HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC) /

KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI (KCKT)

Prinsip Dasar : pemisahan analit berdasarkan kepolarannya, dengan fase diam berupa kolom dan larutan tertentu sebagai fase geraknya.

Prinsip Kerja : dengan bantuan pompa, fasa gerak cair dialirkan melalui kolom ke detector. Cuplikan/sampel dimasukkan ke dalam aliran fasa gerak dengan cara penyuntikan. Di dalam kolom terjadi

pemisahan komponen-komponen campuran. Karena perbedaan kekuatan interaksi antara solute-solut

terhadap fasa diam. Solut-solut yang kurang kuat interaksinya dengan fasa diam akan keluar dari kolom

lebih dulu. Sebaliknya, solut-solut yang kuat berinteraksi dengan fasa diam maka solute-solut tersebut akan

keluar kolom dideteksi oleh detector kemudian direkam dalam bentuk kromatogram kromatografi gas.

Seperti pada kromatografi gas, jumlah peak menyatakan konsentrasi komponen dalam campuran. Computer

dapat digunakan untuk mengontrol kerja sistem HPLC dan mengumpulkan serta mengolah data hasil

pengukuran HPLC.

Komponen/ Alat dan Fungsinya: 1. Fasa Gerak : Fasa gerak dalam HPLC adalah berupa zat cair dan disebut juga eluen atau pelariut.

Berbeda dengan kromatografi gas, HPLC mempunyai lebih banyak pilihan fasa gerak, dibandingkan dengan

fasa gerak untuk kromatografi gas. Dalam kromatografi gas, fasa gerak hanya sebagai pembawa solute

melewati kolom menuju detector. Sebaliknya dalam HPLC, fasa gerak selain berfungsi membawa

komponen-komponen campuran menuju detector, fasa gerak dapat berinteraksi dengan solute-solut. Oleh

karena itu, fasa gerak dalam HPLC merupakan salah satu faktor penentu keberhasilan proses pemisahan.

Zat cair yang akan digunakan sebagai fasa gerak HPLC harus memenuhi beberapa persyaratan berikut:

a. pelarut yang baik untuk cuplikan. b. kemurnian tinggi untuk menghindarkan masuknya kotoran yang dapat menganggu interpretasi

kromatogram.

c. jernih untuk menghindarkan penyumbatan pada kolom. d. mudah diperoleh, murah, tidak mudah terbakar, dan tidak beracun. e. zat cair tidak kental. f. sesuai dengan detektor. Jenis fasa gerak:

Fasa gerak untuk kromatografi partisi, adsorpsi, dan penukar ion bersifat interaktif dalam arti fasa gerak

berinteraksi dengan komponen-komponen cuplikan. Akibatnya, waktu retensi sangat dipengaruhi oleh jenis

pelarut. Sebaliknya fasa gerak untuk kromatografi eksklusi bersifat non interaktif. Oleh karena itu, waktu

retensi dengan kromatografi ini tidak bergantung pada komposisi fasa gerak.

2. Pompa : berfungsi untuk mengalirkan fasa gerak cair melalui kolom yang berisi serbuk halus. Pompa yang dapat digunakan dalam HPLC harus memenuhi persyaratan :

1. Menghasilkan tekanan sampai 600 psi (pons/in2); 2. Keluaran bebas pulsa; 3. Kecepatan alir berkisar antara 0,1-10 mL/menit; 4. Bahan tahan korosi Dikenal tiga jenis pompa yang masing-masing memiliki kenutungan dan kekurangannya yaitu pompa

reciprocating, displacement dan pneumatic.

a. Pompa reciprocating : Jenis pompa ini sekarang banyak dipakai. Pompa ini terdiri dari ruangan kecil tempat pelarut yang dipompa dengan cara gerakan piston mundur-maju yang dijalankan oleh motor.

Piston berupa batang gelas dan berkontak langsung dengan pelarut.

b. Pompa displacement : Pompa ini menyerupai syringe (alat suntik) terdiri dari tabung yang dilengkapi pendorong yang digerakan oleh motor. Pompa ini juga menghasilkan aliran yang cenderung tidak

bergantung tekanan baik kolom dan viskositas pelarut. Selain itu, keluaran pompa ini bebas pulsa. Akan

tetapi pompa ini keterbatasan kapasitas pelarut (~250 mL) dan tidak mudah untuk melakukan pergantian

pelarut.

c. Pompa pneumatic :Dalam pompa ini pelarut di dorong oleh gas bertekanan tinggi. Pompa jenis ini murah dan bebas pulsa. Akan tetapi mempunyai keterbatasan kapasitas dan tekanan yang dihasilkan

(

dilakukan untuk analisis senyawa-senyawa hidrokarbon aromatic polisiklik (PAH) atau residu pestisida dalam

makanan.

Sebagai alternative lain, sampel air dapat di absorpsi oleh suatu adsorben padat (C8 atau C18 yang terikat

pada silica gel), diikuti dengan desorpsi dalam suatu solven yang kemudian langsung dimasukan kedalam kolom.

Suatu solven dengan polaritas rendah, misalnya CH3 berair yang secara bertingkat mengalami perubahan

menjadi CH3OH murni, menjamin pemisahan yang baik pada C-18 yang terikat pada silica gel.

Kelebihan HPLC Dibandingkan dengan kromatografi gas, kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT atau HPLC = High

Performance Liquid Chromatography) mempunyai beberapa kelebihan. Beberapa kelebihan KCKT diantaranya

ialah:

1. dapat dilaksanakan pada suhu kamar; 2. cepat dan mudah melaksanakannya; 3. peka, detektor HPLC dapat divariasi dan unik; 4. pelarut pengembang bisa dipakai berulang kali demikian juga dengan kolomnya; 5. ideal untuk molekul besar dan ion; 6. mudah memperoleh cuplikan; 7. daya pisahnya baik; 8. dapat dihindari terjadinya dekomposisi/kerusakan bahan yang di analisis. 9. HPLC juga dapat menganalisis senyawa yang tidak mudah menguap dan termolabil.

Aplikasi HPLC Dalam Kehidupan HPLC juga cocok digunakan untuk memisahkan minyak atsiri. Minyak atsiri terdiri atas campuran yang

sangat rumit dan oleh karena itu HPLC berguna untuk memisahkan campuran rumit menjadi golongan-golongan

senyawa atau memisahkan golongan senyawa menjadi komponen-komponennya. HPLC digunakan untuk

memisahkan golongan minyak, misalnya terpenoid tinggi, segala senyawa jenis fenol, alkaloid, lipid dan gula.

HPLC baik digunakan untuk senyawa yang dapat dideteksi di daerah spekrum UV atau spectrum sinar tampak.

Kolom yang tersedia mempunyai banyak sekali pelat teori (lebih dari 100.000 untuk kolom 100 cm), dan

kromatografi dilakukan dalam kondisi mendekati kondisi ideal demikian rupa sehingga dapat diperoleh dalam

beberapa menit dan ditafsirkan secara kuantitatif dengan ketepatan yang lumayan. Cuplikan dapat dipisahkan

secara preparative.

Kesimpulan a. Prinsip dasar HPLC adalah pemisahan analit berdasarkan kepolarannya, dengan fase diam berupa kolom dan

larutan tertentu sebagai fase geraknya.

b. Instrumentasi HPLC yaitu: 1. Fasa Gerak 2. Pompa 3. Unit Sistem Penyuntikan atau Penginjeksian Sampel 4. Kolom 5. Detector

c. Dibandingkan dengan kromatografi gas, kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT atau HPLC = High Performance Liquid Chromatography) mempunyai beberapa kelebihan.

d. HPLC digunakan untuk memisahkan golongan minyak, misalnya terpenoid tinggi, segala senyawa jenis fenol, alkaloid, lipid dan gula.

Gambar 1. Sistem pada HPLC

GAS CROMATOGRAPHY MASS SPECTROMETRY (GCMS)

Prinsip Dasar : pemisahan senyawa organik yang menggunakan dua metode analisis senyawa yaitu kromatografi gas (GC) untuk menganalisis jumlah senyawa secara kuantitatif dan spektrometri massa

(MS) untuk menganalisis struktur molekul senyawa analit.

GC : pemisahan campuran berdasarkan perbedaan kecepatan migrasi komponen-komponen

penyusunnya. Gas kromatografi biasa digunakan untuk mengidentifikasi suatu senyawa yang terdapat

pada campuran gas dan juga menentukan konsentrasi suatu senyawa dalam fase gas.

MS : metode untuk mendapatkan berat molekul dengan cara mencari perbandingan massa terhadap

muatan dari ion yang muatannya diketahui dengan mengukur jari-jari orbit melingkarnya dalam medan

magnetik seragam.

Komponen dan Peralatan GCMS a. Instrumentasi Gas Kromatografi

1. Carrier Gas Supply : Gas pembawa (carrier gas) pada kromatografi gas sangatlah penting. Gas yang dapat digunakan pada dasarnya haruslah inert, kering, dan bebas oksigen. Kondisi seperti ini dibutuhkan

karena gas pembawa ini dapat saja bereaksi dan dapat mempengaruhi gas yang akan dipelajari atau

diidentifikasi.

2. Injeksi Sampel : Sejumlah kecil sampel yang akan dianalisis diinjeksikan pada mesin menggunakan semprit kecil. Jarum semprit menembus lempengan karet tebal (Lempengan karet ini

disebut septum) yang mana akan mengubah bentuknya kembali secara otomatis ketika semprit ditarik

keluar dari lempengan karet tersebut.

3. Kolom : Ada dua tipe utama kolom dalam kromatografi gas-cair. Tipe pertama, tube panjang dan tipis berisi material padatan; Tipe kedua, lebih tipis dan memiliki fase diam yang berikatan

dengan pada bagian terdalam permukaannya. Ada tiga hal yang dapat berlangsung pada molekul

tertentu dalam campuran yang diinjeksikan pada kolom:

1. Molekul dapat berkondensasi pada fase diam. 2. Molekul dapat larut dalam cairan pada permukaan fase diam 3. Molekul dapat tetap pada fase gas

b. Instrumentasi Spektorskopi Massa 4. Sumber Ion : Setelah melewati rangkaian gas kromatografi, sampel gas yang akan diuji

dilanjutkan melalui rangkaian spekstroskopi massa. Molekul-molekul yang melewati sumber ion ini

diserang oleh elektron, dan dipecah menjadi ionion positifnya. Tahap ini sangatlah penting karena untuk

melewati filter, partikel-partikel sampel haruslah bermuatan.

5. Filter : Selama ion melui rangkaian spekstroskopi massa, ion-ion ini melalui rangkaian elektromagnetik yang menyaring ion berdasarkan perbedaan masa. Para ilmuwan memisahkan

komponen-komponen massa untuk kemudian dipilih yang mana yang boleh melanjutkan yang mana

yang tidak (prinsip penyaringan). Filter ini terus menyaring ion-ion yang berasal dari sumber ion untuk

kemudian diteruskan ke detektor.

6. Detektor : Ada beberapa tipe detektor yang biasa digunakan. Detektor ionisasi nyala dijelaskan pada bagian bawah penjelasan ini, merupakan detektor yang umum dan lebih mudah untuk

dijelaskan daripada detektor alternatif lainnya. GC biasanya memakai detektor flame ionization detector

(FID) atau thermal conductivity detector (TCD). Sedangkan GC-MS detektornya menggunakan mass

spectrometer (spektrometer massa).

Dalam mekanisme reaksi, pembakaran senyawa organik merupakan hal yang sangat kompleks. Selama

proses, sejumlah ion-ion dan elektron-elektron dihasilkan dalam nyala. Kehadiran ion dan elektron

dapat dideteksi. Seluruh detektor ditutup dalam oven yang lebih panas dibanding dengan temperatur

kolom. Hal itu menghentikan kondensasi dalam detektor.

Hasil detektor akan direkam sebagai urutan puncak-puncak; setiap puncak mewakili satu senyawa

dalam campuran yang melalui detektor. Sepanjang anda mengontrol secara hati-hati kondisi dalam

kolom, anda dapat menggunakan waktu retensi untuk membantu mengidentifikasi senyawa yang

tampak-tentu saja anda atau seseorang lain telah menganalisa senyawa murni dari berbagai senyawa

pada kondisi yang sama.

Prinsip Kerja GCMS Dalam kromatografi gas, pemisahan terjadi ketika sampel diinjeksikan ke dalam fase gerak. Fase gerak

yang biasa digunakan adalah gas inert seperti helium. Fase gerak membawa sampel melalui fase diam yang

ditempatkan dalam kolom. Sampel dalam fase gerak berinteraksi dengan fase diam dengan kecepatan yang

berbeda-beda. Saat terjadi interaksi yang tercepat akan keluar dari kolom lebih dulu, sementara yang lambat

akan keluar paling akhir. Komponen-komponen yang telah terpisah kemudian menuju detektor. Detektor akan

memberikan sinyal yang kemudian ditampilkan dalam komputer sebagai kromatogram. Pada kromatogram,

sumbu x menunjukkan waktu retensi (retention time yaitu waktu saat sampel diinjeksikan sampai elusi berakhir),

Sedangkan sumbu y menunjukkan intensitas sinyal.

Dalam detektor selain memberikan sinyal sebagai kromatogram, komponen-komponen yang terpisah

akan ditembak elektron sehingga terpecah menjadi fragmen-fragmen dengan perbandingan massa dan muatan

tertentu (m/z). Fragmen-fragmen dengan m/z ditampilkan komputer sebagai spektra massa, dimana sumbu x

menunjukkan perbandingan m/z sedangkan sumbu y menunjukkan intensitas. Dari spektra tersebut dapat

diketahui struktur senyawa dengan membandingkannya dengan spektra massa standar dari literatur yang tersedia

dalam komputer. Pendekatan pustaka terhadap spektra massa dapat digunakan untuk identifikasi bila indeks

kemiripan atau Similarity Indeks (SI) berada pada rentangan 80% (Howe and Williams, 1981).

SCANNING ELECTRON MICROSCOPY (SEM)

Komponen Alat Utama : 1. Pistol elektron, biasanya berupa filamen yang terbuat dari unsur yang mudah melepas elektron misal

tungsten.

2. Lensa untuk elektron, berupa lensa magnetis karena elektron yang bermuatan negatif dapat dibelokkan oleh medan magnet.

3. Sistem vakum, karena elektron sangat kecil dan ringan maka jika ada molekul udara yang lain elektron yang berjalan menuju sasaran akan terpencar oleh tumbukan sebelum mengenai sasaran sehingga

menghilangkan molekul udara menjadi sangat penting.

Prinsip kerja dari SEM adalah sebagai berikut: 1. Sebuah pistol elektron memproduksi sinar elektron dan dipercepat dengan anoda. 2. Lensa magnetik memfokuskan elektron menuju ke sampel. 3. Sinar elektron yang terfokus memindai (scan) keseluruhan sampel dengan diarahkan oleh koil pemindai. 4. Ketika elektron mengenai sampel maka sampel akan mengeluarkan elektron baru yang akan diterima

oleh detektor dan dikirim ke monitor (CRT).

Ada beberapa sinyal yang penting yang dihasilkan oleh SEM. Dari pantulan inelastis didapatkan sinyal

elektron sekunder dan karakteristik sinar X sedangkan dari pantulan elastis didapatkan sinyal backscattered

electron. Sinyal -sinyal tersebut dijelaskan pada gambar dibawah ini.

Perbedaan gambar dari sinyal elektron sekunder dengan backscattered adalah sebagai berikut: elektron

sekunder menghasilkan topografi dari benda yang dianalisa, permukaan yang tinggi berwarna lebih cerah dari

permukaan rendah. Sedangkan backscattered elektron memberikan perbedaan berat molekul dari atom atom yang menyusun permukaan, atom dengan berat molekul tinggi akan berwarna lebih cerah daripada atom dengan

berat molekul rendah.

.

Mekanisme kontras dari elektron sekunder : permukaan yang tinggi akan lebih banyak melepaskan

elektron dan menghasilkan gambar yang lebih cerah dibandingkan permukaan yang rendah atau datar, sedangkan

mekasime kontras dari backscattered elektron dijelaskan dengan gambar dibawah ini yang secara prinsip atom atom dengan densitas atau berat molekul lebih besar akan memantulkan lebih banyak elektron sehingga tampak

lebih cerah dari atom berdensitas rendah. Maka teknik ini sangat berguna untuk membedakan jenis atom.

Prinsip Dasar SEM : Cara terbentuknya gambar pada SEM berbeda dengan apa yang terjadi pada mikroskop optic dan TEM. Pada SEM, gambar dibuat berdasarkan deteksi elektron baru (elektron sekunder)

atau elektron pantul yang muncul dari permukaan sampel ketika permukaan sampel tersebut dipindai dengan

sinar elektron. Elektron sekunder atau elektron pantul yang terdeteksi selanjutnya diperkuat sinyalnya,

kemudian besar amplitudonya ditampilkan dalam gradasi gelap-terang pada layar monitor CRT (cathode ray

tube). Di layar CRT inilah gambar struktur obyek yang sudah diperbesar bisa dilihat. Pada proses

operasinya, SEM tidak memerlukan sampel yang ditipiskan, sehingga bisa digunakan untuk melihat obyek

dari sudut pandang 3 dimensi.

SPEKTOFOTOMETER

Spektrofotometer UV-sinar tampak ( visible ) adalah analisa kuantitatif dan kualitatif spesies kimia dengan pengukuran absorbansi atau transmittansi dalam spektroskopi.

Komponen / Alat spektrofotometer ultraviolet terdiri atas : 1. Sumber radiasi : lampu deuterium , lampu wolfram, yang berkesinambungan yang meliputi daerah

spectrum dimana instrument itu dirancang untuk beroperasi.

2. Monokromator, suatu piranti untuk mengecilkan pita sempit panjang-panjang gelombang dari spectrum lebar yang dipancarkan oleh sumber cahaya.

3. Tempat sampel disebut juga kuvet 4. Detektor, yang berupa transduser yang mengubah energy cahaya menjadi suatu isyarat listrik. 5. Suatu pengganda (amplifier), dan rangkaian yang berkaitan membuat isyarat listrik itu memadai untuk di

baca.

6. Sistem pembaca (read Out), Suatu system baca (piranti pembaca) yang memperagakan besarnya isyarat listrik, menyatakan dalam bentuk % Transmitan (% T) maupun Adsorbansi (A).

7. Rekorder

Cara Kerja Alat Spektrofotometer UV- Visible: 1. Sinar dari sumber radiasi diteruskan menuju monokromator. 2. Cahaya dari monokromator diarahkan terpisah melalui blangko dan sampel dengan sebuah cermin

berotasi.

3. Kedua cahaya lalu bergantian berubah arah karena pemantulan dari cermin yang berotasi secara kontinyu.

4. Detektor menerima cahaya dari blangko dan sampel secara bergantian secara berulang ulang. 5. Sinyal listrik dari detektor diproses, diubah ke digital dan dibandingkan antara sampel dan

blangko.Perhitungan dilakukan dengan komputer yang sudah terprogram.

Interaksi Radiasi:

Keterangan : absorpsi (a); transmisi (b); refleksi (c); dan difraksi (d).

Prinsip Dasar Spektrofotometer UV- Visible : Pe Penyerapan sinar tampak atau ultraviolet oleh suatu molekul yang dapat menyebabkan eksitasi elektron dalam orbital molekul tersebut dari tingkat energi dasar

ke tingkat energi yang lebih tinggi.

Absorbansi : Cahaya akan diserap jika energi cahaya tersebut sesuai dengan energi yang dibutuhkan untuk mengalami perubahan dalam molekul. Absorbansi larutan bertambah dengan pengurangan kekuatan sinar.

Nilai Absorbansi berbanding lurus dengan ketebalan dan konsentrasi. Nilai Absorbansi berbanding terbalik

dengan transmitan.

Sumber cahaya yang digunakan adalah kombinasi antara lampu tungsten (UV Visible) halogen dan lampu deuterium (D2).

FOURIER TRANSFORM INFRA RED (FTIR)

Cara Kerja FTIR : Sistim optik Spektrofotometer FTIR seperti pada gambar dibawah ini dilengkapi dengan cermin yang bergerak tegak lurus dan cermin yang diam. Dengan demikian radiasi infra merah akan

menimbulkan perbedaan jarak yang ditempuh menuju cermin yang bergerak ( M ) dan jarak cermin yang

diam ( F ). Perbedaan jarak tempuh radiasi tersebut adalah 2 yang selanjutnya disebut sebagai retardasi ( ). Hubungan antara intensitas radiasi IR yang diterima detektor terhadap retardasi disebut sebagai

interferogram. Sedangkan sistim optik dari Spektrofotometer IR yang didasarkan atas bekerjanya

interferometer disebut sebagai sistim optik Fourier Transform Infra Red.

Prinsip Dasar : Sumber radiasi infra merah mengenai bahan dan terjadi vibrasi gugua fungsi pada bahan yang kemudian didetaksi oleh detektor.

Detektor yang digunakan dalam Spektrofotometer FTIR adalah TGS (Tetra Glycerine Sulphate) atau MCT (Mercury Cadmium Telluride). Detektor MCT lebih banyak digunakan karena memiliki beberapa kelebihan

dibandingkan detektor TGS, yaitu memberikan respon yang lebih baik pada frekwensi modulasi tinggi, lebih

sensitif, lebih cepat, tidak dipengaruhi oleh temperatur, sangat selektif terhadap energi vibrasi yang diterima

dari radiasi infra merah.

Dari deret Fourier tersebut intensitas gelombang dapat digambarkan sebagai daerah waktu atau daerah frekwensi. Perubahan gambaran intensitas gelobang radiasi elektromagnetik dari daerah waktu ke daerah

frekwensi atau sebaliknya disebut Transformasi Fourier (Fourier Transform).

Keunggulan FTIR : Dapat digunakan pada semua frekwensi dari sumber cahaya secara simultan sehingga analisis dapat dilakukan lebih cepat daripada menggunakan cara sekuensial atau scanning. Sensitifitas dari

metoda Spektrofotometri FTIR lebih besar daripada cara dispersi, sebab radiasi yang masuk ke sistim

detektor lebih banyak karena tanpa harus melalui celah (slitless).

Pada sistim optik FTIR digunakan radiasi LASER (Light Amplification by Stimulated Emmission of Radiation) yang berfungsi sebagai radiasi yang diinterferensikan dengan radiasi infra merah agar sinyal

radiasi infra merah yang diterima oleh detektor secara utuh dan lebih baik.