MAKALAH BIOTEKNOLOGI

DNA MICROARRAY

Disusun oleh : Maria Asri A. Keshia Dinda W. Radian Dyah Siti Ummaiyah Laksmi H.P Tasya Adistya Sekar Putri 06/ 193678 / KG / 8038 06/ 193691 / KG / 8040 N.S. 06/ 193707 / KG / 8042 06/ 193744 / KG / 8044 06/ 193766 / KG / 8046 06/ 193780 / KG / 8048 06/ 193814 / KG / 8050

FAKULTAS KEDOKTERAN GIGI UNIVERSITAS GADJAH MADA YOGYAKARTA 2009

DNA MICROARRAY

A. DEFINISI DNA MICROARRAY

DNA Microarray adalah suatu metode yang digunakan untuk menganalisa ekspresi gen dalam jumlah besar secara simultan dan dalam satu kali eksperimen saja karena metode ini dapat menyaring ribuan gen dalam satu eksperimen saja. DNA Microarray ini merupakan teknologi multiplex yang digunakan dalam dunia kedokteran. Tidak hanya dalam dunia kedokteran saja, teknologi ini juga umum digunakan dalam biologi molekuler di mana titik-titik kecil diatur dalam DNA spesifik padatan (biasanya gelas). DNA Microarray (DNA array) dikenal juga sebagai Chip-DNA. Dinamakan Chip-DNA karena teknologi ini menggunakan lempengan kecil (chip) yang terbuat dari kaca yang diatasnya ditata sejumlah ribuan atau bahkan puluhan ribu jenis gen dalam bentuk fragmen DNA hasil penggandaan dari cDNA. Selanjutnya chip yang memuat fragmen DNA dari ribuan jenis gen tersebut digunakan untuk menganalisis ekspresi gen dari suatu jenis sel dengan metode hibridisasi. DNA Microarray atau Chip-DNA dapat digunakan untuk mengatasi persoalan dalam analisis pola-pola ekspresi sejumlah besar gen yang dimiliki manusia. DNA Microarray terdiri dari satu set yang terdiri dari ribuan titik-titik mikroskopis DNA oligonucleotides, disebut fitur, masing-masing berisi picomoles (1012 mol) dari sekuens DNA tertentu, yang dikenal sebagai probe (atau reporter). Ini bisa menjadi bagian pendek dari sebuah gen atau unsur DNA lain yang digunakan untuk berhibridisasi cDNA atau cRNA sampel (disebut sasaran) di bawah kondisi keketatan tinggi. Array itu sendiri merupakan suatu susunan teratur sampel di mana pencocokan sampel DNA diketahui dan tidak diketahui didasarkan pada aturan-aturan dasar korespondensi. Eksperimen array memanfaatkan sistem assay umum seperti microplates

atau immunoblotting standar membran. Ukuran sampel spot umumnya kurang dari 200 mikron diameter biasanya berisi ribuan bintik-bintik.B. TUJUAN DNA MICROARRAY

1.

Mampu menganalisis ekspresi seluruh gen yang terdapat di dalam sel manusia

sehingga membantu manusia dalam melakukan identifikasi seluruh sifat yang melekat pada seseorang.2.

Mendeteksi RNA (paling sering sebagai cDNA setelah transkripsi balik) yang

mungkin atau tidak akan diterjemahkan menjadi protein.3.

Membantu dalam identifikasi gen baru, mengetahui tentang fungsi dan tingkat

ekspresi mereka di bawah kondisi yang berbeda.4.

Membantu manusia dalam melakukan diagnosis, memonitor dan memprediksi suatu penyakit. Teknologi DNA microarray dapat membantu para peneliti mempelajari lebih

lanjut tentang berbagai penyakit seperti penyakit jantung, penyakit mental, penyakit menular dan terutama studi tentang kanker. Sampai saat ini, berbagai jenis kanker telah diklasifikasikan berdasarkan organ-organ di mana tumor tumbuh. Sekarang, dengan perkembangan teknologi microarray, maka akan mungkin bagi peneliti untuk lebih mengklasifikasikan jenis kanker berdasarkan pola-pola aktivitas gen dalam sel tumor. Ini akan sangat membantu masyarakat farmasi untuk mengembangkan obat yang lebih efektif sebagai strategi pengobatan akan ditargetkan langsung ke jenis kanker tertentu. Teknologi Chip-DNA yang didasarkan pada analisis fungsional genomik akan menawarkan paradigma baru dalam diagnosis dan terapi suatu penyakit serta pengembangan dan penemuan obat baru. Paradigma ini diharapkan akan berkembang dengan pesat sehingga akan mampu mengidentifikasi sejumlah besar penyakit yang ada pada manusia yang berhubungan dengan kelainan ekspresi gen (pola penyediaan protein). Selanjutnya juga akan dapat diidentifikasi mengenai kemungkinan adanya resiko munculnya penyakit tertentu berdasarkan pola ekspresi gen, seperti misalnya kanker, diabetes, kardiovaskuler dan lainnya.

5.

Pengembangan dan penemuan obat baru Dengan menggunakan metode ini diharapkan penemuan obat baru dengan

target yang spesifik akan berkembang pesat serta seluruh jenis obat yang telah diketahui pengaruhnya terhadap ekspresi-ekspresi gen tertentu mampu diketahui khasiatnya serta efek sampingnya dengan lebih jelas. Dalam hal ini, lebih spesifiknya dibahas dalam bidang Pharmacogenomics. Pharmacogenomics adalah studi korelasi antara respon terhadap terapi obat dan profil genetik pasien. Analisis komparatif dari gen berpenyakit dan sel-sel normal akan membantu mengidentifikasi konstitusi biokimia protein yang disintesis oleh gen berpenyakit. Peneliti dapat menggunakan informasi ini untuk mensintesis obat yang berjuang dengan protein ini dan mengurangi dampaknya. Metoda DNA microarray memungkinkan untuk menganalisis pola ekspresi genetic global yang mencerminkan sifat tanggapannya terhadap suatu perlakuan (misalnya obat) yang meliputi farmakokinetik, farmakodinamik dan efek samping. Di samping itu metode ini juga dapat untuk menganalisis dan memperkirakan sifat pola penyakit dan tanggapannya terhadap suatu perlakuan.6.

Penelitian toksikologi Teknologi microarray menyediakan platform yang kuat untuk mempelajari racun pada sel dan mengantarkan mereka ke keturunannya.

dampak

Toxicogenomics menetapkan korelasi antara tanggapan terhadap toxicants dan perubahan dalam profil genetik sel-sel ini terkena toxicants.

C. JENIS DNA MICROARRAY Ada banyak jenis array dan dengan berdasarkan perbedaan pengaturan spasial pada suatu permukaan yang dikodekan:1. Tradisional fase padat-array

yaitu kumpulan teratur mikroskopis "spot", yang disebut fitur, masingmasing dengan probe yang spesifik yang melekat pada permukaan padat seperti kaca, plastik atau silicon biochip (umumnya dikenal gen chip, genom chip, chip

DNA atau gen array).Ribuan dari mereka dapat ditempatkan di lokasi yang dikenal pada satu DNA microarray.2. The alternative bead array

yaitu

kumpulan mikroskopis polystyrene bead, masing-masing dengan

probe yang spesifik dan rasio dari dua atau lebih pewarna, yang tidak mengganggu neon pewarna yang digunakan dalam sekuens target. Jenis microarray tersebut tergantung pada jenis sampel yang digunakan untuk bergerak untuk membangun sebuah array dan informasi yang masuk akal, eksperimen microarray dapat dikategorikan dalam tiga cara:1. Analisis microarray Expression

Pada konfigurasi percobaan ini, cDNA berasal dari mRNA dari gen yang dikenal bergerak. Sampel gen dari kedua yang normal dan jaringan yang sakit. Bercak dengan lebih banyak intensitasnya diperoleh untuk gen-gen jaringan berpenyakit , jika gen diekspresikan secara berlebihan dalam kondisi sakit . Pola ekspresi ini kemudian dibandingkan dengan pola ekspresi gen bertanggung jawab untuk suatu penyakit.2. Microarray untuk analisis mutasi

Untuk analisis ini, peneliti menggunakan gDNA. Gen yang mungkin berbeda satu sama lain oleh kurangnya satu basa nukleotida. Salah satu perbedaan mendasar antara kedua sekuens dikenal sebagai polimorfisme nukleotida tunggal (SNP) dan mendeteksi mereka dikenal sebagai deteksi SNP3. Perbandingan genom hibridisasi

Ini digunakan untuk mengidentifikasi kenaikan atau penurunan dari fragmen kromosom utama untuk menyelamatkan gen yang terlibat dalam penyakit.

D. CARA KERJA DNA MICROARRAY Prinsip DNA Microarray Prinsip di balik inti microarray adalah hibridisasi antara dua untai DNA, milik komplementer sekuens asam nukleat pasangan secara khusus satu sama lain dengan membentuk ikatan hidrogen yang saling melengkapi antara pasangan basa nukleotida. Jumlah tinggi pasangan basa komplementer dalam sekuens nukleotida

berarti lebih erat non-kovalen ikatan antara kedua untai. Setelah mencuci off nonikatan spesifik sekuens, hanya untaian pasangan kuat akan tetap hibridisasi. Jadi berlabel fluorescently sekuens target yang mengikat ke urutan probe menghasilkan sinyal yang bergantung pada kekuatan hibridisasi, ditentukan oleh jumlah pasangan basa, kondisi hibridisasi (seperti suhu), dan mencuci setelah hibridisasi. Mikroarray menggunakan Quantitation relatif di mana intensitas fitur dibandingkan dengan intensitas fitur yang sama di bawah kondisi yang berbeda, dan identitas fitur tersebut dikenal dengan posisinya. Sebuah alternatif untuk mikroarray adalah analisis serial ekspresi gen, di mana Transkriptomika adalah sequencing memungkinkan pengukuran mutlak.

(Hibridisasi dari target ke probe)

(langkah microarray) Pembuatan DNA Microarray Microarray dapat dibuat dengan cara yang berbeda, tergantung pada jumlah probe di bawah pemeriksaan, biaya, persyaratan kustomisasi, dan jenis pertanyaan

ilmiah yang diminta. Array mungkin memiliki sedikitnya 10 probe atau hingga 2,1 juta skala micrometre probe dari vendor komersial. Langkah-langkah utama yang terlibat dalam pembuatan DNA microarray:1. 2. 3. 4. 5. 6.

Proses produksi microarray Persiapan target Hibridisasi Scanning slide Analisis data Ekspresi pengelompokan profil

1.

Proses produksi microarray Fragmen DNA yang diperkuat dengan teknik PCR diletakkan pada glass slide mikroskop dilapisi dengan polylysine sebelum proses spotting. Pelapisan polylysine ini bertujuan untuk memastikan fiksasi DNA melalui interaksi elektrostatik. Persiapan slide dicapai dengan memblok polylysine tidak terfiksasi pada DNA untuk menghindari binding target. Sebelum hibridisasi, DNA didenaturasi untuk memperoleh untai tunggal DNA pada microarray, ini akan memungkinkan probe untuk mengikat untai komplementer dari target. Persiapan slide dicapai dengan menghalangi polylysine tidak tetap untuk DNA untuk menghindari target mengikat. DNA didenaturasi untuk memperoleh untai tunggal DNA pada microarray, ini akan memungkinkan probe untuk mengikat untai komplementer dari target. Berikut merupakan contoh glass slide microarray dan oligonucleotida chip:

High density glass slide

Glass slides (microarrays)

Oligonucleotides chips

Detail:

Detail:

Detail:

Ukuran: 12cm x 8cm

Ukuran: 5,4 cm x 0,9 cm

Ukuran: 1,28cmx1,28cm

2400 klon radioactive labelling kondisi

10.000 klon oleh slide fluorescent labelling kondisi eksperimental oleh slide

300.000

oleh membran

oligonucleotides oleh slide

fluorescent kondisi oleh

eksperimental oleh membran

labelling

experimntal slide2.

Persiapan target RNA diekstraksi dari 2 kultur berbeda dimana kita ingin membandingkan tingkat ekspresi. mRNA ditansformasi menjadi cDNA dengan reverse transcription. Pada tahap ini, DNA dari kutur 1 pertama dengan pewarnaan hijau, sedangkan DNA dari kultur 2 diberi label dengan pewarna merah.

3.

Hibridisasi CDNA berlabel hijau dan merah dicampur bersama-sama (hal ini disebut target) kemudian diletakkan pada matriks untai tunggal DNA (hal ini disebut probe). Chip ini kemudian diinkubasi satu malam pada suhu 600. Pada suhu ini, strand DNA bertemu dengan untai komplementer dan cocok bersama untuk menciptakan untai ganda DNA. DNA fluorescent akan terhibridisasi.

4.

Scanning slide

Laser tertarik pada setiap titik dan emisi fluorescent akan bergabung melalui photo-multiplicator (PMT) untuk bersatu dengan mikroskop konfocal. Disini terlihat 2 image dimana skala abu-abu memperlihatkan intensitas fluorescent. Jika kita mengganti warna abu-abu dengan warna hijau untuk image yang pertama dan warna merah untuk image yang kedua. Dengan menempatkan kedua image ini, ada satu image pada titik hijau (dimana hanya DNA dari kondisi pertama terfiksasi) berubah menjadi merah (dimana DNA dari kondisi kedua yang terfiksasi) melewati warna kuning (dimana merupakan DNA dari 2 kondisi terfiksasi dnegan jumlah yang sama).

5.

Analisis data Kita mempunyai 2 image microarray dimana kita harus menghitung jumlah molekul DNA pada setiap kondisi. Kita mengukur jumlah sinyal pada panjang gelombang emisi warna hijau dan jumlah sinyal pada emisi panjang gelombang warna merah . Kemudian kita normalkan jumlah ini sesuai dengan parameternyan ( jumlah ragi pada percobaan ini dalam setiap kondisi kultur). Kita menganggap bahwa jumlah DNA fluorescent yang terfiksasi sebanding dengan jumlah mRNA yang hadir di setiap sel kemudian kita menghitung rasio merah / hijau fluoresensi. Jika rasio ini lebih besar dari image 1 (telihat merah pada gambar), ekspresi gen lebih besar dalam kondisi percobaan kedua, jika rasio ini lebih kecil dari 1 ( terlihat hijau pada gambar), ekspresi gen yang lebih besar pada kondisi pertama.

6.

Ekspresi pengelompokan profil Kemudian kita dapat mencoba untuk mengumpulkan gen yang memiliki profil ekspresi yang sama pada beberapa eksperimen. Pengelompokan ini dapat dilakukan secara bertahap sebagai analisis filogenetik, yang terdiri dari penghitungan kesamaan kriteria antara ekspresi profil dan pengumpulan yang paling mirip. Kita juga dapat menggunakan teknik yang lebih kompleks seperti analisis komponen utama atau neuronal networks. Pada akhir pengelompokan biasanya ditampilkan sebuah matriks dimana setiap kolom mewakili satu ekpresimen dan setiap baris gen. Rasio ditampilkan berkat skala warna dari hijau (repressed gen) menjadi merah (induced gen).

E. APLIKASI PENGGUNAAN DNA MICROARRAY

Aplikasi atau teknologi

Sinopsis

Ekspresi gen profil

Dalam sebuah mRNA atau profil ekspresi gen percobaan dengan ekspresi tingkat ribuan gen secara bersamaan dimonitor untuk mempelajari efek pengobatan tertentu, penyakit, dan tahap-tahap perkembangan pada ekspresi gen. Sebagai contoh, microarray berdasarkan profil ekspresi gen dapat digunakan untuk mengidentifikasi gen yang ekspresinya berubah sebagai respons terhadap patogen atau organisme lain dengan membandingkan ekspresi gen di terinfeksi ke dalam sel atau jaringan yang tidak terinfeksi.

Genomik komparatif hibridisasi

Genom menilai konten dalam sel yang berbeda atau organisme terkait erat.

GeneID

Kecil ID mikroarray untuk memeriksa organisme dalam makanan dan pakan (seperti GMO [1]), mycoplasms dalam kultur sel, atau patogen untuk pendeteksian penyakit, kebanyakan menggabungkan PCR dan teknologi microarray.

Sekuens DNA terikat dengan protein tertentu dapat diisolasi oleh immunoprecipitating bahwa protein (CHIP), fragmen-fragmen ini dapat kemudian hibridisasi ke microarray (seperti ubin array) yang memungkinkan penentuan tempat pengikatan protein hunian di Kromatin immunoprecipitation seluruh genomContoh protein untuk immunoprecipitate adalah on Chip modifikasi histon (H3K27me3, H3K4me2, H3K9me3, dll), kelompok Polycomb protein (PRC2: Suz12, PRC1: YY1) dan kelompoktrithorax protein (Ash1) untuk mempelajari epigenetik lansekap atau RNA Polimerase II untuk mempelajari transkripsi lansekap.

Deteksi SNP

Mengidentifikasi polimorfisme nukleotida tunggal di antara alel dalam atau di antara populasi. [7] Beberapa aplikasi mikroarray menggunakan SNP deteksi, termasuk genotipe, forensik analisis, mengukur kecenderungan terhadap penyakit, obat-calon mengidentifikasi, mengevaluasi germline mutasi pada individu atau somatik mutasi pada kanker , menilai hilangnya heterozigositas, atau keterkaitan genetik analisis.

Penyambungan alternatif deteksi

Ini adalah kepadatan menengah, atau cakupan, untuk ekspresi gen yang khas array (dengan 1-3 probe per gen) dan ubin genomik

array (dengan ratusan atau ribuan probe per gen). Hal ini digunakan untuk uji ekspresi sambatan alternatif bentuk suatu gen. Ekson array memiliki desain yang berbeda, dengan menggunakan probe yang dirancang untuk mendeteksi setiap individu ekson untuk diketahui atau diperkirakan gen, dan dapat digunakan untuk mendeteksi isoform splicing yang berbeda.

Fusion gen microarray

Sebuah Fusion microarray dapat mendeteksi gen fusi transkrip, misalnya dari spesimen kanker. Prinsip di balik ini adalah bangunan pada sambungan alternatif mikroarrayOligo strategi desain yang memungkinkan pengukuran gabungan transkrip chimeric persimpangan dengan bijaksana ekson-pengukuran fusi individu mitra.

Ubin array

Genom ubin array tumpang tindih terdiri dari probe yang dirancang untuk padat mewakili kepentingan daerah genomik, kadang-kadang sebagai besar seluruh manusia sebagai kromosom. Tujuannya adalah untuk mendeteksi secara empiris ekspresi transkrip atau bentuk sambatan alternatif yang mungkin belum diketahui atau diperkirakan sebelumnya.

DAFTAR PUSTAKA Anonim, 2008, Novel DNA microarray chip predicts functional impairment and remission in rheumatoid arthritis,http://esciencenews.com/articles/2008/06/13/novel.dna.microarray. chip.predicts.functional.impairment.and.remission.rheumatoid.arthritis, diunduh tanggal 25/11/09. Anonim, 2009, DNA Microarray, http://en.wikipedia.org/wiki/DNA_microarray, diunduh tanggal 25/11/09. Anonim, 2009, Microarray Technology, http://www.premierbiosoft.com/tech_notes/microarray.html,diunduh tanggal 25/11/09.

http://transcriptome.ens.fr/sgdb/presentation/principle.php http://www.bio.davidson.edu/Courses/genomics/chip/chip.html XiaoKun T, XIAO H. 2009. Perspectives of DNA microarray and next generation DNA sequencing technologies.Sci China Ser C-Life Sci. Vol 52 (1) : 7-16