1Tujuan :

Mahasiswa memahami cara memotong DNA plasmid dan Mahasiswa memahami tujuan

pemotongan DNA Plasmid.

Prinsip :

Pemotongan DNA plasmid dengan enzim retriksi ( BamH1 dan EcoR1) yang bertujuan untuk

memperoleh fragmen DNA plamid agar dapat disisipi dengan fragmen DNA sisipan.

Teori dasar :

Plasmid adalah molekul DNA utas ganda sirkuler (tak berujung) yang berukuran kecil yang

terdapat di dalam sitoplasma, dan dapat melakukan replikasi secara autonom. Karakteristik yang

penting dari plasmid adalah dapat melakukan replikasi, terdapat di luar kromosom, dan secara

genetik dapat ditransfer dengan stabil. Plasmid dapat dikelompokkan berdasarkan sifat yang

disandi oleh gen yang dikandungnya, yaitu : (i) Plasmid F (fertilitas) membawa gen tra, yang

bertanggung jawab terhadap proses konjugasi; (ii) Plasmid R (resistensi) mengandung gen

resistensi terhadap antibiotik atau logam berat; dan (iii) Plasmid yang mengandung gen penyandi

toksin dan bakteriosin seperti ColE1 dari E.coli; (iv) Plasmid degradatif yang mempunyai

kemampuan untuk melakukan metabolisme molekul organik seperti toluen (TOL dari

Pseudomonas putida); (v) Plasmid virulensi yang bertanggung jawab terhadap patogenitas dari

sel inang (pTi pada Agrobacterium tumefaciens).

Restriksi plasmid merupakan proses pemotongan fragmen DNA pada situs tertentu sesuai yang

diinginkan dengan menggunakan enzim restriksi. Enzim restriksi adalah enzim yang bekerja

untuk memotong fragmen DNA pada situs spesifik. Enzim restriksi memotong DNA untai ganda

dengan memutus ikatan kovalen diantara fosfat dari satu deoksiribonukleotida dengan gula dari

deoksiribonukleotida yang berbatasan dengannya. Terdapat dua tipe hasil pemotongan, ujung

rata (blunt end) dan ujung kohesif (sticky end). Ujung rata (blunt end) dihasilkan ketika dua utas

molekul dipotong pada posisi yang sama, bagian akhirnya rata dan tidak ada nukleotida yang

tidak berpasangan. Ujung kohesif (sticky end) dihasilkan ketika setiap molekul DNA dipotong

pada posisi yang tidak sama sehingga salah satu utas (5’ atau 3’) menggantung dengan beberapa

nukleotida. Akhiran untai tunggal yang tidak rata ini dapat berpasangan secara spontan dengan

basa pasangannya sehingga disebut “sticky” (mudah lengket) atau kohesif. Enzim restriksi

dinamakan berdasarkan organisme dari mana enzim tersebut diisolasi. Sebagai contoh Eco RI

yang diisolasi dari Escherichia coli RY13: Eco berasal dari huruf pertama nama genus dan dua

huruf pertama nama spesies; R adalah tipe strain dan I adalah enzim pertama dari tipe tersebut.

Selain itu juga terdapat BamHI enzim pertama yang diisolasi dari Bacillus amyloliquefaciens

strain H

Alat dan Bahan :

Bahan :

1. pUC19 ( yang diisolasi sebelumnya )

2. Enzim endonuklease retriksi (ER) : BamH1, EcoR1

3. Buffer masing-masing ER

4. dH2O steril ( atau 1 x TE pH 8)

5. Standart ukuran molekul DNA

Alat :

1. Pipet mikro 0-20µm

2. Pipet mikro 20- 200 µm

3. Tabung Mikro 1,5 mL

4. Rak tabung mikro

5. Bak es dan es yang telah dihancurkan.

Prosedur Kerja :

Untuk melakukan pemotongan Plasmid pertama-tama masukan komponen-komponen dibawah

ini ke dalam tabung mikro :

DNA (µm) 10xbuffer (µm) Enzim retriksi/5

unit (µm)

DH2O steril (µm) Total Volume

(µm)

pUC19 (2) 2 0 16 20

pUC19 (2) 2 BamH1 (1) 15 20

pUC19 (2) 2 EcoR1 (1) 15 20

Kemudian tabung mikro diinkubasi pada suhu 370C selama paling tidak 2 jam. Selama

menunggu inkubasi, siapkan gel. Lalu tambahkan 5µm blue juice dan panaskan dalam penangas

air 650C selama 5 menit. Setelah itu, masukan ke dalam sumur-sumur elektroforesis dengan

urutan : standar ukuran molekul-(pUC19-BamH1)-(pUC19-EcoR1)-(pUC19 utuh), mulai dari

paling kiri.