ELISA20 JUNI 2015

ELISA (Enzyme-linked-immunosorbent assay)

Salah satu metode imunoassay yang digunakan untuk deteksi:• Antibodi• Protein• Peptida• Biomolekul

Imunoassay

• Immunoassay berasal dari kata “immuno” (=secara imunologi) dan “assay” (=kemurnian suatu substansi/jumlah konstituen dalam suatu campuran).

Kenapa disebut Enzyme Linked Immunosorbent Assay?

1. Antigen/antibodi yang diinginkan diabsorbsi ke permukaan plastik (‘sorbent’)

2. Antigen dikenali oleh antibodi spesifik (‘immuno’)

3. Antibodi ini dikenali oleh antibodi kedua (‘immuno’) yang ditempeli oleh enzim (‘enzyme-linked’)

4. Substrat bereaksi dengan enzim untuk memproduksi produk, berupa warna

Dalam pengertian sederhana:• sejumlah antigen yang tidak dikenal

ditempelkan pada suatu permukaan antibodi spesifik dicucikan pada permukaan tersebut sehingga akan berikatan dengan antigennya.

• Antibodi ini terikat dengan suatu enzim, dan pada tahap terakhir, ditambahkan substansi yang dapat diubah oleh enzim menjadi sinyal yang dapat dideteksi.

Komponen Penting dalam Imunoassay

• Antibodi (antiserum)• Antigen• Labeling material

Antibodi (antiserum)

• Antibodi: protein yg diproduksi oleh sistem imun untuk melawan antigen

Antigen

• Antigen: molekul yang menginduksi produksi antibodi ketika dikenali oleh tubuh

• Apapun yang asing bagi sistem imun, misal: bakteri, virus, dll

Labeling Material

• Diperlukan adanya marker untuk mengetahui ikatan antigen-antibodi

• Marker tidak boleh mengganggu ikatan

Komponen kit

• Pre-coated, stabilized 96-well microtiter• Plate• Sample diluent• Standard and controls• Conjugated detection antibody• 10x wash solution• Substrate• Stop solution

Prinsip Dasar ELISA

1. Antigen/sampel ditambahkan ke plate

2. Blocking buffer ditambahkan untuk menghalangi tempat pengikatan protein

3. Tambahkan antibodi primer yang sesuai

4. Tambahkan konjugat antibodi sekunder-enzim yang sesuai yang mengenali dan berikatan dengan antibodi primer

5. Tambahkan substrat TMB yang akan dikonversi oleh enzim menjadi bentuk yang terdeteksi

Keuntungan ELISA

• Reagen relatif murah dan waktu simpan lama• Spesifitas dan sensitivitas ELISA tinggi• Mudah dilihat hasilnya dan prosedur cepat• ELISA dapat digunakan untuk berbagai infeksi

Kekurangan ELISA

• Pengukuran aktivitas enzim jauh lebih kompleks dibandingkan pengukuran aktivitas dengan menggunakan radioisotop

• Aktivitas enzim dapat terpengaruh oleh konstituen plasma

• Kit tersedia secara komersial, tapi tidak murah• Sangat spesifik untuk antigen tertentu. Tidak akan

mengenali antigen lain• Bisa terjadi positif/negatif palsu, terutama dengan

antigen yang termutasi.

Tipe ELISA

1. Direct ELISA2. Indirect ELISA3. Sandwich ELISA4. Competitive ELISA5. Ogives ELISA

Tahapan ELISA

1. Lapisi well dengan antibodi100 μL antibodi yang terlarut dalam buffer ditambahkan ke tiap well.Tutup plate dan inkubasi pada 4 °C semalaman.

2. Cuci3. Inkubasi dengan sampel uji 100 μL sampel uji atau standar dalam buffer ditambahkan ke tiap well.Tutup plate dan inkubasi pada suhu ruang selama 2 jam.

4. Cuci

Tahapan ELISA5. Inkubasi dengan enzim-antibodi terkonjugasi 100 μL enzim-antibodi terkonjugasi dalam buffer ditambahkan ke tiap well. Tutup plate dan inkubasi pada suhu ruang selama 1 jam. Enzim-antibodi terkonjugasi seharusnya melawan antigen agar dapat ditunjukkan. Antibodi terkonjugasi harusnya spesifik untuk antigen yang diinginkan

6. Cuci7. Pembentukan warna 100 μL substrat kromogenik ditambahkan pada tiap well. Tutup plate dan inkubasi 15 menit, hingga terbentuk warna yang sesuai. Plate sebaiknya dihindarkan dari cahaya selama inkubasi.

8. Penghentian pembentukan warna Pengentian reaksi dengan menambahkan 100 μL 0.5M H2SO4 pada tiap well.

9. Membaca hasil Baca hasil secara langsung melalui bagian bawah plate menggunakan fotometer (ELISA reader) otomatis atau semi-otomatis. Panjang gelombang yang direkomendasikan antara 620-650 nm.

Fluoresensi dalam ELISA

• Saat cahaya dengan panjang gelombang tertentu disinarkan pada suatu sampel, kompleks antigen/antibodi akan berfluoresensi sehingga jumlah antigen pada sampel dapat disimpulkan berdasarkan besarnya fluoresensi denan menggunakan spektrofotometer.

Spektrofotometer

• Spektrofotometer : sebuah alat yang dapat mengukur jumlah dari cahaya yang menembus sumuran dari microplate.

• Kompleks antigen-antibodi yang kita buat pada well microplate akan memberikan perubahan warna pada cairan tersebut, sehingga akan memberikan optical density yang berbeda.

• Optical density dapat dinyatakan meningkat atau menurun berdasarkan pengenceran material standart, sehingga akan menghasilkan kurva dose-response yang nantinya akan digunakan untuk mengestimasi kadar protein tersebut.

Kurva Standar ELISA

• Bentuk kurva standar tergantung pada skala X dan Y.• Kurva standar ELISA dibuat dengan memplot konsentrasi

standar pada X dan absorbansi pada Y, pada skala normal akan terbentuk garis linier kecuali pada area dengan konsentrasi rendah.

Hasil

TERIMA KASIH