HPLC / KCKT(High Performance Liquid Chromatography / Kromatografi Cair Kinerja Tinggi)

PENDAHULUANKromatografi Cair Kinerja Tinggi atau KCKT atau biasa juga disebut dengan High Performance Liquid Chromatography (HPLC) dikembangkan pada akhir tahun 1960-an dan awal tahun 1970-an. Saat ini, KCKT merupakan teknik pemisahan yang diterima secara luas untuk analisis dan pemurnian senyawa tertentu dalam suatu sampel pada sejumlah bidang, salah satunya adalah bidang farmasi.Kegunaan umum KCKT :1. Pemisahan sejumlah senyawa organik, anorganik, maupun senyawa biologis2. Analisis ketidakmurnian3. Analisis senyawa-senyawa tidak mudah menguap4. Penentuan molekul-molekul netral ionic, maupun zwitter ion5. Isolasi dan pemurnian senyawa6. Pemisahan senyawa-senyawa yang strukturnya hampir sama7. Pemisahan senyawa-senyawa dalam jumlah sekelumit, jumlah banyak, dan dalam skala proses industri.Dalam bidang farmasi, khususnya pada analisis farmasi, metode KCKT merupakan metode yang sangat popular untuk menetapkan kadar senyawa obat baik dalam bentuk sediaan atau dalam sampel hayati. Hal ini disebabkan KCKT merupakan metode yang memberikan sensitifitas dan spesifisitas yang tinggi.

INSTRUMENTASI PADA KCKTInstrumentasi pada KCKT pada dasarnya terdiri atas : wadah fase gerak, pompa, alat untuk memasukkan sampel (tempat injeksi), kolom, detector, wadah penampung buangan fase gerak, dan suatu komputer atau integrator atau perekam. Diagram skematik sistem kromatografi cair ditunjukkan dalam gambar di bawah ini :

Gambar 1. Sistem peralatan KCKT secara umum

1. Wadah Fase Gerak dan Fase Gerak Wadah fase gerak harus bersih dan lembam (inert/tidak bereaksi dengan isi wadah). Wadah pelarut kosong atau labu laboratorium dapat digunakan sebagai wadah fase gerak. Wadah ini biasanya dapat menampung fase gerak antara 1-2 liter pelarut.Fase gerak atau eluen biasanya terdiri atas campuran pelarut yang dapat bercampur yang secara keseluruhan berperan dalam daya elusi dan resolusi. Daya elusi dan resolusi ini ditentukan oleh polaritas keseluruhan pelarut, polaritas fase diam, dan sifat komponen-komponen sampel.Fase gerak harus disaring terlebih dahulu sebelum digunakan untuk menhindari partikel-partikel kecil. Selain itu, adanya gas dalam fase gerak juga harus dihilangkan, sebab adanya gas akan berkumpul dengan komponen lain terutama di pompa dan detector akan mengacaukan hasil analisis.

2. PompaPompa yang cocok digunakan untuk KCKT adalah pompa yang mempunyai syarat sebagaimana syarat wadah pelarut, yakni: pompa harus inert terhadap fase gerak. Bahan yang umum dipakai untuk pompa adalah gelas, baja tahan karat, Teflon, dan batu nilam. Pompa yang digunakan sebaiknya mampu memberikan tekanan sampai 5000 psi dan mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan alir 3 mL/menit. Untuk tujuan preparatif, pompa yang digunakan harus mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan 20 mL/menit

Tujuan penggunaan pompa atau sistem penghantaran fase gerak adalah untuk menjamin proses penghantaran fase gerak berlangsung secara tepat, reprodusibel, konstan, dan bebas dari gangguan. Ada 2 jenis pompa dalam KCKT yaitu : pompa dengan tekanan konstan, dan pompa dengan aliran fase gerak yang konstan.

3. Injektor/Tempat Penyuntikan SampelSampel-sampel cair dan larutan disuntikkan secara langsung ke dalam fase gerak yang mengalir di bawah tekanan menuju kolom menggunakan alat penyuntik yang terbuat dari tembaga tahan karat dan katup Teflon yang dilengkapi dengan keluk sampel (loop sample) internal, dan eksternal

Gambar 2. Posisi keluk sampel (loop sample) pada keadaan (a) Load/Memasukkan Sampel, dan (b) injeksi sampel ke kolom

4. KolomAda 2 jenis kolom pada KCKT yaitu kolom konvensional dan kolom mikrobor. Kolom merupakan bagian KCKT yang mana terdapat fase diam untuk berlangsungnya proses pemisahan solute/analit.Kolom mikrobor mempunyai 3 keuntungan yang utama dibandingkan kolom konvensional, yakni : Konsumsi fase gerak kolom mikrobor hanya 80% atau lebih kecil dibanding dengan kolom konvensional karena pada kolom mikrobor kecepatan alir fase gerak lebih lambat (10-100 mikroliter/menit) Adanya aliran fase gerak yang lebih lambat membuat kolom mikrobor lebih ideal jika digabung dengan spektrometer massa. Sensitivitas kolom mikrobor ditingkatkan karena solute lebih pekat, karenanya jenis kolom ini sangat bermanfaat jika jumlah sampel terbatas missal sampel klinis.Kebanyakan fase diam pada KCKT berupa silica yang dimodifikasi secara kimiawi, silica yang tidak dimodifikasi, atau polimer-polimer stiren dan divinil benzene. Permukaan silica adalah polar dan sedikit asam karena adanya residu gugus silanol (Si-OH)Oktadesil silica (ODS atau C18) merupakan fase diam yang paling sering digunakan karena mampu memisahkan senyawa-senyawa dengan kepolaran yang rendah, sedang, maupun tinggi. Oktil atau rantai alkil yang lebih pendek lagi lebih sesuai untuk solute yang polar, silica-silika aminopropil dan sianopropil (nitril) lebih cocok sebagai pengganti silica yang tidak dimodifikasi. Silika yang tidak dimodifikasi akan memberikan waktu retensi yang bervariasi disebabkan karena adanya kandungan air yang digunakan.

5. DetektorDetektor pada KCKT dikelompokkan menjadi 2 golongan yaitu : detektor universal (yang mampu mendeteksi zat secara umum, tidak bersifat spesifik, dan tidak bersifat selektif) seperti detektor indeks bias dan detektor spektrometri massa; dan golongan detektor yang spesifik yang hanya akan mendeteksi analit secara spesifik dan selektif, seperti detektor UV-Vis, detektor fluoresensi, dan elektrokimiaIdealnya, suatu detektor harus mempunyai karakteristik sebagai berikut :a. Mempunyai respon terhadap solute yang cepat dan reprodusibelb. Mempunyai sensitifitas yang tinggi, yaitu mampu mendeteksi solute pada kadar yang sangat kecil c. Stabil dalam pengoperasiannyad. Mempunyai sel volume yang kecil sehingga mampu meminimalkan pelebaran pitae. Sinyal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi solute pada kisaran yang luar (kisaran dinamis linier) f. Tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak

6. Komputer, Integrator, atau RekorderAlat pengumpul data seperti computer, integrator, atau rekorder, dihubungkan dengan detektor. Alat ini akan mengukur sinyal elektronik yang dihasilkan oleh detektor lalu mem-plotkannya sebagai suatu kromatogram yang selanjutnya dapat dievaluasi oleh seorang analisRekorder saat ini jarang digunakan karena rekorder tidak dapat mengintegrasikan data, sementara itu baik integrator maupun komputer mampu mengintegrasikan puncak-puncak dalam kromatogram. Komputer mempunyai keuntungan lebih karena komputer secara elektronik mampu menyimpan kromatogram untuk evaluasi di kemudian hariINTERPRETASI DATA KROMATOGRAM HPLCCara menginterpretasi data kromatogram dari HPLC dilakukan dengan dua cara :1. Dengan penentuan waktu retensi2. Dengan penentuan berdasarkan luas dan tinggi puncakWaktu retensi/Retention time (Rt) adalah sinyal yang diterima dari detektor yang menunjukkan waktu suatu senyawa terelusi (untuk analisis kualitatif) dan jumlah sampel yang terpisah (untuk analisis kuantitatif)

Gambar 3. Contoh interpretasi data kromatogram HPLC untuk penentuan waktu retensi dari senyawa A dan senyawa B

Gambar di atas menjelaskan kepada kita bahwa terdapat dua senyawa yang berhasil dipisah setelah dibiarkan terelusi selama +/- 15 menit. Senyawa A terpisah sekitar menit ke-5, kemudian senyawa B baru terpisah pada menit ke-15. Interpretasi kromatogram dengan menggunakan penentuan waktu retensi, biasanya digunakan untuk mengidentifikasi sediaan farmasi yang beredar di pasaran dan dibandingkan dengan senyawa baku-nya, contohnya tablet Paracetamol.Sedangkan untuk interpretasi kromatogram dengan menentukan luas dan tinggi puncak biasa digunakan untuk menentukan jumlah sampel yang terpisah. Biasanya, nilai pasti dari luas dan tinggi dari puncak sudah ditampilkan secara otomatis di komputer. Jadi, tidak susah lagi dalam mengukur tinggi dan luas puncaknya.

AB

CD

Gambar 4. Contoh interpretasi data kromatogram HPLC untuk penentuan tinggi dan luas puncak

Dibawah ini merupakan contoh analisis dari sampel Asetaminofen menggunakan instrument HPLC :Acetaminophen (USP 32)Fase gerak= Metanol : Air (1:3) Larutan standar= Buatlah 0,01 mg/mL Asetaminofen dalam fase gerakSistem Kromatografi =Mode: LCDetektor: UV pada panjang gelombang 243 nmKolom: L1 ukuran 3,9-mm x 30-cmLaju alir: 1,5 mL/menitVolume injeksi: 10 L

REFERENSI1. Gandjar, Ibnu Gholib. 2012. Kimia Farmasi Analisis. Pustaka Pelajar : Yogyakarta.2. Rohman, Abdul. 2009. Kromatografi untuk Analisis Obat. Graha Ilmu : Yogyakarta.3. Agilent Technologies. HPLC Basics : Fundamentals of Liquid Chromatography (HPLC). Agilent Technologies Inc : California, USA.