ISOLASI BAKTERIOFAGA ANTI Streptococcus agalactiaeDARI IKAN NILA (Oreochromis niloticus)

Angela Mariana Lusiastuti, Uni Purwaningsih, dan Tuti Sumiati

Balai Riset Perikanan Budidaya Air Tawar

Jl. Raya Sempur No.1, Bogor 16154

E-mail: lusiastuti@yahoo.com

(Naskah diterima: 8 April 2010; Disetujui publikasi: 12 Agustus 2010)

ABSTRAK

Infeksi Streptococcus merupakan salah satu penyakit serius pada ikan yang disebabkanoleh bakteri gram positif. Infeksi oleh streptococcus beta-hemolitik paling seringdilaporkan menginfeksi ikan. Di antara streptococci beta-hemolitik, Streptococcus iniaepenyebab septicemia, meningoencefalitis, dan kematian pada ikan budidaya. Selainitu, Streptococcus agalactiae juga menyebabkan streptococcosis parah pada ikannila. Alternatif yang bisa digunakan untuk terapi infeksi streptococcosis adalah denganpenggunaan bakteriofaga yang merupakan virus yang hidup pada bakteri. Tujuanpenelitian ini adalah isolasi bakteriofaga S. agalactiae sebagai kandidat agen terapiyang memberikan efek protektif melawan infeksi streptococcosis. Faga diisolasi dariBrain Heart Infusion Agar (BHIA) yang sudah ditanami dengan 15 isolat S. iniae dan S.agalactiae. Isolat S. iniae dan S. agalactiae diisolasi dari ikan sakit dengan gejalaklinis Streptococcosis. Setelah itu diidentifikasi dengan pewarnaan Gram, tes katalase,pertumbuhan pada agar darah dan API 20 Strep System. Pertumbuhan faga ditunjukkandengan adanya zona lisis pada tempat yang ditetesi dengan sampel cairan usus dariikan nila sehat. Faga yang tumbuh lalu dikoleksi secara steril, disentrifus dansupernatannya difiltrasi dengan membran filter 0,45 μm dan disimpan pada suhu 4oC.Dari 15 isolat S. iniae dan S. agalactiae hanya satu isolat yaitu PSaT-18 yangmenunjukkan zona lisis seperti yang ditunjukkan pada cawan petri isolat kontrol S.iniae. Zona lisis tersebut timbul akibat adanya faga yang memberikan proteksi terhadapS. iniae dan S. agalactiae. Zona lisis yang tidak jernih disebabkan konsentrasi fagayang terlalu rendah akibat dilakukan pengenceran pada proses filtrasi. Faga yangdiperoleh selanjutnya akan dilakukan uji in vitro dan in vivo untuk mengetahuiefektivitasnya.

KATA KUNCI: S. iniae, S. agalactiae, bakteriofaga, ikan nila

ABSTRACT: Isolation Streptococcus agalactiae bacteriophage fromOreochromis niloticus. By: Angela Mariana Lusiastuti, UniPurwaningsih, and Tuti Sumiati

Streptococcal infection is a serious disease in fish caused by gram positive bacteria.The causative agent is Streptococcus β-hemolytic. Streptococcus iniae, a β-hemolyticbacterium is the main causative agent of septicemia, meningoencephalitis, and fishmortality. Moreover, the other causative agent is S. agalactiae. Bacteriophageswhich are viruses that live on bacteria can be selected and used as therapy forStreptococcosis. The aim of this research is to isolate bacteriophage of S. agalactiaeas therapeutic agent candidate giving protecting effect for Streptococcosis. Phageswas isolated from Brain Heart Infusion Agar (BHIA) were obtained from cultures of S.iniae and S. agalactiae. Strains S. iniae and S. agalactiae were isolated from

Isolasi bakteriofaga anti ..... (Angela Mariana Lusiastuti)

237

Streptococcosis fish. The predominant types of colonies were subcultured andsubjected to biochemical and physiological tests such as Gram staining, catalasetest, hemolytic activity in blood agar and API 20 Strep System. Phages were isolatedby using a double agar layer method. A zona lysis with plaques was removed from theplate, centrifuged and the supernatant was filtered through a 0.45 μm membranefilter and stored at 4oC. From 15 isolates of S. iniae and S. agalactiae, only oneisolate PSaT-18 showed lysis zone. The lysis zone developed because the phages giveprotection to S. agalactiae. The lysis zone is not clear because the phageconcentration is too low and the dilution in filtration process is too high. Later, thesephages were used for invitro and invivo test.

KEYWORDS: S. iniae, S. agalactiae, bacteriophages, Oreochromis niloticus

PENDAHULUAN

Ikan nila (Oreochromis niloticus) merupakanikan budidaya yang menguntungkan tetapiserangan penyakit bakterial streptococcosismenyebabkan kerugian sekitar 30%-40%.Salah satu jenis bakteri streptococcus yangmenimbulkan penyakit adalah S. iniae. Tetapi,Supriyadi et al. (2005) dan Lusiastuti et al.(2008) mengisolasi jenis streptococcus lainyang bersifat patogen selain S. iniae yaitu S.agalactiae. Nomoto et al. (2004) menemukanadanya infeksi campuran antara S. iniae,Lactococcus garviae dan S. dysgalactiae,sedangkan Evans et al. (2006) menemukaninfeksi ganda antara S. agalactiae dan L.garviae pada dolfin. Jika sudah terjadi infeksibakteri, antibiotika biasanya sebagai obatpilihan untuk terapi. Munculnya sifat resistensimikroba terhadap antibiotika dan bahayanyaresidu antibiotika yang berdampak negatif bagimasyarakat menyebabkan beberapa jenisantibiotika broad spectrum dilarang beredardan dipergunakan untuk obat ikan (KeputusanMenteri Kelautan dan Perikanan KepMen No.26/MENKP/2002 tentang pelaranganpenggunaan antibiotik dan KepMen No. 20/MENKP/2003 tentang klasifikasi obat ikan).

Alternatif yang bisa digunakan untuk terapiinfeksi streptococcosis adalah denganpenggunaan bakteriofaga yang merupakanvirus yang hidup pada bakteri. Bakteriofagasecara teoritis dapat sebagai terapi penyakitinfeksius, tetapi hanya sedikit yangmelaporkan potensinya sebagai agen kontrolbiologis pada penyakit yang terjadi di alam.Faga dari beberapa bakteri patogen pada ikan,seperti Aeromonas salmonicida (Rodgers etal., 1981), A. hydrophila (Merino et al., 1990),dan Yersinia ruckeri (Stevenson & Airdrie,1984) telah dilaporkan tetapi tidak ada tindaklanjut setelahnya untuk digunakan sebagai

agen kontrol infeksi bakteri pada ikan.Penelitian Wu et al. (1981) dan Wu & Chao(1982) pertamakali menjelaskan aplikasi fagasebagai kontrol biologis patogen pada ikan(A. hydrophila dan Edwardsiella tarda). Setelahitu, penelitian secara kontinu oleh Smith &Huggins (1982) di mana faga berhasildigunakan sebagai terapi infeksi E. coli yangmenyerang tubuh dan otak tikus, diare E. colipada anak sapi, kambing, dan babi (Smith etal., 1987) dan Barrow et al. (1998) tentangpencegahan infeksi E. coli pada unggas. Nakai& Park (2002) telah melakukan terapi fagaspesifik dari L. garvieae melalui intra perito-neal dan per oral secara eksperimental padaikan ekor kuning dan pada infeksi Pseudomo-nas plecoglossicida yang merupakan bakteripenyebab haemorrhagic ascites pada ikanAyu.

Dibandingkan dengan antibiotika kimiawi,bakteriofaga mempunyai beberapa ke-untungan (Lorch, 1999) yaitu: (1) dampaknyaterbatas: tidak seperti antibiotik, bakteriofagadapat bereplikasi sendiri secara eksponensialselama ada bakteri spesifik di sekitarnya.Menurunnya jumlah bakteri akan menurunkanpula jumlah faga dan secara perlahan faga akanmenghilang dari ikan sakit dan lingkungannya.Faga baik diberikan pada dosis tunggal; (2)perkembangan resistensi terbatas: bakteridapat resisten terhadap faga. Tetapi karenafaga mempunyai daya mutasi dan tingkatreplikasi yang tinggi, faga beradaptasi dantidak bersaing dengan bakteri; (3) targetspesifik: terapi dengan antibiotika seringmenyebabkan ketidakseimbangan florabakteri dan menimbulkan munculnya infeksisekunder seperti Pseudomonas sp. atauClostridium difficile yang menyebabkan infeksidan diare pada kolon. Di lain pihak, targetsasaran bakteriofaga pada bakteri yangspesifik saja sehingga gangguan pada flora

J. Ris. Akuakultur Vol.5 No.2 Tahun 2010: 237-243

238

usus menjadi lebih ringan (Lorch, 1999).Tujuan penelitian ini adalah mengisolasibakteriofaga dari ikan yang terkena strepto-coccosis untuk diseleksi sebagai kandidatagen kontrol biologis terhadap Streptococcussp.

BAHAN DAN METODE

Bakteri

Sebanyak 15 isolat bakteri yang berperansebagai organisme indikator yaitu S. iniae (5isolat) dan S. agalactiae (7 isolat) dan 3 isolatdiduga S. dysgalactiae dan L. garviae di-gunakan dalam penelitian ini. Isolat-isolattersebut berasal dari ikan sakit dengan gejalaStreptococcosis yang berasal dari JawaTengah dan Jawa Barat. Isolat yang berasal dariotak, hati, limpa, dan ginjal dipelihara dalamBrain Heart Infusion Agar (BHIA) dan koloniyang tumbuh dikarakterisasi secara kimiawi.

Isolasi dan KarakterisasiStreptococcus

Cairan otak, hati, limpa, dan ginjal dariikan sakit dengan gejala streptococcosisdiinokulasi pada BHIA dan diinkubasi pada25oC selama 48 jam. Koloni yang tumbuhdengan karakteristik koloni kecil, halus, dantidak berwarna dilakukan pengujianselanjutnya meliputi: pewarnaan Gram,produksi katalase, tes tolerans garam (6,5%NaCl), aktivitas hemolitik pada agar darah,tes API 20 STREP System, dan sensitivitasantibiotika pada Mueller Hinton Agar.

Organ yang diduga terinfeksi juga di-lakukan pemeriksaan patologi anatomi baiksecara makroskopis maupun mikroskopis(histopatologis).

Isolasi faga dan Plaque FormingUnit (PFU) Assay

Faga diisolasi dari ikan sehat, ikan sakit,dan air kolam dari Jawa Tengah dan Jawa Barat.Organ yang digunakan berupa ginjal, hati, danotak (pooling) serta isi usus dihomogenisasidengan PBS dan disentrifus 3.000 x g selama10 menit. Satu mL supernatan diinokulasimasing-masing dalam 100 mL BHIB yang sudahdisuplementasi dengan isolat bakteri S. iniae,S. agalactiae, dan isolat Streptococcus lain(organisme indikator). Untuk sampel air, 100mL air kolam difilter melalui 0,45 μm membranfilter dan dicampur dengan 100 mL double

strength BHIB berisi organisme indikator.Setelah 48 jam ditumbuhkan dan diadukperlahan pada suhu 25oC, kultur disentrifusdan di-filter, supernatantnya dilakukan PlaqueForming Unit Assay (PFU).

HASIL DAN BAHASAN

Karakteristik Isolat OrganismeIndikator

Bentuk koloni pada S. iniae dan S.agalactiae hampir sama. Koloni sangat halus,bentuknya kecil berdiameter ± 1 mm, tampakseragam dan tidak berwarna (colorless, nonpigmented). Jika koloni tumbuh banyak,berkumpul menjadi satu dan tebal makacenderung berwarna keputihan. Streptococ-cus dysgalactiae dan L. garviae yang jugadigunakan sebagai organisme indikatormempunyai bentuk koloni yang lebih besardan berwarna kekuningan. Baik S. iniae, S.agalactiae, dan Streptococcus yang lainmenghasilkan reaksi terhadap API 20 STREPSistem yang hampir sama hanya berbedadengan hasil tes Voges Proskauer (VP). Strep-tococcus iniae dan S. faecalis hasil tes VPnegatif sedangkan S. agalactiae positif.Menurut Evans et al. (2006), tes VP isolat S.agalactiae dari otot dolfin betina dewasamenunjukkan hasil negatif menggunakanmetode konvensional sedangkan dengan APIRapid ID 32 test kit memberikan hasil yangpositif. Streptococcus iniae dan S. agalactiaetidak toleran terhadap kadar garam 6,5% dantes katalasenya negatif. Perbedaan yangtampak pada agar darah, S. iniae adalah betahemolitik dengan terbentuknya zona lisisyang jernih dan tidak berwarna (colorless)sedangkan S. agalactiae adalah alfa hemolitikdikarakterisasi oleh zona lisis yang berwarnakehijauan. Jika pada satu cawan petri tumbuhdua jenis koloni yaitu S. iniae dan S. agalactiaemaka S. agalactiae akan tumbuh dominan danmenekan pertumbuhan S. iniae pada hari keduainkubasi.

Streptococcus agalactiae patogen padaikan dan menyebabkan perubahan klinis danhistopatologis, termasuk exophthalmia,meningoencephalitis, vakuolisasi dannekrosis sel-sel hati serta nekrosis dankongesti limpa. Menurut Lindahl et al. (2005),S. agalactiae juga patogen pada mamaliatermasuk manusia dan sapi. Gambar 1menunjukkan kerusakan pada hati dan limpaakibat streptococcosis.

Isolasi bakteriofaga anti ..... (Angela Mariana Lusiastuti)

239

Pada parensim hati sel-sel hepatositmenunjukkan atrofi, pembengkakan berwarnakeabuan (cloudy swelling), vakuolisasi dannekrosis. Vakuolisasi terbentuk sebagai akibatgangguan mekanisme penyerapan sodiumsedangkan nekrosis terjadi karena aktivitastoksin dan enzim yang dihasilkan olehStreptococcus sp. Kongesti (pembendunganpembuluh darah) terjadi akibat prosesperadangan dan kerusakan dari organ. Nampakadanya endapan pigmen hemosiderin dangranulomatosis pada hati. Ada tiga tahapankerusakan pada hati, tahap awal ditandaidengan inflamasi dan hiperemi (kemerahan),biasanya infeksi bersifat akut. Tahapselanjutnya mulai terjadi gangguanmetabolisme dengan diawali munculnyadegenerasi lemak, hati tampak pucat dan rapuhpada pemeriksaan eksternal.

Pada limpa tampak adanya inflamasi granu-lomatous menunjukkan produksi granulomapada jaringan yang terinfeksi. Di dalam granu-loma yang berwarna coklat keabu-abuantersebut terdapat eksudat inflamasi dan bakteriyang terdapat dalam kondisi tidak terbentuk(amorphous matter). Beberapa kapiler tampakadanya eritrosit.

Isolasi Bakteriofaga dari S.agalactiae

Pada Tabel 1 menyajikan hasil isolasibakteriofaga terhadap tiga jenis organismeindikator yaitu S. iniae dan S. agalactiae. Duajenis faga dapat diisolasi dari 15 sampel

dengan tiga kondisi yaitu ikan sakit secaraklinis streptococosis, ikan subklinis dan airkolam dan dinamai PSaT-1 dan PSaT-2. Zonalisis dari PSaT-1 tidak sejernih zona lisis yangdibentuk oleh PSaT-2. PSaT-2 menunjukkanzona lisis yang lebih tajam. Zona lisis terbentuksetelah 24 jam pada inkubasi 28oC. Organismeindikator yang digunakan oleh masing-masingfaga berbeda, untuk PSaT-1 menggunakan S.iniae dan PSaT-2 dengan S. agalactiae. Tetapijenis sampel dari keduanya sama yaitu dari isiusus ikan sublinis. Hal ini menunjukkanbeberapa kemungkinan bahwa keduanyaadalah faga yang sama dan spesifik terhadapS. agalactiae tetapi bersifat strain spesifikkarena masih mampu melisis S. iniae.

Faga sulit diisolasi dari ikan sakit karenamikroba penyebabnya tumbuh dominan. Padaikan yang sehat, fagapun sulit diisolasi.Menurut Lorch (1999), jika jumlah bakteripatogen menurun maka fagapun secaraperlahan akan tereliminasi dan menghilangdari tubuh ikan dan lingkungannya. Pada ikantampak sehat atau disebut dalam kondisisubklinis, faga dapat diisolasi. Pada kondisisubklinis, pertumbuhan faga dan mikrobapatogen penyebabnya dalam keadaanseimbang atau jumlah faga lebih banyakdibanding mikroba penyebabnya. Ikan masihtampak sehat secara klinis tetapi mikrobapatogen mulai berkembang biak. Ikan subklinisyang digunakan sebagai sampel masih aktifberenang dan tampak sehat hanya ada sedikitlecet-lecet pada kulitnya. Kondisi organnyajuga tampak normal tidak ditemukan adanya

Gambar 1. Kerusakan pada sel hati dan limpa

Figure 1. Necrosis of liver and spleen cells

a. Vakuolisasi dan nekrosis sel-sel hati (Vacuolisation and necrosis of liver cells)b. Nekrosis dan kongesti limpa (Necrosis and congestion of spleen cells)

b

a

a

b

J. Ris. Akuakultur Vol.5 No.2 Tahun 2010: 237-243

240

Tab

el 1

.Is

ola

si b

akte

riofa

ga

terh

adap

S. i

nia

e dan

S. a

gala

ctia

e

Tab

le 1

.The

isol

ati

on o

f bact

erio

phages

fro

m S

. in

iae a

nd S

. agala

ctia

e

Jen

is o

rga

nis

me

in

dik

ato

rN

o.

iso

lat

Sa

mp

el

fag

aZ

ona

lis

isD

esi

na

si f

ag

aK

ind

of

ind

ica

tor

org

an

ism

Isola

te n

um

ber

Ph

ag

es s

am

ple

Lysi

s zo

ne

Ph

ag

es d

esig

na

tion

S. in

iae

N1

.ot.

JTIk

an s

akit (s

ick

fish

)T

idak

ad

a (n

one

)-

N1

.ht.

JTIk

an s

akit (s

ick

fish

)T

idak

ad

a (n

one

)-

N1

.gj.J

TIk

an s

ubkl

inis

(sub

clin

ical f

ish

)T

idak

ad

a (n

one

)-

N2

.ot.

JTA

ir (w

ate

r)

Tid

ak a

da

(non

e)

-

02.G

MA

ir (w

ate

r)

Tid

ak a

da

(non

e)

-

03.M

ND

Air

(wa

ter

)T

idak

ad

a (n

one

)-

S. a

ga

lact

iae

N1

.ot.

CRT

Ikan

su

bkl

inis

(sub

clin

ical f

ish

)A

da

(pos

itiv

e)

PSaT

-2

N1

.gj.C

RT

Ikan

su

bkl

inis

(sub

clin

ical f

ish

)A

da

(pos

itiv

e)

PSaT

-2

N2

.ot.

CRT

Ikan

su

bkl

inis

(sub

clin

ical f

ish

)T

idak

ad

a (n

one

)-

N2

.gj.C

RT

Ikan

su

bkl

inis

(sub

clin

ical f

ish

)T

idak

ad

a (n

one

)-

Iso

lat m

urn

i S. i

nia

e

Pure

isol

ate

of S.

inia

e

01.T

BIk

an s

ubkl

inis

(sub

clin

ical f

ish

)A

da

(pos

itiv

e)

PSaT

-1

Isolasi bakteriofaga anti ..... (Angela Mariana Lusiastuti)

241

kelainan secara makroskopis. Di bawah inidua jenis faga yang dapat tumbuh denganmembentuk zona lisis terhadap S. agalactiae.

Zona lisis yang tampak pada Gambar 2tidak jernih disebabkan konsentrasi faga yangrendah dan kemungkinan akibat dilakukannyapengenceran pada waktu proses filtrasimenggunakan broth sehingga faga kurang kuatmembentuk zona lisis.

KESIMPULAN

Bakteriofaga telah dapat diisolasi dari S.agalactiae dan spesifik terhadap S. agalactiaetetapi masih membentuk zona lisis terhadapS. iniae.

DAFTAR ACUAN

Barrow, P., Lovell, M., & Jr Berchieri, A. 1998.Use of lytic bacteriophage for control ofexperimental Escherichia coli septicemiaand meningitis in chickens and calves. Clin.Diag. Lab. Immunol., 5: 294-298.

Evans, J.J., Pasnik, D.J., Klesius, P.H., & Al-Ablani,S. 2006. First report of Streptococcusagalactiae and Lactococcus garviae froma wild bottlenose dolphin (Tursiopstruncatus). J. of Wildlife Dis., 42(3): 561-569.

Lindahl, G., Stalhammar-Carlemalm, M., &Areschoug, T. 2005. Surface proteins ofStreptococcus agalactiae and relatedproteins in other bacterial pathogens.Clinical Microbiology, 18: 102-127.

Lorch, A. 1999. Bacteriophages: An Alternativeto Antibiotics? Ausbiotech, 9(5): 1-5.

Lusiastuti, A.M., Supriyadi, H., Aryati, Y., Mufidah,T., Gardenia, L., & Sumiati, T. 2008. Studi

kasus: Streptococcosis pada ikan guramedisebabkan oleh Streptococcus iniae danStreptococcus agalactiae. Prosiding Semi-nar Gelar Teknologi di Manado tanggal 2-3Mei 2008, 8 hlm.

Merino, S., Camprubi, & Tomas, JM. 1990. Isola-tion and characterization of bacteriophagePM2 from Aeromonas hydrophila. FEMSMicrobiol. Lett., 68: 239-244.

Nakai, T. & Park, S.C. 2002. Bacteriophagetherapy of infectious diseases in aquacul-ture. Res. In Microbiol., 153(2002): 13-18.

Nomoto, R., Munasinghe, L.I., Jin, D.H.,Shimahara, Y., Yasuda, H., Nakamura, A.,Misawa, N., Itami, T., & Yoshida, T. 2004.Lancefield group C Streptococcusdysgalactiae infection responsible for fishmortalitas in Japan. J. Fish Dis., 27: 679-686.

Rodgers, C.J., Pringle, J.H., McCarthy, D.H., &Austin, B. 1981. Quantitative and qualita-tive studies of Aeromonas salmonicidabacteriophage. J. Gen. Microbiol., 125: 335-345.

Smith, H.W. & Huggins, M.B. 1982. Successfultreatment of experimental Escherichia coliinfections in mice using phage: Its generalsuperiority over antibiotics. J. Gen.Microbiol., 128: 307-318.

Smith, H.W., Huggins, M.B., & Shaw, K.M. 1987.The control of experimental Escherichiacoli diarrhoeae in calves by means of bac-teriophages. J. Gen. Microbiol., 133: 1,111-1,126.

Supriyadi, H., Widiyati, A., Sunarto, A., & Prihadi,T.H. 2005. Keragaan penyakit bakterial ikannila (O. niloticus), pada KJA di lokasi berbeda.J. Pen. Perik. Indonesia, 11(7): 35-46.

Gambar 2. Faga yang membentuk zona lisis terhadap S. agalactiae

Figure 2. The lysis zone of phages from S. agalactiae

J. Ris. Akuakultur Vol.5 No.2 Tahun 2010: 237-243

242

Stevenson, R.M.V. & Airdrie, D.W. 1984. Isola-tion of Yersinia ruckeri bacteriopahges.Appl. Environ. Microbiol., 47: 1,201-1,205.

Wu, J.L. & Chao, W.J. 1982. Isolation and appli-cation of new bacteriophage ET-1 whichinfect Edwardsiella tarda the pathogen ofedwardsiellosis. CAPD Fisheries Series No.8, Reports on Fish Disease Res. (Taiwan),4: 8-17.

Wu, J.L., Lin, H.M., Jan, L., Hsu, Y.L., & Chang, L.H.1981. Biological control of fish bacterialpathogen Aeromonas hydrophila by bac-teriophage AH1. Fish Pathol., 15: 271-276.

Yuasa, K., Kitancharoen, N., Kataoka, Y., & Al-Murbaty, F.A. 1999. Streptococcus iniae, thecausative agent of mass mortality inrabbitfish Siganus canaliculatus in bahrain.J. Aquat. Anim Health, 11: 87-93.

Isolasi bakteriofaga anti ..... (Angela Mariana Lusiastuti)

243