Laporan Biotek DNA

download Laporan Biotek DNA

of 17

  • date post

    18-Sep-2015
  • Category

    Documents

  • view

    31
  • download

    4

Embed Size (px)

description

Laporan Biotek DNA

Transcript of Laporan Biotek DNA

LAPORAN PRAKTIKUM BIOTEKNOLOGI ISOLASI DNA

Disusun Oleh:Nama: ASTIDHIA NADIANIM: 135040200111062Kelompok: L1/ SENIN, 11.00-12.40Asisten: ARINI YUNIA R.

Program Studi AgroekoteknologiFakultas PertanianUNIVERSITAS BRAWIJAYAMalang2014BAB IPENDAHULUAN1.1 Latar BelakangSeiring dengan berkembangnya teknologi, banyak cara yang dilakukan untuk mengetahui sebuah jasad baik itu manusia maupun tumbuhan berasal dari tetua yang bagaimana. DNA merupakan suatu asam nukleat dengan kandungan materi genetik dengan fungsi sebagai pengatur perkembangan biologis seluruh bentuk kehidupan suatu biologis. DNA terdapat pada nukleus, mitokondria dan kloroplas pada tumbuhan.Proses isolasi DNA dilakukan untuk menyisipkan suatu gen tertentu ke dalam sel jasad target. Sumber dari gen tersebut dapat berasal dari DNA genom jasad hidup yang bersangkutan. Untuk mengisolasi secara spesifik DNA yang mencakupi gen tertentu dan dapat dilakukan dengan beberapa teknik.Isolasi DNA dapat dilakukan baik pada manusia maupun pada tanaman. Pada praktikum kali ini adalah isolasi DNA pada tanaman jagung dan kacang tanah.1.2 TujuanAdapun tujuan dari praktikum ini adalah agar dapat mengetahui pengertian isolasi DNA, metode dan tahapan yang dilakukan pada proses isolasi DNA dan melakukan proses-proses yang berkaitan langsung untuk melakukan isolasi DNA.1.3 ManfaatAdapun manfaat dari praktikum ini adalah agar memahami pengertian isolasi DNA, metode dan tahapan yang dilakukan pada proses isolasi DNA serta proses yang berkaitan langsung untuk melakukan isolasi DNA.BAB IITINJAUAN PUSTAKA

2.1 Pengertian Isolasi DNA

Isolasi DNA adalah proses mengidentifikasi DNA dari suatu makhluk hidup dengan suatu proses ekstraksi DNA di dalam sel (Hatta, 2002). Isolasi DNA adalah proses pengeluaran DNA dari tempatnya berada (ekstraksi atau lisis) biasanya dilakukan dengan homogenasi dan penambahan buffer ekstraksi atau buffer lisis untuk mencegah DNA rusak (Yuwono, 2006). DNA isolation is a routine procedure to collect DNA for subsequent molecular or forensic analysis. Isolasi DNA adalah prosedur rutin untuk mengumpulkan DNA untuk analisis molekuler atau forensik berikutnya (Doyle, 1990). DNA isolation is the most important step in molecular biology analysis. Several DNA isolation techniques which are developed were expensive. Isolasi DNA merupakan tahap terpenting dalam analisis biologi molekuler. Teknik-teknik isolasi DNA yang telah dikembangkan sangat mahal dan memerplukan waktu yang lama (Listanto,1996).

2.2 Macam Metode Isolasi DNA

Metode I: Metode Ekstraksi Modifikasi Doyle & Doyle (1990) dengan Nitrogen Cair.Daun temulawak sebanyak 1 gram digerus dengan PVP dannitrogen cair hingga menjadi tepung. Sebanyak 10 mL bufer ekstraksi hangat dan 2.5 mL 2-merkaptoetanol ditambahkanke dalam sampel dan diinkubasi sambil digoyang perlahan pada suhu 55C, kecepatan 150 rpm selama 1 jam. Selanjutnya diekstraksi ulang dengan kloroform:isoamil alkohol (24:1) sebanyak 10 mL. Selanjutnya, dilakukan pemisahan dengan sentrifugasi pada kecepatan 1000 g selama 5 menit. Aliquot yang terdapat pada bagian atas dipindahkan ke tabung baru dan ditambahkan dengan isopropanol dingin sebanya 2/ volume. Kemudian diinversi dan diinkubasi dalam es selama 30 menit. Pelet dikoleksi dengan sentrifugasi pada kecepatan 12000 g selama 20 menit. Pelet dicuci dengan buffer pencucii (etanol 76% dan ammonium asetat). Sentrifugasi dilakukan pada kecepatan 14000 g selama 10 menit. Pencucian dilakukan sebanyak 2 kali. Pelet yang telah dicuci selanjutnya ditambahkan dengan bufer TE dan ditambahkan RNAse A dengan konsentrasi final 10 ug/mL. RNAse A diaktivasi pada suhu 37C selama 30 menit. Selanjutnya, dipisahkan dengan sentrifugasi pada kecepatan 12000 g selama 5 menit. Pelet yang dihasilkan diresuspensi denganmolecular water. Proteinase K ditambahkan dengan dua variasi penambahan. Metode II : Metode Ekstraksi Modifikasi Doyle & Doyle (1990) tanpa Nitrogen Cair.Sampel daun sebanyak 0.2 gram dan digerus dengan PVP dan 0.75 mL buffer ekstraksi (2% b/v CTAB, 1.4 M NaCl, 20 mM EDTA, 100 mM Tris-HCl (pH 8), 0.2% (v/v) 2- merkaptoetanol). Inkubasi dilakukan denganincubator shakerpada suhu 65C dengan 50 rpm selama satu jam. Sampel kemudian dibiarkan pada suhu ruang untuk prosescooling. Sampel ditambahkan 0.75 mL kloroform: isoamil alkohol (24:1) dan disentrifugasi 12.000 rpm selama 10 menit pada suhu 4C. Supernatan berisi DNA dipindahkan ke tabung baru dan ditambahkan dengan 2/3 volume isopropanol dingin kemudian diinversi perlahan sebanyak 10 kali. Smapel tersebut disentrifugasi 11.000 rpm selama 10 menit pada suhu 4C. Pelet yang telah kering diberi 25 Lmolecular waterdan disimpan pada suhu -20C. Metode III : Metode Ekstraksi Modifikasi Zheng et al (1995).Sampel daun 200 mg digerus hingga halus dan ditambahkan buffer ekstraksi (25 mM EDTA (pH 7.5), 50 mM TrisHCl (pH 8.0), 300 mM NaCl, dan SDS 1%) sebanyak 400 L dalam mortar dingin. Sampel ditambahkan 100 L buffer ekstraksi di dalam tabung dingin dan ditambahkan 400 L kloroform kemudian diinversi. Sentrifugasi dilakukan 13.000 rpm selama 1 menit pada suhu 4C. Lapisan atas yang terbentuk ditambahkan 800 L etanol absolut dan diinkubasi pada suhu -20oC selama 1 jam. Sentrifugasi dilakukan 13.000 rpm selama 3 menit pada suhu 4C. Endapan berupa pellet DNAditambahkan 500 L Etanol 70% dan disentrifugasi kembali. Pellet yang telah kering diresuspensi dengan 50 Lmolecular waterdan ditambahkan RNAse serta diinkubasi pada suhu 37C selama 30 menit. Sentrifugasi 10000 rpm dilakukan selama 5 menit. Pellet kering ditambahkan 50 l molecular water. Suspensi tersebut disimpan pada suhu -20C.Ketiga metode tersebut di atas dimodifikasi untuk mendapatkan DNA genom dengan kualitas terbaik. Modifikasi dilakukan dengan variasi penambahan etanol 76%, buffer pencuci (etanol 76% dan ammonium asetat 3M), Proteinase K, RNAse A, kalium asetat 5M, dan PVP. Selain itu, modifikasi juga dilakukan dengan variasi penambahan larutan pada tahap yang berbeda (Utami, 2012).

2.3 Tahap Isolasi DNAMenurut Yuwono (2006), adapun tahap isolasi DNA adalah dengan: Perusakan dinding sel dengan menggunakan N cair. Lisis membran sel dengan menggunakan detergen kationik. Pemurnian dari beberapa kontaminan seperti senyawa sekunder (fenol) polisakarida, RNA, dan Protein. Presipitasi yaitu penggumpalan DNA menggunakan isopropanol dingin.

2.4 Manfaat Isolasi DNAMenurut Yuwono (2006), manfaat isolasi DNA dalam bidang pertanian adalah sebagai berikut: Visualisasi DNA dengan elektroforesis gel. Peninjauan pola fragmen DNA hasil pemotongan secara enzimatik melalui teknik Hibridisasi Southern. Isolasi DNA genomik dalam rangka pembuatan pustaka genomik. Isolasi plasmid atau DNA fage dalam prosedur rutin peminakan DNA. Isolasi DNA yang diperlukan sebagai cetakan (template) dalam prosedur perbanyakan DNA secara in vitro melalui teknik PCR.Isolasi DNA diperlukan untuk analisis genetik, yang digunakan untuk tujuan ilmiah, medis, atauforensik. Para ilmuwan menggunakan DNA di sejumlahaplikasi, seperti pengenalan DNA ke dalam sel dan binatang atau tanaman, atau untuk tujuan diagnostik. Dalam obat aplikasi yang terakhir adalah yang paling umum. Di sisilain, ilmu forensik perlu memulihkan DNA untuk identifikasi individu (bagi pemerkosan misalnya, pencuri kecil, kecelakaan, atau korban perang), penentuan ayah, dan pabrik atau identifikasi hewan (Yuwono, 2006).

BAB IIIMETODOLOGI

3.1 Alat, Bahan dan FungsiAlat: Mortal & Pisteel : untuk menghaluskan bahan Tubes 1,5ml : wadah untuk pengamatan Spatula : memindahkan bahan dari mortar Tips : mempermudah kerja micropipet Mikro pipet : untuk mengambil bahan cair Erlenmeyer : wadah untuk bahan cair Microwave : memanaskan bahan Sentrifuge : untuk memisahkan larutan berdasarkan berat molekul Vortex: untuk menghomogenkan Oven : untuk memanaskan bahan dan mengeringkannya Freezer : untuk menginkubasiBahan: Daun Jagung dan daun Kacang tanah muda sebagai bahan pengamatan. Buffer ekstrasi CTAB dan Karbon untuk melisis membran sel dari daun agar tidak pecah. Marcaptoethanol untuk menghilangkan flavonoid dan mencegah terjadinya browning. Nitrogen cair untuk agar DNA pada tanaman sewaktu penggerusan tidak rusak PVP untuk menghilangkan fenol Chisam untuk pemurnian Isopropanol untuk penggumpalan/presipitasi DNA Buffer pencuci untuk menghindari kontaminasi Buffer TE untuk melarutkan DNA

3.2 Langkah Kerja + Dokumentasi4 Campurkan Buffer ekstraksi 1,5 ml + karbon + mercaptoethanol 4 LTimbang 0,1 g sampel, gerus dalam mortar, tambah nitrogen cair + PVP

Campurkan Buffer ekstraksi 1,5 ml + karbon + mercaptoethanol 4 L

Campurkan Buffer ekstraksi 1,5 ml + karbon + mercaptoethanol 4 LCampurkan Buffer ekstraksi 1,5 ml + karbon + mercaptoethanol 4 L

4.1 Analisa Perlakuan

BAB IVHASIL DAN PEMBAHASAN

dokumentasi:

Pemotongan Penimbangan Penambahan PVP Bahan ahan

Penambahan PenggerusanPindah N2 cair bahanke tube

HomogenisasiInkubasi Sentrifuge di vortexdalam oven 10.000 rpm

Pemindahan Penambahan PenambahanSupernatan Chisam Isopropanol

Di inkubasi SentrifugePenambahanDalam freezer 8.000 rpmBuffer

3.3 Analisis Perlakuan

Pertama-tama siapkan alat dan bahan. Potong-potong daun jangan sampai ada tulang daunnya. Kemudian gerus dengan mortal dan pisteel. Lalu tambahkan nitrogen cair dan PVP. Setelah itu masukkan kedalam tube 2 ml dan tambahkan campuran buffer ekstrasi, karbon dan marcaptoethanol.Setelah itu vortex tube dan inkubasi dalam oven dengan suhu 65C selama 15 menit dinginkan sebentar. Lalu sentrifuge dengan kecepatan 10.000 rpm selama 5 menit. Selanjutnya tambahkan chisam dan vortex lagi selama 5 menit. Setelah itu sentrifuge lagi dengan kecepatan 10.000 rpm selama 5 menit. Pindahkan supernatan kedalam tube yang baru dan