Discussion

Banyak penelitian telah difokuskan pada mekanisme VEGFR2 sinyal aktivasi

sebagai lawan sinyal terminasi, yang jauh studinya lebih sedikit. Penelitian ini memberikan

bukti bahwa (1) berlebih dari PTP1B menghambat VEGFR2 autofosforilasi, ERK1 / 2

fosforilasi, dan proliferasi EC, sedangkan knockdown PTP1B menggunakan siRNA

signifikan meningkatkan respon ini, (2) PTP1B mengikat VEGFR2 di HUVECs

overexpressing PTP1B, serta dalam sel CHO cotransfected dengan PTP1B dan VEGFR2

domain sitoplasmik; (3) protein rekombinan PTP1B aktif dephosphorylates VEGFR2

immunoprecipitates VEGF-dirangsang HUVECs, (4) berlebih dari PTP1B menstabilkan

endotel sel-sel persimpangan dengan mengurangi VE-cadherin fosforilasi tirosin dan

meningkatkan TER, sedangkan PTP1B siRNA menyebabkan efek yang berlawanan, (5)

PTP1B secara fisik asosiasi dengan VE-cadherin di HUVECs, dan (6) ekspresi PTP1B dan

kegiatan tersebut meningkat secara dramatis dalam hindlimb iskemik Model.

Penelitian sebelumnya menunjukkan bahwa beberapa PTP, termasuk SHP-1, SHP-2,

dan HCPTPA, mengikat VEGFR2 secara langsung atau secara tidak langsung. Namun, peran

endogen dalam VEGFR2 autofosforilasi dalam kondisi fisiologis tetap jelas. SHP-1 terlibat

dalam tumor necrosis factor. pencegahan VEGFR2 fosforilasi, sedangkan SHP-2

menghambat fosforilasi tirosin dari VEGFR2 di Ecs ketika mereka yang dibudidayakan

hanya pada tipe kolagen. HCPTPA berlebih melemahkan VEGFR2 autofosforilasi, tapi ini

belum diteliti dengan pendekatan kerugian-of-fungsi. Menggunakan berlebih dan knockdown

pendekatan, serta kopresipitasi dan tes cotransfection, penelitian ini menunjukkan bahwa

fungsi PTP1B sebagai regulator negatif untuk VEGFR2 autofosforilasi di ECs melalui

mengikat VEGFR2 sitoplasma domain kinase. Dari catatan, VEGFR2 adalah dikaitkan lagi

dengan medium PTP1B di HUVECs mengekspresikan PTP1B-WT, serta dalam sel CHO

transfected dengan PTP1B-WT atau mutan substrat-menjebak PTP1B (PTPD / A dan

PTP1B-C / S), menunjukkan PTP1B yang mengikat VEGFR2 dengan cara fosforilasi-

independen, seperti yang ditunjukkan dengan cara mengikat untuk p130Cas. Kita tidak bisa

mendeteksi PTP1B asosiasi dengan VEGFR2 dalam sel lacZ-terinfeksi, yang mungkin karena

pembentukan kompleks stabil PTP1B endogen dengan substrat nya. Selain itu, VEGFR2

defosforilasi menunjukkan bahwa ligan-diinduksi, diaktifkan VEGFR2 yang

dephosphorylated oleh PTP1B. Konsisten dengan temuan kami, PTP1B telah ditunjukkan

untuk mengikat dan dephosphorylate platelet-derived reseptor faktor pertumbuhan, faktor

pertumbuhan epidermal receptor10 dan reseptor insulin, 7,11 menunjukkan PTP1B yang

merupakan reseptor yang relevan secara biologis tirosin kinase fosfatase. Studi kami tidak

bisa mengesampingkan kemungkinan bahwa ada interaksi langsung PTP1B-VEGFR2,

mungkin melalui protein menengah, yang diperlukan untuk PTP1B diinduksi defosforilasi

VEGFR2.

VEGFR2 autofosforilasi diperlukan untuk aktivasi jalur sinyal beragam, seperti ERK1

/ 2 dan p38 MAPK, yang terlibat dalam EC proliferasi dan migrasi, masing-masing. Peristiwa

sinyal hilir yang berasal dari para tyrosines autophosphorylated dalam VEGFR2, serta

defosforilasi RTKs oleh PTP sangat spesifik lokasi. Laporan sebelumnya menunjukkan

bahwa fosforilasi Y1175 dalam VEGFR2 sangat penting untuk aktivasi PLCý, Dan

selanjutnya ERK fosforilasi dan proliferasi sel, sedangkan pY1214 terlibat dalam VEGF-

dirangsang p38 MAPK aktivasi dan migrasi sel. Penelitian ini menunjukkan bahwa PTP1B

siRNA meningkatkan, sedangkan berlebih dari PTP1B menghambat, fosforilasi Y1175 dari

VEGFR2, PLCý, ERK, dan proliferasi EC tanpa mempengaruhi fosforilasi p38 MAPK atau

Akt, serta migrasi EC. Konsisten dengan Hasilnya kami, Milarski dkk melaporkan bahwa

PTP1B khusus dephosphorylates faktor pertumbuhan epidermal reseptor pY992, yang

merupakan situs pengikatan spesifik untuk PLCý. Pada sisi lain, menggunakan babi aorta

ECS transfected dengan chimeric murine VEGFR2, Holmqvist dkk dan Dayanir dkk

menunjukkan VEGFR2-pY1175/1173 yang diperlukan untuk phosphatidylinositol Aktivasi

3-kinase, yang terlibat dalam EC migrasi dan proliferasi, masing-masing. Selain itu, PTP1B

inhibitor meningkatkan fosforilasi Akt dan endotel NO sintase dan meningkatkan disfungsi

endotel perifer dalam model gagal jantung kronis tikus. Ini bertentangan Bukti mungkin

disebabkan perbedaan eksperimental kondisi (kondisi kultur sel atau sistem transfeksi dengan

chimeric VEGFR2 murine atau jenis sel atau spesies). Sekarang mungkin bahwa PTP1B

mungkin istimewa mengikat VEGFR2- PLCý kompleks tetapi tidak untuk VEGFR2-

phosphatidylinositol 3-kinase kompleks, yang dapat membentuk konformasi sesuai atau

melokalisasi di kompartemen subselular PTP1B terkait. Selanjutnya, PTP1B dapat

mempengaruhi fosforilasi VEGFR2 lainnya situs selain pY1175 reseptor. Namun demikian,

Data kami dengan jelas menunjukkan bahwa PTP1B negatif mengatur proliferasi EC,

setidaknya sebagian, dengan selektif menghambat VEGFR2-pY1175-PLCý-jalur ERK secara

utuh ECS manusia. Analisis detail menggunakan mutan Y1175FVEGFR2, karakterisasi

interaksi PTP1B dan VEGFR2 dan lokalisasi mereka, dan identifikasi situs defosforilasi (s)

dari VEGFR2 oleh PTP1B merupakan tujuan penelitian di masa depan.

VE-cadherin-dimediasi sel - adhesi sel penting bagi menjaga integritas endotel ECs.

Fosforilasi tirosin VE-cadherin dikaitkan dengan hilangnya sel-sel kontak di monolayer

konfluen ECs dan peningkatan permeabilitas endotel, yang merupakan peristiwa awal untuk

mempromosikan angiogenesis. Kegiatan PTP juga mengatur integritas sel-sel persimpangan.

Kami menemukan bahwa PTP1B mengikat dan colocalizes dengan VE-cadherin pada kontak

sel-sel dalam membrana basalis. Ekspresi dari PTP1B menstabilkan endotel sel-sel

persimpangan dengan mengurangi VE-cadherin fosforilasi tirosin dan meningkatkan TER,

sedangkan PTP1B siRNA menyebabkan efek yang berlawanan. Dengan demikian, fungsi

PTP1B untuk mempertahankan integritas penghalang endotel. Konsisten dengan hasil kami,

PTP1B telah ditunjukkan untuk melokalisasi di persimpangan sel-sel dalam terimpit tikus

kornea EC dan, dalam sistem lain, untuk mengikat langsung ke E-cadherin atau N-cadherin,

yang terlibat dalam menstabilkan intercellular junction. Mengingat bahwa sebagian kecil dari

VEGFR2 terlokalisir di VE-cadherin yang mengandung sel-sel kontak, dapat dibayangkan

bahwa PTP1B terlokalisasi di adherens junction dapat membentuk beberapa kompleks

dengan VEGFR2 dan VE-cadherin untuk downregulate VEGF sinyal, sehingga membatasi

Program angiogenik. Kepadatan yang disempurnakan fosfatase-1 (DEP1) / CD148 asosiasi

langsung dengan VEcadherin / VEGFR2 kompleks, yang pada gilirannya mempromosikan

contact dependend penghambatan VEGFR2 fosforilasi, ERK aktivasi, dan proliferasi EC.

Dengan demikian, PTP1B-dimediasi penghambatan proliferasi VEGFR2-ERK-EC mungkin,

setidaknya sebagian, dengan meningkatkan kontak sel-sel, sehingga memberikan kontribusi

untuk DEP-1-dimediasi inhibisi kontak-tergantung dari VEGFR2 sinyal dalam ECs. Selain

itu, endotel vaskular PTP (VE-PTP) dan SHP-234 mengikat VE-cadherin dan β-Catenin,

masing-masing, yang terlibat dalam VE-cadherin fungsi barrier dimediasi dalam konfluen

EC. Ini menunjukkan yang PTP1B dan lainnya PTP yang melokalisasi pada sel-sel kontak

dapat bekerja sama untuk mempertahankan tingkat rendah tirosin fosforilasi, dan dengan

demikian menstabilkan integritas junctional, yang dapat berkontribusi untuk inhibisi kontak-

tergantung VEGF sinyal dan proliferasi EC.

PTP memiliki residu Cys reaktif di situs aktif enzim (misalnya, Cys215 di PTP1B

manusia), yang di terdeprotonasi pH netral dan rentan terhadap oksidatif reversibel inaktivasi

oleh agonis-induced spesies oksigen reaktif (ROS). Kami dan lain-lain menunjukkan bahwa

ROS yang terlibat di VEGFR2 autofosforilasi, serta hilangnya adhesi sel-sel melalui

peningkatan fosforilasi tirosin VE-cadherin dan / atau protein junctional lainnya. Apakah

VEGF-induced ROS terlibat dalam oksidatif inaktivasi PTP1B di EC saat ini sedang

diselidiki.

PTP inhibitor Umum mempromosikan VEGFR2 aktivated , pemulihan aliran darah,

atau angiogenesis setelah hindlimb iskemia, menunjukkan PTP sebagai target terapi yang

potensial untuk mempromosikan neovaskularisasi. Menggunakan mouse Model iskemia

hindlimb, kami menunjukkan bahwa ekspresi PTP1B meningkat pada lectinpositive EC dan

miosit skeletal dalam-tergantung waktu cara dengan puncak di 7days setelah hindlimb

iskemia, yang dikaitkan dengan peningkatan aktivitas PTP1B. Pewarnaan ini Pola ini

konsisten dengan laporan sebelumnya untuk induksi dari VEGFR2 di otot rangka iskemik.

Bersama dengan kami data in vitro, iskemia diinduksi upregulation PTP1B mungkin

merupakan suatu mekanisme kompensasi penting yang menumpulkan overactivation sinyal

angiogenik in vivo, setidaknya sebagian, oleh fosforilasi tirosin menghambat VEGFR2 dan

VEcadherin. Hasil kami konsisten dengan laporan sebelumnya yang PTP1B menghambat

faktor-atau platelet-derived growth fibroblast pertumbuhan proliferasi faktor-diinduksi

vaskular berbudaya otot polos, sedangkan PTP1B berekspresi dan neointima formasi yang

meningkat dalam model cedera vaskular. Ini ditafsirkan sebagai fungsi counterregulatory dari

PTP1B di pembentukan neointima dalam menanggapi cedera vaskular. Sebaliknya, Ekspresi

SHP-2 tidak berubah setelah iskemia, dan SHP-2 siRNA tidak memiliki efek pada VEGFR2

autofosforilasi dalam kultur EC, menunjukkan keterlibatan spesifik PTP1B dalam respons

angiogenik in vitro dan in vivo. Sugano et al melaporkan bahwa SHP-1 protein meningkat

pada tikus hindlimb Model iskemia, yang mencegah tumor necrosis Faktor? diinduksi efek

penghambatan negatif pada VEGF sinyal. Kami juga menemukan bahwa SHP-1 protein

meningkat setelah iskemia, tetapi tingkat kenaikan yang jauh lebih sedikit dari itu dari

PTP1B. Laporan sebelumnya menunjukkan bahwa PTP1B inhibitor meningkatkan

angiogenesis VEGF-dimediasi menggunakan Matrigel tikus model, yang tidak dapat

menghilangkan efek nonspesifik. Karena iskemia kami hindlimb Data berimplikasi tetapi

tidak tidak menyimpulkan bahwa PTP1B mungkin memainkan peran dalam VEGF diinduksi

angiogenesis in vivo, penyelidikan lebih lanjut akan diperlukan menggunakan PTP1B -/- tikus

dalam studi di masa depan. Mengingat bahwa PTP1B-/- tikus mencegah diabetes tipe 2 dan

obesitas di mana iskemia- angiogenesis diinduksi terganggu, PTP1B menghambat mungkin

menjadi strategi terapi yang penting untuk mempromosikan kapal baru formasi dalam

penyakit kardiovaskular.

kesimpulannya, kami menunjukkan bahwa fungsi PTP1B sebagai regulator negatif

VEGF sinyal dengan dephosphorylating VEGFR2 via mengikat reseptor, serta dengan

menstabilkan persimpangan adherens melalui fosforilasi tirosin menghambat VE-cadherin

yang menengahi inhibisi kontak-tergantung dari VEGFR2 sinyal. Mekanisme ini dapat

berkontribusi untuk penghambatan spesifik ERK-EC proliferasi jalur. Induksi dari PTP1B

oleh hindlimb iskemia dapat mewakili Mekanisme counterregulatory penting yang

menumpulkan luas, kegiatan yang tidak terkendali VEGFR2 dan lainnya RTKs selama

angiogenesis in vivo. Temuan ini harus memberikan wawasan baru ke PTP1B sebagai target

terapi yang potensial untuk mempromosikan neovaskularisasi di iskemik kardiovaskuler

penyakit.