EFEK EKSTRAK ETANOL TEH HIJAU ( var. assamica SEBAGAI ...
74
EFEK EKSTRAK ETANOL TEH HIJAU (Camellia sinensis var. assamica) SEBAGAI PENGHAMBAT PEMBENTUKAN BIOFILM Escherichia coli SECARA IN VITRO TUGAS AKHIR Untuk Memenuhi Persyaratan Memperoleh Gelar Sarjana Kedokteran Oleh: Made Kurnia Alvina NIM. 155070100111021 PROGRAM STUDI KEDOKTERAN FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS BRAWIJAYA MALANG 2018
Transcript of EFEK EKSTRAK ETANOL TEH HIJAU ( var. assamica SEBAGAI ...
EFEK EKSTRAK ETANOL TEH HIJAU (Camellia sinensis var. assamica) SEBAGAI PENGHAMBAT PEMBENTUKAN BIOFILM Escherichia coli
SECARA IN VITRO
TUGAS AKHIR
Untuk Memenuhi Persyaratan
Memperoleh Gelar Sarjana Kedokteran
Oleh:
Made Kurnia Alvina NIM. 155070100111021
PROGRAM STUDI KEDOKTERAN FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS BRAWIJAYA
MALANG 2018
DAFTAR ISI Halaman Judul ............................................................................................. i
Halaman Pengesahan ................................................................................ ii
Pernyataan Keaslian Tulisan ...................................................................... iii
Kata Pengantar .......................................................................................... iv
Abstrak ...................................................................................................... vi
Abstract ..................................................................................................... vii
Daftar Isi ................................................................................................... viii
Daftar Tabel ............................................................................................... xi
Daftar Gambar ........................................................................................... xii
Daftar Bagan ............................................................................................ xiii
Daftar Singkatan ....................................................................................... xiv
BAB I PENDAHULUAN ............................................................................. 1
1.1 Latar Belakang Masalah ....................................................................... 1
1.2 Rumusan Masalah ................................................................................ 3
1.3 Tujuan Penelitian .................................................................................. 3
1.3.1 Tujuan Umum ............................................................................. 3
1.3.2 Tujuan Khusus ............................................................................ 3
1.4 Manfaat Penelitian ................................................................................ 4
1.4.1 Manfaat Akademis ...................................................................... 4
1.4.2 Manfaat Praktis ........................................................................... 4
BAB II TINJAUAN PUSTAKA ................................................................... 5
2.1 Escherichia coli ..................................................................................... 5
2.1.1 Taksonomi Escherichia coli .......................................................... 5
2.1.2 Karakteristik Bakteri ..................................................................... 6
2.1.3 Identifikasi Karakteristik Bakteri Escherichia coli .......................... 7
2.1.3.1 Pewarnaan Gram ............................................................. 7
2.1.3.2 Koloni pada Agar Eosin Methylene Blue ........................... 8
2.1.3.3 Uji Biokimia ...................................................................... 8
2.2 Biofilm ................................................................................................... 8
2.2.1 Mekanisme Pembentukan Biofilm ................................................ 9
2.2.2 Pembentukan Biofilm pada Escherichia coli ............................... 11
2.2.3 Quorum Sensing ........................................................................ 13
2.2.3.1 Quorum Sensing (QS) pada E. coli ................................. 14
2.2.4 Uji Pembentukan Biofilm ............................................................ 16
2.2.4.1 Metode Tabung .............................................................. 16
2.2.4.2 Metode Congo Red Agar ................................................ 16
Halaman
2.2.4.3 Metode Tissue Culture Plate .......................................... 17
2.3 Teh (Camellia sinensis) ...................................................................... 18
2.3.1 Morfologi Teh (Camellia sinensis)… ........................................... 18
2.3.2 Teh Hijau (Camellia sinensis var. assamica) .............................. 19
2.3.3 Taksonomi Teh Hijau (Camellia sinensis var. assamica) ............ 19
2.3.4 Teh Hijau sebagai Antibakteri ..................................................... 20
2.3.4.1 Tanin .............................................................................. 20
2.3.4.2 Katekin (Polifenol) .......................................................... 21
2.3.5 Senyawa Penghambat Biofilm .................................................... 22
2.3.5.1 Tanin .............................................................................. 22
2.3.5.2 Katekin (Polifenol) .......................................................... 22
BAB III KERANGKA KONSEP DAN HIPOTESIS PENELITIAN ............. 23
3.1 Kerangka Konsep ............................................................................... 23
3.2 Hipotesis Penelitian ............................................................................ 25
BAB IV METODE PENELITIAN .............................................................. 26
4.1 Rancangan Penelitian ........................................................................ 26
4.2 Populasi dan Sampel .......................................................................... 26
4.3 Variabel Penelitian .............................................................................. 27
4.3.1 Variabel Bebas ........................................................................... 27
4.3.2 Variabel Terikat .......................................................................... 27
4.4 Lokasi dan Waktu Penelitian ............................................................... 28
4.5 Alat dan Bahan Penelitian ................................................................... 28
4.5.1 Alat dan bahan Pembuatan Ekstrak Daun Teh Hijau................... 28
4.5.2 Alat dan Bahan Identifikasi Bakteri.............................................. 29
4.5.3 Alat dan bahan Deteksi Biofilm.....................................................29
4.6 Definisi Operasional ............................................................................ 30
4.7 Prosedur Penelitian............................................................................. 32
4.7.1 Persiapan Teh Hijau (Camellia sinensis var. assamica) ............. 31
4.7.1.1 Ekstraksi dan Evaporasi....................................................31
4.7.2 Persiapan Bakteri ....................................................................... 31
4.7.2.1 Persiapan Biofilm Escherichia coli.................................... 32
4.7.2.2 Pembuatan Perbenihan Cair Bakteri ............................... 35
4.7.3 Uji Hambat Pembentukan Biofilm pada Escherichia coli..............35
4.7.4 Pengukuran Mean Gray Value..................................................... 38
4.8 Analisis Data.. ..................................................................................... 38
4.9 Rencana Operasional Penelitian...........................................................40
BAB 5 HASIL PENELITIAN DAN ANALISIS DATA ................................ 41
5.1 Hasil Penelitian ................................................................................... 41
5.1.1 Hasil Ekstraksi Daun Teh Hijau (Camellia sinensis var. assamica).
........................................................................................................... 41
5.1.2 Hasil Identifikasi Bakteri ............................................................. 42
5.1.3 Hasil Uji Hambat Pembentukan Biofilm ...................................... 44
5.2 Analisis Data ....................................................................................... 47
5.2.1 Uji Normalitas dan Homogenitas ................................................ 48
5.2.2 Uji Oneway ANOVA ................................................................... 48
5.2.3 Uji Post Hoc ............................................................................... 49
5.2.4 Uji Korelasi Pearson ................................................................... 51
BAB 6 PEMBAHASAN ............................................................................ 53
BAB 7 PENUTUP ..................................................................................... 57
7.1 Kesimpulan ......................................................................................... 57
7.2 Saran .................................................................................................. 57
Daftar Pustaka ......................................................................................... 59
Lampiran .................................................................................................. 68
vi
ABSTRAK
Alvina, Made Kurnia. 2018. Efek Ekstrak Etanol Teh Hijau (Camellia sinensis var. assamica) sebagai Penghambat Pembentukan Biofilm Escherichia coli secara In Vitro. Tugas Akhir, Program Studi Kedokteran, Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya. Pembimbing : (1) Prof. Dr. dr. Noorhamdani AS, DMM, Sp. MK(K) (2) dr. Isngadi, M.Kes, Sp.An.KAO
Escherichia coli adalah bakteri patogen penyebab Urinary Tract Infection (UTI) tersering pada wanita. Bakteri ini merupakan pembentuk biofilm, yang dapat melindungi bakteri dari antimikroba. Teh hijau dalam bentuk minuman digemari oleh masyarakat. Tujuan penelitian ini untuk membuktikan efek ekstrak etanol teh hijau sebagai penghambat pembentukan biofilm pada bakteri E. coli secara in vitro, dengan menggunakan metode dilusi tabung. Foto hasil pengamatan dikuantifikasi menjadi nilai mean gray value. Pada penelitian ini dibuktikan bahwa peningkatan konsentrasi ekstrak berkolerasi positif dengan peningkatan nilai mean gray value, dengan korelasi kuat (korelasi Pearson, p=0,902). Kesimpulan penelitian ini adalah ekstrak etanol teh hijau dapat menghambat pembentukan biofilm Escherichia coli secara in vitro secara signifikan.
Kata kunci: Escherichia coli, teh hijau, biofilm.
7
ABSTRACT
Alvina, Made Kurnia. 2018. Green Tea Ethanol Extract (Camellia sinensis var.
Assamica) Effectivity as an Inhibitor for Biofilm Formation of
Escherichia coli. Final Assignment, Medical Faculty, Brawijaya
University. Pembimbing : (1) Prof. Dr. dr. Noorhamdani AS, DMM, Sp.
MK(K) (2) dr. Isngadi, M.Kes, Sp.An.KAO
Escherichia coli is the most common pathogenic cause of urinary tract infection
(UTI) in women. This bacterium is a biofilm forming, which can protect bacteria
from antimicrobials. Green tea in the form of drinks is favored by the public. The
purpose of this study was to prove the effect of green tea ethanol extract as an
inhibitor of biofilm formation in E. coli bacteria in vitro, using the tube dilution
method. Observed photos are quantified to mean gray values. In this study it was
proved that the increase in the concentration of extracts correlated positively with
an increase in the mean gray value, with a strong exchange (Pearson
occurrence, p = 0.902). This study was conducted in the form of significant in
vitro Escherichia coli biofilm.
Key words: Escherichia coli, green tea, biofilm.
BAB 1
PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang Masalah
Menurut Donlan (2002) biofilm merupakan komunitas kompleks dari sel
permukaan pada mikroba yang berada di dalam matrix polimer yang
mengandung saluran air terbuka. Mikroorganisme yang bertumbuh di dalam
biofilm sangat resisten terhadap agen antimikroba dengan 1 atau lebih
mekanisme. Salah satu bakteri pembentuk biofilm untuk melawan agen
antimikroba adalah Eschericia coli.
Escherichia coli adalah bakteri enterik gram negatif, memberikan hasil
positif pada tes indol, lysine decarboxylase, dan fermestasi manitol, serta
menghasilkan gas dari glukosa. Escherichia coli adalah penyebab tersering dari
infeksi saluran kencing dan bertanggung jawab terhadap 90% dari infeksi saluran
kencing primer pada wanita muda (Brooks et al., 2013). Menurut penelitian yang
dilakukan oleh Soto (2006), kejadian UTI (Urinary Tract Infection) relapse pada
wanita salah satunya dipengaruhi oleh kapasitas dari bakteri Escherichia coli
untuk memproduksi biofilm (Brooks, 2013).
Pada matrix biofilm Escherichia coli ditemukan exopolysaccharides yang
merupakan komponen kunci dari matrix biofilm (Beloin et al., 2010). Formasi
biofilm bakteri ini diregulasi oleh sistem quorum sensing (QS). Quorum sensing
adalah proses komunikasi antar sel pada bakteri yang melibatkan produksi,
pelepasan, dan subsequent sensing dari autoinducer (Miller et al., 2002).
Quorum sensing pada bakteri menghasilkan acyl-homoserine lactone-signaling
molecules untuk berkomunikasi. N acyl-homoserine lactones akan berikatan
dengan molekul reseptor LuxR dan menyebabkan aktivasi pembentukan dimer
atau multimer kompleks LuxRAHL. Kompleks ini berperan sebagai regulator
transkripsi pada gen target sistem quorum sensing (Parsek and Greenberg,
2000). Pembentukan biofilm adalah faktor kunci untuk keberlangsungan hidup
mikroba pada lingkungan-lingkungan yang berbeda, serta menunjukkan mode
perlindungan dari pertumbuhan yang menyebabkan sel-sel dapat bertahan pada
lingkungan yang tidak bersahabat dan menyebar untuk membentuk niche baru
(Stoodley et al., 2004).
Hal yang perlu dilakukan sekarang adalah mencegah pembentukan
biofilm pada bakteri-bakteri patogen manusia, salah satunya Escherichia coli.
Alternatif yang dapat dipilih adalah ekstrak dari tanaman yang potensial.
Kandungan zat aktif yang dapat berperan sebagai antibiofilm adalah katekin
(secara khusus epigallocatechin gallate (EGCG) dan epicatechin gallate (ECG)) ,
yang bekerja dengan cara penetrasi dan interaksi dengan lipid bilayers yang
dapat menurunkan virulensi dan resistensi antibiotik pada bakteri (Taylor et al.,
2005). Katekin terdapat pada daun teh. Menurut data Karori (2007) kandungan
katekin setelah pengolahan paling banyak ditemukan pada teh hijau jika
dibandingkan dengan teh oolong dan teh hitam. Empat kandungan katekin yang
ditemukan pada teh hijau adalah epigallocatechin gallate (EGCG), epicatechin
(EC), epicatechin-3-gallate (ECG) dan epigallocatechin (EGC) (Carbera et al.,
2006; Jigisha et al., 2012). Epigallocatechin gallate merupakan kandungan
terbanyak dengan efek farmakologi menghambat autoinducer pada sistem
quorum sensing (QS).
Terapi terhadap penyakit infeksi saluran kencing oleh bakteri Eschericha
coli yang menghasilkan biofilm akan susah dilakukan, maka dari itu melalui
penelitian ini perlu dibuktikan mengenai efektifitas kandungan katekin yang
spesifik pada teh hijau dalam menghambat pembentukan biofilm pada
Escherichia coli.
1.2 Rumusan Masalah
Berdasarkan uraian di atas maka penelitian ini diajukan untuk menjawab
rumusan masalah sebagai berikut:
Apakah ekstrak daun teh hijau (Camellia sinensis var.assamica) memiliki efek
menghambat pembentukan biofilm pada Escherichia coli secara in vitro?
1.3 Tujuan Penelitian
1.3.1 Tujuan Umum
Membuktikan bahwa ekstrak daun teh hijau (Camellia sinensis
var.assamica) memiliki efek antimikroba sebagai penghambat pembentukan
biofilm pada Escherichia coli secara in vitro
1.3.2 Tujuan Khusus
1. Untuk mengetahui perbedaan hasil dari pemberian masing-masing konsentrasi
ekstrak daun teh hijau (Camellia sinensis var.assamica) dalam menghambat
pembentukan biofilm pada bakteri Escherichia coli secara in vitro.
2. Untuk mengetahui Kadar Hambat Minimal dari ekstrak daun teh hijau
(Camellia sinensis var.assamica) yang dapat menghambat pembentukan biofilm
(MBIC = Minimal Biofilm Inhibitory Concentration) pada bakteri Escherichia coli
secara in vitro.
1.4 Manfaat Penelitian
1.4.1 Manfaat Akademis
1. Dapat digunakan sebagai dasar teori untuk menambah ilmu pengetahuan
dalam bidang kesehatan mengenai manfaat dari ekstrak daun teh hijau (Camellia
sinensis var.assamica) sebagai penghambat pembentukan biofilm pada bakteri
Escherichia coli.
2. Dapat menambah ilmu yang dapat dikembangkan dalam melakukan terapi
terhadap biofilm yang dibentuk oleh Escherichia coli.
1.4.2 Manfaat Praktis
1. Dapat menjadi pilihan terapi adjuvant terhadap infeksi Escherichia coli yang
membentuk biofilm.
2. Dapat meningkatkan kemampuan masyarakat mengenai manfaat minuman
yang mengandung teh hijau.
BAB 2
TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Escherichia coli
Escherichia coli adalah bakteri enterik gram negatif, memberikan hasil
positif pada tes indol, lysine decarboxylase, dan fermestasi manitol, serta
menghasilkan gas dari glukosa (Brooks et al., 2013). Mikroba ini penghuni utama
di usus besar, penyebab utama infeksi saluran kemih dan luka infeksi,
pneumonia, meningitis, serta septisemia (Noorhamdani dkk., 2015).
Perkembangan biofilm pada bakteri Escherichia coli adalah proses yang
kompleks dan menghasilkan struktur yang penting untuk penyakit (Jayaraman et
al., 1999). Matriks-matriks ini terbentuk melalui setidaknya lima tahap
perkembangan yang mencakup (i) pelekatan awal sel planktonik ke permukaan
padat, (ii) transisi dari keterikatan reversibel ke ireversibel, (iii) pengembangan
awal arsitektur biofilm, (iv) pengembangan microcolonies menjadi biofilm matang,
dan (v) dispersi sel dari biofilm untuk kembali ke keadaan planktonic (van Houdt
and Michiels, 2005). Pada uropathogenic Escherichia coli yang ditumbuhkan di
medium yeast extract-Casamino Acids (YESCA) menghasilkan pellicle biofilm
yang mengapung dan dapat dinaikkan dari permukaan broth. Pellicle biofilm ini
bergantung pada serat extracellular curli amyloid (Hung et al., 2013).
2.1.1 Taksonomi Escherichia coli
Escherichia coli termasuk dalam genus Escherichia, dan merupakan
spesies yang bertanggung jawab pada hampir semua infeksi klinis pada genus
ini. Bakteri ini merupakan basil enterik oportunistik yang memfermentasikan
laktosa (Noorhamdani dkk. 2015). Berikut adalah taksonomi dari bakteri E. coli:
(Todar, 2004)
Kingdom : Bacteria
Phylum : Proteobacteria
Kelas : Gamma Proteobacteria
Ordo : Enterobacteriales
Familia : Enterobacteriaceae
Genus : Escherichia
Spesies : E. coli
2.1.2 Karakteristik Bakteri
Escherichia coli adalah bakteri Gram negatif berbentuk batang, tidak
membentuk spora, dan memiliki flagela peritrikus (Noorhamdani dkk., 2015).
Bakteri E. coli merupakan bakteri yang bersifat fakultatif anaerobdan memiliki tipe
metabolisme fermentasi dan respirasi tetapi pertumbuhannya paling banyak di
bawah keadaan anaerob, namun beberapa E. coli juga dapat tumbuh dengan
baik pada suasana aerob (Meng dan Schroeder, 2007).
Enterobacteriaceae termasuk bakteri yang besar dengan panjang 2 – 4
μm dengan sisi yang paralel dan ujung yang membulat. Dinding sel, membran
sel, dan struktur-struktur internalnya secara morfologis mirip di antara bakteri-
bakteri yang termauk Enterobacteriaceae. Komponen dari dinding sel terluarnya
adalah lipopolysaccharide (LPS) disebut juga antigen O, kapsul polisakarida
antigen K, dan flagellar protein antigen H (Sherris, 2011).
Suhu yang baik untuk menumbuhkan E. coli yaitu pada suhu optimal
37°C pada media yang mengandung 1% peptone sebagai sumber nitrogen dan
karbon. Ukuran sel dari bakteri E. coli biasanya berukuran panjang 2,0 –6,0 μm
dan lebar 1,1 – 1,5 μm dengan bentuk sel bulat dan cenderung ke batang
panjang (Melliawati, 2009).
Escherichia coli tumbuh baik pada media yang lazim digunakan. Isolat
dari urin dapat dengan cepat diidentifikasi sebagai E. coli karena kemampuannya
memberikan hemolisis tipe beta pada agar dara, morfologi koloni metallic sheen
pada media diferensial agar EMB dan tes spot indole yang positif (Noorhamdani
dkk., 2015).
2.1.3 Identifikasi Karakteristik Escherichia coli
2.1.3.1 Pewarnaan Gram
Bakteri merupakan mikroorganisme transparan dan tidak berwarna, yang
sulit untuk dilihat secara langsung. Oleh karena itu, diperlukan pewarnaan bakteri
untuk identifikasi bakteri tersebut. Bakteri gram positif dan gram negatif
dipengaruhi oleh struktur dinding sel bakteri. Warna akhir tes pewarnaan gram
untuk bakteri gram negatif adalah merah. Setelah ditentukan jenis gram negatif
atau positif, bakteri kemudian dilihat bentuknya dengan menggunakan mikroskop
(Burton dan Engelkrik, 2004).
2.1.3.2 Koloni pada Agar Eosin Methylene Blue (EMB)
Escherichia coli yang ditanam pada medium agar Eosin Methylene Blue
(EMB), koloninya akan nampak seperti tetesan tinta pada lantai yang disebut
‘metallic sheen’ (Noorhamdani dkk., 2015).
2.1.3.3 Uji Biokimia
Kultur pada media diferensial yang mengandung zat warna khusus dan
karbohidrat, misalnya: medium Eosine-Methylene Blue (EMB), MacConkey, atau
deoksikholat dapat membedakan antara bakteri yang meragikan laktosa (lactose
fermenting) yang koloninya berwarna merah dengan nonlactose-fermenting
bacteria yang koloninya tidak berwarna (pucat). Escherichia coli adalah bakteri
yang meragikan laktosa sehingga koloninya berwarna merah. Pada medium TSI
yang mengandung 0,1% glukosa, 1% sukrosa, 1% laktosa, ferosulfat, ekstrak
jaringan dan indikator pH, apabila hanya glukosa yang diragikan awalnya akan
berwarna kuning lalu berubah menjadi merah, namun apabila laktosa atau
sukrosa yang diragikan slant dan butt tetap berwarna kuning (Noorhamdani dkk.,
2015).
2.2 Biofilm
Biofilm adalah asosiasi mikroorganisme dimana sel mikroba saling
menempel pada permukaan hidup atau tidak hidup di dalam matriks zat polimer
ekstraselular yang diproduksi sendiri. Biofilm bakteri bersifat menular dan bisa
mengakibatkan infeksi nosokomial (Jamal, 2005).
Biofilm memiliki sifat tertentu termasuk adanya gradien nutrisi, gas dan
produk metabolik, kerapatan sel yang relatif meningkat, pengendapan zat
polimer ekstraselular dan tanda bahaya yang berlawanan terhadap pengobatan
antimikroba (McBain, 2009). Pembentukan biofilm sering dianggap sebagai
alasan yang mendasari mengapa pengobatan dengan agen antimikroba gagal
dan diperkirakan 65-80% dari semua infeksi manusia dianggap terkait dengan
biofilm, ini merupakan tantangan serius (Coenye, 2010).
2.2.1 Mekanisme Pembentukan Biofilm
Pembentukan biofilm adalah proses yang sangat kompleks, di mana sel-
sel mikroorganisme berubah dari bentuk pertumbuhan planktonik menjadi sessile
(Okada, 2005). Proses pembentukan biofilm terjadi melalui serangkaian peristiwa
yang menyebabkan adaptasi dalam kondisi gizi dan lingkungan yang beragam
(Hentzer, 2005). Pembentukan biofilm mengikuti langkah-langkah penting (a)
keterikatan pada permukaan (b) pembentukan koloni mikro (c) pembentukan
struktur tiga dimensi (d) pembentukan biofilm, pematangan dan pelepasan
(Costerton, 1999).
Ketika sel bakteri mencapai ke dekat permukaan / pendukung begitu
dekat sehingga gerakannya sangat melambat, ia membuat hubungan yang
reversibel dengan permukaan dan / atau telah menempel pada mikroba lain ke
permukaan. Untuk pembentukan biofilm, sistem antarmuka padat-cair dapat
menyediakan lingkungan ideal bagi mikroorganisme untuk dilekatkan dan
tumbuh (Costerton, 19999). Untuk keterikatan yang paling sering dan
pembentukan biofilm yang kasar, permukaan hidrofilik dan dilapisi akan
memberikan lingkungan yang lebih baik. Keterikatan yang meningkat juga dapat
terjadi karena kenaikan tetapi tidak melebihi tingkat kritis dalam kecepatan aliran,
suhu konsentrasi air atau nutrisi. Kehadiran struktur lokomotor pada permukaan
sel seperti flagella, pili, fimbriae, protein atau polisakarida juga penting dan
mungkin memberi keuntungan dalam pembentukan biofilm saat ada komunitas
campuran (Donlan, 2002).
Pembentukan koloni mikro terjadi setelah bakteri menempel pada
permukaan fisik / jaringan biologis dan pengikatan ini kemudian menjadi stabil
yang berakibat pada pembentukan mikro-koloni. Perkalian bakteri dalam biofilm
dimulai sebagai akibat sinyal kimia. Mekanisme genetik produksi
exopolysaccharide diaktifkan saat intensitas sinyal melewati batas tertentu
(Costerton, 1999). Jadi dengan cara ini menggunakan sinyal kimia tersebut,
pembelahan sel bakteri terjadi di dalam matriks exopolysaccharide yang
tertanam, yang akhirnya menghasilkan pembentukan mikro-koloni (Mckenney,
1998).
Setelah tahap pembentukan koloni mikro biofilm, ekspresi gen terkait
biofilm tertentu terjadi. Produk gen ini dibutuhkan untuk EPS yang merupakan
bahan struktur utama biofilm. Dilaporkan bahwa bakteri dengan sendirinya dapat
memicu pembentukan matriks ekstraselular. Pembentukan matriks diikuti oleh
formasi saluran berisi air untuk pengangkutan nutrisi dalam biofilm. Peneliti telah
mengusulkan agar saluran air ini seperti sistem peredaran darah,
mendistribusikan nutrisi yang berbeda dan membuang bahan limbah dari
masyarakat di koloni mikro biofilm (Parsek, 2003).
Setelah pembentukan biofilm, para peneliti sering memperhatikan bahwa
bakteri meninggalkan biofilm itu sendiri secara teratur. Dengan melakukan ini
bakteri bisa mengalami perbanyakan dan penyebaran yang cepat. Detasemen
sel bakteri planktonik dari biofilm adalah detasemen terprogram, memiliki pola
alami (Costerton, 1999). Terkadang karena beberapa bakteri stres mekanis
terlepas dari koloni ke sekitarnya. Tapi dalam kebanyakan kasus beberapa
bakteri menghentikan produksi EPS dan terlepas ke lingkungan. Penyebaran sel
biofilm terjadi baik dengan memisahkan sel-sel baru yang terbentuk dari sel
tumbuh atau dispersi agregat biofilm karena efek yang mengalir atau karena
quorum sensing (Baselga, 1994).
2.2.2 Pembentukan Biofilm pada Escherichia coli
E. coli adalah spesies yang beragam secara genetis yang menyebabkan
penyakit diare dan berbagai infeksi ekstraintestinal yang memenuhi banyak atau
semua kriteria yang diajukan untuk infeksi terkait biofilm (Kaper, 2004). Pola
kepatuhan bakteri terhadap sel HEP-2 epitel in vitro sesuai dengan yang
ditemukan pada permukaan mukosa pada model hewan dan membedakan
patotipe yang berbeda, seperti pengikatan E. coli secara difus, enteropathogenic
E. coli (EPEC), dan enteroaggregative E. coli (EAggEC). Uropathogenic E. coli
sering diisolasi dari biofilm yang terbentuk di lumen kateter, di mana mereka
melawan pengobatan antibiotik (Nicolle, 2005).
E. coli telah menjadi organisme model gram-negatif penting untuk analisis
in vitro pembentukan biofilm pada permukaan abiotic (O’Toole, 2000). Beberapa
faktor penentu permukaan terlibat dalam pembentukan biofilm seperti:
1. Flagella dan Motilitas
E. coli motil umumnya memperlihatkan beberapa flagella peritrik. Motilitas
terlibat dalam kolonisasi organisme inang atau organ target dan mendorong
kontak sel ke permukaan awal.
2. Fimbriae
Fimbriae adalah salah satu faktor virulen yang terkait dengan adhesi
jaringan inang strain E. coli pathogen (Finley et al., 1997). Di antaranya, fimbriae
tipe 1 adalah yang paling umum di antara E. coli dan memiliki peran penting
dalam keterikatan awal pada permukaan abiotik dalam pembentukan biofilm
(Pratt et al., 1998).
3. Protein Autotransporter
Protein sekretorik ini menyajikan semua persyaratan untuk sekresi di
sitoplasma dan membran luar ke permukaan sel bakteri (Desvaux et al., 2004).
Di antara protein ini Ag43, AIDA (adhesin involved in diffuse adherence) dan
TibA terlibat dalam adhesi. Antigen 43 mempromosikan agregasi sel melalui
interaksi Ag43-Ag43 oleh mekanisme handshake intraselular (Hasman et
al.,1999).
4. Curli
Agregat curli fimbriae pada permukaan sel membentuk struktur diameter
6 sampai 12 nm yang panjangnya bervariasi antara 0,5 dan 1 μm. Serat perekat
Curli juga mempromosikan pembentukan biofilm ke permukaan abiotik baik
dengan memfasilitasi interaksi sel permukaan awal dan interaksi sel-sel
berikutnya (Cookson et al., 2002; Uhlich et al., 2006; Vidal et al., 1998)
5. F Conjugative Pilus
F-pilus mempromosikan adhesi awal dan pematangan biofilm melalui
pelekatan nonspesifik ke permukaan abiotik dan kontak sel-ke-sel berikutnya
yang menstabilkan struktur biofilm (Ghigo et al., 2001; Molin & Tolker-Nielsen,
2003; Reisner et al., 2003).
6. Produksi Eksopolisakarida
Matriks biofilm disusun oleh eksopolisakarida. Matriks ini membentuk
lapisan kental terhidrasi yang melindungi bakteri yang menempel dari
pengeringan dan dari pertahanan inang karena bakteri yang membentuk struktur
ini mungkin tidak dikenali oleh sistem kekebalan tubuh. Matriks juga dapat
dilibatkan dalam perlindungan bakteri terhadap molekul beracun seperti
antimikroba, radikal hidroksil, dan anion superoksida). Matriks biofilm juga dapat
menghambat pencucian enzim, nutrisi, atau bahkan molekul pensinyalan yang
kemudian dapat mengakumulasi secara lokal dan menciptakan lingkungan mikro
yang lebih baik di dalam biofilm (Redfield et al., 2002; Starkey et al., 2004; Welch
et al., 2002). Semua aspek matriks ini dapat berkontribusi terhadap
pengembangan resistensi fenotipik biofilm E. coli patogen dan menyebabkan
infeksi persisten (Anderson et al., 2003; Justice et al., 2004). Selain itu, interaksi
exopolysaccharide dengan komponen matriks lainnya mendukung pertumbuhan
tiga dimensi biofilm (White et al., 2003).
2.2.3 Quorum Sensing
Quorum sensing adalah proses komunikasi sel-sel yang memungkinkan
bakteri berbagi informasi tentang densitas sel dan menyesuaikan ekspresi gen
sesuai dengan itu (Rutherford dan Bassler, 2012). Meskipun ada perbedaan
dalam komponen regulasi dan mekanisme molekuler, semua sistem QS yang
diketahui bergantung pada tiga prinsip dasar. Pertama, anggota komunitas
menghasilkan AI, yang merupakan molekul pensinyalan. Pada kepadatan sel
rendah, AI berdifusi jauh, dan oleh karena itu, ada pada konsentrasi di bawah
ambang batas yang diperlukan untuk deteksi. Pada kepadatan sel tinggi,
produksi kumulatif AI mengarah pada konsentrasi tinggi lokal, memungkinkan
deteksi dan respons (Kaplan dan Greenberg, 1985). Kedua, AI terdeteksi oleh
reseptor yang ada di sitoplasma atau di membran. Ketiga, selain mengaktifkan
ekspresi gen yang diperlukan untuk perilaku kooperatif, deteksi AI menghasilkan
aktivasi produksi AI (Novick et al., 1995; Seed et al., 1995).
Bakteri gram negatif berkomunikasi menggunakan molekul kecil sebagai
AI berupa asyl-homoserine lactones (AHLs) atau molekul lain yang produksinya
bergantung pada S-adenosylmethionine (SAM) sebagai substrat (Wei et al.,
2011).
Populasi bakteri menggunakan QS untuk mengendalikan pembentukan
biofilm, yang memberi anggota populasi nutrisi akses superior sehingga
memungkinkan mereka untuk melawan lingkungan yang tidak menghasilkan
biofilm (Nadell and Bassler, 2011).
2.2.3.1 Quorum Sensing (QS) pada E. Coli
Pada E. coli, aktivitas ekstraselular AI-2 meningkat pada mid- sampai
late-exponential phase dan dengan cepat menurun saat memasuki fase
stasioner (Hardie et al., 2003). Hilangnya aktivitas AI-2 ekstraselular di E. coli
disebabkan oleh serapannya, dilakukan dengan cara diimpor melalui transporter
kaset ATP bernama transporter luxS-regulated (Taga et al., 2003). Protein
transporter adalah bagian dari operon lsr, yang diatur oleh cyclic AMP/ cyclic
AMP receptor protein dan protein yang ditranskripsi dari dua gen, lsrK dan lsrR,
yang terletak tepat di hulu dari lsr dan ditranskripsikan secara berbeda dalam
operon lsrRK miliknya sendiri (Wang et al., 2005). LsrR dan LsrK termasuk di
antara regulator QS positif pertama yang diidentifikasi di E coli (De
Keersmaecker et al., 2006). Fungsi fisiologis yang terkait dengan AI-2
ekstraselular atau sitoplasma dapat ditunjukkan sebagian dengan menggunakan
mutan lsrK dan lsrR. Pada mutan lsrK, ekspresi transporter Lsr ditekan, dan AI-2
tetap berada dalam supernatan (ekstraselular AI-2) (Wang et al., 2005). Pada
mutan lsrR, transporter Lsr diekspresikan, dan AI-2 ekstraselular terus diimpor ke
dalam sel (sitoplasma AI-2), terlepas dari akumulasinya (Taga et al., 2003). lsrR
dan lsrK berfungsi sebagai regulasi ekspresi gen global dan mempengaruhi
arsitektur biofilm melalui regulasi koordinat gen-gen biofilm-related seperti wza
(bertanggung jawab untuk asam kolanik) dan autoaggregation gene flu (Wang et
al., 2005).
E. coli seperti bakteri gram negatif penghasil biofilm lainnya, juga
menggunakan QS untuk mengontrol pembentukan biofilm. Sintesis asam kolanik
diperlukan untuk membentuk EPS selama perkembangan biofilm (Pratt et al.,
1998). Produk gen wza dikaitkan dengan sintesis asam kolanik untuk ekspresi
dan perakitan EPS (Beis et al., 2004). Banyak laporan menggambarkan
pentingnya wza dalam pembentukan biofilm, dan perubahan ekspresi wza
mempengaruhi pembentukan biofilm (Pratt et al., 1998). Hebatnya, gen ini
menginduksi 3,7 - dan 3,5 kali lipat pada mutan lsrR dan lsrK. Juga, regulator
putatif untuk sintesis asam kolanik, wcaA, diinduksi 3,5 kali lipat pada mutan lsrR.
Dua fungsi kunci yang diketahui mempengaruhi pembentukan dan arsitektur
biofilm, sintesis asam kolanik dan pembentukan fimbria, diregulasi oleh gen
regulator QS LsrR dan LsrK. Juga, struktur biofilm diubah secara signifikan pada
mutan lsrR dan lsrK. (Wang et al., 2005).
2.2.4 Uji Pembentukan Biofilm
2.2.4.1 Metode Tabung
Sebuah perulangan organisme uji dari piring kultur semalam diinokulasi
dalam tabung kaca borosilikat yang mengandung 10 ml kaldu kedelai Trypticase
dengan glukosa 1%. Tabung kemudian diinkubasi pada suhu 37 ° C selama 24
jam secara aerob. Setelah inkubasi, tabung dituang dan dicuci dengan garam
penyangga fosfat pada pH 7,3 dan dikeringkan. Tabung kemudian diwarnai
dengan kristal violet (0,1%) selama 15 menit. Pewarnaan itu dituang dan tabung
dicuci dengan air deionisasi dan dikeringkan dalam posisi terbalik. Pembentukan
biofilm dianggap positif saat film yang terlihat melapisi dinding dan bagian bawah
tabung. Pembentukan lapisan bernoda pada antarmuka cairan-udara dianggap
negatif untuk pembentukan biofilm (Ruchi et al., 2015).
2.2.4.2 Metode Congo Red Agar
Metode Congo Red Agar (CRA) adalah metode penyaringan kualitatif
sederhana untuk mendeteksi produksi biofilm. Media yang digunakan terdiri dari
kaldu infus jantung otak (BHI) (37 g / l) ditambah sukrosa (50 g / l), agar No 1
(10g / l) dan Kongo merah (0,8 g / l). First Congo Red stain disiapkan sebagai
larutan berair pekat dan diautoklaf (121ºC selama 15 menit) secara terpisah dari
unsur penyusun media lainnya. Kemudian ditambahkan ke agar infus jantung
otak yang diautoklaf dengan sukrosa pada suhu 55ºC. Pelat CRA diinokulasi
dengan organisme uji dan diinkubasi pada suhu 37 ° C selama 24 jam secara
aerob (Ruchi et al., 2015).
2.2.4.3 Metode Tissue Culture Plate
Perulangan organisme uji terisolasi dari kultur semalam diinokulasi dalam
10 ml kaldu kedelai Trypticase dengan glukosa 1% dan diinkubasi pada suhu 37
° C selama 24 jam. Sumur individu dari kultur jaringan polistirena bawah
polistirena steril yang terbata rata diisi dengan 200ul suspensi bakteri yang
sesuai dengan 0,5 McFarland setelah pengenceran lebih lanjut 1: 100 dengan
media segar bersama dengan organisme kontrol. . Hanya kaldu yang berfungsi
sebagai kontrol untuk memeriksa kemandulan dan pengikat media yang tidak
spesifik. Pelat diinokulasi pada suhu 37 ° C selama 24 jam. Setelah inkubasi, isi
masing-masing sumur dilepaskan dengan penyadapan dan sumur yang lembut
dicuci tiga kali dengan 300 μl larutan garam steril. Bakteri terlampir yang tersisa
tetap panas dengan cara mengeksposnya ke udara panas pada suhu 60 ° C
selama 60 menit. Kemudian pewarna kristal 150 μl (2%) ditambahkan ke masing-
masing sumur. Setelah 15 menit, kelebihan noda dibilas dengan dekantasi, dan
piring dicuci. 150 μl etanol 95% ditambahkan ke masing-masing sumur, dan
setelah 30 menit, kerapatan optik (OD) film bakteri patri ditafsirkan dibaca
dengan menggunakan pembaca piring mikrotiter pada 600nm. Nilai OD dihitung
untuk semua strain yang diuji dan kontrol negatif, nilai cut-off (ODc) telah
ditetapkan. Ini didefinisikan sebagai tiga standar deviasi (SD) di atas mean OD
dari kontrol negatif: ODc = OD rata-rata kontrol negatif + (3 × SD kontrol negatif).
Nilai akhir OD dari strain yang diuji dinyatakan sebagai nilai OD rata-rata
regangan yang dikurangi dengan nilai ODc (OD = rata-rata OD dari regangan -
ODc); Nilai ODc dihitung untuk setiap lempeng microtiter secara terpisah. Ketika
sebuah nilai negatif diperoleh, maka disajikan sebagai Untuk interpretasi hasil
yang lebih mudah, strain dibagi menjadi beberapa kategori berikut:
1. Bukan pembentuk biofilm (0) OD≤Odc
2. Pembentuk biofilm lemah (+ or 1) = ODc<OD≤2×ODc
3. Pembentuk biofilm sedang (++ or 2) = 2×ODc <OD≤4×ODc
4. Pembentuk biofilm kuat (+++or 3), 4×ODc <OD
(Ruchi et al., 2015).
2.3 Teh (Camellia sinensis)
Diproduksi dari daun muda Camellia sinensis L. (Kuntz), teh merupakan
salah satu minuman paling populer di seluruh dunia. Ini dibudidayakan di lebih
dari 30 negara di seluruh dunia, dan jumlah total teh yang diproduksi dan
dikonsumsi di dunia, 78% berkulit hitam, 20% berwarna hijau, dan 2% adalah
oolong (Graham, 1992; Muktar dan Ahmad, 2000).
2.3.1 Morfologi Teh (Camellia sinensis)
Pohon yang tingginya mencapai 20 m bila dibiarkan atau perdu bila
dilakukan pemangkasan terus untuk dipanen daunnya. Berkayu tegak dengan
percabangan banyak, ujung ranting berambut warna cokelat kehijauan. Daun
tunggal, kaku, bentuk bundar telur dengan ujung dan pangkal runcing, tapi
bergigi, permukaan daun mengilap berwarna hijau tua. Bunga tunggal berada di
ketiak daun, warna putih kekuningan, baunya wangi. Buah kotak, keras, warna
cokelat kehitaman kalau sudah tua (Hidayat dan Napitupulu, 2015).
2.3.2 Teh Hijau (Camellia sinensis var.assamica)
Komposisi kimiawi teh hijau kompleks: protein (15- 20% berat kering)
yang enzimnya merupakan fraksi penting; aminoasida (1-4% berat kering) seperti
teanine atau 5-Nethylglutamine, asam glutamat, triptofan, glisin, serin, asam
aspartat, tirosin, valin, leusin, treonin, arginin, lisin; karbohidrat (5-7% berat
kering) seperti selulosa, pektin, glukosa, fruktosa, sukrosa; lipid sebagai linoleat
dan? asam linolenat; sterol sebagai stigmasterol; vitamin (B, C, E); dasar xantik
seperti kafein dan teofilin; pigmen sebagai klorofil dan karotenoid; senyawa volatil
seperti aldehida, alkohol, ester, lakton, hidrokarbon, dll; mineral dan elemen jejak
(5% berat kering) seperti Ca, Mg, Cr, Mn, Fe, Cu, Zn, Mo, Se, Na, P, Co, Sr, Ni,
K, F dan Al. Karena pentingnya kehadiran mineral dalam teh, banyak penelitian
telah dilakukan untuk menentukan kadar daun teh hijau dan infusnya (Costa et
al., 2002).
2.3.3 Taksonomi Teh Hijau (Camellia sinensis var. assamica)
Taksonomi dari tanaman teh hijau (Camellia sinensis var. assamica)
sebagai berikut:
Kerajaan : Plantae
Divisi : Magnoliophyta
Kelas : Magnoliopsida
Ordo : Ericales
Famili : Theaceae
Genus : Camellia
Spesies : Camellia sinensis
Varietas : var. Assamica
(Syamsulbahri, 1996)
2.3.4 Teh Hijau sebagai Antibakteri
Komposisi kimia dari daun teh telah dicatat dengan baik. Komponen
utama dari daun teh adalah polyphenol (Balentine et al., 1997). Katekin polifenol
teh hijau, khususnya (-) - epigallocatechin gallate (EGCg) dan (-) - epicatechin
gallate (ECg), dapat menghambat pertumbuhan berbagai jenis bakteri Gram
positif dan Gram-negatif dengan potensi sedang (Taylor et al., 2005).
Komponen katekin teh hijau bertanggung jawab atas aktivitas antibakteri,
serta EGC, EGCg dan ECg merupakan agen antibakteri yang paling penting
(Yam et al., 1997; Hara, 2001). Konsentrasi EGCg yang tinggi secara ireversibel
merusak membran sitoplasma bakteri, dengan dasar liposom fosfatidil kolin
membocorkan pewarna fluorescent setelah terpapar ke senyawa tersebut (Ikigai
et al., 1993). Kerusakan membran sitoplasma dihasilkan dari pembentukan
hidrogen peroksida oleh EGCg di dalam bilayer (Arakawa et al., 2004).
2.3.4.1 Tanin
Tanin adalah polifenol yang larut dalam air yang berbeda dari
kebanyakan senyawa fenolik alami lainnya dalam kemampuannya untuk
mengendapkan protein seperti gelatin dari larutan (Spencer et al., 1988). Asam
tannic mengkelat besi dari medium, sehingga tidak tersedia untuk
mikroorganisme. Besi sangat penting untuk kebanyakan bakteri patogen dan
asam tannic menunjukkan tiga kali lebih banyak afinitas untuk besi daripada E.
coli (Chung et al., 1998).
2.3.4.2 Katekin (Polifenol)
Katekin bekerja pada bakteri, enzim, dan toxin hemolitik menandakan
katekin menonaktifkan protein (Okubo et al., 1989). Katekin memiliki berbagai
potensi antimikroba terhadap mikroorganisme resisten dengan cara mengganggu
membran sel, menghambat biosintesis konstituen sel, pensinyalan sel atau
kerusakan DNA (Sharangi, 2009). Bakterisidal dari EGCg menghancurkan
membran liposom dan menyebabkan pelepasan carboxyfluorescein
intraliposomal. Penghancuran membran ini memulai penetrasi katekin ke bagian
dalam sel (Ikigai et al., 1992). EGCG juga menghambat aktivitas penisilinase
peptidoglikan dari membran sel bakteri dengan mengikatnya baik secara
langsung maupun tidak langsung, sehingga menjaga penisilin agar tidak
terinaktivasi (Zhao et al., 2002). EGCG dapat menyebabkan kematian sel bakteri
dengan menghambat DNA gyrase bakteri, sehingga mencegah DNA supercoiling
(Gradisar et al., 2007). DHFR adalah enzim kunci yang mengurangi 7,8-
dihidrofolat (DHF) sampai 5,6,7,8-tetrahidrofolat (THF). Reaksi reduksi
bergantung NADPH ini terlibat dalam biosintesis nukleotida. EGCG menunjukkan
aktivitas antifolat terhadap DHFR dan karenanya menyebabkan terganggunya
sintesis DNA (Gordon et al., 2010; Navarro-Martínez et al., 2005).
2.3.5 Senyawa Penghambat Biofilm
2.3.5.1 Tanin
Tanin menghambat sinyal pada mekanisme quorum sensing dengan cara
berikatan kuat dengan molekul protein sehingga menghasilkan ikatan silang
(Ahadi, 2003) walaupun efek yang ditimbulkan tidak signifikan (Huber, 2003).
Tanin merupakan salah satu kelompok terbesar polifenol tanaman. Mereka
dikelompokkan menjadi tanin kental (proanthocyanidins atau katekin) dan tanin
terhidrolisis (gallotannins dan ellagitannins) (Nagy et al., 2011)
2.3.5.2 Katekin (Polifenol)
Senyawa EGCG dalam polifenol mampu menghambat biofilm pada E. coli
dengan cara menurunkan pertumbuhan sel pada dosis tinggi dan menginhibisi
quorum sensing. dengan pemberian sampai dosis tertentu, EGCG dapat
mereduksi intensitas sinyal pada quorum sensing bakteri hingga 50% (Maeyama
et al., 2005).
EGCG pada dosis tertentu menghambat morfogenesis koloni dengan
kuat. Pengurangan biofilm yang jelas diamati pada konsentrasi EGCG serendah
12,5 μg / ml, sedangkan pengurangan pertumbuhan koloni memerlukan
setidaknya 20 kali lipat konsentrasi EGCG yang lebih tinggi dan juga MIC selama
pertumbuhan di media cair adalah> 400 μg / ml (Lee et al., 2009).
BAB 3
KERANGKA KONSEP DAN HIPOTESIS PENELITIAN
3.1 Kerangka Konsep
Ekstrak Teh Hijau (Camellia sinensis var.
assamica)
Membentuk lapisan
monolayer labil
Membentuk suatu
mikrokoloni
Mekanisme QS untuk komunikasi
Biofilm
Perubahan sel
planktonik menjadi sel
penghasil biofilm
Membentuk
EPS
Katekin
Tanin
Bagan 3.1 Kerangka Konsep dan Hipotesis Penelitian
: Proses pembentukan biofilm
: Mengandung
: Menghambat
: Variabel yang diteliti
: Variabel yang tidak diteliti
Bakteri Escherichia coli mencapai jumlah yang cukup untuk menimbulkan
infeksi sehingga menjadi sel planktonik (sel bebas). Lalu E. coli berkumpul untuk
membentuk biofilm. Pembentukan biofilm E. coli dimulai dari perubahan sel
planktonik menjadi sel pembentuk biofilm (fenotipik). Setelah itu, perlekatan
bakteri E. coli tersebut membentuk lapisan monolayer yang masih bersifat
sementara. Bersamaan dengan itu, untuk perlekatan permanen, bakteri E. coli
membentuk matriks EPS yaitu suatu perekat yang melekatkan bakteri pada satu
permukaan dan melekatkan satu sama lain pada monolayer yang menjadi tempat
sel bakteri melekat. Setelah bakteri E. coli melekat secara permanen, akan
terbentuk mikrokoloni yang selanjutnya diikuti dengan pengembangan dan
maturasi biofilm bakteri E. coli melalui mekanisme quorum sensing.
Pada penelitian ini, variabel yang diteliti adalah ekstrak teh hijau dan
biofilm bakteri E. coli. Ekstrak teh hijau dengan kandungan tanin dan katekin
(yang ditunjukkan dengan panah berwarna biru), bersinergi untuk menghambat
pembentukan biofilm. Katekin menghambat pembentukan biofilm melalui dua
mekanisme, yaitu menghambat EPS dan menghambat AHLs dan AI-2 agar tidak
berkomunikasi. Tanin membantu kerja katekin pada penghambatan AHLs dan AI-
2 agar tidak saling berkomunikasi. Dari kerja tanin dan katekin pada ekstrak teh
hijau ini, maka pembentukan biofilm E. coli akan terhambat.
3.2 Hipotesis Penelitian
Ekstrak daun teh hijau (Camellia sinensis var.assamica) memiliki efek
menghambat pembentukan biofilm pada Escherichia coli secara in vitro.
BAB 4
METODE PENELITIAN
4.1 Rancangan Penelitian
Dalam penelitian ini metode yang digunakan adalah true eksperimental
Escherichia coli dengan design post-test only control group design dan metode
tabung. Kelompok kontrol adalah kelompok yang tidak mendapat perlakuan
berupa pemberian ekstrak. Kelompok perlakuan adalah kelompok yang
mendapat perlakuan berupa pemberian ekstrak dengan konsentrasi 3,125%,
6,25%, 12,5%, 25%, 50%, dan 100%. Penelitian inti dilakukan dengan
konsentrasi 0%, 7,5%, 10%, 12,5%, 15%, 17,5%, dan 20%.
4.2 Populasi dan Sampel
Penelitian ini menggunakan sampel Escherichia coli pembentuk biofilm.
Sampel ini diperoleh dari isolat Escherichia coli pembentuk biofilm yang didapat
dari stok kultur laboratorium mikrobiologi Fakultas Kedokteran Universits
Brawijaya. Jumlah pengulangan penelitian dihitung dengan rumus sebagai
berikut (Notobroto, 2005):
(p-1) (n-1) ≥ 15
(7-1) (n-1) ≥15
6n-6 ≥15
6n ≥21
n ≥3,5
n = 4
Keterangan:
n = jumlah pengulangan tiap perlakuan
p = jumlah perlakuan (dosis ekstrak teh hijau): 0 (kontrol), 7,5%, 10%,
12,5%, 15%, 17,5%, dan 20% = 7 perlakuan
Berdasarkan perhitungan di atas, maka besar sampel atau pengulangan
yang diperlukan dalam penelitian ini paling sedikit adalah 4.
4.3 Variabel Penelitian
4.3.1 Variabel Bebas
Variabel bebas adalah variabel yang disengaja atau ditentukan, dan
dipelajari pengaruhnya terhadap variabel terikat. Variabel bebas pada penelitian
ini adalah ekstrak daun teh hijau (Camellia sinensis var. assamica) dengan
konsentrasi 0%, 7,5%, 10%, 12,5%, 15%, 17,5%, dan 20% (Matthew, 2016).
4.3.2 Variabel Tergantung
Variabel tergantung adalah variabel yang dipikirkan sebagai akibat atau
keadaannya tergantung dari variabel-variabel lain. Variabel tergantung pada
penelitian ini adalah ketebalan biofilm bakteri Escherichia coli pembentuk biofilm
untuk menentukan Kadar Hambat Biofilm Minimal (KHBM).
4.4 Lokasi dan Waktu Penelitian
Ekstraksi bahan penelitian dilakukan di Politeknik Negeri Malang
pada bulan Maret 2018 dan penelitian ini dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi
Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya Malang pada rentang waktu Februari
– April 2018
4.5 Alat dan Bahan Penelitian
4.5.1 Alat dan Bahan Pembuatan Ekstrak Daun Teh Hijau
1. Daun teh hijau (Camellia sinensis var.assamica)
2. Etanol 96%
3. Timbangan analitik
4. Gelas kimia 250 ml
5. Sokhet
6. Cawan petri
7. Penjepit cawan petri
8. Desikator
9. Spatula
10. Pemanas aquades
11. Kertas saring
12. Thimble
13. Oven
4.5.2 Alat dan Bahan Identifikasi Bakteri
1. Isolat Escherichia coli
2. Bahan pengecatan Gram: lugol,kristal violet, safranin, dan alkohol 96%
3. Minyak imersi, mikroskop, dan ose
4. Medium agar Eosin Methylene Blue (EMB)
5. Lampu spiritus
6. Tabung reaksi
4.5.3 Alat dan Bahan Deteksi Biofilm
1. TSB + glycerol 10%
2. Biakan Escherichia coli pembentuk biofilm
3. Tabung reaksi
4. Phosphate Buffer Saline (PBS) pH 7,3
5. Deionized water
6. Kristal violet
7. Pipet
8. Ose
9. Beaker glass
10. Inkubator
4.6 Definisi Operasional
1. Escherichia coli adalah bakteri gram negatif penyebab tersering dari infeksi
saluran kencing pada wanita. Sampel ini diperoleh dari isolat Escherichia coli
pembentuk biofilm yang didapat dari stok kultur laboratorium mikrobiologi
Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya
2. Biofilm adalah agregat multiseluler yang akan membentuk lapisan padat pada
permukaan suatu substrat atau medium. Pada penelitian ini biofilm dibentuk oleh
Escherichia coli dengan medium tabung.
3. Ekstrak teh hijau adalah hasil ekstraksi cair teh hijau dengan pelarut etanol.
Ekstrak yang didapat dianggap memiliki kandungan ekstrak sebesar 100%. Teh
hijau berasal dari Materia Medika.
4. Metode tabung adalah metode deteksi biofilm dengan menggunakan tabung
sebagai medium yang bersifat kualitatif.
5. Minimum Biofilm Inhibitory Concentration (MBIC) adalah konsentrasi ekstrak
teh hijau terendah yang mampu menghambat pembentukan biofilm yang ditandai
dengan terjadinya penipisan bentuk cincin dan lapisan ungu kebiruan yang
terdapat pada dinding dan dasar tabung.
6. Mean Gray Value adalah acuan skala intensitas warna yang terdapat pada
program Adobe Photoshop CS6. Skala berkisar antara 0-255. Angka mendekati
0 menunjukkan kepekatan warna yang tinggi. Sedangkan angka mendekati 255
menunjukkan kepekatan warna yang rendah (Andriyani, 2014).
4.7 Prosedur Penelitian
4.7.1 Persiapan Teh hijau (Camellia sinensis var. assamica)
4.7.1.1 Ekstraksi dan Evaporasi
1. Menggunakan 100 gr daun kering teh hijau (Camellia sinensis var.
assamica) dicuci bersih dan dikeringkan, kemudian di oven dengan suhu
40º-60º sehinggakandungan airnya berkurang.
2. Kemudian, daun teh hijau yang kering tersebut di blender menjadi
sediaan bubuk, kemudian dimasukkan kedalam gelas Erlenmeyer ukuran
1L lalu direndam dengan etanol 96% sampai volume 1L, kemudian
dikocok sampai benar – benar tercampur, kurang lebih 30 menit dan
diamkan satu malam sampai mengendap.
3. Setelah satu malam, diambil lapisan atas campuran etanol 96% dengan
zat aktif yang sudah terambil, proses ini dilakukan sampai sebanyak 3 kali
dan dilanjutkan dengan proses evaporasi.
4. Memasang evaporator set pada tiang permanen agar dapat digantung
dengan kemiringan 30º-40º terhadap meja dengan susunan dari bawah
ke atas alat pemanas air, labu penampung hasil evaporasi, rotatory
evaporator dan tabung pendingin.
5. Kemudian air dingin yang terhubung dengan bak penampung air dingin
melalui selang plastik.
6. Hasil maserasi dimasukkan dalam labu evaporasi sedangkan rotatory
evaporator, alat pompa sirkulasi air dingin dan alat pompa vakum
dinyalakan.
7. Pemanas aquades juga dinyalakan sehingga hasil ekstraksi dalam tabung
penampung evaporasi mendidik sampai dengan suhu 78ºC (sesuai titik
didih etanol 96%) dan etanol 96% mulai menguap.
8. Hasil penguapan etanol 96% dikondensasikan menuju labu penampung
etanol 96% menuju labu penampung etanol 96% sehingga tidak
tercampur hasil evaporasi dan uap lain tersedot pompa vakum.
9. Proses evaporasi dilakukan hingga volume hasil ekstraksi berkurang dan
menjadi kental. Setelah kental evaporasi dihentikan dan hasil evaporasi
diambil. Hasil evaporasi ditampung dalam cawan penguap kemudian di
oven selama kurang lebih 1,5 sampai 2 jam untuk menguapkan pelarut
yang tersisa. Setelah itu kita dapatkan hasil ekstraksi sebanyak 15 mL.
(Sudarmadji et al., 2003).
4.7.2 Persiapan Bakteri
4.7.2.1 Identifikasi Bakteri
A. Pemeriksaan Mikroskopis
Pembentukan sediaan slide
1. Object glass dibersihkan dahulu dengan kapas, dilanjutkan fiksasi
dengan dilewatkan di atas api dan biarkan dingin sehingga object
glass menjadi steril dari bahan pencemar lain. Kemudian pembuatan
sediaan yang tidak terlalu tebal dan tidak terlalu tipis dengan cara:
2. Teteskan satu ose aquades steril pada gelas objek. Ambil sedikit
biakan kuman menggunakan ose, kemudian suspensikan dengan
aquades pada gelas objek dan ratakan. Khusus sediaan cair tidak
perlu disuspensikan dengan aquades.
3. Biarkan sediaan kering di udara, kemudian lakukan fiksasi dengan
cara melewatkan sediaan di atas api satu atau dua kali (Forbes et al.,
2007).
B. Pewarnaan Gram
1. Tuang sediaan pada gelas objek dengan kristal violet dengan durasi
1 menit. Buang sisa kristal violet dan bilas dengan air.
2. Tuang sediaan dengan lugol selama 1 menit. Buang sisa lugol dan
bilas dengan air.
3. Tuang sediaan dengan alkohol 96% selama 5-10 detik atau sampai
warna cat luntur. Buang sisa alkohol dan bilas lagi dengan air.
4. Tuang sediaan dengan safranin selama ½ menit. Buang sisa safranin
dan bilas lagi dengan air.
5. Keringkan sediaan dengan kertas penghisap.
6. Lihat di bawah mikroskop dengan lensa objektif perbesaran 100x
(Cahyani, 2013).
C. Perbenihan Pada Agar Eosin Methylene Blue (EMB)
Escherichia coli yang ditanam pada medium agar Eosin Methylene Blue
(EMB), koloninya akan nampak seperti tetesan tinta pada lantai yang
disebut ‘metallic sheen’ (Noorhamdani dkk., 2015).
Pembiakan Bakteri Pada Medium EMB
1. Coretkan bakteri menggunakan metode quadrant streak pada medium
EMB.
2. Sediaan diinkubasi dengan suhu 37°C selama 18-24 jam.
3. Koloni bakteri Escherichia coli pada medium EMB menghasilkan
gambaran hijau metalik.
D. Microbact 12A
Uji biokimia menggunakan Microbact 12A meliputi beberapa prosedur uji
antara lain:
1. Satu koloni bakteri yang telah diinkubasi selama 18-24 jam diambil
dengan menggunakan ose kemudian dilarutkan ke dalam 3-5 ml
garam fisiologis dalam tabung reaksi steril hingga homogen.
2. Larutan bakteri yang telah homogen dimasukkan ke dalam sumur
Microbact 12A sebanyak 100µL atau 4 tetes. Untuk sumur lysin,
ornitin dan H2S ditambahkan larutan mineral oil sebanyak 1-2
tetes. Setelah itu, Microbact 12A diinkubasi pada suhu 37ºC
selama 18-24 jam.
3. Microbact 12A yang telah diinkubasi kemudian diberikan reagent
pada sumur nomor 8 dengan indol kovact sebanyak 2 tetes,
sumur nomor 10 dengan VP I dan VP II masing-masing 1 tetes,
dan sumur nomor 12 dengan TDA sebanyak 1 tetes.
4. Evaluasi hasil dilihat melalui sumur-sumur Microbact 12A apakah
positif atau negatif dengan cara membandingkan dengan tabel
warna dan hasilnya ditulis pada formulir Patent Record.
5. Angka-angka oktaf didapatkan dari penjumlahan reaksi positif dari
tiap-tiap kelompok (3 sumur didapatkan 1 angka oktaf).
6. Nama bakteri dilihat dengan computer berdasarkan angka oktaf
yang keluar.
4.7.2.2 Pembuatan Perbenihan Cair Bakteri
1. Beberapa koloni bakteri Escherichia coli dipindahkan ke broth
menggunakan ose, kemudian dilakukan spektrofotometri dengan panjang
gelombang 625 nm untuk mengetahui nilai absorbansi dan suspensi.
2. Untuk mendapatkan suspensi bakteri uji dengan konsentrasi bakteri
sebesar /mL yang setara dengan OD = 0,1 maka dilakukan perhitungan
sebagai berikut
N1 X V1 = N2 X V2
Keterangan:
V1 = Volume bakteri yang akan ditambah pengencer
N1 = Nilai absorbansi suspensi (hasil spektrofotometri)
V2 = Volume suspensi bakteri uji (10 mL)
N2 = OD (0,1 = setara dengan /mL
3. Sehingga diperoleh volume (mL) bakteri yang akan ditambah pengencer
untuk mendapatkan bakteri dengan konsentrasi /ml sebanyak 10 mL.
4. Setelah diperoleh suspensi bakteri dengan konsentrasi /mL sebanyak
10 mL, dilakukan pengenceran sebanyak 100 kali dengan menggunakan NaCl
dan nutrient broth, sehingga konsentrasi bakteri menjadi /mL. Kini bakteri
telah siap digunakan untuk penelitian.
4.7.3 Uji Hambat Pembentukan Biofilm pada Escherichia coli
a. Uji Hambat Pembentukan Biofilm
1. Menyiapkan perbenihan cair bakteri dengan kepadatan 106
CFU/ml.
2. Membuat suspensi bakteri dalam medium TSB + glycerol 10%
berdasarkan perhitungan OD dari spektrofotometri.
3. Mengisi tabung reaksi 1-6 dengan suspensi bakteri dalam medium
TSB + glycerol 10% 2 ml, dan tabung kontrol diisi 4 ml.
4. Mencampurkan 2 ml larutan ekstrak dalam tiap tabung kecil ke
dalam tabung reaksi 1-6 sehingga didapatkan larutan sebanyak 4
ml dengan konsentrasi ekstrak daun teh hijau pada masing-
masing tabung sebagai berikut:
Tabung 1: 0% (kontrol) Tabung 4: 12,5% Tabung 7 : 100%
Tabung 2: 3,125% Tabung 5: 25%
Tabung 3: 6,25% Tabung 6: 50%
5. Mengisi tabung reaksi 1 – 7 dengan suspensi bakteri dari medium
TSBglu dan ekstrak.
6. Menginkubasi keenam tabung selama 24 jam dengan suhu 37ºC.
7. Mengeluarkan tabung dari inkubator setelah 24 jam dan mencuci
dengan PBS (pH 7,3) serta mengeringkan airnya. Memberikan
kristal violet (0,1%) 0,5 ml. Kemudian, membuang kelebihan
warna dan mencuci tabung dengan deionized water.
8. Tabung dikeringkan. Segera amati dan catat biofilm yang
terbentuk (Cahyani, 2013). Dapat terlihat sebuah film melapisi sisi
dan dasar tabung. Hal ini diyakini sebagai indikasi pembentukan
biofilm. Jumlah biofilm dinilai sebagai 0 = tidak ada, 1 = lemah, 2 =
sedang atau 3 = kuat (Praharaj et al., 2013).
b. Penelitian Inti
1. Ekstrak teh hijau (Camellia sinensis var. assamica) yang kental
diambil sebanyak 1 gr dan dicampur dengan NaCl sebanyak 1 ml,
sehingga didapatkan ekstrak teh hijau dengan konsentrasi 50%.
2. Menyiapkan perbenihan cair bakteri dengan kepadatan 106 CFU/ml.
3. Membuat suspensi bakteri dalam medium TSBglu berdasarkan OD
dari spektofotometri.
4. Menyiapkan tujuh tabung steril yang akan diisi dengan bakteri dan
konsentrasi ekstrak yang ditentukan setelah uji pendahuluan, yaitu
0% (kontrol); 7,5%; 10%; 12,5%; 15%; 17,5%; 20%.
5. Mengisi tabung reaksi 1 – 7 dengan suspensi bakteri dari medium
TSBglu dan ekstrak etanol daun teh hijau.
6. Kemudian keenam tabung tersebut diinkubasi dalam inkubator
selama 24 jam pada suhu 37ºC.
7. Setelah 24 jam, keenam tabung tersebut dicuci dengan larutan PBS
(pH 7,3), lalu dikeringkan.
8. Setelah kering, seluruh tabung dicat dengan kristal violet 0,1%
sebanyak 4ml atau hingga larutan kristal violet mengisi lebih tinggi
dari batas larutan yang telah dibentuk pada masing – masing tabung.
Diamkan selama 15 menit, kemudian buang larutan kristal violet dan
cuci dengan air, kemudian dikeringkan.
9. Semua buangan dari tabung dimasukkan ke dalam lisol.
Pembentukan biofilm dapat diamati pada area airfluid border (area
antara medium cair dan udara).
4.7.4 Pengukuran Mean Gray Value
Hasil pembentukan biofilm pada tabung kemudian difoto dengan
menggunakan kamera digital. Untuk mengetahui intensitas warna pada area
cincin dan dinding tabung pada masing-masing kelompok maka digunakan
program aplikasi Adobe Photoshop CS6. Mean Gray Value yang dinyatakan
dalam skala 0 – 255. Semakin rendah nilai Mean Gray Value menunjukkan
intensitas warna yang semakin tebal, sementara semakin tinggi nilai Mean Gray
Value menunjukkan intensitas warna yang semakin tipis. Langkah-langkah
dimulai dengan membuka aplikasi Adobe Photoshop CS6, pilih File dan
masukkan hasil fotonya. Selanjutnya pilih tab Wndow dan pilih Measurement
Log, blok area yang akan dilihat intensitas warnanya dengan menggunakan
Rectangular Marquee Tool, lalu klik Record Measurements maka akan
didapatkan nilai Mean Gray Value yang merupakan rata-rata dari intensitas
warna pengecatan tabung (Andiyani, 2014).
4.8 Analisis Data
Analisis hasil penelitian menggunakan analisis statistik SPSS versi 15.0
untuk Windows. Langkah pertama, hasil Mean Gray Value dianalisis dengan
menggunakan uji Kolmogorov-Smirnov. Uji ini merupakan bagian dari teknik
pengujian normalitas suatu distribusi data. Uji normalitas data adalah hal yang
lazim dilakukan sebelum sebuah metode statistik. Uji normalitas ini merupakan
salah satu bagian dari uji persyaratan analisis data atau biasa disebut asumsi
klasik. Tujuan uji normalitas adalah untuk mengetahaui apakah distribusi sebuah
data mengikuti atau mendekati distribusi normal, yakni distribusi data yang
mempunyai pola seperti distribusi normal. Pada aplikasinya, uji ini guna
mengetahui korelasi antara peningkatan konsentrasi ekstrak teh hijau terhadap
ketebalan yang terdeteksi melalui Mean Gray Value. Kemudian analisis data
menggunakan program SPSS (Statistical Product of Service Solution) versi 13.0
(Dahlan, 2009).
4.9 Rencana Operasional Penelitian
Bagan 4.1 Alur Kerja Penelitian
Escherichia coli
Identifikasi Bakteri:
1. Pewarnaan Gram
2. Perbenihan pada media
spesifik agar Eosin
Methylene Blue (EMB)
3. Microbact 12A
Simpan dalam
media TSB +
glycerol 10%
Kultur selama 24 jam
(sebanyak 40 µL)
Ekstrak daun teh hijau
(Camellia sinensis var.
assamica) metode: maserasi
Pemberian konsentrasi
ekstrak 0%, 7,5%, 10%,
12,5%, 15%, 17,5%, dan 20%
dengan 4 kali pengulangan
Pengamatan pembentukan biofilm dengan metode tabung:
1. Inkubasi pada 37ºC selama 24 jam
2. Cuci dengan PBS (pH 7,3) 3. Cat dengan kristal violet
0,1% 4. Cuci dengan air
biasa/deionized water
Hasilnya difoto dengan kamera digital
Ukur Mean Gray Value dengan Adobe Photoshop CS6
Analisis data dengan SPSS for Windows 13.0
BAB 5
HASIL PENELITIAN DAN ANALISIS DATA
5.1 Hasil Penelitian
5.1.1 Hasil Ekstraksi Daun Teh Hijau (Camellia sinensis var. assamica)
Sebanyak 100 gram daun teh hijau digunakan untuk membuat ekstrak.
Pertama, daun teh hijau kering dicuci hingga bersih. Lalu dikeringkan dengan
oven suhu 80ºC selama kurang lebih 2 hari. Setelah proses pengeringan, daun
teh dijadikan bentuk serbuk. Selanjutnya tahap ekstraksi, yaitu merendam serbuk
daun teh dalam etanol 96%. Sisa pelarut pada ekstrak dihilangkan dengan cara
dioven pada suhu 70º-80ºC hingga diperoleh hasil bobot konstan ekstrak.
Gambar 5.1 Hasil Akhir Ekstrak Etanol Daun Teh Hijau (Camellia sinensis var. assamica) pada Botol
Keterangan: tanda panah menunjukkan cairan ekstrak teh hijau berwarna hijau tua kehitamanan dan pekat
5.1.2 Hasil Identifikasi Bakteri
Bakteri yang digunakan merupakan bakteri Escherichia coli. Identifikasi
ulang bakteri ini diawali dengan metode pewarnaan Gram, penanaman pada
media Eosin Methylene Blue Agar, dan MicrobactTM. Pewarnaan Gram
menunjukkan hasil berupa bakteri Gram negatif dengan bentuk batang.
Perbenihan pada media EMB menunjukkan pertumbuhan koloni bakteri
berwarna green metallic sheen. Bakteri Escherichia coli spesifik tumbuh
berwarna green metallic sheen pada EMB.
Uji biokimia dengan menggunakan MicrobactTM dilakukan untuk
konfirmasi lebih lanjut dan didapatkan hasil 94,50% Escherichia coli, sesuai pada
Gambar 5.4. Hasil ini memperkuat kesimpulan bahwa bakteri biakan yang diteliti
merupakan bakteri Escherichia coli.
Gambar 5.2 Hasil Pewarnaan Gram Bakteri Escherichia coli Keterangan: tanda panah menunjukkan bentukan bakteri gram negatif berbatang pendek
dan berwarna merah pada pembesaran 1000 kali.
Gambar 5.3 Hasil Perbenihan Bakteri Escherichia coli pada media EMB Keterangan: Koloni Escherichia coli yang menunjukkan metallic sheen pada media EMB
Gambar 5.4 Hasil MicrobactTM
pada Bakteri Escherichia coli Keterangan: tanda panah menunjukkan hasil uji bakteri Escherichia coli dengan
MicrobactTM
94,50%
5.1.3 Hasil Uji Hambat Pembentukan Biofilm
Uji pendahuluan dilakukan terlebih dahulu untuk menentukan konsentrasi
yang akan diteliti. Konsentrasi yang digunakan pada uji pendahuluan adalah
0%; 3,125%; 6,25%; 12,5%; 25%; 50%; dan 100%. Hasil uji pendahuluan
menunjukkan bahwa pada konsentrasi 12,5% dan 25% sudah tidak ditemukan
adanya pembentukan cincin biofilm pada area airfluid border. Berdasarkan hasil
tersebut ditentukan konsentrasi yang akan digunakan pada penelitian
sesungguhnya (penelitian inti) yaitu 0%; 7,5%; 10%; 12,5%; 15%; 17,5%; dan
20%. Konsentrasi 0% merupakan kelompok kontrol yang menggunakan NaCl
tanpa pemberian ekstrak.
Pengamatan dilakukan terhadap intensitas cincin yang terbentuk pada
airfluid border yang menandakan terbentuknya biofilm. Gambaran cincin difoto
menggunakan kamera digital, kemudian dilakukan kuantifikasi dengan melihat
Mean Gray Value menggunakan aplikasi Adobe Photoshop CS6 yang
dinyatakan dalam skala 0 – 255. Pengukuran Mean Gray Value juga dilakukan
pada tabung yang masih baru untuk melihat nilai awal Mean Gray Value tabung
kosong untuk tabung yang digunakan. Apabila Mean Gray Value pada kelompok
perlakuan lebih kecil 10% dari Mean Gray Value tabung kosong yang masih
baru, maka konsentrasi pada kelompok tersebut merupakan Kadar Hambat
Biofilm Minimal (KHBM). Pada penelitian ini, tabung kosong yang digunakan
menunjukkan nilai Mean Gray Value sebesar 160,12. Nilai ini kemudian
dibandingkan dengan nilai Mean Gray Value kelompok perlakuan, seperti
terlihat pada tabel 5.1, Gambar 5.6 dan 5.7.
Tabel 5.1 Hasil Pengukuran Mean Gray Value dengan Aplikasi Adobe
Photoshop CS6
Konsentrasi Pengulangan
Mean ± SD I II III IV
0% 70,68 58,54 52,33 91,93 68,37 ± 17,46
7,50% 85,95 60,06 84,27 95,45 81,34 ± 15,07
10% 98,96 78,22 87,21 110,76 93,79 ± 14,15
12,50% 105,33 96,96 96,41 115,8 103,63 ± 9,09
15% 128,08 97,3 107,37 135,14 116,97 ± 17,63
17,50% 130,97 116,73 128,03 150,98 131,68 ± 14,26
20% 136,89 146,95 152,84 153,21 147,47 ± 7,62
Mean Gray Value 160,12
Tabung Kosong
Keterangan: Semakin kecil nilai Mean Gray Value mencerminkan biofilm yang terbentuk masih tebal. Sebaliknya, nilai Mean Gray Value yang tinggi berarti cincin biofilm sudah menipis. Kadar hambat biofilm minimal dicapai bila hasil rerata Mean Gray Value 10% di bawah Mean Gray Value tabung kosong, yaitu 144,108 (10% dari 160,12). Dapat dilihat KHBM pada penelitian ini adalah pada konsentrasi 20%, di mana rerata Mean Gray Value 147,47.
(1) (2) (3)
(4) (5) (6)
(7)
Gambar 5.5 Hasil Uji Hambat Pembentukan Biofilm Pengulangan 1 – 4.
Keterangan: tanda panah menunjukkan bahwa dengan meningkatnya konsentasi, maka ketebalan cincin semakin tipis. Biofilm ditandai dengan cincin berwarna biru pada tabung. Pada penelitian, didapatkan tabung dengan pemberian konsentrasi 20% menghasilkan cincin biofilm paling tipis.
Keterangan :
1. Konsentrasi 0%,
2. Konsentrasi 7,5%,
3. Konsentrasi 10%,
4. Konsentrasi 12,5%,
5. Konsentrasi 15%,
6. Konsentrasi 17,5%,
7. Konsentrasi 20%.
Secara visual, cincin tidak nampak pada konsentrasi 20%.
Gambar 5.6 Grafik Pengukuran Mean Gray Value
5.2 Analisis Data
Analisis hasil penelitian menggunakan analisis statistik SPSS versi 23.
Pertama, dilakukan uji normalitas dan homogenitas dari hasil Mean Gray Value
pada tabel 5.1. Selanjutnya, data dianalisis dengan uji Kolmogorov-Smirnov
untuk mengetahui normalitas dan uji Oneway ANOVA dengan pilihan
homogenitas. Kemudian dari hasil kedua uji tersebut, dilakukan uji komparasi
dengan Oneway ANOVA untuk memastikan adanya perbedaan signifikan antar
kelompok data. Selanjutnya, dilakukan uji Post Hoc Test multiple comparison test
metode Tukey untuk melihat signifikansi suatu kelompok data terhadap masing-
masing kelompok data lainnya. Setelah itu dilakukan uji korelasi Pearson untuk
mengetahui korelasi antara peningkatan konsentrasi ekstrak teh hijau terhadap
0
20
40
60
80
100
120
140
160
Kontrol Konsentrasi7,5%
Konsentrasi10%
Konsentrasi12,5 %
Konsentrasi15%
Konsentrasi17,5%
Konsentrasi20%
Mean Gray Value
Mean Gray Value
Mean Gray Value. Selanjutnya dilakukan uji regresi linear untuk mengetahui
besarnya pengaruh konsentrasi ekstrak daun teh hijau terhadap Mean Gray
Value.
5.2.1 Uji Normalitas dan Homogenitas
Suatu data dianggap tersebar normal jika hasil uji normalitas
menunjukkan p>0,05 dan dianggap homogen jika hasil uji homogenitas
menunjukkan p>0,05. Hasil uji normalitas Kolmogorov Smirnov menunjukkan
nilai p=0,200 (Lampiran 4), maka disimpulkan bahwa data berdistribusi normal.
Kemudian dari hasil uji homogenitas Levene, didapatkan nilai p=0,546 (Lampiran
5), maka disimpulkan bahwa data bervarian homogen. Berdasarkan hasil ini
dapat dilakukan uji statistik parametrik.
5.2.2 Uji Oneway ANOVA
Uji Oneway ANOVA dilakukan untuk mengetahui tingkat perbedaan
antara rerata tiap kelompok dalam keseluruhan data yang telah didapatkan. Data
dianggap berbeda signifikan bila p<0,05. Hasil uji menunjukkan nilai p = 0,000
(kurang dari 0,05), maka disimpulkan bahwa terdapat perbedaan antara rerata
tiap kelompok yang signifikan. (Lampiran 6).
5.2.3 Uji Post Hoc
Tabel 5.2 Nilai Signifikan Kelompok terhadap Kelompok Lainnya pada Uji
Post Hoc
0% 7,5% 10% 12,5% 15% 17,5% 20%
0% 0,839 0,191 0,027 0,001 0,000 0,000
7,5% 0,839 0,870 0,322 0,025 0,001 0,000
10% 0,191 0,870 0,951 0,276 0,015 0,000
12,5% 0,027 0,322 0,951 0,825 0,118 0,004
15% 0,001 0,025 0,276 0,825 0,754 0,073
17,5% 0,000 0,001 0,015 0,118 0,754 0,692
20% 0,000 0,000 0,000 0,004 0,073 0,692
Tabel 5.3 Rangkuman Hasil Uji Post Hoc
0% 7,5% 10% 12,5% 15% 17,5% 20%
0% - - + + + +
7,5% - - - + + +
10% - - - - + +
12,5% - - - - - +
15% + + - - - -
17,5% + + + - - -
20% + + + + - -
Uji Post Hoc Multiple Comparation digunakan untuk mengetahui
signifikansi masing-masing kelompok data satu dengan lainnya. Metode Post
Hoc yang digunakan adalah uji Tukey HSD. Perbedaan dianggap signifikan jika
nilai p<0,05 pada masing-masing kelompok data.
Kelompok data pertama adalah perlakuan tanpa pemberian ekstrak teh
hijau (konsentrasi 0%) atau disebut kontrol. Hasilnya adalah didapatkan
perbedaan Mean Gray Value yang tidak signifikan terhadap konsentrasi 7,5%
dan 10% (p>0,05). Pada konsentrasi 12,5%, 15%, 17,5%, dan 20% terdapat
perbedaan yang signifikan (p<0,05). Kemudian hasil komparasi kelompok data
kedua, yaitu perlakuan dengan konsentrasi ekstrak 7,5% didapatkan perbedaan
Mean Gray Value yang tidak signifikan terhadap konsentrasi 0% (kontrol), 10%,
dan 12,5% (p>0,05). Pada konsentrasi 15%, 17,5%, dan 20% terdapat
perbedaan yang signifikan (p<0,05). Sedangkan pada kelompok data ketiga,
yaitu konsentrasi ekstrak 10% didapatkan perbedaan Mean Gray Value yang
tidak signifikan terhadap konsentrasi 0% (kontrol), 7,5%, 12,5%, dan 15%
(p>0,05). Pada konsentrasi 17,5% dan 20% terdapat perbedaan yang signifikan
(p<0,05). Pada kelompok data keempat, yaitu konsentrasi ekstrak 12,5%
didapatkan perbedaan Mean Gray Value yang tidak signifikan terhadap
konsentrasi 7,5%, 10%, 15%, dan 17,5% (p>0,05). Pada konsentrasi 0%
(kontrol) dan 20% terdapat perbedaan yang signifikan (p<0,05). Sedangkan pada
kelompok data kelima, yaitu konsentrasi 15% didapatkan perbedaan Mean Gray
Value yang tidak signifikan terhadap konsentrasi 10%, 12,5%, dan 17,5%. Pada
konsentrasi 0% (kontrol), 7,5%, dan 20% terdapat perbedaan yang signifikan
(p<0,05). Pada kelompok data keenam, yaitu konsentrasi 17,5% didapatkan
perbedaan Mean Gray Value yang tidak signifikan terhadap konsentrasi 12,5%,
15%, dan 20% (p>0,05). Pada konsentrasi 0% (kontrol), 7,5%, dan 10% terdapat
perbedaan yang signifikan (p<0,05). Dan pada kelompok data terakhir, yaitu
konsentrasi ekstrak 20% didapatkan perbedaan Mean Gray Value yang
signifikan terhadap konsentrasi 0% (kontrol), 7,5%, 10%, dan 12,5% (p<0,05).
Sehingga dapat disimpulkan bahwa antar kelompok data yang berdekatan tidak
terdapat signifikansi yang cukup. Namun, pada kelompok data dengan
konsentrasi tertinggi terdapat perbedaan angka Mean Gray Value yang signifikan
terhadap empat konsentrasi terendah.
5.2.4 Uji Korelasi Pearson
Uji korelasi dilakukan untuk mengetahui keeratan dan bentuk hubungan
antara dua variabel yang dinyatakan dengan koefisien korelasi. Hubungan
signifikan ditunjukkan dengan p<0,05, sedangkan nilai p>0,05 menunjukkan
bahwa korelasi tidak signifikan.
Berdasarkan uji yang dilakukan, didapatkan hasil nilai p=0,000 dengan
nilai korelasi 0,761. Adapun klasifikasi nilai korelasi Pearson sebagai berikut
(Sugiyono, 2007):
Nilai Korelasi 0 – 0,199 = sangat rendah
Nilai Korelasi 0,200 – 0,399 = rendah
Nilai Korelasi 0,400 – 0,599 = sedang
Nilai Korelasi 0,600 – 0,799 = kuat
Nilai Korelasi 0,800 – 1,000 = sangat kuat
Korelasi dapat bertanda positif dan negatif. Korelasi positif menunjukkan arah
yang searah antar variabel. Sedangkan korelasi negatif menunjukkan arah yang
berlawanan. Hasil uji korelasi Pearson menunjukkan hasil-hasil sebagai berikut:
1. Nilai p = 0,000, yang menandakan terdapat korelasi yang signifikan
antara konsentrasi ekstrak teh hijau dengan Mean Gray Value. (Lampiran
5)
2. Nilai korelasi (r) = 0,902, yang berarti korelasi antara konsentrasi ekstrak
daun teh hijau dengan Mean Gray Value atau ketebalan biofilm kuat.
3. Arah korelasi positif, sehingga disimpulkan semakin tinggi konsentrasi
ekstrak teh hijau, semakin tinggi pula nilai Mean Gray Value yang
menandakan semakin tipis cincin biofilm yang terbentuk.
BAB 6
PEMBAHASAN
Penelitian eksperimental ini menggunakan bakteri Eschericia coli yang
didapat dari Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Kedokteran Universitas
Brawijaya. Eschericia coli ditanam pada media Nutrient Agar Plate. Daun teh
hijau (Camellia sinensis var. assamica) yang digunakan berasal dari Kebun Teh
Wonosari Lawang, Malang. Daun teh hijau dipilih karena langsung dikeringkan di
kebunnya dan melalui proses yang tidak terlalu panjang sehingga kandungan
aktif dalam daun teh hijau masih cukup banyak. Daun teh hijau kering kemudian
diekstraksi dengan pelarut etanol 96% di Laboratorium Teknik Kimia Politeknik
Negeri Malang. Metode ini dilakukan karena prosedur dan peralatannya lebih
sederhana serta lebih sesuai agar mendapatkan bahan aktif dari tanaman.
Uji pendahuluan dilakukan terlebih dahulu untuk menentukan konsentrasi
yang akan diteliti. Konsentrasi yang digunakan pada uji pendahuluan adalah 0%;
3,125%; 6,25%; 12,5%; 25%; 50%; dan 100%. Hasil uji pendahuluan
menunjukkan bahwa pada konsentrasi 12,5% dan 25% sudah tidak ditemukan
adanya pembentukan cincin biofilm pada area airfluid border. Berdasarkan hasil
tersebut ditentukan konsentrasi yang akan digunakan pada penelitian
sesungguhnya (penelitian inti) yaitu 0%; 7,5%; 10%; 12,5%; 15%; 17,5%; dan
20%. Hasil penelitian inti secara visual menunjukkan bahwa cincin biofilm sudah
mulai menghilang pada konsentrasi 17,5% dan 20%. Rata-rata hasil Mean Gray
Value setiap konsentrasi akan dibandingkan dengan rata-rata Mean Gray Value
tabung yang kosong. Kadar Hambat Biofilm Minimal (KHBM) dicapai apabila
hasil Mean Gray Value 10% di bawah Mean Gray Value tabung kosong (Maciá et
al., 2014). Pada penelitian ini didapatkan KHBM adalah 144,108. Nilai tersebut
sudah tercapai pada konsentrasi 20%, walaupun secara visual cincin biofilm
mulai menghilang pada konsentrasi 17,5%.
Hasil penelitian inti dalam dilusi tabung selanjutnya didokumentasikan
dengan kamera digital lalu diolah menjadi data kuantitatif. Dengan menggunakan
aplikasi Adobe Photoshop CS6, dilakukan pengamatan data secara kuantitatif
yaitu, melihat intensitas warna cincin pada tiap tabung. Didapatkan hasil pada
konsentrasi 0% hingga 20% adanya kenaikan rata-rata Mean Gray Value yang
berbanding lurus dengan kenaikan konsentrasi ekstrak etanol daun teh hijau.
Semakin tinggi nilai Mean Gray Value menunjukkan semakin tipisnya intensitas
warna yang menandakan semakin tipisnya cincin yang terbentuk. Kadar Hambat
Biofilm Minimal (KHBM) juga dapat ditentukan, yaitu pada kadar 20%. Hasil
penelitian ini membuktikan bahwa ekstrak etanol daun teh hijau (Camellia
sinensis var. assamica) terbukti mampu menghambat pembentukan biofilm
bakteri Escherichia coli.
Pada penelitian yang dilakukan oleh Maharani (2014) tentang pengaruh
ekstrak teh hijau (Camellia sinensis var. assamica) terhadap pembentukan
biofilm Staphylococcus aureus secara in vitro didapatkan hasil bahwa ekstrak teh
hijau memiliki efek menghambat pembentukan biofilm bakteri Staphylococcus
aureus dengan KHBM pada konsentrasi minimal 4,125%. Berarti ini menandakan
bahwa ekstrak daun teh hijau juga memiliki efek menghambat pembentukan
biofilm pada bakteri Gram positif.
Penelitian ini selaras dengan penelitian yang dilakukan oleh Matthew
(2015) mengenai efek ekstrak teh hijau terhadap pembentukan biofilm bakteri
Aggregaribacter actinomycetemcommitans. Pada penelitian tersebut, semakin
tinggi konsentrasi ekstrak daun teh hijau maka cincin biofilm yang akan terbentuk
pada dinding tabung akan semakin tipis. Pada penelitiannya, dinemukan bahwa
konsentrasi optimal dalam menghambat biofilm (KHBM) adalah 12,5%,
sedangkan pada penelitian ini didapatkan konsentrasi KHBM adalah 20%. Hal ini
dapat disebabkan oleh perbedaan bakteri dan/ atau metode ekstraksi teh hijau.
Pada penelitian yang dilakukan oleh Johono (2014) mengenai efek
ekstrak daun kamboja putih (Plumeria obtusa) terhadap pertumbuhan bakteri
Escherichia coli secara in vitro didapatkan Kadar Bunuh Minimal dari ekstrak
daun kamboja putih adalah pada konsentrasi 32%. Terjadi penurunan rata-rata
jumlah koloni Escherichia coli seiring dengan peningkatan konsentrasi ekstrak
etanol daun kamboja putih.
Kandungan tanin pada teh hijau dapat menghambat sinyal pada
mekanisme quorum sensing dengan cara berikatan kuat dengan molekul protein
sehingga menghasilkan ikatan silang (Ahadi, 2003) walaupun efek yang
ditimbulkan tidak signifikan (Huber, 2003). Tanin merupakan salah satu kelompok
terbesar polifenol tanaman. Mereka dikelompokkan menjadi tanin kental
(proanthocyanidins atau katekin) dan tanin terhidrolisis (gallotannins dan
ellagitannins) (Nagy et al., 2011). Selain itu senyawa EGCG dalam polifenol yang
juga terdapat pada teh hijau mampu menghambat biofilm pada E. coli dengan
cara menurunkan pertumbuhan sel pada dosis tinggi dan menginhibisi quorum
sensing. dengan pemberian sampai dosis tertentu, EGCG dapat mereduksi
intensitas sinyal pada quorum sensing bakteri hingga 50% (Maeyama et al.,
2005). EGCG pada dosis tertentu menghambat morfogenesis koloni dengan
kuat. Pengurangan biofilm yang jelas diamati pada konsentrasi EGCG serendah
12,5 μg / ml, sedangkan pengurangan pertumbuhan koloni memerlukan
setidaknya 20 kali lipat konsentrasi EGCG yang lebih tinggi dan juga MIC selama
pertumbuhan di media cair adalah> 400 μg / ml (Lee et al., 2009).
Keterbatasan pada penelitian ini adalah tidak bisa dipastikan zat aktif dari
teh hijau yang mana yang paling berperan dalam menghambat biofilm.
Keterbatasan lain adalah belum diketahuinya efek lama simpan ekstrak terhadap
efektivitas ekstrak etanol daun teh hijau. Dapat dipertimbangkan juga, untuk
menggunakan isolat E. coli dari pasien, baik yang masih sensitif terhadap
antimikroba ataupun yang telah resisten untuk generalisasi hasil penelitian yang
lebih luas.
BAB 7
KESIMPULAN DAN SARAN
7.1 Kesimpulan
Berdasarkan hasil pemberian ekstrak daun teh hijau (Camellia sinensis var.
assamica) terhadap pembentukan biofilm Escherichia coli, dapat disimpulkan
bahwa :
1. Ekstrak daun teh hijau (Camellia sinensis var. assamica) dapat
menghambat pembentukan biofilm Escherichia coli secara in vitro.
2. Semakin tinggi konsentrasi ekstrak daun teh hijau (Camellia sinensis var.
assamica), semakin besar daya hambat pembentukan biofilm
Escherichia coli secara in vitro.
3. Kadar Hambat Minimum (KHM) dari ekstrak daun teh hijau (Camellia
sinensis var. assamica) terhadap pembentukan biofilm Escherichia coli
secara in vitro adalah pada konsentrasi 20%
7.2 Saran
Berdasarkan hasil penelitian dan pembahasan saya menyarankan hal-hal
sebagai berikut:
1. Penelitian lebih lanjut mengenai zat aktif pada teh hijau (Camellia
sinensis var. Assamica) yang memiliki efek menghambat
pembentukan biofilm.
2. Penelitian lebih lanjut mengenai dosis efektif teh hijau (Camellia
sinensis var. Assamica) sebagai penghambat pembentukan biofilm
tanpa menimbulkan efek toksik.
3. Penelitian lebih lanjut mengenai uji toksisitas ekstra teh hiaju
(Camellia sinensis var. Assamica).
4. Penelitian lebih lanjut mengenai efek lama simpan ekstrak terhadap
efektivitas ekstrak etanol teh hijau (Camellia sinensis var. Assamica)
sebagai penghambat biofilm Escherichia coli.
5. Potensi untuk mengembangkan penelitian yang menggunakan
ekstrak teh hijau (Camellia sinensis var. Assamica) sebagai
penghambat pembentukan biofilm Escherichia coli secara in vivo.
DAFTAR PUSTAKA
Anderson GG, Palermo JJ, Schilling JD, Roth R, Heuser J, Hultgren SJ. 2003. Intracellular bacterial biofilm-like pods in urinary tract infections. Tersedia dari URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12843396. Diakses pada tanggal 3 September 2017.
Andiyani DZP. 2014. Efek Ekstrak rimpang Jahe Merah (Zingber officinale var. Rubra) Sebagai Penghambat Pembentukan Biofilm pada Staphylococcus aureus Secara In Vitro. Tugas Akhir. Tidak dipublikasikan, Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya Malang.
Arakawa H, Maeda M, Okubo S, Shimamura T. 2004. Role of hydrogen peroxide in bactericidal action of catechin. Biol Pharm Bull 27, pp.277-81.
Baselga R. 1994. Staphylococcus aureus capsule and slime as virulence factors in ruminant mastitis. A review. Vet Microbiol 39, pp.195-204.
Beloin C, Roux A, Ghigo JM. 2008. Curr Top Microbiol Immunol: Escherichia coli biofilms. Tersedia dari URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2864707/. Diakses pada tanggal 3 September 2017.
Beis K, Collins RF, Ford RC, Kamis AB, Whitfield C, Naismith JH. 2004. Three-dimensional structure of Wza, the protein required for translocation of group 1 capsular polysaccharide across the outer membrane of Escherichia coli. J Biol Chem 279, pp. 28227-32.
Brooks GF, Carroll KC, Butel JS, Morse SA, Mietzner TA. 2013. Jawetz Melnick & Adelbergs Medical Microbiology 26 E. McGraw Hill Professional.
Cahyani DP. 2013. Pengaruh Ekstrak Etanol Kulit Jeruk Nipis (Citrus aurantifolia) Terhadap Perbaikan Sel Epitel Gingiva Tikus Putih Galur Wistar (Rattus Novergicus) yang diinduksi Actinobacillus actinomycetemcomitans. Tugas Akhir. Tidak dipublikasikn, Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya Malang.
Coenve T, Nelis HJ. 2010. In vitro and in vivo model systems to study microbial biofilm formation. Tersedia dari URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20816706. Diakses pada tanggal 12 Oktober 2017.
Cookson AL, Cooley WA, Woodward MJ. 2002. The role of type 1 and curli fimbriae of Shiga toxin-producing Escherichia coli in adherence to abiotic surfaces. International Journal of Medical Microbiology 292, pp. 3-4 195 205 1438-4221.
Costerton J. 1999. Bacterial biofilms. A common cause of persistent infections Sci 284, pp. 1318-1322.
Costa LM, Gouveia ST, Nobrega JA. 2002. Comparison of heating extraction procedures for Al, Ca, Mg and Mn in tea samples. Ann Sci 18, pp. 313–318.
Dahlan MS. 2009. Statistik untuk Kedokteran Kesehatan. Jakarta: Salemba Medika.
Desvaux M, Parham NJ. 2004. The autotransporter secretion system. Research in Microbiology 155, pp. 0923-2508.
De Keersmaecker SC, Sonck K, Vanderleyden J. 2006. Let LuxS speak up in AI-2 signaling. Trends Microbiol 14, pp. 114-9.
Donlan RM. 2002. Biofilms: Microbial life on surfaces. Emerging Infectious Diseases 8(9), pp. 881–890.
Finlay BB. 1997. Interactions of enteric pathogens with human epithelial cells. Bacterial exploitation of host processes. Advances in Experimental and Medical Biology 412, pp. 289-293.
Forbes BA, Sahm DF, Weissfeld AS. 2007. Baley and Scott’s Diagnostic Microbiology, 12th ed.St. Louis: Mosby Company.
Ghigo JM. 2001. Natural conjugative plasmids induce bacterial biofilm development. Nature. 12, pp. 442-445.
Gordon NC, Wareham DW. 2010. Antimicrobial activity of the green tea polyphenol (-)-epigallocatechin-3-gallate (EGCG) against clinical isolates of Stenotrophomonas maltophilia. Int J Antimicrob Agents 36, pp.129-31.
Graham HN. 1992. Green tea composition, consumption, and polyphenol chemistry. Prev Med 21, pp. 334-50.
Gradišar H., Friedrich J., Križaj I., Jerala R. 2007. Similarities and Specifities of Fungal. Keartinolytic Proteases: Comparison of Keratinases of Paecilomyces marquandii and Doratomyces microsporus to some Known Proteases. Applied and Enviromental Microbiology 71 pp. 3420-3426.
Hara Y. 2001. Green tea: health benefits and applications. New York, USA: Marcel Dekker.
Hardie KR, Cooksley C, Green AD, Winzer K. 2003. Autoinducer 2 activity in Escherichia coli culture supernatants can be actively reduced despite maintenance of an active synthase, LuxS. Microbiology 149, pp. 715-728.
Hasman H, Chakraborty T, Klemm P. 1999. Antigen-43-mediated autoaggregation of Escherichia coli is blocked by fimbriation. Journal of Bacteriology 181, pp. 4834-4841.
Hentzer M. 2005. Transcriptome analysis of Pseudomonas aeruginosa biofilm development: anaerobic respiration and iron limitation. Biofouling. 2, pp. 37-61.
Hung C, Zhou Y, Pinkner JS, Dodson KW, Crowley JR, Heuser J, Chapman MR, Hadjifrangiskou M, Henderson JP, Hultgren SJ. 2013. Escherichia coli Biofilms Have an Organized and Complex Extracellular Matrix Structure. Tersedia dari URL: http://mbio.asm.org/content/4/5/e00645-13.full. Diakses pada tanggal 3 Oktober 2017.
Ikigai H, Nakae T, Hara Y, Shimamura T. 1993. Bactericidal catechins damage the lipid bilayer. Biochim Biophys Acta 1147, pp.132-6.
Jamal M, Tasneem U, Hussain T, Andleeb S. 2015. Bacterial Biofilm: Its Composition, Formation, and Role in Human Infections. Tersedia dari URL: http://www.rroij.com/open-access/bacterial-biofilm-its-composition-formation-and-role-in-human-infections.php?aid=61426. Diakses pada tanggal 10 Oktober 2017.
Jayaraman A, Mansfeld FB, Wood TK. 1999. Inhibiting Sulfate-Reducing Bacteria in Biofilms by Expressing the Antimicrobial Peptides Indolicidin and Bactenecin. J Indust Microbiol Biotechnol 22, pp.167–175.
Johono MF. 2014. Pengaruh Ekstrak Etanol Daun Kamboja Putih (Plumeria obtusa) Sebagai Antimikroba Terhadap Escherichia coli Secara in Vitro.
Tugas Akhir. Tidak dipublikasikan, Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya Malang.
Justice SS, Hung C, Theriot JA, Fletcher DA, Anderson GG, Footer MJ. 2004. Differentiation and developmental pathways of uropathogenic Escherichia coli in urinary tract pathogenesis. Procedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 101, pp. 1333-1338.
Kaper JB, Nataro JP, Mobley HL. 2004. Pathogenic Escherichia coli. Tersedia dari URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15040260/. Diakses pada tanggal 11 Oktober 2017.
Kaplan HB, Greenberg EP. 1985. Diffusion of autoinducer is involved in regulation of the Vibrio fischeri luminescence system. J Bacteriol 163, pp. 1210-4.
Lee MR, Pawlowski KS, Luong A, Furze A, Roland PS. 2009. Biofilm presence in human with chronic suppurative otitis media. Otolaryngology. Head and Neck Surgery 141, pp. 567-71.
Lui J.-K, Jurtshuk P. 1986. N,N,N’-N’-tetramethyl- p-phenylenediamine-dependent cytochrome oxidase analyses of Bacillus species. Int. J. Syst. Bacteriol 36, pp. 38 – 46.
Macià MD, Rojo-Molinero E, Oliver A. 2014. Antimicrobial susceptibility testing in biofilm-growing bacteria. Clinical Microbiology and Infection 20 pp. 981–990.
Maharani P. 2014. Efek Ekstrak Teh Hijau (Camellia sinensis var. assamica) sebagai Penghambat Pembentukan Biofilm pada Staphylococcus aureus secara In Vitro. Tugas Akhir. Tidak dipublikasikan, Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya Malang.
Maeyama R, Kwon IK, Mizunoe Y, Anderson JM, Tanaka M, Matsuda T. 2005. Novel bactericidal surface: Cathecin-loaded surface-erodible polymer prevents biofilm formation. Tersedia dari URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16028232. Diakses pada tanggal 20 Oktober 2017.
Matthew J. 2016. Efek Ekstrak Daun Teh Hijau (Camellia sinensis var. assamica) Sebagai Penghambat Pembentukan Biofilm pada Aggregatibacter
actinomycetemcomitans secara In Vitro. Tugas Akhir. Tidak dipublikasikan, Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya Malang.
McBain AJ. 2009. Chapter 4: In vitro biofilm models: an overview. Tersedia dari URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19729092. Diakses pada 10 Oktober 2017.
Mckenney D. 1998. The ica locus of Staphylococcus epidermidis encodes production of the capsular polysaccharide/adhesin. Infect Immunity 66, pp. 4711-4720.
Miller MB, Skorupski K, Lenz DH, Taylor RK, Bassler BL, Parallel. 2002. Quorum Sensing Systems Converge to Regulate Virulence in Vibrio cholera. Tersedia dari URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/m/pubmed/11544353/. Diakses pada tanggal 30 September 2017.
Molin S, Tolker-Nielsen T. 2003. Gene transfer occurs with enhanced efficiency in biofilms and induces enhanced stabilisation of the biofilm structure. Current Opinion on Biotechnology 14, pp. 255-261.
Muktar H, Ahmad N. 2000. Tea polyphenols: prevention of cancer and optimizing health. Am J Clin Nutr 71, pp.1698-702.
Nadell CD, Bassler BL. 2011. A fitness trade-off between local competition and dispersal in Vibrio cholerae biofilms. Proc Natl Acad Sci U S A 108, pp. 14181-5.
Nagy M, Grancˇai D, Mucˇaji P. 2011. Farmakognózia Biogenéza Prírodných Látok. Martin, TN, USA: Osveta.
Navarro-Martínez MD, Navarro-Perán E, Cabezas-Herrera J, Ruiz-Gómez J, García-Cánovas F, Rodríguez-López JN. 2005. Antifolate activity of epigallocatechin gallate against Stenotrophomonas maltophilia. Antimicrob Agents Chemother 49, pp. 2914-20.
Nicolle LE. 2005. Catheter-related urinary tract. Tersedia dari URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16060714/. Diakses pada tanggal 11 Oktober 2017.
Noorhamdani, Santoso S, Sumarno, Dzen SM, Roekistiningsih, Winarsih S, et al. 2015. Bakteriologi Medik, Edisi Kedua. Malang: Laboratorium Mikrobiologi FKUB.
Novick RP, Projan SJ, Kornblum J, Ross HF, Ji G, Kreiswirth B, Vandenesch F, Moghazeh S. 1995. The agr P2 operon: an autocatalytic sensory transduction system in Staphylococcus aureus. Mol Gen Genet 248, pp. 446-58.
Notobroto BH. 2005. Penelitian Eksperimental dalam Materi Praktikum Teknik Sampling dan Penghitungan Besar Sampel Angkatan III. Surabaya: Lembaga Penelitian Universitas Airlangga.
O’Toole G, Kaplan HB, Kolter R. 2000. Biofilm formation as microbial development. Tersedia dari URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11018124/. Diakses pada 15 Oktober 2017.
Okada M. 2005. Structure of the Bacillus subtilis quorum-sensing peptide pheromone ComX. Nat Chem Biol 1, pp. 23-24.
Okubo S, Ikigai H, Toda M, Shimamura T. 1989. Lett. Appl. Microbiol. 9, pp. 65-66.
Orth D, Grif K, Dierich MP, Würzner R. 2006. Prevalence, structure and expression of urease genes in Shiga toxin-producing Escherichia coli from humans and the environment. Tersedia dari URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16877040/. Diakses pada tanggal 20 Oktober 2017.
Oser, B. 1965. Enzymes and their action: cell respiration. In L. Hawk (ed.), Physiological chemistry, 14th ed. McGraw-Hill, Boston, MA.
Parsek MR, Singh PK. 2003. Bacterial biofilms: an emerging link to disease pathogenesis. Annu Rev Microbiol 57, pp. 677-701.
Praharaj AK, Tandel K, Kumar S. 2013. Differences in Vancomycin MC among MRSA Isolates by Agar Dilution and E Test Method. Indian Journal of Medical Microbiology 30(4), pp. 453-455.
Pratt LA, Kolter R. 1998. Genetic analysis of Escherichia coli biofilm formation: roles of flagella, motility, chemotaxis and type I pili. Molecular Microbiology 30, pp. 285-293.
Redfield RJ. 2002. Is quorum sensing a side effect of diffusion sensing? Trends in Microbiology 10, pp. 365-370.
Reisner A, Haagensen JA, Schembri MA, Zechner EL, Molin S. 2003. Development and maturation of Escherichia coli K-12 Biofilms. Molecular Microbiology 48, pp. 933-946.
Rutherford ST, Bassler BL. 2012. Bacterial Quorum Sensing: Its Role in Virulence and Possibilities for Its Control. Tersedia dari URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3543102/. Diakses pada tanggal 15 Oktober 2017.
Ruchi T, Sujata B, Anuradha D. 2015. Comparison of Phenotypic Methods for the Detection of Biofilm Production in Uro-Pathogens in a Tertiary Care Hospital in India. Tersedia dari URL: http://www.ijcmas.com/vol-4-9/Tayal%20Ruchi,%20et%20al.pdf. Diakses pada tanggal 20 Oktober 2017.
Seed PC, Passador L, Iglewski BH. 1995. Activation of the Pseudomonas aeruginosa lasI gene by LasR and the Pseudomonas autoinducer PAI: an autoinduction regulatory hierarchy. J Bacteriol 177(3), pp. 654-9.
Sharangi A. 2009. Medical and therapeutic potentialities of tea (Camellia sinensis L.). A review. Food Res Int 42, pp. 529-535.
Soto SM, Francesc M, Guiral E, Vila J. 2011. Biofilm Formation in Uropathogenic Escherichia coli Strains: Relationship with Urovirulence Factors and Antimicrobial Resistance. Tersedia dari URL: https://www.intechopen.com/books/clinical-management-of-complicated-urinary-tract-infection/biofilm-formation-in-uropathogenic-escherichia-coli-strains-relationship-with-urovirulence-factors-a. Diakses pada 14 Oktober 2017).
Spencer CM,Cai Y, Martin R, Gaffney SH, Goulding PN, Magnolato D, Lillcy TH, Haslam E. 1988. Phytochemistry 27, 2397.
Stoodley LH, Costerton JW, Stoodley P. 2004. Nature Reviews Microbiology 2 Bacterial biofilms: from the Natural environment to infectious diseases.
Tersedia dari URL: https://www.nature.com/nrmicro/journal/v2/n2/full/nrmicro821.html. Diakses pada tanggal 30 September 2017.
Sudarmadji S, Haryono B, Suhardi. 2003. Analisa Bahan Makanan dan Pertanian. Yogyakarta: Liberty.
Sugiyono. 2007. Metode Penelitian Kuantitatif Kualitatif dan R&D. Bandung: Alfabeta.
Taga ME, Miller ST, Bassler BL. 2003. Lsr-mediated transport and processing of AI-2 in Salmonella typhimurium. Mol. Microbiol 50, pp. 1411-1427.
Taylor PW, Hamilton-Miller JM, Stapleton PD. 2005. Antimicrobial properties of green tea catechins. Tersedia dari URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19844590. Diakses pada 30 September 2017.
Todar K. 2004. Escherichia coli. Tersedia dari URL: http://www.textbookofbacteriolog y.net.klebsiella.html. Diakses pada 30 September 2017.
Towaha, J., Balittri. 2013. Warta Penelitian dan Pengembangan Tanaman Industri (Vol. 19, No. 3).
Uhlich GA, Cooke PH, Solomon EB. 2006. Analyses of the red-dry-rough phenotype of an Escherichia coli O157:H7 strain and its role in biofilm formation and resistance to antibacterial agents. Applied Environmental Microbiology 72, pp. 2564 2572.
Van HR, Michiels SW. 2005. Role of bacterial cell surface structures in Escherichia coli biofilm formation. Tersedia dari URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15950122/. Diakses pada tanggal 3 November 2017.
Vidal O, Longin R, Prigent-Combaret C, Dorel C, Hooreman M, Lejeune P. 1998. Isolation of an Escherichia coli K-12 mutant strain able to form biofilms on inert surfaces: involvement of a new ompR allele that increases curli expression. Journal of Bacteriology 9, pp. 2442-2449.
Wang L, Li J, March JC, Valdes JJ, Bentley WE. 2005. luxS-dependent gene regulation in Escherichia coli K-12 revealed by genomic expression profiling. J. Bacteriol 187, pp. 8350-8360.
Wei Y, Perez LJ, Ng WL, Semmelhack MF, Bassler BL. 2011. Mechanism of Vibrio cholerae autoinducer-1 biosynthesis. ACS Chem Biol 6(4), pp. 356-65.
Welch RA, Burland V, Plunkett G, Redford P, Roesch P, Rasko D. 2002. Extensive mosaic structure revealed by the complete genome sequence of uropathogenic Escherichia coli. Procedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 26, pp. 17020 17024.
White AP, Gibson DL, Collinson SK, Banser PA, Kay WW. 2003. Extracellular polysaccharides associated with thin aggregative fimbriae of Salmonella enterica serovar enteritidis. Journal of Bacteriology 18, pp. 5398-5407.
Wood TK. 2009. Insights on Escherichia coli Biofilm Formation and Inhibition from Whole-Transcriptome Profiling. Tersedia dari URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2621073/. Diakses pada tanggal 4 November 2017.
Yam TS, Shah S, Hamilton-Miller JM. 1997. Microbiological activity of whole and fractionated crude extracts of tea (Camellia sinensis), and of tea components. FEMS Microbiol Lett 152(1), pp.169-74.
Zhao WH, Hu ZQ, Hara Y, Shimamura T. 2002. Inhibition of penicillinase by epigallocatechin gallate resulting in restoration of antibacterial activity of penicillin against penicillinase-producing Staphylococcus aureus. Antimicrob Agents Chemother 46, pp. 2266–2268.
