1. Pengertian Elisa Reader

ELISA (singkatan bahasa Inggris: Enzyme-linked immunosorbent assay) atau 'penetapan

kadar imunosorben taut-enzim' merupakan uji serologis yang umum digunakan di berbagai

laboratorium imunologi. Uji ini memiliki beberapa keunggulan seperti teknik pengerjaan yang

relatif sederhana, ekonomis, dan memiliki sensitivitas yang cukup tinggi. ELISA

diperkenalkan pada tahun 1971 oleh Peter Perlmann dan Eva Engvall untuk menganalisis

adanya interaksi antigen dengan antibodi di dalam suatu sampel dengan

menggunakan enzim sebagai pelapor (reporter label).

2. Penggolongan Elisa Reader

Umumnya ELISA dibedakan menjadi dua jenis, yaitu competitive assay yang

menggunakan konjugat antigen–enzim atau konjugat antobodi–enzim, dan non-competitive

assay yang menggunakan dua antibodi. Pada ELISA non-competitive assay, antibodi kedua

akan dikonjugasikan dengan enzim sebagai indikator. Teknik kedua ini seringkali disebut

sebagai "Sandwich" ELISA.

3. Teknik Penggunaan Elisa REader

Uji ini dilakukan pada plate 96-well berbahan polistirena. Untuk melakukan teknik

"Sandwich" ELISA ini, diperlukan beberapa tahap yang meliputi:

1. Well dilapisi atau ditempeli antigen.

2. Sampel (antibodi) yang ingin diuji ditambahkan.

3. Ditambahkan antibodi kedua yang dikonjugasikan dengan enzim tertentu seperti

peroksidase alkali. Antibodi kedua ini akan menempel pada antibodi sampel sebelumnya.

4. Dimasukkan substrat enzim yang dapat menimbulkan warna tertentu saat bereaksi.

5. Intensitas warna campuran diukur dengan spektrofotometer yang disebut ELISA

reader hingga mendapatkan hasil berupa densitas optis (OD). Dengan menghitung rata-rata

kontrol negatif yang digunakan, didapatkan nilai cut-off untuk menentukan hasil positif-

negatif suatu sampel. Hasil OD yang berada di bawah nilai cut-off merupakan hasil negatif,

dan demikian juga sebaliknya.

Uji ini memiliki beberapa kerugian, salah satu di antaranya adalah kemungkinan yang

besar terjadinya hasil false positive karena adanya reaksi silang antara antigen yang satu

dengan antigen lain.[2] Hasil berupa false negative dapat terjadi apabila uji ini dilakukan

pada window period, yaitu waktu pembentukan antibodi terhadap suatu virus baru dimulai

sehingga jumlah antibodi tersebut masih sedikit dan kemungkinan tidak dapat terdeteksi

4. Sejarah Penemuan

         Teknik ELISA pertama kali diperkenalkan pada tahun 1971 oleh Peter Perlmann dan

Eva Engvall. Mereka menggunakan teknik ELISA ini dalam bidang imunologi  (ELISA

konvensional) untuk menganalisis interaksi antara antigen dan antibodi di dalam suatu

sampel, dimana interaksi tersebut ditandai dengan menggunakan suatu enzim yang berfungsi

sebagai pelopor/ reporter/ signal.

         Dalam perkembangan selanjutnya, selain digunakan sebagai uji kualitatif untuk

mengetahui keberadaan suatu antibodi atau antigen dengan menggunakan antibodi atau

antigen spesifik, teknik ELISA juga dapat diaplikasikan dalam uji kuantitatif untuk mengukur

kada antibodi atau antigen yang diuji dengan menggunakan alat bantu erupa spektrofotometer

atau dengan cara menetukan jumlah penambahan atau kadar antibodi atau antigen, sehingga

dapat dibuat suatu kurva standard an kadar antibodi atau antigen yang tidak diketahui dapat

ditentukan.

5. Prinsip Dasar Teknik ELISA

Prinsip dasar dari teknik ELISA ini secara simple dapat dijabarkan sebagai berikut :

         Pertama antigen atau antibodi yang hendak diuji ditempelkan pada suatu permukaan

yang berupa microtiter. Penempelan tersebut dapat dilakukan melalui dua cara, yaitu

penempelan secara non spesifik dengan adsorbs ke permukaan microtiter, dan penempelan

secara spesifik dengan menggunakan antibody atau antigen lain yang bersifat spesifik dengan

antigen atau antibodi yang diuji (cara ini digunakan pada teknik ELISA sandwich).

Selanjutnyaantibodi atau antigen spesifik yang telah ditautkan dengan suatu enzim signal

(disesuaikan dengan sampel => bila sampel berupa antigen, maka digunakan antibodi spesifik

, sedangkan bila sampel berupa antibodi, maka digunakan antigen spesifik) dicampurkan ke

atas permukaan tersebut, sehingga dapat terjadi interaksi antara antibodi dengan antigen yang

bersesuaian. Kemudian ke atas permukaan tersebut dicampurkan suatau substrat yang dapat

bereaksi dengan enzim signal. Pada saat substrat tersebut dicampurkan ke permukaan, enzim

yang bertaut dengan antibodi atau antigen spesifik yang berinteraksi dengan antibodi atau

antigen sampel akan bereaksi dengan substrat dan menimbulkan suatu signal yang dapat

dideteksi. Pada ELISA flourescense misalnya, enzim yang tertaut dengan antibodi atau

antigen spesifik akan bereaksi dengan substrat dan menimbulkan signal yang berupa pendaran

flourescense.

6. Kelebihan dn Kelemahan Teknik ELISA

Teknik ELISA ini memiliki beberapa kelebihan, antara lain :

Teknik pengerjaan relatif sederhana

Relatif ekonomis (karena jenis a antibodi yang digunakan hanya satu saja, sehingga

menghemat biaya untuk membeli banyak jenis antibodi)

Hasil memiliki tingkat sensitivitas yang cukup tinggi.

Dapat digunakan untuk mendeteksi keberadaan antigen walaupun kadar antigen

tersebut sangat rendah (hal ini disebabkan sifat interaksi antara antibodi atau antigen

yang bersifat sangat spesifik)

Dapat digunakan dalam banyak macam pengujian.

Sedangkan kekurangan dari teknik ELISA antara lain :

Jenis antibodi yang dapat digunakan pada uji dengan teknik ELISA ini hanya jenis

antibodi monoklonal (antibodi yang hanya mengenali satu antigen)

Harga antibodi monoklonal relatif lebih mahal daripada antibodi poliklonal, sehingga

pengujian teknik ELISA ini membutuhkan biaya yang relatif mahal.

Pada beberapa macam teknik ELISA, dapat terjadi kesalahan pengujian akibat kontrol

negatif yang menunjukkan respons positif yang disebabkan inefektivitas dari larutan

blocking sehingga antibodi sekunder atau antigen asing dapat berinteraksi dengan antibodi

bertaut enzim signal dan menimbulkan signal.

Reaksi antara enzim signal dan substrat berlangsung relatif cepat, sehingga pembacaan

harus dilakukan dengan cepat (pada perkembangannya, hal ini dapat diatasi dengan

memberikan larutan untuk menghentikan reaksi).

6. Alat dan Bahan Yang Digunakan

   Alat paling utama yang digunakan dalam teknik ELISA adalah microtiter. Microtiter ini

berupa suatu papan plastik dengan cekungan sebanyak 96 buah (8 cekungan ke arah bawah

dan 12 cekungan ke samping). Microtiter ini terbuat dari bahan plistirena. Cekungan dari

microtiter memiliki tinggi sekitar 1 cm dan diameter 0,7 cm. Selain itu, alat dan bahan lain

yang umum digunakan dalam teknik ELISA antara lain :

Antigen yang dimurnikan (jika sampel yang akan dideteksi atau dikuantifikasikan berupa

antibodi).

Larutan standard (kontrol positif dan negatif).

Sampel yang ingin dites.

Cairan pencuci (buffer).

Antibodi atau antigen yang tertaut dengan enzim signal.

Substrat yang bersifat spesifik terhadap enzim signal.

ELISA reader (spektrofotometer) untuk pengukuran kuantitatif.

7. Macam-macam Teknik ELISA

Secara umum, teknik ELISA dibedakan menjadi dua jenis, yaitu teknik ELISA

kompetitif yang menggunakan konjugat antigen-enzim atau konjugat antibodi-enzim, dan

teknik ELISA nonkompetitif yang menggunakan dua antibodi (primer dan sekunder). Pada

teknik ELISA nonkompetitif, antibody kedua (sekunder) akan dikonjugasikan dengan enzim

yang berfungsi sebagai signal. Teknik ELISA nonkompetitif ini seringkali disebut sebagai

teknik ELISA sandwich.

Dewasa ini, teknik ELISA telah berkembang menjadi berbagia macam jenis teknik.

Perkembangan ini didasari pada tujuan dari dilakukannya uji dengan teknik ELISA tersebut

sehingga dapat diperoleh hasil yang optimal. Berikut ini adalah beberapa macam teknik

ELISA yang relatif sering digunakan, antara lain :

a. ELISA Direct

           Teknik ELISA ini merupakan teknik ELISA yang paling sederhana. Teknik ini

seringkali digunakan untuk mendeteksi dan mengukur konsentrasi antigen pada sampel

ELISA direct menggunakan suatu antibody spesifik (monoklonal) untuk mendetaksi

keberadaan antigen yang diinginkan pada sampel yang diuji.

           Pada ELISA direct, pertama microtiter diisi dengan sampel yang mengandung antigen

yang diinginkan, sehingga antigen tersebut dapat menempel pada bagian dinding-dinding

lubang microtiter, kemudian microtiter dibilas untuk membuang antigen yang tidak menempel

pda dinding lubang microtiter. Lalu antibodi yang telah ditautkan dengan enzim signal

dimasukkan ke dalam lubang-lubang microtiter sehingga dapat berinteraksi dengan antigen

yang diinginkan, yang dilanjutkan dengan membilas microtiter untuk membuang antibody

tertaut enzim signl yang tidak berinteraksi dengan antigen. Lalu, ke dalam lubang-lubang

microtiter tersebut ditambahkan substrat yang dapat bereaksi dengan enzim signal, sehingga

enzim yang tertaut dengan antibodi yang telah berinteraksi dengan antigen yang diinginkan

akan berinteraksi dengan substrat dan menimbulkan signal dapat dideteksi. Pendeteksian

interaksi antara antibodi dengan antigen tersebut selanjutnya dapat dihitung dengan

menggunakan kolorimetri, chemiluminescent, atau fluorescent end-point.

           ELISA direct memiliki beberapa kelemahan, antara lain :

·        Immunoreaktifitas antibodi kemungkinan akan berkurang akibat bertaut dengan enzim.

·   Penautan enzim signal ke setiap antibodi menghabiskan waktu dan mahal.

·   Tidak memiliki fleksibilitas dalam pemilihan tautan enzim (label) dari antibodi pada

percobaan yang berbeda.

·    Amplifikasi signal hanya sedikit.

·    Larutan yang mengandung antigen yang diinginkan harus dimurnikan sebelum digunakan

untuk uji ELISA direct.

Sedangkan kelebihan dari ELISA direct antara lain :

·         Metodologi yang cepat karena hanya menggunakan 1 jenis antibody.

·         Kemungkinan terjadinya kegagalan dalam uji ELISA akibat reaksi silang dengan

antibody lain (antibody sekunder) dapat diminimalisasi.

b. ELISA Indirect

Teknik ELISA indirect ini pada dasarnya juga merupakan teknik ELISA yang paling

sederhana, hanya saja dalam teknik ELISA indirect yang dideteksi dan diukur konsentrasinya

merupakan antibody. ELISA indirect menggunakan suatu antigen spesifik (monoklonal) serta

antibody sekunder spesifik tertaut enzim signal untuk mendeteksi keberadaan antibody yang

diinginkan pada sampel yang diuji.

Pada ELISA indirect, pertama mocrotiter diisi dengan larutan yang mengandung

antigen spesifik, sehingga antigen spesifik tersebut dapal menempel pada bagian dinding

lubang microtiter. Selanjutnya microtiter dibilas untuk membuang antigen yang tidak

menempel pada dinding lubang microtiter. Kemudian larutan sampel yang mengandung

antibody yang diinginkan dimasukkan ke dalam lubang-lubnag microtiter, sehingga terjadi

terjadi interaksi antara antigen spesifik dengan antibody yang dinginkan. Selanjutnya

microtiter kembali dibilas untuk membuang antibodi yang tidak berinteraksi dengan antigen

spesifik. Lalu ke dalam lubang microtiter dimasukkan larutan yang berisi antibody sekunder

spesifik tertaut enzim signal, sehingga pada lubang microtiter tersebut terjadi interaksi antara

antibody yang diinginkan dengan antibody sekunder spesifik tertaut enzim

signal.  Selanjutnya microtiter dibilas lagi untuk membuang antibody sekunder tertaut enzim

signal yang tidak berinteraksi dengan antibody spesifik. Kemudian pada tahap akhir ELISA

indirect, ditambahkan substrat yang dapat bereaksi dengan enzim signal, lalu enzim yag

tertaut dengan antibody sekunder speifik yang telah berinteraksi dengan antibody yang

diinginkan akan bereaksi dengan substrat dan menimbulkan signal yang dapat dideteksi.

ELISA indirect memiliki beberapa kelemahan, antara lain :

Membutuhkan waktu pengujian yang relative lebih lama daripada ELISA direct karena

ELISA indirect membutuhkan 2 kali waktu inkubasi yaitu pada saat terjadi interaksi antara

antigen spesifik dengan antibody yang dinginkan dan antara antibody  yang diinginkan

dengan antibody sekunder tertaut enzim signal, sedangkan pada ELISA direct hanya

membutuhkan 1 kali waktu inkubasi yaitu pada saat terjadi interaksi antara antigen yang

diinginkan dengan antibody spesifik tertaut enzim signal.

Sedangkan kelebihan dari ELISA indirect antara lain :

Terdapat berbagai macam variasi antibody sekunder yang terjual secar komersial di pasar.

Immunoreaktifitas  dari antibody yang diinginkan (target) tidak terpengaruh oleh penautan

enzim signal ke antibody sekunder karena penautan dilakuka pada wadah berbeda.

Tingkat sensitivitas meningkat karena setiap antibody yag diinginkan memiliki beberapa

epitop yang bisa berinteraksi dengan antibody sekunder.

 c. ELISA Sandwich

           Teknik ELISA jenis ini menggunakan antibody primer spesifik untuk menangkap

antigen yang diinginkan dan antibody sekunder tertaut enzim signal untuk mendeteksi

keberadaan antigen yang diinginkan. Pada dasarnya, prinsip kerja dari ELISA sandwich mirip

dengan ELISA direct, hanya saja pada ELISA sandwich, larutan antigen yang diinginkan

tidak perlu dipurifikasi. Namun, karena antigen yang diinginkan tersebut harus dapat

berinteraksi dengan antibody primer spesifik dan antibody sekunder spesifik tertaut enzim

signal, maka teknik  ELISA sandwich ini cenderung dikhususkan pada antigen memiliki

minimal 2 sisi antigenic (sisi interaksi dengan antibodi) atau antigen yang bersifat multivalent

seperti polisakarida atau protein. Pada ELISA sandwich, antibody primer seringkali disebut

sebagai antibody penangkap, sedangkan antibody sekunder seringkali disebut sebagai

antibody penangkap, sedagkan antibody sekunder seringkali disebut sebagai antibody deteksi.

           Dalam pengaplikasiannya, ELISA sandwich lebih banyak dimanfaatkan untuk

mendeteksi keberadaan antigen multivalent yang kadarnya sangat rendah pada suatu larutan

dengan tingkat kontaminasi tinggi. Hal ini disebabkan ELISA sandwich memiliki tingkat

sensitivitas tinggi terhadap antigen yang diinginkan akibat keharusan dari antigen tersebut

untuk berinteraksi dengan kedua antibody.

           Pada ELISA sandwich, pertama microtiter diisi dengan larutan yang mengandung

antibody penangkap, sehingga antibody penangkap tersebut dapat menempel pada bagian

dinding lubang microtiter. Selanjutnya microtiter dibilas untuk membuang antibody

penangkap yang tidak menempel pada dinding lubang microtiter. Kemudian larutan sampel

yang mengandung antigen yang diinginkan dimasukkan ke dalam lubang-lubang microtiter,

sehingga terjadi interaksi antara antibody penangkap dengan antigen yang diinginkan.

Selanjutnya, microtiter kembali dibilas untuk membuang antigen yang tidak bereaksi dengan

antigen penangkap. Lalu, kedalam lubang microtiter dimasukkan larutan yang berisi antibody

detector sehingga pada lubang microtiter tersebut terjadi interaksi antara antigen yang

diinginkan dengan antibody detector. Selanjutnya microtiter dibilas lagi untuk membuang

antibody detector yang tidak berinteraksi dengan antibody spesifik. Kemudian pada tahap

akhir  ELISA indirect, ditambahkan substrat yang dapat bereaksi dengan enzim signal, lalu

enzim yang tertaut pada antibody detector yang telh berinteraksi dengan antigen yang

diinginkan akan bereaksi dengan substrat dan menimbulkan signal yang dapat dideteksi.

           Dalam ELISA sandwich, terdapat beberapa faktor yng mempengaruhi tingkat

sensitivitas dari hasil pengujian, antara lain :

Banyak molekul antibody penangkap yang berhasil menempel pada dinding-dinding

microtiter.

Avinitas dari antibody penangkap dan antibody detector terhadap antigen sebenarnya,

teknik ELISA sandwich ini merupakan pengembangan dari teknik ELISA terdahulu,

yaitu ELISA direct. Kelebihan teknik ELISA sandwich ini pada dasarnya berada pada

tingkat sensitivitasnya yang relatif lebih tinggi karena antigen yang diinginkan harus

dapat berinteraksi dengan dua jenis antibody, yaitu antibody penangkap dan antibody

detector. Namun demikian, teknik ELISA sandwich ini juga memiliki kelemahan, yaitu

teknik ini hanya dapat diaplikasikan untuk medeteksi antigen yang bersifat multivalent

serta sulitnya mencari dua jenis antibody yang dapat berinteraksi antigen yang sama pada

sisi antigenic yang berbeda (epitopnya harus berbeda).

d. ELISA Biotin Sterptavidin (Jenis ELISA Modern)

Pada perkembangan selanjutnya, teknik ELISA sandwich ini juga dikembangkan untuk

mendeteksi antibody dengan tingkat sensitivitas relatif lebih tinggi. Teknik ini dikenal sebagai

teknik ELISA penangkap antibody, dimana prinsip kerjanya sama dengan ELISA sandwich,

hanya saja yang digunakan dalam teknik ini adalah antigen penangkap dan antigen detector

(antigen bertaut enzim signal, bersifat opsional apabila antibody yang diinginkan tidak bertaut

dengan enzim signal).

Contoh dari aplikasi teknik ini adalah teknik ELISA untuk mendeteksi vitamin biotin

yang bertaut dengan suatu antibody avidin dengan mengubah antibody avidin menjadi

antibody streptavidin, dimana satu molekul streptavidin dapat mengikat empat molekul biotin

(pengembangan dari ELISA indirect), sehingga signal yang teramplifikasi menjadi semakin

kuat akibat interaksi antara biotin dengan enzim yang menjadi semakin banyak.

e. ELISA Kompetitif

Teknik ELISA jenis ini juga merupakan pengembangan teknik ELISA

terdahulu.Prinsip dasar dari teknik ini adalah dengan menambahkan suatu competitor ke

dalam lubang mikrotiter.Teknik ELISA kompetitif ini dapat diaplikasikan untuk mendeteksi

keberadaan antigen atau antibody.

Pada pendeteksian antigen, pertama  mikrotiter diisi antibody spesifik yang dapat

berinteraksi dengan antigen yang diinginkan maupun antigen spesifik bertaut enzim signal,

sehingga antibody spesifiktersebut dapat menempel pada bagian dinding-dinding

lubangmikrotiter. Lalu larutan yang mengandung antigen spesifik yang telah ditautkan dengan

enzim signal dan larutan sampel yang mengandung antigen yang diinginkan dimasukkan ke

dalam lubang-lubang mikrotiter sehingga terjadi kompetisi antaraantigen spesifik bertaut

enzim signal dengan antigen yang diinginkan untuk dapat berinteraksi dengan antibody

spesifik yang dilanjutkan dengan membilas mikrotiter untuk membuang antigen spesifik

tertaut enzim signal atau antigen yang tidak berinteraksi dengan antibody spesifik. Lalu

kedalam lubang-lubang mikrotiter tersebut ditambahkan substrat yang dapat bereaksi dengan

enzim signal yang tertaut pada antigen spesifik, sehingga enzim yang tertaut dengan antigen

yang telah berinteraksi dengan antibody spesifik akan bereaksi dengan substrat dan

menimbulkan signal yang dapat dideteksi. Pada proses pendeteksian ini, pendeteksian positif

ditandai oleh tidak adanya signak yang ditimbulkan, yang berarti bahwa antigen yang

diinginkan telah menang berkompetisi dengan antigen spesifik tertaut enzim signal dan

berinteraksi dengan antibody spesifik.

Sedangkan pada pendeteksian antibody, pertama mikrotiter diisi antigen spesifik yang

dapat berinteraksi dengan anti bodi yang diinginkan maupun antibody spesifik tertaut enzim

signal, sehingga antigen spesifik tersebut dapat menempel pada bagian dinding-dinding

mikrotiter, kemudian mikrotiter dibilas untuk membuang antigen spesifik yang tidak

menempel pada dinding-dinding mikrotiter. Lalu larutan yang mengandung antibody spesifik

yang telah ditautkan dengan enzim signal dan larutan sampel yang mengandung antibody

yang diinginkan dimasukkan ke dalam lubang-lubang mikrotiter, sehingga terjadi kompetisi

antara antibody spesifik tertaut enzim signal dengan antibody yang diinginkan untuk

dapatberinteraksi dengan antigen spesifik, yang dilanjutkan dengan membilas mikrotiter

untuk membuang antibody spesifik tertaut enzim signal atau antibody yang tidak berinteraksi

dengan antigen spesifik. Lalu, kedalam lubang-lubang mikrotiter tersebut ditambahkan

substrat yang dapat bereaksi dengan enzim signal yang tertaut pada antibody spesifik,

sehingga enzim yang tertaut dengan antibody yang telah berinteraksi dengan antigen spesifik

akan bereaksi dengan substrat dan menimbulkan signal yang dapat dideteksi. Pada proses

pendeteksian ini, pendeteksian positif juga ditandai oleh tidak adanya signal yang

ditimbulkan, yang berarti antibody yang diinginkan telah menang berkompetisi dengan

antibody spesifik tertaut enzim signal dan berinteraksi dengan antigen spesifik.

Kelebihan dari teknik ELISA kompetitif ini adalah tidak diperlukannya purifikasi

terhadap larutan sampel yang mengandung antibody atau antigen yang diinginkan, tapi hasil

yang diperoleh tetap memiliki tingkat sensitivitas tinggi akibat sifat spesitifitas dari antibody

dan antigen.

f. ELISA Multiplex

Teknik ELISA merupakan pengembangan teknik ELISA yang ditujukan untuk

pengujian secara simultan,sedangkan prinsip dasarnya mirip dengan teknik ELISA terdahulu.

8. Aplikasi Teknik ELISA

Berikut ini adalah beberapa ontoh aplikasi teknik ELISA, antara lain:

a.       Pemeriksaan donor darah untuk pembuktian adanya kontaminasi virus:

·            HIV-1 dan  HIV-2 (keberadaan antibody anti-HIV)

·            Hepatitis C (presence of antibodies)

·            Hepatitis B (test untuk keberadaan antibody dan antigen virus)

·            HTLV-1 dan -2 (keberadaan entibodi)

b.      Pengukuran level hormone

·            hCG (sebagai tes kehamilan)

·            LH ( menentukan waktu ovulasi)

·            TSH, T3dan T4 (untuk fungsi thyroid)

c.       Pendeteksian Infeksi

·            Agen penularan secara seksual, HIV, Syphilis dan Chlamydia

·            Hepatitis B dan C

·            Toxoplasma Gondii

d.   Pendeteksian bahan allergen pada makanan dan debu rumah.

e.    Pendeteksian keberadaan zat obat-obatab terlarabg, seperti

·            Cocain

·            Opium

·            -9-tetrahydrocannabiol, campuran aktif pada marijuana.