Cilostazol Secara in Vitro

Yahdiana Harahap, Umar Mansur, Christine EstherinaDepartemen Farmasi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan AlamUniversitas Indonesia

VALIDASI METODE ANALISISCILOSTAZOL DALAM PLASMA IN VITROSECARA KROMATOGRAFI CAIRKINERJA TINGGI

Majalah Ilmu Kefarmasian, Vol. V, No. 1, April 2008, 09 - 20ISSN : 1693-9883

ABSTRACTCilostazol is an antiplatelet agent with the mechanism of action by inhibiting phos-phodiesterase III (PDE III). Referred to Food and Drug Administration(FDA),cilostazol is a drug recommended to be bioequivalence (BE) studied. A high-perfor-mance liquid chromatographic (HPLC) method with ultraviolet detector for in vitrodetermination of cilostazol in human plasma had been developed and validated.Cilostazol and pioglitazone as internal standard were extracted from human plasmaby protein precipitation method using methanol. The mobile phase consisting of ac-etonitrile-potassium di-hydrogen phosphate buffer 50 mM (40:60) was used at theflow rate of 1.5 mL/min on reversed phase C18 column (SunfireTM, 5 m, 250x4.6mm), and was detected at wavelength of 257 nm. Linearity was established withinconcentration range of 20-2000 ng/mL with coefficient correlation (r) was 0,9999.Accuracy (% diff) of this method was -14.67% up to 8.84% with precision (CV)being 0.98% to 4.93%, and absolute recovery was established to be 82.26% to 119.85%.Cilostazol in plasma was stable for 30 days in -200C storage.

Keyword: Validation, HPLC, cilostazol, pioglitazone, plasma in vitro.

ABSTRAK

Cilostazol merupakan antiplatelet yang bekerja dengan menghambat fosfodiesteraseIII (PDE III). Berdasarkan Food and Drug Administration (FDA), cilostazolmerupakan obat yang wajib untuk uji bioekuivalensi. Metode analisis menggunakankromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) dengan detektor ultraviolet untuk penentuancilostazol dalam plasma manusia in vitro telah dikembangkan dan divalidasi. Cilostazoldan pioglitazone sebagai baku dalam diekstraksi dari plasma dengan metodepengendapan protein menggunakan metanol. Fase gerak terdiri dari asetonitril-daparkalium dihidrogen fosfat 50 mM (40:60) dengan kecepatan alir 1,5 mL/menit,menggunakan kolom C18 (SunfireTM, 5 m, 250x4,6 mm) fase terbalik, dan dideteksipada panjang gelombang 257 nm. Pada rentang konsentrasi 20 - 2000 ng/mLdihasilkan kurva kalibrasi yang linier dengan koefisien korelasi (r) 0,9999. Akurasi

Corresponding author : E-mail : [email protected]

9

MAJALAH ILMU KEFARMASIAN

(% diff) dari metode ini -14,67% sampai 8,84% dengan presisi (KV) antara 0,98%sampai 4,93%, dan uji perolehan kembali absolute 82,26% sampai 119,85%. Cilostazoldalam plasma stabil selama 30 hari pada penyimpanan dengan suhu -200C.

Kata kunci: Validasi, KCKT, cilostazol, pioglitazone, plasma in vitro.

PENDAHULUAN

Cilostazol merupakan obat yangmempunyai khasiat sebagai anti-platelet. Cilostazol dipasarkan per-tama kali di Jepang pada tahun 1988dan disetujui oleh Food and Drug Ad-ministration (FDA) pada tahun 1999.Mekanisme kerja cilostazol adalahdengan menghambat fosfodiesteraseIII (PDE III), enzim yang mengu-raikan cAMP, mengakibatkan pe-ningkatan cAMP dalam platelet danpembuluh darah, sehingga terjadipenghambatan agregasi platelet danvasodilatasi (1).

Dosis yang disarankan untukcilostazol adalah 100 mg dua kalisehari atau 50 mg dua kali sehari jikapemberian bersama inhibitor iso-enzim sitokrom P450 seperti ketoko-nazol, itrakonazol dan eritromisin(2). Cilostazol diabsorpsi setelahpemberian dosis oral dan absorpsiditingkatkan jika pemberian bersamamakanan kaya lemak. Cilostazoldimetabolisme secara luas dalam hatioleh isoenzim sitokrom P450, ter-utama CYP3A4 dan sedikit olehCYP2C19, menjadi metabolit aktifdan inaktif; yang terutama diekskresidalam urin (74%) dan sisanya dalamfeses (20%). Cilostazol dan metabolitaktifnya mempunyai waktu paruheliminasi nyata 11 sampai 13 jam.

Cilostazol terikat protein sebanyak 95sampai 98% (3). Konsentrasi cilos-tazol dalam darah berkisar antara 20- 2000 ng/mL (4).

Berdasarkan Food and Drug Ad-ministration (FDA), cilostazol meru-pakan obat yang wajib untuk uji bio-ekuivalensi (5). Untuk itu diperlukansuatu metode analisis obat yangterpercaya dalam matriks biologisyang sesuai. Metode analisis yangselektif dan sensitif untuk penilaiansecara kuantitatif suatu obat danmetabolitnya penting agar berhasilmenuntun uji preklinik dan/ataubiofarmasetik dan uji farmakologiklinik. Pengukuran analit dalammatriks biologis harus divalidasi.Validasi metode bioanalisis men-cakup semua prosedur yang menun-jukkan bahwa metode khusus yangdigunakan untuk pengukuran kuan-titatif analit yang berasal dalammatriks biologis, seperti darah,plasma, serum, atau urin, dapatdipercaya dan dapat dilakukan ulang(reproducible) untuk penggunaan yangdiinginkan (6).

Penelitian mengenai metode ana-lisis cilostazol dalam matriks biologissudah cukup banyak dilakukan.Metode analisisnya menggunakanperalatan yang canggih, seperti Liq-uid Chromatography- Mass Spectrometer(LC-MS), Liquid Chromatography-Mass

10

Vol. V, No.1, April 2008

Spectrometer-Mass Spectrometer (LC/MS/MS) (7,8). Namun penerapanmetode yang telah ada tersebut tidakselalu dapat dilakukan karena diper-lukan biaya yang sangat besar untukmenyediakan peralatan yang di-butuhkan. Salah satu cara analisiscilostazol yang paling banyak di-gunakan adalah dengan kromato-grafi cair kinerja tinggi (KCKT)(1,4,9). Metode-metode analisiscilostazol dalam plasma yang telahada memiliki beberapa kesulitan,diantaranya menggunakan metodeekstraksi dengan tahapan yangpanjang, yaitu metode ekstraksi cair-cair dengan beberapa macam pelarutlalu dilanjutkan dengan ekstraksi cair-padat, atau menggunakan ekstraksicair-cair saja, serta penggunaan fasegerak dengan sistem gradien (1,4,7,8,9). Pada penelitian ini, dilakukanpengembangan metode analisis cilos-tazol dalam plasma manusia secarain vitro dengan metode KCKT meng-gunakan detektor ultraviolet yangtelah ada dengan teknik ekstraksiyang lebih sederhana, yaitu teknikpengendapan protein, sehinggadiperoleh suatu metode yang lebihsederhana dan sensitif, karena kehi-langan obat dapat diminimalisasi.

Penelitian ini bertujuan untukmemperoleh kondisi optimum untukanalisis cilostazol dalam plasma invitro secara kromatografi cair kinerjatinggi dan melakukan validasi me-tode analisis cilostazol dalam plasma

in vitro secara kromatografi cairkinerja tinggi.

METODE PENELITIAN

BahanBahan-bahan yang digunakan

adalah Cilostazol (Korea OtsukaPharmaceutical CO., Ltd.), Piogli-tazone HCl (Aarti Drugs Limited),Plasma darah (PMI), Metanol proHPLC (Merck), Asetonitril pro HPLC(Merck), Aquabidestilata (OtsukaPharmaceutical), Kalium dihidrogenfosfat (Merck).

AlatAlat yang digunakan adalah

kromatografi cair kinerja tinggi(KCKT) merek Shimadzu (Promi-nence) model LC-20AD dengandegasser DGU-20As (Prominence,Shimadzu), autosampler SIL-20A(Prominence, Shimadzu), oven kolomCTO-10AS vp (Shimadzu), dan di-lengkapi dengan detekto ultravioletSPD-20A (Prominence, Shimadzu),sistem integrasi menggunakan pe-rangkat lunak LC-Solution (Shima-dzu), kolom C18 SunfireTM 5 m (Wa-ters) dengan panjang kolom 250x4,6mm, spektrofotometer UV-Vis modelJasco V-530, sentrifugator (Profuge14 D), vorteks (Maxi Mix II-Barn-stead), timbangan analitik, pH meter(Eutech Instruments pH 510), mikro-pipet (Socorex) 100 dan 1000 l, bluetip, yellow tip, dan sample cup.

11


Cara kerja

1. Pembuatan Larutan Standara. Pembuatan Larutan Induk Cilos-tazol dan larutan uji

Cilostazol ditimbang 25,0 mgsecara seksama, dimasukkan ke da-lam labu ukur 25,0 mL dan dilarutkandengan metanol, ditambahkan hing-ga batas, sehingga diperoleh larutancilostazol dengan konsentrasi 1,0mg/mL. Pengenceran dilakukanuntuk mendapatkan larutan dengankonsentrasi tertentu.

b. Pembuatan Larutan Induk bakudalam dan larutan uji

Pioglitazone HCl ditimbang 25,0mg secara seksama, kemudian dima-sukkan ke dalam labu ukur 25,0 mLdan dilarutkan dengan metanol, di-tambahkan hingga batas, sehinggadiperoleh konsentrasi lebih kurang1,0 mg/mL. Pengenceran dilakukanuntuk mendapatkan larutan dengankonsentrasi tertentu.

2. Kondisi Kromatografi CilostazolKondisi optimum untuk analisis

cilostazol dalam plasma in vitro meng-gunakan KCKT dengan detektor UV-Vis, kolom C18 SunfireTM 5 m (Wa-ters), panjang kolom 250 x 4,6 mm,dideteksi pada panjang gelombang257,0 nm, menggunakan fase gerakasetonitril-dapar kalium dihidrogenfosfat 50 mM (40:60) dengan kece-patan alir 1,5 mL/menit dan meng-gunakan pioglitazone sebagai bakudalam.

3. Validasi Metode Analisis Cilostazoldalam Plasma

a. Penyiapan Sampel Cilostazoldalam Plasma

Plasma yang mengandung cilo-stazol dengan konsentrasi tertentusebanyak 600,0 L dimasukkan kedalam sample cup lalu ditambahkan50,0 l baku dalam (20,0 g/mL) dan600,0 l metanol, lalu dikocok denganvorteks selama 1 menit dan disen-trifugasi selama 10 menit dengankecepatan 5000 rpm. Supernatandipindahkan ke dalam vial auto-sampler, sebanyak 100,0 l larutandisuntikkan ke alat KCKT.

b. Pengukuran LOD dan LLOQLarutan cilostazol dalam plasma

disiapkan dengan konsentrasi 20,0;100,0; 500,0; 1000,0; 1500,0 dan 2000,0ng/mL dengan penambahan 50,0 lbaku dalam (20,0 g/mL), kemudiandiekstraksi seperti cara penyiapansampel. Sebanyak 100,0 l aliquotmasing-masing larutan tersebut di-suntikkan ke alat KCKT pada kon-disi terpilih. Dari data pengukurankemudian dihitung nilai LOQ. Setelahdiperoleh nilai LOQ, maka disiapkanlarutan cilostazol dalam plasmadengan konsentrasi setengah atauseperempat LOQ, lalu supernatanhasil ekstraksi disuntikkan sebanyak100,0 l pada alat KCKT pada kondisiterpilih sebanyak 5 kali. Dihitungpersentase akurasi (%diff) dan koe-fisien variasinya (KV).

12


c. Pembuatan Kurva Kalibrasi danUji Linearitas dalam Plasma In vitro

Sampel blanko (plasma tanpabaku dalam), sampel zero (plasmadengan baku dalam), serta larutancilostazol dalam plasma dengankonsentrasi 20,0; 100,0; 500,0; 1000,0;1500,0 dan 2000,0 ng/mL denganpenambahan 50,0 l baku dalam (20,0g/mL) disiapkan, kemudian dieks-traksi seperti pada cara penyiapansampel. Sebanyak 100,0 l aliquotmasing-masing larutan tersebutdisuntikkan ke alat KCKT pada kon-disi terpilih masing-masing sebanyak5 kali.

d. Uji Akurasi dan PresisiLarutan cilostazol dalam plasma

dengan konsentrasi rendah (60,0 ng/mL), sedang (830,0 ng/mL), dantinggi (1600,0 ng/mL) dengan 50,0 lbaku dalam (20,0 g/mL) disiapkan,lalu diekstraksi seperti pada carapenyiapan sampel. Sebanyak 100,0 laliquot masing-masing larutantersebut disuntikkan ke alat KCKTpada kondisi terpilih, diulangisebanyak 5 kali untuk masing-masingkonsentrasi. Uji dilakukan selama 5hari berturut-turut (akurasi danpresisi intra-day dan inter-day).

e. Uji Perolehan Kembali (% recov-ery)

Larutan cilostazol dalam plasmadengan konsentrasi rendah (60,0 ng/mL), sedang (830,0 ng/mL), dantinggi (1600,0 ng/mL) dengan 50,0 lbaku dalam (20,0 g/mL) disiapkan,lalu diekstraksi seperti pada cara

penyiapan sampel. Sebanyak 100,0 laliquot masing-masing larutan ter-sebut disuntikkan ke alat KCKT padakondisi terpilih sebanyak 5 kali.

f. Uji Selektivitas Metode Analisisdalam Plasma

Sampel plasma yang mengan-dung cilostazol pada konsentrasiLLOQ dengan 50,0 l baku dalam(20,0 g/mL) disiapkan, setelah itudiekstraksi seperti pada penyiapansampel. Sebanyak 100,0 l aliquotmasing-masing larutan tersebut di-suntikkan ke alat KCKT pada kon-disi terpilih sebanyak 5 kali. Diujiterhadap plasma yang berasal darienam sumber yang berbeda.

g. Pengujian Stabilitas1) Stabilitas Beku dan Cair

Larutan cilostazol dalamplasma dengan konsentrasi ren-dah (60,0 ng/mL), sedang (830,0ng/mL), dan tinggi (1600,0 ng/mL) disiapkan, lalu dilakukantiga siklus beku cair. Setelah ituditambahkan 50,0 l baku dalam(20,0 g/mL) dan dilakukanekstraksi, disuntikkan dua ali-quot untuk masing-masing kon-sentrasi sebanyak 100,0 l ke alatKCKT (sebelumnya diukur pulapada t = 0, pada saat sebelumdilakukan tiga siklus beku cair).

2) Stabilitas Jangka PendekLarutan cilostazol dalam

plasma dengan konsentrasirendah (60,0 ng/mL), sedang(830,0 ng/mL), dan tinggi (1600,0

13


ng/mL) disiapkan, kemudiandisimpan pada temperatur kamarselama 24 jam, diukur padarentang waktu 0, 6 dan 24 jam.Sebelum diukur, ditambahkan50,0 l baku dalam (20,0 g/mL)dan dilakukan ekstraksi, disun-tikkan dua aliquot untuk masing-masing konsentrasi sebanyak100,0 l ke alat KCKT.

3) Stabilitas Larutan StokLarutan cilostazol dengan

konsentrasi 10,0 l/mL dan bakudalam 10,0 l/mL disiapkan.Sebagian larutan disimpan padatemperatur kamar selama 24 jam(untuk stabilitas jangka pendek)dan sebagian lagi disimpandalam lemari pendingin (40C)selama 20 hari (untuk stabilitasjangka panjang). Kemudian di-suntikkan masing-masing 20,0 lke alat KCKT pada kondisi ter-pilih. Ketidakstabilan zat diamatidengan membandingkan responinstrumen terhadap larutan stokyang telah disimpan denganlarutan stok yang disiapkan se-saat sebelum disuntikkan.

4) Stabilitas Paska Preparasi(Post Preparation Stability)

Disiapkan larutan cilostazoldalam plasma dengan konsen-trasi rendah (60,0 ng/mL), se-dang (830,0 ng/mL), dan tinggi(1600,0 ng/mL), kemudian di-tambahkan dengan 50,0 l bakudalam dan dilakukan ekstraksiseperti pada penyiapan sampel,

lalu disuntikkan dua aliquotuntuk masing-masing konsen-trasi sebanyak 100,0 l ke alatKCKT pada kondisi analisisterpilih. Sebagian disimpan da-lam rak autosampler pada suhukamar. Analisis dilakukan padajam ke-0 dan 22. Ketidakstabilanzat diamati dengan menghitungnilai % diff dan mengamatibentuk masing-masing kroma-togram.

5) Stabilitas Jangka PanjangLarutan cilostazol dalam

plasma dengan konsentrasirendah (60,0 ng/mL), sedang(830,0 ng/mL), dan tinggi (1600,0ng/mL), kemudian disimpanselama 1 bulan dan diperiksapada hari ke-0, 14 dan 30. Padasaat akan diperiksa, ditambah-kan dengan 50,0 l baku dalam(20,0 g/mL) dan dilakukanekstraksi seperti pada penyiapansampel, lalu disuntikkan dua ali-quot untuk masing-masing kon-sentrasi sebanyak 100,0 l ke alatKCKT pada kondisi analisisterpilih. Ketidakstabilan zatdiamati dengan menghitung nilai% diff dan mengamati bentukmasing-masing kromatogram.

HASIL DAN PEMBAHASANPada pencarian kondisi analisis

optimum diperoleh kondisi kroma-tografi, menggunakan kolom C18SunfireTM 5 m (Waters), panjangkolom 250 x 4,6 mm, fase gerak aseto-nitril-dapar kalium dihidrogen fosfat

14


50 mM pH 5,2 (40:60), kecepatan alir1,5 mL/menit, detektor ultravioletpada panjang gelombang 257,0 nm.

Waktu retensi cilostazol danpioglitazon (baku dalam) berturut-turut adalah 9,40 menit dan 15,60menit (Gambar 1).

Validasi suatu metode analisisperlu dilakukan sebelum metode ter-sebut digunakan untuk penelitianlebih lanjut, seperti uji bioavailabi-litas, bioekuivalensi, dan farmako-kinetik. Sudah ada beberapa metodeyang telah dikembangkan oleh pene-liti-peneliti terdahulu untuk analisiscilostazol dalam plasma denganmenggunakan KCKT atau peralatanyang lebih modern seperti LC-MSatau LC-MS-MS. Namun metode ana-lisis tersebut mempunyai kelemahan,yaitu kerumitan dalam metode eks-traksi yang menggunakan ekstraksifase padat kemudian dilanjutkandengan ekstraksi cair-cair atau meng-gunakan ekstraksi cair-cair saja, sertaperalatan analisis yang canggih

(dengan spektrometer massa) yangtidak selalu terdapat di semua labo-ratorium. Metode analisis yang di-gunakan dalam penelitian ini mem-punyai beberapa kelebihan, yaitumenggunakan metode ekstraksi yangsederhana serta menggunakan alatKCKT yang umum.

Berdasarkan literatur, diperolehrentang konsentrasi cilostazol dalamplasma adalah 20,0-2000,0 ng/mL (4),maka dari itu dibuat kurva kalibrasiuntuk menghitung LOQ dan menen-tukan LLOQ dengan rentang kon-sentrasi 20,0; 100,0; 500,0; 1000,0;1500,0 dan 2000,0 ng/mL. Berdasar-kan perhitungan statistik diperolehnilai LOD 71,5 ng/mL dan nilai LOQsebesar 238,32 ng/mL. LLOQ meru-pakan konsentrasi terendah analitdalam sampel yang dapat ditentukansecara kuantitatif dan masih meme-nuhi syarat akurasi dan presisi,dimana nilai % diff pada lima kalipenyuntikan tidak lebih dari + 20%(6). Untuk menetapkan nilai LLOQ,

Gambar 1. Kromatogram ekstrak plasma dengan penambahan cilostazolkonsentrasi 2,0 g/mL dan baku dalam pioglitazone 1,6 g/mL.

15


tahap yang dilakukan adalah denganmembuat konsentrasi setengah atauseperempat dari nilai LOQ lalu di-hitung nilai % diff dari lima kali pe-nyuntikan, tetapi karena pada pem-buatan kurva kalibrasi konsentrasi20,0 ng/mL masih memberikan nilai% diff di bawah 20%, maka dicobadilakukan lima kali penyuntikan padakonsentrasi tersebut. Dari lima kalipenyuntikan didapatkan nilai % difftidak ada yang menyimpang lebihdari +20% atau kurang dari -20%,maka ditetapkan nilai LLOQ adalahsebesar 20,0 ng/mL. Hal tersebutmenunjukkan bahwa metode yangdigunakan sensitif. Setelah diperolehnilai LLOQ, dibuat kurva kalibrasidan uji linearitas dengan menghitungkoefisien korelasi dari kurva kali-brasi, dengan rentang konsentrasilebih kurang 20,0-2000,0 ng/mL, dimana nilai LLOQ harus menjadikonsentrasi terendah dari kurva

kalibrasi. Pada pembuatan kurvakalibrasi disuntikkan plasma blanko(plasma tanpa penambahan cilostazoldan baku dalam), plasma zero (plasmadengan penambahan baku dalam),dan enam larutan cilostazol dalamplasma dengan penambahan bakudalam, masing-masing sebanyak limakali penyuntikan. Dari hasil analisisdiperoleh persamaan regresi lineary = 0,0025x + 0,0066 dengan koefisienkorelasi r = 0,9999, di mana kriterialinearitas untuk sediaan dalam ma-triks biologis adalah r = 0,998. Makadapat disimpulkan bahwa metodeanalisis cilostazol dalam plasmadengan rentang konsentrasi 20,0-2000,0 ng/mL memenuhi kriteria ujilinearitas.

Pada uji selektivitas, dilakukananalisis terhadap enam plasma darisumber yang berbeda pada konsen-trasi LLOQ yaitu 20,0 ng/mL. Darihasil yang diperoleh, dihitung nilai

Tabel 1. Data uji selektivitas cilostazol dalam plasma in vitrodengan penambahan baku dalam

Konsentrasi Plasma Konsentrasi Rata-rata SD CV % diffsebenarnya (ng/ml) terukur (ng/ml)

A 16,24 -18,7916,03 19,86

B 18,70 -6,5216,98 15,08

C 18,31 -8,46

20,0 ng/ml 20,84 17,86 1,60 8,97 4,21

D 17,12 14,4020,51 2,56

E 18,13 -9,3418,38 -8,09

F 16,94 -15,2816,14 -19,32

16


KV kurang dari 20% dan % diff tidakmenyimpang lebih dari +20% ataukurang dari -20%, serta tidak adapuncak pengganggu pada wakturetensi cilostazol dan pioglitazone.

Dapat disimpulkan bahwa me-tode analisis yang digunakan adalahselektif. Pada uji akurasi, presisi, danperolehan kembali, dilakukan analisisterhadap tiga rentang konsentrasiyang disebut sebagai Quality controlsample (QC), yaitu konsentrasi rendah(60,0 ng/mL), sedang (830,0 ng/mL),dan tinggi (1600,0 ng/mL). Uji yangdilakukan adalah uji intra-day daninter-day selama lima hari berturut-turut. Dari hasil perhitungan, diper-oleh nilai % diff untuk uji akurasitidak menyimpang kurang dari -15%atau lebih dari +15% untuk masing-masing konsentrasi selama lima hariuji (intra-day), dan nilai % diff dari tiapkonsentrasi tidak berubah secarasignifikan dari hari ke hari (inter-day).Untuk uji presisi diperoleh nilai KVkurang dari 15% untuk masing-

masing konsentrasi selama lima hariuji (intra-day), begitu juga pada ujiinter-day. Data tersebut menunjukkanbahwa metode analisis memilikiketerulangan yang baik, dalam satuhari analisis atau dari hari ke hari,karena nilai KV tidak lebih dari15%. Untuk uji perolehan kembaliabsolut, diperoleh nilai persen per-olehan kembali seluruhnya beradadalam rentang 80-120%. Berdasarkandata-data yang diperoleh, dapatdisimpulkan bahwa metode analisisyang digunakan memenuhi kriteriauji akurasi, presisi dan perolehankembali.

Uji stabilitas perlu dilakukanuntuk mengetahui batas waktukestaan larutan standar dan larutancilostazol dalam plasma. Hasil ujistabilitas larutan standar menentukankapan suatu larutan masih dapatdigunakan atau harus dibuat barusedangkan hasil uji stabilitas larutancilostazol dalam plasma menentukanbatas waktu pemeriksaan setelah

Gambar 2. Kromatogram ekstrak plasma tanpa penambahan cilostazoldan baku dalam pioglitazone (plasma blanko)

17


pengambilan sampel darah dilaku-kan. Uji stabilitas yang dilakukanadalah uji stabilitas larutan stokcilostazol, stabilitas beku-cair, sta-bilitas jangka pendek, stabilitasselama berada dalam autosampler(stabilitas post-preparatif), dan sta-bilitas jangka panjang. Dari hasil ujistabilitas larutan stok diperoleh ke-simpulan bahwa larutan stok cilos-tazol stabil selama 7 hari dengan pe-nyimpanan dalam lemari pendingin(suhu + 40C), ditunjukkan dari nilai% diff terhadap jam ke-0 (larutan stokyang baru dibuat) yang tidak me-nyimpang lebih dari +2% dan -2%.Pada uji stabilitas beku-cair, stabilitasjangka pendek, dan stabilitas post-preparatif, diperoleh nilai % diff jugatidak menyimpang lebih dari +15%

dan -15%.Dapat disimpulkan bahwa larut-

an cilostazol dalam plasma memenuhikriteria uji stabilitas beku-cair, sta-bilitas jangka pendek, dan stabilitaspost-preparatif. Pada uji stabilitasjangka panjang diperoleh data bahwasampai hari ke-30, larutan cilostazoldalam plasma yang disimpan difreezer pada suhu -200C masih stabil,ditunjukkan dari perhitungan nilai %diff yang tidak menyimpang lebihdari +15% dan -15%, serta bentukkromatogram yang tidak berubah.

Dari penelitian yang telah dila-kukan oleh ChauHwei J. Fu et al,menunjukkan bahwa larutan cilos-tazol dalam plasma stabil pada pe-nyimpanan -200C selama 12,5 bulan(10).

Konsentrasi Hari Konsentrasi Rata-rata SD CV % diffsebenarnya (ng/ml) ke- terukur (ng/ml)

1 54,00 -9,992 53,11 -11,48

60,0 3 58,62 55,15 3,00 5,43 -2,304 51,98 -13,365 58,05 -3,26

1 890,88 7,332 726,32 -12,49

830,0 3 869,53 833,39 63,92 7,67 4,764 849,55 2,365 830,66 0,08

1 1672,16 4,512 1500,63 6,21

1600,0 3 1638,18 1613,42 66,10 4,10 2,394 1616,63 1,04

5 1639,51 2,47

Tabel 2. Data uji akurasi dan presisi cilostazol dalam plasma in vitrodengan penambahan baku dalam selama 5 hari (uji inter-day)

18


Konsentrasi Jam Konsentrasi Konsentrasi % diffSebenarnya (ng/ml) ke- Terukur (ng/ml) rata-rata (ng/ml)

0 53,72 53,93 -10,4754,15 -9,75

60,0 6 57,15 56,74 -4,7556,32 -6,13

24 58,02 57,79 -3,3057,56 -4,06

0 812,85 806,66 -2,07800,46 -3,56

830,0 6 738,35 734,69 -11,04731,03 -11,92

24 918,94 914,05 10,72909,16 9,54

0 1546,15 1549,34 -3,371552,53 -2,97

1600,0 6 1479,35 1459,49 -7,541439,62 -10,02

24 1706,96 1743,22 6,68 1779,48 11,22

Tabel 3. Data uji stabilitas jangka pendek cilostazol dalam plasma in vitrodengan penambahan baku dalam

Konsentrasi Jam Konsentrasi Konsentrasi % diffSebenarnya (ng/ml) ke- Terukur (ng/ml) rata-rata (ng/ml)

0 53,71 53,44 -10,4853,17 -11,38

60,0 14 56,04 56,17 -6,6056,29 -6,18

30 51,03 51,48 -14,9451,93 -13,45

0 783,06 768,20 -5,66753,34 9,24

830,0 14 850,33 844,46 2,45838,59 1,04

30 710,68 708,40 -14,38706,13 -14,92

0 1453,70 1444,37 -9,141435,04 -10,31

1600,0 14 1681,58 1647,85 5,101614,12 0,88

30 1516,89 1486,48 -5,191456,07 -9,00

Tabel 4. Data uji stabilitas jangka panjang cilostazol dalam plasma in vitrodengan penambahan baku dalam

19


KESIMPULAN

Hasil validasi dari metode bio-analisis yang dikembangkan denganmetode ekstraksi yang lebih seder-hana menunjukkan kriteria validasi,yaitu selektivitas, kurva kalibrasi,linearitas, akurasi, presisi, perolehankembali, dan stabilitas memenuhisyarat yang ditetapkan oleh FDAdalam Guidance for Industry: Bio-analytical Method Validation.

DAFTAR ACUAN

1. Shi, SJ, ZF Li, HT Chen, FD Zeng.2005. Cardiovascular Effects andSimultaneous Pharmacokineticand Pharmacodynamic Modelingof Cilostazol in Healthy Subjects.Asian J Drug Metab Pharmacokinet.5(4): 301-308.

2. Anonim. 2003. Product Mono-graph: Pletal (Cilostazol). OtsukaPharmaceutical Europe Limited.London.

3. Anonim. 2007. Martindale: TheComplete Drug Reference, 35th edi-tion. The Pharmaceutical Press.

4. Varanasi, VSK, S Veeraraghavan,P Suresh, RSS Thappali, R Ragha-van, V SSK Vakkalanka. 2008.Validated High Performance Liq-uid Chromatographic Methodfor Simultaneous Determinationof Rosiglitazone, Cilostazol, and3,4-Dehydro-cilostazol in RatPlasma and Its Application toPharmacokinetics. Arzneim-Forsch/ Drug Res. 58(6): 288298.

5. Guidance for Industry: IndividualProduct Bioequivalence Recommen-

dations. 2007. Center for DrugEvaluation and Research (CDER). http://www.fda.gov/cder/guidance/bioequivalence/default.htm. Tanggal 19 Januari2009 pukul 10.03.

6. Guidance for Industry: Bio-analytical Method Validation. 2001.Center for Drug Evaluation andResearch (CDER). http//www.fda.gov/cder/guidance/index.htm. Tanggal 26 November 2008pukul 08.56.

7. Bramer SL, PN Tata, SS Vengur-lekar, JH Brisson. 2001. Methodfor the Quantitative Analysis ofCilostazol and Its Metabolites inHuman Plasma Using LC/MS/MS. J Pharm Biomed Anal. 26: 637650.

8. Nirogi RV, VN Kandikere, MShukla, K Mudigonda, W Shri-vasthava, PV Datla, A Yerramilli.2006. Simultaneous Quantifica-tion of Cilostazol and Its PrimaryMetabolite 3,4-Dehydrocilos-tazol in Human Plasma by RapidLiquid Chromatography/Tan-dem Mass Spectrometry. AnalBioanal Chem. 384(3): 780-790.

9. Fu CJ, PN Tata, K Okada, HAkiyama, SL Bramer. 1999. Si-multaneous Quantitative Deter-mination of Cilostazol and ItsMetabolites in Human Plasma byHigh-Performance Liquid Chro-matography. J Chromatogr B Bio-med Sci Appl. 728: 251262.

10. Anonim. 2005. Clarkes Analysis ofDrugs and Poisons. Pharmaceuti-cal Press.

20

Cilostazol Secara in Vitro

Documents

Transcript of Cilostazol Secara in Vitro