri tertentu)Meliputi kapsul,

flagellum, pilus, fimbria, klorosom, vakuola gas dan endospSthaplyococcus

adalah bakteri gram-positif yang berbentuk bola. Bakteri ini ada yang berkoloni

dan berbentuk seperti buah anggur. Pada tahun 1884, Rosenbach menjelaskan

ada dua jenis warna staphlycoccus yaitu : sthapylococcus aureus yang berwarna

kuning dan sthapylococcus albus yang berwarna putih. Beberapa karateristik

yang dimiliki sthapylococcus aureus diantaranya hemolytic pada darah segar,

10

catalase-oxidase-positif dan negatif, dapat tumbuh paa suhu erkisar antara 15

sampai 45 derajat dan lingkungan NaCl padakonsentrasi tinggi hingga 15 persen

dan menghasilkan enzim coagulase. Selin itu, biasanya s. aeureus merupakan

pathogen seperti bisul, styes dan furunculosis beberapa infeksi (radang paru-

paru, radang kelenjar dada, radang urat darah, meningitis, saluran kencing

osteomyelitis dan endocarditis) serta menyebabkan keracunan makanan yaitu

dengan melepaskan enterotoxins menjadi makanan sehingga menjadi toksik

dengan melepaskan super antigens ke dalam aliran darah (kenneath, 2008)

2.2 Perwarnaan Gram ( Pewarnaan Diferensial)

Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah salah satu teknik pewarnaan

yang paling penting dan luas yang digunakan untuk mengidentifikasi bakteri.

Dalam proses ini, olesan bakteri yang sudah terfiksasi dikenai larutan-larutan

berikut : zat pewarna kristal violet, larutan yodium, larutan alkohol (bahan

pemucat), dan zat pewarna tandingannya berupa zat warna safranin atau air

fuchsin. Metode ini diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark

Hans Christian Gram (1853–1938) yang mengembangkan teknik ini pada tahun

1884 untuk membedakan antara pneumokokus dan bakteri Klebsiella

pneumonia.

Dengan metode pewarnaan Gram, bakteri dapat dikelompokkan menjadi

dua, yaitu bakteri Gram positif (berwarna ungu/biru) dan bakteri Gram negatif

(berwarna merah). Perbedaan utama di antara keduanya adalah struktur dan

komposisi dinding selnya.

11

1. Bakteri Gram Positif

mampu mempertahankan zat warna utama dalam pewarnaan Gram, yaitu

Gentian Violet, sehingga nampak berwarna ungu saat pengamatan

dikarenakan dinding sel kelompok bakteri ini tersusun oleh sebagian

besar Peptidoglikan, yang mampu mengikat zat warna dan tidak rusak

saat dicuci dengan alcohol.

memiliki dinding sel yang tebal dan membran sel selapis.

12

Ciri-ciri bakteri gram positif yaitu:

1. Struktur dinding selnya tebal, sekitar 15-80 nm, berlapis tunggal atau

monolayer.

2. Dinding selnya mengandung lipid yang lebih normal (1-4%), peptidoglikan

ada yang sebagai lapisan tunggal. Komponen utama merupakan lebih dari

50% berat ringan. Mengandung asam tekoat.

3. Bersifat lebih rentan terhadap penisilin.

4. Pertumbuhan dihambat secara nyata oleh zat-zat warna seperti ungu kristal.

5. Komposisi nutrisi yang dibutuhkan lebih rumit.

6. Lebih resisten terhadap gangguan fisik.

7. Resistensi terhadap alkali (1% KOH) larut.

8. Tidak peka terhadap streptomisin.

9. Toksin yang dibentuk Eksotoksin Endotoksin

13

2. Bakteri Gram Negatif

memiliki komposisi dinding sel yang sebagian besar tersusun dari lapisan

lipid, sehingga pada saat pewarnaan kurang dapat mempertahankan zat

warna utama terutama saat dicuci dengan alcohol (lipid rusak saat dicuci

dengan alcohol), akibatnya kelompok bakteri ini memberikan

kenampakan warna merah (warna dari zat warna ke dua : safranin atau

air fuchsin) di akhir kegiatan pewarnaan Gram.

dinding sel tipis yang berada di antara dua lapis membran sel

14

Ciri-ciri bakteri gram negatif yaitu:

1. Struktur dinding selnya tipis, sekitar 10 – 15 mm, berlapis tiga atau

multilayer.

2. Dinding selnya mengandung lemak lebih banyak (11-22%),

peptidoglikan terdapat didalam.

3. lapisan kaku, sebelah dalam dengan jumlah sedikit ± 10% dari berat

kering, tidak mengandung asam tekoat.

4. Kurang rentan terhadap senyawa penisilin.

5. Pertumbuhannya tidak begitu dihambat oleh zat warna dasar misalnya

kristal violet.

6. Komposisi nutrisi yang dibutuhkan relatif sederhana.

7. Tidak resisten terhadap gangguan fisik.

8. Resistensi terhadap alkali (1% KOH) lebih pekat.

9. Peka terhadap streptomisin.

10. Toksin yang dibentuk Endotoksin.

15

Perbedaan secara umum antara bakteri gram negatif dan bakteri gram

positif yaitu : Bakteri Gram-negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan

zat warna metil ungu pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram-positif akan

mempertahankan zat warna metil ungu gelap setelah dicuci dengan alkohol,

sementara bakteri gram-negatif tidak. Pada uji pewarnaan Gram, suatu pewarna

penimbal (counterstain) ditambahkan setelah metil ungu, yang membuat semua

bakteri gram-negatif menjadi berwarna merah atau merah muda. Pengujian ini

berguna untuk mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini berdasarkan perbedaan

struktur dinding sel mereka.

16

Perbedaan relatif sifat bakteri gram positif dan gram negatif.

Sifat Bakteri garam (+) Bakteri gram negatif(-)

Komposisi dinding sel Kandungan lipid rendah (1-

4%)

Kandungan lipid tinggi

Ketahanan terhadap

penisilin

Lebih sensitive Lebih tahan

Penghambatan oleh

pewarna basa (VK)

Lebih dihambat Kurang dihambat

Kebutuhan nutrisi Kebanyakan spesies relatif

kompleks

Relatif sederhana

Ketahanaa terhadap

perlakuan fisik

Lebih tahan Kurang tahan

17

Teknik pewarnaan gram haruslah sesuai prosedur karena dapat

mengakibatkan kesalahan identifikasi data apakah gram positif atau gram

negative sehingga diperlukan adanya praktikum ini dilakukan agar mengetahui

jalanya mekanisme pewarnaan gram.

Dalam pewarnaan gram diperlukan empat reagen yaitu :

1.      Zat warna utama (violet kristal)

2.      Mordan (larutan Iodin) yaitu senyawa yang digunakan untuk

mengintensifkan warna utama

3.      Pencuci / peluntur zat warna (alcohol / aseton) yaitu solven organic

yang digunakan uantuk melunturkan zat warna utama

4.      Zat warna kedua / cat penutup (safranin) digunakan untuk mewarnai

kembali sel-sel yang telah kehilangan cat utama setelah perlakuan denga alcohol.

18

Pada pewarnaan gram, bakteri yang telah difiksasi dengan panas

sehingga membentuk noda pada kaca objek diwarnai dengan pewarna basa yaitu

crystal violet. Karena warna ungu mewarnai seluruh sel, maka pewarna ini

disebut pewarna primer. Selanjutnya noda dicuci dan pada noda spesimen

ditetesi iodin yang merupakan mordant. Setelah iodin dicuci, baik bakteri Gram

Positif maupun Gram Negatif tampak berwarna ungu. Selanjutnya noda

spesimen dicuci dengan alkohol yang merupakan decolorizing agent (senyawa

peluntur warna) yang pada spesies bakteri tertentu dapat menghilangkan warna

ungu dari sel. Setelah alkohol dicuci, noda spesimen diwarnai kembali dengan

safranin yang merupakan pewarna basa berwarna merah. Bakteri yang tetap

berwarna ungu digolongkan ke dalam Gram Positif, sedangkan bakteri yang

berwarna merah digolongkan ke dalam Gram Negatif (Suriawiria, 1999).

Pewarna yang digunakan antara lain : kristal violet sebagai gram A,

iodine sebagai gram B, alkohol sebagai gram C, serta safranin sebagai gram D.

19

Faktor-faktor yang mempengaruhi pewarnaan gram :

Keasaman

Pelunturan zat warna

Pelunturan zat warna adalah suatu senyawa yang menghilangkan warna dari

sel yang telah diwarnai. Ini berfungsi untuk mengahsilkan kontras yang baik

pada bayangan mikroskop. Ditinjau dari kekuatan ikatan anatara sel dengan

zat warna, maka dikenal beberapa istilah, misalnya tahan asam, tahan

alcohol, tahan air dan lain-lain. Istilah tahan asam digunakan bila zat warna

telah diikat kuat oleh sel sehingga tidak dapat dilunturkan warnanya oleh

asam, begitu juga dengan tahan alcohol dan tahan air masing-masing tidak

dapat dilunturkan oleh alcohol dan air. Ada beberapa macam peluntur zat

warna, antara lain:

a.    Peluntur warna bersifat asam yakni HNO3, HCl, H2SO4 dan campuran

asam-asam tersebut  dengan alcohol.

b.    Peluntur zat warna bersifat basa yakni KOH, NaOH, sabun dan garam-

garam basa.

c.    Peluntur zat warna lemah, yaitu alcohol, air minya cengkeh, aseton dan

gliserin

d.    Garam-garam logam berat AgNO3, CuSO4 dan lain-lain.

e.    Garam-garam logam riangan Na2SO4, MgSO4 dan lain-lain

Umur biakan

Pewarnaan gram memberikan hasil baik bila menggunakan biakan segar

yang berumur 24-48 jm. Bila menggunakan biakan tua maka kemungkinan

besar terjadi penyimpangan hasil pewarnaan gram (Waluyo, 2008).

20

Perlakuan khusus

Prinsip pewarnaan gram

Dinding sel bakteri gram positif terdiri atas lapisan Peptidoglikan yang

tebal menjadikan afinitasnya tinggi terhadap Kristal violet dan iod

membentuk senyawa sukar larut dalam alkohol, sehingga tetap

memegang kuat zat utama ( berwarna ungu ).

Dinding sel bakteri gram negatif mengandung lapisan lemak dan

karbohidrat yang afinitasnya rendah terhadap cat utama dan mudah

luntur atau larut dalam alkohol, selanjutnya akan menerima atau

memegang cat lawan ( berwarna merah ).

Kelebihan dan kekurangan pewarnaan gram

1. Kelebihan

Pengecatan Gram penting sebagai pedoman awal untuk memutuskan

terapi antibiotik, sebelum tersedia bukti definitif bakteri penyebab infeksi (kultur

dan tes kepekaan bakteri terhadap antibiotik). Hal ini karena bakteri Gram

positif dan negatif mempunyai kepekaan yang berbeda terhadap berbagai jenis

antibiotika. Kadang-kadang morfologi bakteri yang telah dicat Gram mempunyai

makna diagnostik. Misalnya pada pemeriksaan Gram ditemukan Gram negatif

diplococci intraseluler dari spesimen pus (nana) uretral, maka memberikan

presumptive diagnosis untuk penyakit infeksi gonore.

21

2. Kekurangan

Pengecatan Gram memerlukan mikroorganisme dalam jumlah banyak

yakni lebih dari 104 per ml. Sampel yang cair dengan jumlah kecil

mikroorganisme misalnya cairan serebrospinal, memerlukan prosedur sentrifuge

dulu untuk mengkonsentrasikan mikroorganisme tersebut. Pellet (endapan hasil

sentrifuge) kemudian dilakukan pengecatan untuk diperiksa secara mikroskopis.

Berikut ini adalah penyakit-penyakit yang dapat ditimbulkan bakteri

Gram positif dan negatif:

Gram Genus Penyakit

Gram

positif

Staphylococcus

Streptococcus

Enterococcus

Listeria

Bacillus

Clostridium

Mycobacterium

Propionibacterium

Mycoplasma

impetigo, keracunan makanan,

bronkitis

pneumonia/radang paru,

meningitis, karies gigi

enteritis

listeriosis

anthrax

tetanus, botulisme

difteri

tuberkulosis

jerawat

pneumonia

Gram

negatif

Salmonella Salmonelosis

gastroenteritis/radang saluran

22

Escherichia

Shigella

Neisseria

Bordetella

Legionella

Pseudomonas

Vibrio

Campylobacter

Helicobacter

Haemophilus

Treponema

Chlamydia

cerna

disentri

meningitis, gonorea

batuk rejan

legionnaires' disease

infeksi luka bakar

kolera

gastroenteritis

tukak lambung

bronkitis, pneumonia

sifilis

pneumonia, uretritis, trakoma

Mekanisme Penyerapan Zat Warna oleh Gram Positif dann Gram  

Negatif

Ada kalanya, setelah suatu preparat yang sudah meresap suatu zat warna,

kemudian dicuci dengan asam encer, maka semua zat warna terhapus. Ditinjau

dari tujuan pewarnaan sudah barang tentu pewarnaan tersebut merupakan

kegagalan. Tetapi ada juga preparat yang tahan asam encer, misalnya hasil basil

TBC dan basil-basil yang berspora. Setelah zat warna yang pertama (ungu)

terserap, maka sediaan dicuci dengan alkohol kemudian ditumpangi dengan zat

warna yang berlainan, yaitu dengan zat warna merah. Jika sediaan itu kemudian

kita cuci dengan air, lalu dengan alcohol maka dua kemungkinan dapat terjadi.

23

Pertama, zat warna tambahan terhapus, sehingga yang nampak ialah zat warna

asli (ungu). Dalam hal ini sediaan (bakteri) kita sebut gram positif. Kedua, zat

warna tambahan (merah) bertahan hingga zat warna asli tidak tampak. Dalam

hal ini sediaan bakteri kita katakan gram negatif (Dwidjoseputro,1998).

Menurut Hadioetomo (1988), dinding sel yang lebih tebal pada bakteri

gram positif menyusut oleh perlakuan alkohol karena terjadinya dehidrasi,

menyebabkan pori-pori dinding sel menutup sehingga mencegah larutnya

kompleks ungu kristal-iodium pada langkah pemucatan. Sedangkan sel-sel gram

negatif mempunyai kandungan lipid yang lebih tinggi pada dinding selnya dan

lipid pada umumnya larut dalam alkohol dan aseton. Larutan lipid oleh pemucat

yang digunakan dalam pewarnaan gram diduga memperbesar pori-pori dinding

sel dan inilah yang menyebabkan proses pemucatan pada sel-sel gram negatif

berlangsung lebih cepat.

2.3 Pewarnaan Spora

24

Spora bakteri adalah bentuk bakteri yang sedang dalam usaha

mengamankan diri  terhadap pengaruh buruk dari luar.Spora bakteri mempunyai

fungsi yang sama sepertti kristal amoeba, sebab bakteri dalam bentuk spora dan

amoeba dalam bentuk Kristal merupakan suatu fase di mana kedua

mikroorganisme itu berubah bentuk untuk melindungi diri terhadap faktor luar

yang tidak menguntungnkan. Endospora hanya terdapat pada bakteri merupakan

25

tubuh dinding  yang tebal yang sangat refraktif, dan sangat resisten. Dihasilkan

oleh semua spesies basillus, clostidum, dan sporosarcina. Bakteri yang mampu

membentuk endospora dapat tumbuh dan bereproduksi selama banyak generasi

sehingga sel vegetatif. Namun pada beberapa tahapan di dalam pertumbuhanya,

terjadi sintesis protoplasma baru dalam sitoplasma vegetatifnya yang di

maksudkan untuk menjadi spora (Pelczar, 2007).

Bentuk spora ada yang bulat, ada pula yang bulat panjang. Hal ini

tergantung oleh spesisesnya endospora ada yang lebih kecil ada pula yang lebih

besar dari pada diameter sel induk. Letak sel di dalam sel serta ukurannya dalam

pembentukanya  tidaklah sama bagai semua spesies. Sebagai contoh beberapa

spora adalah sental yang dibentuk ditengah-tengah sel, yang kedua adalah

terminal yang dibentuk diujung, ketiga yaitu  subterminal yang dibentuk di dekat

ujung. Pada umumnya sporulasi itu mudah terjadi jika keadaan medium

memburuk dan zat-zat yang timbul sebagai zat-zat pertukaran zat bertimbun-

timbun dan faktor-faktor luar lainya merugikan tetapi pada beberapa spesies

mampu membentuk spora meskipun tidak terganggu oleh faktor luar. Sporulasi

dapat di cegah, jika selalu diadakan pemindahan piaraan ke medium yang baru,

beberapa spesies bakteri dapat kehilangan kemampuanya untuk membentuk

spora-spora dapat tumbuh lagi menjadi bakteri apabila keadaan di luar

menguntungkan. Mula-mula air meresap ke dalam spora, kemudian spora

mengembang dan kulit spora menjadi retak karenanya  keretakan ini dapat

terjadi pada salah satu ujung. Tetapi juga dapat terjadi di tengah-tengah spora.

Hal ini merupakan cirri khas bagi beberapa spesies bacillus, jika kulit spora

26

pecah di tengah-tengah maka masing-masing pecahan akan merupakan suatu

tutup pada kedua ujung bakteri (Pelczar, 2001).

Tujuan dari pewarnaan spora yaitu mengenal dasar-dasar kimiawi pada

pewarnaan spora dan kinerja dari prosedur untuk membedakan spora bakteri dan

bentuk vegetatif. Prinsip pada pewarnaan ini pemanasan akan mengembangkan

lapisan luar spora sehingga berwarna hijau. Melalui pendinginan utama akan

terperangkap didalam spora dengan pencucian zat warna utama yang da pada sel

vegetatif akan terlepas, sehingga pada pewarnaan yang kedua(safranin) sel

vegetatif akan berwarna merah. Fungsi zat warna malachite green merupakan

pewarna yang kuat yang dapat berpenetrasi kedalam endospora (Dwidjoseputro,

2005).

Spora pada bakteri merupakan struktur yang tahan panas dan tahan bahan

kimia. Spora dibentuk oleh bakteri tertentu untuk mengatasi lingkungan yang

tidak mengntungkan bagi bakteri tersebut. Lingkungan yang tidak

memungkinkan atau menguntungkan disebabkan langkanya sumber karbon,

energy dan fosfat. Selain itu bahaya yang bersifat toksik, suhu yang idak sesuai

atau lingkungan yang kering.

Ada dua tipe spora yang terbentuk, yang pertama terbentuk dalam sel,

yang disebut dengan endospora dan spora yang terbentuk diluar sel yang disebut

eksospora. Lapisan bagian luar spora merupakan lapisan penahan yang baik

terhadap bahan kimia, sehingga spora sulit diwarnai. Spora bakteri dapat

diwarnai dengan cara dipanaskan. Pemanasan ini menyebabkan lapisan luar

27

spora mengembang sehingga zat warna dapat masuk, dapat memakai larutan

hijau malakhit dan lauran safranin (Waluyo, 2008).

Faktor-faktor yang mempengaruhi pengecatan spora:

1. Fiksasi

2. Smear terlalu tebal

3. Waktu pengecatan tidak tepat

4. Konsentrasi reaagen

5. Umur bakteri

6. Nutrisi

2.4 Faktor- Faktor Yang Mempengaruhi Pewarnaan Bakteri

1.      Fiksasi

Fiksasi perlu dilakukan sebelum pewarnaan bakteri karena berguna

merekatkan sel bakteri pada gelas objek, membunuh bakteri, melepaskan granula

(butiran) protein menjadi gugusan reaktif (NH3+) membuat sel-sel lebih kuat,

mencegah terjadinya otolisis sel, mengubah avinitas, fiksasi dapat dilakukan

secara fisik atau dengan bahan kimia.

2.      Peluntur zat warna

Peluntur zat warna berguna untuk menghasilkan kontras yang lebih baik

pada bayangan mikroskop. Pada umumnya, sel-sel yang mudah diwarnai akan

lebih mudah pula dilunturkan warnanya. Sedangkan sel-sel yang sukar diwarnai

akan lebih sukar dilunturkan warnanya.

28

3.      Substrata

Merupakan zat warna asam atau basa dapat bereaksi dengan senyawa-

senyawa tertentu. Oleh karena itu, senyawa-senyawa organik seperti protein,

karbohidrat, lemak dan asam nukleat akan mempengaruhi pewarnaan.

Berdasarkan jenis zat warna yang diserap oleh sel, maka dapat dibedakan tiga

macam sel yaitu: sel-sel asidofil, basodill dan sudanofil.

4.      Intensifikasi warna

Zat warna dapat diintensifikasikan dengan cara menambahkan mordan,

yaitu zat kimia yang dapat menyebabkan sel-sel bakteri dapat diwarnai lebih

intensif karena zat warna terikat lebih kuat daripada jaringan sel. Mordan dibagi

atas dua macam, yaitu mordan asam dan mordan basa. Mordan asam adalah

mordan yang bereaksi dengan zat-zat warna basa. Sedangkan mordan basa

adalah mordan yang bereaksi dengan anion zat warna asam.

5.      Zat warna penutup atau zat warna lawan

Zat warna lawan adalah suatu zat warna basa yang berbeda warnanya

dengan zat warna mula-mula yang digunakan. Gunanya adalah untuk

memberikan warna pada sel-sel yang berbeda warnanya dengan zat warna mula-

mula. Zat warna penutup diberikan pada akhir pewarnaan dengan tujuan untuk

memberikan kontras pada sel-sel yang tidak menyerap zat warna utama (Sutedjo,

1991).

2.5 Teknik Pewarnaan Gram

29

Alat :

Object Glass

Cover Glass

Pipet Tetes

Botol Semprot

Bunsen

Bahan :

Apusan Bakteri

Zat Warna Gentian Violet

Iodine

Alcohol

Zat Warna Safranin/ Air Fuchsin

Aquades

Spiritus

Prosedur :

1. Persiapkan Apusan bakteri yang telah dibuat pada tahap sebelumnya.

2. Teteskan 1 tetes Zat Warna I (Gentian Violet) ke atas area apusan,

biarkan selama 20 detik.

3. Cuci perlahan dengan menggunakan air aquades, biarkan 2 detik.

4. Teteskan 1 tetes Larutan Iodine ke atas apusan, biarkan 30 detik s.d. 1

menit.

30

5. Cuci dengan Alcohol, hingga larutan yang mengalir sudah tidak

berwarna (sekitar 10 – 20 detik).

6. Cuci perlahan dengan menggunakan air aquades, biarkan selama 2 detik.

7. Teteskan 1 tetes Zat Warna II (Safranin/ Air Fuchsin), biarkan selama 20

detik.

8. Cuci perlahan dengan menggunakan air aquades, biarkan selama 2 detik.

9. Keringkan di suhu ruang.

10. Amati di atas mikroskop dengan perbesar 100 x Objektif, dengan

bantuan minyak imersi.

2.6 Teknik Pewarnaan Spora

1. Alat- alat :

- Lampu bunsen

- Pipel

- Objek glass (kaca presparat dan penutup)

- Tabung reaksi

- Jarum oase

- Mikroskop

- Kipas angin

- Kaca tipis

- Spatula

- Gunting

- Spritus

31

- Kertas saring

- Pinset

- Cover glass

- Pensil

- Kertas

2. Bahan – Bahan :

-       Aquades

-       Alkohol 95 % + 70 %

-       Biakan murni satu jenis bakteri

-       Zat warna Kristal violet

-       Nigrosin

-       Larutan logol’s

-       Malachite green

-       Tissue

-       Crystal violet

-       Safranin

-       Methylen

-       Media Na

-       Nigrap

-       Tinta cina

Prosedur :

32

1. Disterilkan kaca preparat dengan alkohol 70%.

2. Dikeringkan (dilap) dengan tissue.

3. Difiksasi diatas lampu bunsen.

4. Ditetesi akuades.

5. Difiksasi sampai tetesan akuades menyerap dan berbekas diatas kaca

preparat.

6. Diambil secara aseptis suatu koloni dengan menggunakan jarum ose.

7. Tutup koloni tersebut dengan menggunakan kertas saring.

8. Teteskan 2-3 tetes malachite green.

9. Difiksasi diatas lampu bunsen.

10. Diamkan selama 1 menit, setelah itu lepas kertas saring.

11. Bilas dengan akuades selama 30 detik.

12. Teteskan safranin selama 30 detik.

13. Keringkan.

14. Amati dengan mikroskop dan catat hasil.

2.7 Teknik Pewarnaan Nukleus

Pegertian Nukleus

33

Nukleus merupakan organel terbesar dalam sel, terdapat di semua sel

eukariotik, kecuali sel-sel pembuluh floem dewasa dan sel darah merah mamalia

dewasa. Bentuk inti umumnya bulat hingga lonjong dengan garis tengah ± 10

µm (mikro meter) dan panjangnya ± 20 µm. Umumnya tiap sel hanya memiliki

satu inti, tetapi ada juga organisme yang memiliki inti lebih dari satu.

Contohnya, Paramecium yang memiliki dua inti, yaitu mikronukleus dan

makronukleus.

Nukleus memiliki peranan yang sangat penting bagi kehidupan sel,

karena berfungsi mengendalikan seluruh kegiatan sel. Hal ini disebabkan karena

inti sel mengandung informasi genetika dalam bentuk DNA (deoxyribonucleic

acid). DNA mampu mereplikasi (membuat tiruan diri) yang diikuti oleh

pembelahan inti. Sehingga, inti duplikasinya mengandung DNA yang sama

seperti induknya.

Nukleus terbungkus oleh selaput inti dan mengandung kromatin, satu

atau dua nukleolus, dan nukleoplasma. Selaput inti terdiri atas dua lapis

membran. Selaput luar berhubungan langsung dengan retikulum endoplasma,

retikulum endoplasma tertutup oleh ribosom dan terlibat dalam sintesis protein.

34

Pada selaput inti terdapat pori-pori yang memungkinkan pertukaran zat-zat

antara nukleus dan sitoplasma, misalnya keluarnya RNAd (ribonucleic acid

duta), masuknya protein ribosom, nukleotida, dan molekul yang mengatur

kegiatan DNA.

Di dalam inti terdapat nukleoplasma atau getah inti yang berbentuk gel.

Nukleoplasma mengandung berbagai substansi kimia, seperti ion-ion, protein,

enzim, dan nukleotid. Kromatin tersusun atas untaian DNA yang terikat pada

protein dasar. Kromatin berarti materi berwarna, karena sifatnya yang mudah

menyerap warna agar bisa dilihat di bawah mikroskop.

Pada proses pembelahan sel, kromatin menyerap zat pewarna secara intensif

sehingga lebih mudah dilihat. Benang kromatin mengerut (memendek)

menyerupai benang terpilin yang disebut kromosom.

Nukleolus memiliki bentuk bulat, terdapat di dalam nukleoplasma yang

berfungsi dalam pembuatan RNA. Selain itu, nukleolus mengandung banyak

DNA yang bertindak sebagai organisator nukleus dan mengandung salinan gen-

gen yang memberi kode RNA ribosom. Nukleolus akan melarut dan tidak

tampak lagi dalam profase (tingkat awal dalam proses pembelahan sel) dan akan

dibuat lagi oleh organisator pada akhir pembelahan sel (telofase).

Nukleus mengandung sebagian besar gen yang mengendalikan sel

eukariota (sebagian lain gen terletak di dalam mitokondria dan kloroplas).

Dengan diameter rata-rata 5 µm, organel ini umumnya adalah organel yang

35

paling mencolok dalam sel eukariota. Kebanyakan sel memiliki satu nukleus,

namun ada pula yang memiliki banyak nukleus, contohnya sel otot rangka, dan

ada pula yang tidak memiliki nukleus, contohnya sel darah merah matang yang

kehilangan nukleusnya saat berkembang.

Selubung nukleus melingkupi nukleus dan memisahkan isinya (yang

disebut nukleoplasma) dari sitoplasma. Selubung ini terdiri dari dua membran

yang masing-masing merupakan lapisan ganda lipid dengan protein terkait.

Membran luar dan dalam selubung nukleus dipisahkan oleh ruangan sekitar 20–

40 nm. Selubung nukleus memiliki sejumlah pori yang berdiameter sekitar

100 nm dan pada bibir setiap pori, kedua membran selubung nukleus menyatu.

Di dalam nukleus, DNA terorganisasi bersama dengan protein menjadi

kromatin. Sewaktu sel siap untuk membelah, kromatin kusut yang berbentuk

benang akan menggulung, menjadi cukup tebal untuk dibedakan melalui

mikroskop sebagai struktur terpisah yang disebut kromosom.

Struktur yang menonjol di dalam nukleus sel yang sedang tidak membelah ialah

nukleolus, yang merupakan tempat sejumlah komponen ribosom disintesis dan

dirakit. Komponen-komponen ini kemudian dilewatkan melalui pori nukleus ke

sitoplasma, tempat semuanya bergabung menjadi ribosom. Kadang-kadang

terdapat lebih dari satu nukleolus, bergantung pada spesiesnya dan tahap

reproduksi sel tersebut.

Nukleus mengedalikan sintesis protein di dalam sitoplasma dengan cara

mengirim molekul pembawa pesan berupa RNA, yaitu mRNA, yang disintesis

36

berdasarkan "pesan" gen pada DNA. RNA ini lalu dikeluarkan ke sitoplasma

melalui pori nukleus dan melekat pada ribosom, tempat pesan genetik tersebut

diterjemahkan menjadi urutan asam amino protein yang disintesis.

Fungsi Nukleus adalah sebagai berikut :

1. Mengendalikan seluruh kegiatan sel

2. Mengeluarkan RNA dan subunit ribosom ke sitoplasma

3. Mengatur pembelahan sel

4. Membawa informasi genetic Fungsi Nukleus memiliki peran yang sangat vital

dalam kehidupan sebuah sel.

5. Peranan nucleus dalam hal ini adalah untuk mengatur dan mengontrol segala

aktifitas kehidupan sel serta membawainformasi genetik yang diturunkan ke

generasi berikutnya.

Contoh pewarnaan pada nukleus

37

Hematoxylin akan mewarnai nucleus. Ada delapan jenis larutan

pewarnaan haematoxylin, yaitu  Dellafied, Erlich, Heidenhains, Harris, Mayer,

Weigert, Carazzi, dan Cole. Masing-masing formula pewarnaan memiliki

kelebihan dan kekurangan masing-masing. Yang paling sering digunakan

adalah haematoxylin Mayer danhaematoxylin Harris.

Komposisi Haematoxylin Mayer

• Kristal haematoxylin………………….... 1 gr

• Akuades…………………………….....… 1000 ml

38

• Sodium iodate…………………………… 0,2 gr

• Ammonium/potassium alum.................. 50 gr

• Citric acid………………………….....…. 1 gr

• Chloralhydrate………………………..…. 50 gr

Cara Pembuatan Hematoxylin Mayer

1. Larutkan Ammonium/Potassium alum di dalam aquades.

2. Tambahkan Haematoxylin dan campurkan secara baik.

3. Tambahkan Sodium Iodate, Citric Acid, dan Chloralhydrate.

4. Campur dan aduk hingga seluruhnya tercampur dengan baik.

5. Biarkan semalam dan saring dengan kertas saring besoknya.

Prosedur Pewarnaan Nukleus dengan Hematoxylin :

- Deparafinasi dengan xylene

- Kelebihan xylene diisap dengan kertas filter melalui tepi gelas benda.

- Celup sebentar dalam alkohol 96%, kemudian 80%, 70%, 50%, 30%, aquadest.

- Masukkan kedalam larutan Hematoxylin dengan waktu tertentu : 3-7 detik.

- Air mengalir : 10 menit. Cuci aquadest sebentar.

- Masukkan sebentar saja berturut-turut mulai dari alkohol 30%, 50%, 70%.

- Kemudian kedalam larutan eosin 0,5% (dalam alkohol 70%) 1-3 menit.

- Pewarnaan selesai, tetapi jaringan tidak dapat ditutup langsung dengan Canada

balsam, karena Canada balsam dilarutkan dalam xylene, sedangkan jaringan

39

masih berada dalam media alkohol 70% sehingga jaringan harus dibawa ke

media xylene dulu.

- Dari larutan eosin 0,5% (dalam alkohol 70%) selanjutnya berturut-turut

masukkan ke alkohol 70%, 80%, 96%, alkohol absolut, masing-masing

sebentar saja.

- Masukkan xylene ± 10 menit (xylene berfungsi untukl mengantar ke canada

balsam juga berfungsi untuk menjernihkan jaringan yang sudah terpulas).

- Jarigan ditutup dengan gelas penutup setelah ditetesi dengan Canada balsam

terlebih dahulu.

Untuk menganalisis struktur jaringan yang telah diiris, preparat harus

diwarnai.Pewarnaan rutin yang sering dikerjakan adalah haematoxylin-eosin

(HE), karena pewarnaan ini dapat menunjukkan sebagian besar struktur

histologi.

Afinitas hematein terhadap nuclei tidak baik, jika tidak menggunakan Mordant.

Mordant adalah penghubung haematoxyllin dan DNA

Logam: Al, Fe, tungsten, molybdenum, lead.

Tipe mordant mempengaruhi tipe jaringan yang terwarnai dan hasil akhir

pewarnaan

Eosin adalah zat warna Xanthene. Eosin paling cocok dikombinasikan

dengan pewarna haematoxylin. Eosin memiliki nilai kemampuan differensiasi

40

sendiri untuk membedakan antara sitoplasma dari tiap sel dan serabut jaringan

ikat yang berbeda.

Jenis eosin :

Eosin Y (yellowish), water soluble

Eosin B (Bluish)

Ethyl Eosin (eosin S, eosin alkohol absolut)

Eosin Y(yellowish) paling banyak digunakan, karena termasuk zat warna

asam sehingga dapat berikatan dengan protein (basa) dan dapat berpenetrasi

pada struktur padat dan bersifat metakromatik. Terdapat dalam 2 bentuk ,yaitu :

monomer (merah) dan dimer (orange merah).

Hasil pewarnaannya , yaitu : sitoplasma akan berwarna merah, eritrosit akan

berwarna orange merah, nukleus piknotik akan berwarna ungu, dan nukleolus

akan berwarna merah.

Komposisi Eosin

Eosin-alkohol Stock 1%

• Eosin y ws……………………………………… 1 gr

• aquades……………………………………………… 20 ml

• Larutkan dan tambahkan alkohol 95% ……….. 80 ml

Eosin working solution

• Eosin-alkohol stock 1 bagian

41

• Alkohol 80% 3 bagian

• Dibuat sesaat sebelum digunakan dan tambahkan Asam Asetat glasial 0,5 ml

untuk

setiap 100 ml larutan dan aduk dengan baik.

Cara kerja :

1. deparafinisasi preparat yang telah kering ke dalam xylol sebanyak 3x (@

10 menit)

2. Masukkan ke dalam alkohol sebanyak 2x (@5 menit)

3. cuci dengan air mengalir sampai alkohol hilang

4. masukkan ke dalam larutan hematoxylin selama 7 menit

5. cuci dengan air mengalir sampai tidak luntur

6. celupkan dalam HCL 2x celup untuk decolorisasi

7. cuci dengan air

8. rendam dalam air sampai warna air menjadi biru

9. masukkan ke dalam larutan eosin

10. cuci dengan air mengalir

11. cuci dengan alkohol I

12. cuci dengan alkohol II

42

 Gambar Menutup kaca benda dengan cover glass (kiri). Hasil pewarnaan HE

pada kulit tebal (kanan).

Hasil

• Nukleus berwarna biru.

• Sitoplasma berwarna kemerahan dengan adanya beberapa variasi warna pada

komponen tertentu.

43

 Gambar irisan jaringan yang telah diwarnai dan ditutupi dengan cover glass

diletakkan di atas slide tray hingga entellan mengering.

44

BAB IIIPENUTUP

3.1 KesimpulanPada umumnya bakteri bersifat tembus cahaya, hal ini disebabkan karena

banyak bakteri yang tidak mempunyai zat warna (Waluyo, 2007) . Salah satu

cara untuk mengamati bentuk sel bakteri sehingga mudah untuk diidentifikasi

ialah dengan metode pengecatan atau pewarnaan.

Pewarnaan gram adalah salah satu teknik pewarnaan diferensial yang

paling penting dan paling luas digunakan untuk bakteri.

Pewarnaan GRAM, bakteri diklasifikasikan ke dalam 2 (dua) kelompok

besar yaitu : Bakteri Gram Positif dan Negatif.

Spora bakteri adalah bentuk bakteri yang sedang dalam usaha

mengamankan diri  terhadap pengaruh buruk dari luar.

3.2 Saran

Adapun tujuan pembuatan makalah ini adalah untuk memenuhi tugas

mata kuliah mikrobiologi dan parasitologi . Makalah ini jauh dari kesempurnaan.

Untuk itu penulis berharap bagi yang membaca makalah ini bisa memberikan

masukan.

45

DAFTAR PUSTAKA

Dwidjoseputro, D. 2005. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Jakarta : Djambatan.

Pelczar, M.J.2007. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Jakarta : UI Press.

Sutedjo, M.1991. Mikrobiologi Tanah. Jakarta : Rhineka Cipta.

Waluyo,lud. 2010. Buku Petunjuk Praktikum Mikrobiologi Umum. UMM.

Malang

Widjoseputro, D., 1989. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Malang : Djambatan

46

LAMPIRAN

RANGKUMAN HASIL DISKUSI

Tanggal : Kamis , 27 Februari 2014

Moderator : Rahma Puji Astuti

Observer : Poppy Apriani

Notulen : Ayu Andira

1. P {Tetry Rahayu Pratama (5)} : Apa perbedaan bakteri gram positif dan bakteri gram negatif ?

J {Desi Ratna Sari} :Perbedaan relatif sifat bakteri gram positif dan gram negatif.

Sifat Bakteri garam (+) Bakteri gram negatif(-)

Komposisi dinding sel Kandungan lipid rendah (1-4%)

Kandungan lipid tinggi

Ketahanan terhadap penisilin

Lebih sensitif Lebih tahan

Penghambatan oleh pewarna basa (VK)

Lebih dihambat Kurang dihambat

Kebutuhan nutrisi Kebanyakan spesies relatif kompleks

Relatif sederhana

Ketahanaa terhadapperlakuan fisik

Lebih tahan Kurang tahan

2. P {Fitri Yanti (2) } : Apa kekurangan dan kelebihan pewarnaan spora ?J {Afrilita Putri Yuza} : o Kekurangannya yaitu : beberapa spesies dapat kehilangan kemampuanya

untuk membentuk spora-spora dapat tumbuh lagi menjadi bakteri apabila

keadaan di luar menguntungkan.

o Kelebihannya yaitu : dapat mengenal dasar-dasar kimiawi pada

pewarnaan spora dan kinerja dari prosedur untuk membedakan spora

bakteri dan bentuk vegetatif.

3. P {Izzi Wahyuni (2) } : Apa faktor-faktor yang mempengaruhi pewarnaan

bakteri?

J { Angelia Yolanda } :

47

a) FiksasiFiksasi perlu dilakukan sebelum pewarnaan bakteri karena berguna merekatkan sel bakteri pada gelas objek, membunuh bakteri, melepaskan granula (butiran) protein menjadi gugusan reaktif (NH3+) membuat sel-sel lebih kuat, mencegah terjadinya otolisis sel, mengubah avinitas, fiksasi dapat dilakukan secara fisik atau dengan bahan kimia.

b) Peluntur zat warnaPeluntur zat warna berguna untuk menghasilkan kontras yang lebih baik pada bayangan mikroskop. Pada umumnya, sel-sel yang mudah diwarnai akan lebih mudah pula dilunturkan warnanya. Sedangkan sel-sel yang sukar diwarnai akan lebih sukar dilunturkan warnanya.

c) SubstrataMerupakan zat warna asam atau basa dapat bereaksi dengan senyawa-senyawa tertentu. Oleh karena itu, senyawa-senyawa organik seperti protein, karbohidrat, lemak dan asam nukleat akan mempengaruhi pewarnaan. Berdasarkan jenis zat warna yang diserap oleh sel, maka dapat dibedakan tiga macam sel yaitu: sel-sel asidofil, basodill dan sudanofil.

d) Intensifikasi warnaZat warna dapat diintensifikasikan dengan cara menambahkan mordan, yaitu zat kimia yang dapat menyebabkan sel-sel bakteri dapat diwarnai lebih intensif karena zat warna terikat lebih kuat daripada jaringan sel. Mordan dibagi atas dua macam, yaitu mordan asam dan mordan basa. Mordan asam adalah mordan yang bereaksi dengan zat-zat warna basa. Sedangkan mordan basa adalah mordan yang bereaksi dengan anion zat warna asam.

e) Zat warna penutup atau zat warna lawanZat warna lawan adalah suatu zat warna basa yang berbeda warnanya dengan zat warna mula-mula yang digunakan. Gunanya adalah untuk memberikan warna pada sel-sel yang berbeda warnanya dengan zat warna mula-mula. Zat warna penutup diberikan pada akhir pewarnaan dengan tujuan untuk memberikan kontras pada sel-sel yang tidak menyerap zat warna utama (Sutedjo, 1991).

4. P {Riska (4) }: Apa tujuan dari pewarnaan bakteri gram positif dan negatif ?J {Dian Agusti Tanjung }:a. Mempermudah melihat bentuk jasad, baik bakteri, ragi, ataupun fungi.b. Memperjelas ukuran dan bentuk jasad.c. Melihat struktur luar dan kalau memungkinkan juga struktur dalam jasad.d. Melihat reaksi jasad terhadap pewarna yang diberikan sehingga sifat-sifat

fisik dan kimia yang ada akan dapat diketahui.

48

5. P {Surya Yuliana (5) } : Apa yang dimaksud dengan larutan Malachite green ?J {Dzaiyat Irwan } :

Malachite Green merupakan pewarna triphenylmethane dari group rasamilin. Bahan ini merupakan bahan yang kerap digunakan untuk mengobati berbagai penyakit dan parasit dari golongan protozoa .

Fungsi zat warna malachite green merupakan pewarna yang kuat yang dapat berpenetrasi kedalam endospora

49