High Performance Liquid Cromatography (HPLC)

HPLC adalah singkatan dari High Performance Liquid Cromatography,

yaitu alat yang berfungsi mendorong analit melalui sebuah kolom dari fase diam

( yaitu sebuah tube dengan partikel bulat kecil dengan permukaan kimia tertentu)

dengan memompa cairan (fase bergerak) pada tekanan tinggi melalui kolom.

Sampel yang akan dianalisis dijadikan dalam volume yang kecil dari fase bergerak

dan diubah melalui reaksi kimia oleh fase diam ketika sampel melalui sepanjang

kolom. Tujuan penggunaan alat ini adalah mengetahui kadar asam organik.

SISTEM PERALATAN HPLC

Instrumentasi HPLC pada dasarnya terdiri atas: wadah fase gerak, pompa, alat

untuk memasukkan sampel (tempat injeksi), kolom, detektor, wadah penampung

buangan fase gerak, dan suatu komputer atau integrator atau perekam.

Diagram skematik sistem kromatografi cair seperti ini :

ada dua perbedaan dalam HPLC, yang mana tergantung pada polaritas

relatif dari pelarut dan fase diam.

1. Fase normal HPLC

Normal phase HPLC (NP HPLC) merupakan metode yaang mengeksplorasi

perbedaan kepolaran antara analit dalam campuran dengan fase diam. semakin kuat

interaksi fase diam dengan analit, semakin lama retensi analit. Normal phase HPLC (NP

HPLC) merupakan metode yaang mengeksplorasi perbedaan kepolaran antara analit

dalam campuran dengan fase diam. semakin kuat interaksi fase diam dengan analit,

semakin lama retensi analit. Pemilihan normal phase HPLC berhubungan dengan

kelarutan sampel dalam fase gerak. Dengan pelarut utama nonpolar, biasanya fase normal

dipilih sebagai metode untuk pemisahan senyawa yang sangat hidrofobik, yang tidak larut

dengan senyawa polar atau air.

Pada HPLC ada yang disebut dengan waktu retensi, yaitu Waktu yang

dibutuhkan oleh senyawa untuk bergerak melalui kolom menuju detektor. Waktu

retensi diukur berdasarkan waktu dimana sampel diinjeksikan sampai sampel

menunjukkan ketinggian puncak yang maksimum dari senyawa itu.

Senyawa-senyawa yang berbeda memiliki waktu retensi yang berbeda. Untuk

beberapa senyawa, waktu retensi akan sangat bervariasi dan bergantung pada:

tekanan yang digunakan (karena itu akan berpengaruh pada laju alir dari

pelarut)

kondisi dari fase diam (tidak hanya terbuat dari material apa, tetapi juga

pada ukuran partikel)

komposisi yang tepat dari pelarut

temperatur pada kolom

pada praktikum HPLC ada yang disebut dengan detektor, yaitu suatu alat

untuk mendeteksi substansi yang telah melewati kolom.yang umum digunakan

adalah serapan ultra violet.

Jumlah cahaya yang diserap akan bergantung pada jumlah senyawa

tertentu yang melewati melalui berkas pada waktu itu.

2. Fase balik HPLC

Pada fase ini ukuran kolom sama, tetapi silika dimodifikasi menjadi non

polar melalui pelekatan rantai-rantai hidrokarbon panjang pada permukaannya

secara sederhana baik berupa atom karbon 8 atau 18. akan terdapat atraksi yang

kuat antara pelarut polar dan molekul polar dalam campuran yang melalui kolom.

Atraksi yang terjadi tidak akan sekuat atraksi antara rantai-rantai hidrokarbon

yang berlekatan pada silika (fase diam) dan molekul-molekul polar dalam larutan.

Oleh karena itu, molekul-molekul polar dalam campuran akan menghabiskan

waktunya untuk bergerak bersama dengan pelarut.

Senyawa-senyawa non polar dalam campuran akan cenderung membentuk atraksi

dengan gugus hidrokarbon karena adanya dispersi gaya van der Waals. Senyawa-

senyawa ini juga akan kurang larut dalam pelarut karena membutuhkan

pemutusan ikatan hydrogen sebagaimana halnya senyawa-senyawa tersebut

berada dalam molekul-molekul air atau metanol misalnya. Oleh karenanya,

senyawa-senyawa ini akan menghabiskan waktu dalam larutan dan akan bergerak

lambat dalam kolom. Ini berarti bahwa molekul-molekul polar akan bergerak

lebih cepat melalui kolom.

Wadah Fase gerak dan Fase gerak

Wadah fase gerak harus bersih dan lembam (inert). Wadah pelarut kosong

ataupun labu laboratorium dapat digunakan sebagai wadah fase gerak. Wadah ini

biasanya dapat menampung fase gerak antara 1 sampai 2 liter pelarut.

Fase gerak atau eluen biasanya terdiri atas campuran pelarut yang dapat

bercampur yang secara keseluruhan berperan dalam daya elusi dan resolusi. Daya

elusi dan resolusi ini ditentukan oleh polaritas keseluruhan pelarut, polaritas fase

diam, dan sifat komponen-komponen sampel. Untuk fase normal (fase diam lebih

polar daripada fase gerak), kemampuan elusi meningkat dengan meningkatnya

polaritas pelarut. Sementara untuk fase terbalik (fase diam kurang polar daripada

fase gerak), kemampuan elusi menurun dengan meningkatnya polaritas pelarut.

Fase gerak sebelum digunakan harus disaring terlebih dahulu untuk

menghindari partikel-partikel kecil ini. Selain itu, adanya gas dalam fase gerak

juga harus dihilangkan, sebab adanya gas akan berkumpul dengan komponen lain

terutama di pompa dan detektor sehingga akan mengacaukan analisis.

Elusi dapat dilakukan dengan cara isokratik (komposisi fase gerak tetap

selama elusi) atau dengan cara bergradien (komposisi fase gerak berubah-ubah

selama elusi) yang analog dengan pemrograman suhu pada kromatografi gas.

Elusi bergradien digunakan untuk meningkatkan resolusi campuran yang

kompleks terutama jika sampel mempunyai kisaran polaritas yang luas.

Fase gerak yang paling sering digunakan untuk pemisahan dengan fase

terbalik adalah campuran larutan bufer dengan metanol atau campuran air dengan

asetonitril. Untuk pemisahan dengan fase normal, fase gerak yang paling sering

digunakan adalah campuran pelarut-pelarut hidrokarbon dengan pelarut yang

terklorisasi atau menggunakan pelarut-pelarut jenis alkohol. Pemisahan dengan

fase normal ini kurang umum dibanding dengan fase terbalik.

Pompa

Pompa yang cocok digunakan untuk HPLC adalah pompa yang

mempunyai syarat sebagaimana syarat wadah pelarut yakni: pompa harus

inert terhadap fase gerak. Bahan yang umum dipakai untuk pompa adalah

gelas, baja tahan karat, Teflon, dan batu nilam. Pompa yang digunakan

sebaiknya mampu memberikan tekanan sampai 5000 psi dan mampu

mengalirkan fase gerak dengan kecepatan alir 3 mL/menit. Untuk tujuan

preparatif, pompa yang digunakan harus mampu mengalirkan fase gerak

dengan kecepatan 20 mL/menit.

Tujuan penggunaan pompa atau sistem penghantaran fase gerak adalah

untuk menjamin proses penghantaran fase gerak berlangsung secara tepat,

reprodusibel, konstan, dan bebas dari gangguan. Ada 2 jenis pompa

dalam HPLC yaitu: pompa dengan tekanan konstan, dan pompa dengan

aliran fase gerak yang konstan. Tipe pompa dengan aliran fase gerak yang

konstan sejauh ini lebih umum dibandingkan dengan tipe pompa dengan

tekanan konstan.

Tempat penyuntikan sampel

Sampel-sampel cair dan larutan disuntikkan secara langsung ke dalam fase

gerak yang mengalir di bawah tekanan menuju kolom menggunakan alat

penyuntik yang terbuat dari tembaga tahan karat dan katup teflon yang

dilengkapi dengan keluk sampel (sample loop) internal atau eksternal.

Posisi pada saat memuat sampel                 Posisi pada saat menyuntik sampel

Kolom dan Fase diam

Ada 2 jenis kolom pada HPLC yaitu kolom konvensional dan kolom mikrobor.

Kolom merupakan bagian HPLC yang mana terdapat fase diam untuk

berlangsungnya proses pemisahan solut/analit.

Kolom mikrobor mempunyai 3 keuntungan yang utama dibanding dengan kolom

konvensional, yakni:

Konsumsi fase gerak kolom mikrobor hanya 80% atau lebih kecil

dibanding dengan kolom konvensional karena pada kolom mikrobor

kecepatan alir fase gerak lebih lambat (10 -100 μl/menit).

Adanya aliran fase gerak yang lebih lambat membuat kolom mikrobor

lebih ideal jika digabung dengan spektrometer massa.

Sensitivitas kolom mikrobor ditingkatkan karena solut lebih pekat,

karenanya jenis kolom ini sangat bermanfaat jika jumlah sampel terbatas

misal sampel klinis.

HPLC ini digunakan untuk asam organik, seperti asam formiat dan asam

asetat. Pada praktikum kali ini zat yang digunakan adalah asam asetat sebgai

fasa gerak nya. Jika sampel mula-mula berbentuk padatan harus di-distruksi

dulu kemudian di-treatment sehingga berupa larutan homogen yang tidak

terdapat endapan lagi dan bening karena syarat sampel yang dapat dianalisa

menggunakan HPLC adalah harus tidak ada endapan dan harus bening.

Langkah yang dilakukan dalam HPLC :

Langkah-langkah menganalisa menggunakan HPLC yaitu mula-mula sampel

diinjeksi dengan syringe. Sampel yang digunakan sebanyak 500 ppm.Kemudian

sampel masuk ke injection hall. Dari injection hall ini proses utama cara kerja

HPLC dimulai, yaitu dengan memompa sampel ke kolom oleh LC20AT dalam

tekanan tinggi.

Dari kolom, sampel dijadikan fase bergerak dan diolah dengan fase, Setelah

terpisah dengan berbagai perhitungan matematis, HPLC yang sudah

disambungkan dengan komputer ini memberikan pembacaan berupa peak. Setelah

itu kita mencari luasan di bawah peak untuk mengetahui kadar analit.

Keuntungan dari penggunaan HPLC yaitu :

1. Lebih teliti

2. Sudah digital sehingga penggunaannya cepat dan lebih praktis

Sedangkan kerugian dari penggunaan HPLC yaitu :

1. Larutan harus dicari fase diamnya terlebih dulu

2. Hanya bisa digunakan untuk asam organik

3. Harus mengetahui kombinasi yang optimum antara pelarut, analit, dan

gradien elusi

4. Harganya mahal sehingga penggunaannya dalam lingkup penelitian yang

terbatas

Diameter internal dari kolom HPLC adalah aspek yang penting yang

menentukan kapasitas analit yang dapat dimasukkan dan dapat mempengaruhi

sensitivitas. Kolom yang lebih lebar dijumpai di aplikasi industri seperti

pemurnian obat-obatan, sedangkan kolom yang lebih sempit menaikkan

sensitivitas dan hanya membutuhkan sedikit solven.

Ukuran partikel juga berpengaruh. HPLC tradisional kebanyakan fase

diamnya melekat pada partikel silika. Ukuran partikel yang paling umum

adalah 5μm. Ukuran yang lebih kecil menyediakan luas area lebih besar dan

separasi yang lebih baik, namun tekanan yang dibutuhkan untuk kecepatan

linear optimum berbanding terbalik dengan kuadrat diameter partikel.

Tekanan pompa yang besar dibutuhkan untuk partikel yang sangat kecil, dan

sekarang ada UHPLC (Ultra HPLC) yang dapat bekerja pada tekanan sangat

tinggi (1000 atm).