ELEKTROFORESIS GEL AGAROSA

Oleh:

Nama : Suminar Sundari M.H.NIM : B1J009013Rombongan : VIIIKelompok : 3Asisten : Lia Rahayu

LAPORAN PRAKTIKUM BIOLOGI MOLEKULER

KEMENTERIAN PENDIDIKAN NASIONALUNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN

FAKULTAS BIOLOGIPURWOKERTO

2011

I. PENDAHULUAN

A. Latar Belakang

Elektroforesis merupakan metode yang sudah dipakai oleh banyak peneliti

terutama peneliti yang berkaitan dengan genetika ataupun molecular. Seiring

dengan kemajuan zaman yang semakin pesat dinegara-negara berkembang akan

selalu diikuti pula dengan kemajuan ilmu pengetahuan yang semakin marak

dibidang teknologi. Salah satu diantaranya adalah pengembangan di bidang Biologi

Molekul. Bidang ilmu pengetahuan Bidang Molekuler ini telah dimulai pada akhir

abad ke 19, setelah metode elektroforesis ditemukan dan dipakai untuk menganalisa

berbagai kegiatan penelitian di bidang Kimia, Biologi (Genetika, Taksonomi dan

Bio-sistematik).

Metode elektroforesis mulai berkembang akhir abad ke-19 setelah ditemukan

penelitian yang menunjukkan adanya penelitian yang menunjukkan adanya efek dari

listrik terhadap partikel-partikel atau molekul-molekul yang bermuatan listrik, dalam

hal ini termasuk juga protein. Elektroforesis berasal dari bahasa Yunani yang

mempunyai arti transport atau perpindahan melalui partikelpartikel listrik. Metode

elekroforesis telah digunakan dan dikembangkan didalam teknik analisa untuk

penelitian di bidang biologi dan genetika. Metode tersebut berkembang sangat pesat

sekali di zaman kemajuan teknologi, disebabkan karena pengerjaannya sangat

sederhana dan sangat mudah. Di dalam ilmu biologi maupun biologi molekuler,

metode elektrorofesis banyak digunakan untuk taksonomi, sistematik dan genetik dari

tumbuhan.

B. Tujuan

Tujuan praktikum adalah untuk mengetahui cara kerja dan prinsip kerja

elektroforesis..

II. MATERI DAN METODE

A. Materi

Alat-alat yang digunakan pada praktikum ini yaitu DNA marker, misalnya DNA

λ yang dipotong dengan HindIII, DNA produk PCR, agarosa, larutan buffer TAE 50x

(242 g tris-base; 57,1 g asam asetat glacial; 100 ml EDTA 0,5 M pH 8; dilarutkan dalam

akuades hingga 1000 ml), akuades, Loading dye 6x (0,25% bromophenol blue; 0,25%

xylene cyalol; 15% ficoll tipe 4000; EDTA 120 mM), larutan Etidium Bromid (EtBr).

Bahan yang digunakan dalam praktikum ini adalah gelas ukur 1000 ml, labu

erlenmeyer 50 ml, tabung mikrosentrifuga, sarung tangan, seperangkat mikropipet

beserta tipnya (Bio-Rad dan Axygen Scientific), kertas parafilm, seperangkat alat

elektroforesis, UV transluminator, kaca mata UV, kamera digital.

B. Matode

Praktikum ini dilakukan dengan cara sebagai berikut:

1. Dibuat larutan buffer TAE 1x dengn cara mencampurkan 10 ml TAE 50x ditambah

dengan akuades hingga 50 ml.

2. Agarosa dibuat, yaitu dengan agarosa 0,2 gram ditambah TAE 1x hingga 20 ml,

TAE : Agarosa (100 ml : 1 %).

3. Disiapkan baki elektroforesis, selotip diletakan di setiap ujung kaki baki

elektroforesis ( harus dipastikan bahwa selotip melekat kuat pada masing ujung

baki).

4. Dipasangkan sisir elektroforesis disalah satu ujung kaki baki dengan posisi hampir

menyentuh dasar baki.

5. Larutan suhu diperiksa dengan cara menempelkan erlenmeyer ke tangan, jika suhunya

sudah turun hingga sekitar 600 C, dituangkan larutan agarosa ke dalam baki

elektroforesis, dibiarkan hingga larutan berubah menjadi gel padat.

6. Setelah memadat, sisiran diambil, selotip dilepas dari ujung – ujung baki.

7. Baki yang berisi gel agarosa dimasukkan ke dalam tangki elektroforesis yang telah

diisi dengan sisa larutan buffer TAE 1x (dipastikan bahwa gel terendam seluruhnya

dalam TAE).

8. Disiapkan kertas parafilm didekat tangki elektroforesis.

9. Dimasukkan 15µl sampel DNA dan 3µ loading dye 6x ke dalam sumuran dengan cara

mencampurkan kedua bahan tersebut terlebh dahulu secara merata pada ketras

parafim dengan menggunakan mikropipet.

10. Dimasukkan pula DNA marka ( DNA λ) sebanyak 10µl ke dalam sumuran.

11. Dibuat catatan mengenai nomor sumuran dan jenis DNA yang dimasukkan.

12. Kedua kabel dari sumber arus ke tangki elektroforesis dihubungkan, (kutub negatif

berada didekat sumuran, sedangkan kabel yang tersambung ke kutub positif berada

jauh dari sumuran.

13. Sumber arus dinyalakan, voltase dan waktu running diatur hingga diperoleh 70 Volt.

14. Elektroforesis dijalankan (melakukan running) dengan menekan tombol run pada

sumber arus.

15. Elektroforesis akan berhenti apabila waktu yang ditetapkan sudah habis, yang

ditandai oleh adanya bunyi alarm. Sumber arus dimatikan dan baki diangkat dari

tangki elektroforesis.

16. Dengan menggunkan sarung tangan, gel agarosa dimasukkan ke dalam larutan Etbr

selama 10 menit, kemudian diletakkan di atas UV transiluminator (selubung

kacahitam diletakkan di atas UV transiluminator).

17. UV transiluminator dinyalakan, diamati pita – pita DNA yang tervisualisasi.

18. Didokumentasikan dengan menggunakan kamera.

III.HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Hasil

Keterangan :

1. DNA Marker

2. DNA Kromosom

3. DNA Plasmid

4. DNA Plasmid Enzim Retriksi

1

2

3

4

B. Pembahasan

Metode Elektroforesis Gel Agarosa didasarkan pada pergerakan molekul

bermuatan dalam media penyangga matriks stabil di bawah pengaruh medan listrik.

Media yang umum digunakan adalah gel agarosa atau poliakrilamid. Elektroforesis gel

agarosa digunakan untuk memisahkan fragmen DNA yang berukuran lebih besar dari

100 pb dan dijalankan secara horizontal, sedangkan elektroforesis poliakrilamid dapat

memisahkan 1 pb dan dijalankan secara vertikal. Elektroforesis poliakrilamid biasanya

digunakan untuk menentukan urutan DNA (sekuensing). Prinsip pemisahan dalam

elektroforesis didasarkan atas perbedaan migrasi komponen pada fase pendukung,

karena adanya perbedaan muatan dan masa molekul ( Zubay, 1989).

Elektroforesis DNA merupakan teknik untuk memisahkan sampel DNA

berdasarkan atas ukuran (berat molekul) dan struktur fisik molekulnya. Gel yang biasa

digunakan antara lain agarosa. Elektroforesis gel agarosa dapat dilakukan untuk

memisahkan sampel DNA dengan ukuran dari beberapa ratus hingga 20.000 pasang basa

(bp). Molekul DNA bermuatan negatif sehingga di dalam medan listrik akan bermigrasi

melalui matriks gel menuju kutub positif (anode). Makin besar ukuran molekulnya,

makin rendah laju migrasinya. Berat molekul suatu fragmen DNA dapat diperkirakan

dengan membandingkan laju migrasinya dengan laju migrasi fragmen-fragmen molekul

DNA standar (DNA marker) yang telah diketahui ukurannya. Visulisasi DNA

selanjutnya dilakukan di bawah paparan sinar ultraviolet setelah terlebih dahulu gel

dalam pembuatannya ditambahkan larutan etidium bromid. Cara lain untuk melihat

visualisasi DNA adalah gel direndam di dalam larutan etidium bromid sebelum

dipaparkan di atas sinar ultraviolet ( Pratiwi, 2001).

Elektroforesis merupakan proses bergeraknya molekul bermuatan pada suatu

medan listrik. Kecepatan molekul yang bergerak pada medan listrik tergantung

pada muatan, bentuk dan ukuran. Dengan demikian elektroforesis dapat digunakan

untuk separasi makromolekul (seperti protein dan asam nukleat). Posisi molekul yang

terseparasi pada gel dapat dideteksi dengan pewarnaan atau autoradiografi, ataupun

dilakukan kuantifikasi dengan densitometer. Elektroforesis untuk makromolekul

memerlukan matriks penyangga untuk mencegah terjadinya difusi karena timbulnya

panas dari arus listrik yang digunakan. Elektroforesis biasanya memerlukan media

penyangga sebagai tempat bemigrasinya molekul-mulekul biologi. Media

penyangganya bermacam-macam tergantung pada tujuan dan bahan yang akan

dianalisa. Media penyangga yang sering dipakai dalam elektroforesis antara lain yaitu

kertas, selulose, asetat dan gel. Gel poliakrilamid dan agarosa merupakan matriks

penyangga yang banyak dipakai untuk separasi protein dan asam nukleat ( Zubay,

1989).

Larutan DNA yang bermuatan negatif dimasukkan ke dalam sumur-sumur yang

terdapat pada gel agarosa dan diletakkan di kutub negatif, apabila dialiri arus listrik

dengan menggunakan larutan buffer yang sesuai maka DNA akan bergerak ke kutup

positif. Laju migrasi DNA dalam medan listrik berbanding terbalik dengan massa DNA.

Migrasi DNA terutama ditentukan oleh ukuran panjang dan bentuk DNA. Fragmen

DNA yang berukuran kecil akan bermigrasi lebih cepat dibanding yang berukuran besar,

sehingga elektroforesis mampu memisahkan fragmen DNA berdasarkan ukuran

panjangnya. Untuk visualisasi maka ditambahkan larutan etidium bromida yang akan

masuk diantara ikatan hidrogen pada DNA, sehingga pita fragmen DNA akan kelihatan

dibawah lampu UV. Panjang amplikon bisa diperkirakan dengan membandingkannya

dengan pita DNA standar ( Pratiwi, 2001).

Gel elektroforesis digunakan untuk memisahkan fragmen DNA berdasarkan

ukurannya. Dimana jika sentrifugasi berarti memisahkan molekul menggunakan

kekuatan gravitasi sementara gel elektroforesis berarti memisahkan molekul dengan

menggunakan kekuatan elektrik. Gel elektroforesis mengambil keuntungan bahwa,

sebagai asam organik, DNA bermuatan negatif. Ketika diletakkan di dalam medan

listrik, molekul DNA menuju ke kutub positif (anoda) dan menjauhi kutub negatif

(katoda). Sebelum dilakukan elektroforesis, suspensi DNA terlebih dahulu harus

ditambahkan loading buffer (dye), yang berfungsi untuk menambah densitas, sehingga

DNA akan selalu berada di dasar sumur; pewarna untuk memudahkan meletakkan

sampel DNA ke dalam sumur, agar dapat bergerak ke arah anoda dengan laju yang dapat

diperkirakan sehingga dapat digunakan sebagai tanda migrasi DNA. Pewarna yang biasa

digunakan adalah bromophenol blue dan xylene cyanol. Selain itu, pembacaan pita DNA

di dalam gel yang telah diwarnai dengan ethidium bromida di atas lampu UV yang

dibandingkan dengan DNA standar juga sering dilakukan untuk menganalisis kuantitas

jumlah DNA (Suharsono dan Widyastuti , 2006).

Menurut Soedarmadji (1996), beberapa faktor mempengaruhi kecepatan migrasi

dari molekul protein yakni:

1. Ukuran molekul protein

Migrasi molekul protein berukuran besar lebih lambat daripada migrasi

molekul berukuran kecil.

2. Konsentrasi gel

Migrasi molekul protein pada gel berkosentrasi rendah lebih cepat daripada

migrasi molekul protein yang sama pada gel berkosentrasi tinggi.

3. Bufer (penyangga) dapat berperan sebagai penstabil medium pendukung dan dapat

mempengaruhi kecepatan gerak senyawa karena ion sebagai pembawa protein yang

bermuatan. Kekuatan ion yang tinggi dalam bufer akan meningkatkan panas sehingga

aliran listrik menjadi maksimal. Hal ini dapat mempercepat gerakan molekul

protein. Kekuatan ion rendah dalam bufer akan menurunkan panas sehingga aliran listrik

akan sangat minimal dan migrasi molekul protein sangat lambat.

4. Medium penyangga

Medium pendukung ideal untuk elektroforesis adalah bahan kimia inert yang

bersifat relatif stabil, mudah ditangani dan mempunyai daya serap yang baik, sebagai

migrasi elektron atau penyaringan berdasarkan ukuran molekul seperti gel

poliakrilamid (Sudarmadji, 1996). Jika ukuran pori dari medium kira-kira sama

dengan molekul, maka molekul yang lebih kecil akan berpindah lebih bebas di

dalam medan listrik, sedangkan molekul yang lebih besar akan dibatasi dalam

migrasinya. Besarnya pori-pori dapat diatur dengan mengubah konsentrasi

penyusun gel poliakrilamidnya yaitu akrilamid dan bisakrilamid.

5. Kekuatan voltase

Voltase yang dipakai rendah (100-500) V, kecepatan migrasi molekul

sebanding dengan tingginya voltase yang digunakan. Voltase yang dipakai tinggi (500-

10000) V, mobolitas molekul meningkat secara lebih tajam dan digunakan untuk

memisahkan senyawa dengan BM rendah serta jenis arus yang dipakai selalu harus

searah (bukan bolak balik).

6. Temperatur medium disaat proses elektroforesis berlangsung.

Jika temperatur tinggi akan mempercepat proses bermigrasinya protein dan

sebaliknya jika temperatur rendah akan mengurangi kekuatan bermigrasinya protein.

Pada saat elektroforesis berlangsung, protein akan bergerak dari elektroda negatif

menuju elektroda positif sampai pada jarak tertentu pada gel poliakrilamid tergantung

pada berat molekulnya. Semakin rendah berat molekulnya maka semakin jauh pula

protein bergerak atau mobilitasnya tinggi. Sebaliknya protein dengan berat molekul

lebih besar akan bergerak pada jarak yang lebih pendek atau mobilitasnya rendah

(Sumitro et al., 1996).

Hasil praktikum menunjukkan bahwa DNA sampel tidak terbaca, melainkan

terjadi penumpukan. Hal ini terjadi mungkin karena kurang tepat dan kurang hati-hati

dalam memasukkan DNA marka ke dalam sumuran, sehingga DNA marka terlalu

banyak dan hingga memenuhi sumur sebelahnya. Hasil elektroforesis akan didapatkan

pita-pita protein yang terpisahkan berdasarkan berat molekulnya. Tebal tipisnya pita

yang terbentuk dari pita protein menunjukkan kandungan atau banyaknya protein

yang mempunyai berat molekul yang sama yang berada pada posisi pita yang

sama. Hal ini sejalan dengan prinsip pergerakan molekul bermuatan, yakni molekul

bermuatan dapat bergerak bebas di bawah pengaruh medan listrik, molekul dengan

muatan dan ukuran yang sama akan terakumulasi pada zona atau pita yang sama atau

berdekatan (Soedarmadji, 1996).

Fungsi dari alat dan bahan yang digunakan dalam elektroforesis gel agarosa:

Aquades : sebagai pelarut

Etidium bromide : sebagai pewarna DNA

Baki gel agarosa : sebagai cetakan gel agarosa

Sisir elektroforesis : untuk membuat sumuran pada gel agarosa

Tangki elektroforesis: untuk running DNA

Loading dye : sebagai pemberat DNA

Mikropipet : untuk mengambil dan menghomogenkan sampel

DNA dan loading dye

Kertas Parafilm : untuk tempat menghomogenkan sampel DNA dan

loading dye

UV Transiluminator : untuk melihat pita-pita DNA

TAE : Trisbase sebagai buffer sesuai dengan pH,

Asam Asetat Glasial sebagai elektrolit gram,

EDTA (Etylen Diamine Tetra Asetic Acid) sebagai

pe-non aktif DNA-se

DNA marka : DNA penanda

Sarung tangan : Melindungi terkena DNA-se yang dapat merusak

DNA

IV. KESIMPULAN DAN SARAN

A. Kesimpulan

Berdasarkan hasil dan pembahasan, dapat disimpulkan :

1. Elektroforesis adalah teknik pemisahan komponen atau molekul bermuatan

berdasarkan perbedaan tingkat migrasinya dalam sebuah medan listrik .

2. Hasil yang didapat dilihat dari pendaran pita-pita DNA yang terbentuk pada

elektroforesis,DNA marka mengalami degradasi atau mengumpul tetapi DNA sampel

bisa terbaca. Hal ini yang mungkin terjadi karena beberapa kemungkinan antara lain

kesalahan dalam memasukkan DNA marka ke dalam sumur gel.

B. Saran

Acara praktikum sudah berjalan cukup baik,hanya saja keterbatasan alat untuk

praktikum masih kurang memadai, sehingga tidak memungkinkan masing-masing

praktikan untuk mencoba.

DAFTAR REFERENSI

Pratiwi, R. 2001. Mengenal Metode Elektroforesis. Oseana. Volume XXVI. Nomor 1. Balitbang Biologi Laut, Puslitbang Osenologi LIPI, Jakarta

Sudarmadji, S., 1996. Teknik Analisa Biokimiawi. Edisi Pertama Liberty. Yogyakarta.

Suharsono dan Widyastuti, U. 2006. Penuntun Praktikum Pelatihan Teknik Pengklonan Gen. Pusat Penelitian Sumber Daya Hayati dan Bioteknologi, IPB.

Sumitro, S. B, Fatchiyah, Rahayu, Widyarti, dan Arumningtyas. 1996. Kursus Teknik-Teknik Dasar Analisis Protein dan DNA. Jurusan Biologi FMIPA Universitas Brawijaya. Malang

Zubay, G.L. 1989. Biochemistry 2nd Edition. Mcmillan Publishing Coorporation. New York.