FOSFOR DARAH

Agustinus Hadi Prasetyo (G84120080)Dewi Esti Restiani (G84120010)Anastasia Armimi (G84120083)

Hanung Safrida Nurlaila (G84120073)Eneng Nurlela

DEPARTEMEN BIOKIMIAFAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

INSTITUT PERTANIAN BOGORBOGOR

2015

PENDAHULUAN

Menurut Poedjiadi 2009, apabila darah menggumpal di dalam suatu tabung reaksi, terbentuklah suatu massa padat yang berwarna merah. Akan tetapi bila di biarkan agak lama, gumpalan itu akan berkontraksi dan menghasilkan cairan kuning supernatan yang dinamakan serum. Pada intinya serum adalah plasma dikurangi fibrinogen dan faktor-faktor penggumpalan darah, serum darah hewan terdiri dari air sebanyak 92% dan zat-zat lain sebanyak 8. Komposisi serum darah hewan sangat kompleks dan dapat dibagi menjadi beberapa bagian yaitu air, oksigen, karbondioksida, danprotein, lesitin, albumin, dan fibrinogen laktosa, piruvat lipida, lesitin, kolesterol.

Adapun kandungan unsur hara yang dimiliki dalam komponen serum darah sapi antara lain (mg/100gr) yaitu N = 0,0084; P = 0,1000; K = 0,0098; C-Organik = 3,2760; Bahan Organik = 56,4800; Kadar Air = 93,9590 dan komponen serum darah ayam antara lain yaitu N = 0,0058; P = 0,2000; K = 0,0145; C-Organik = 5,3040; Bahan Organik = 9,1400, dan Kadar Air = 89,930% (Poedjiadi 2009).

 Metode yang digunakan dalam Metode Fardiaz. Prinsip penetapan kadar fosfor yaitu dengan mereaksikan bahan atau sampel dengan asam sitrat untuk mengubah semua metafosfat dan pirofosfat menjadi ortofosfat, yang kemudian diperlakukan dengan asam molibdat dan asam vanadat sehingga ortofosfat akan bereaksi dengan asam molibdat dan asam vanadat dan melalui reaksi kompleksometri akan terbentuk kompleks asam vanadimolibdifosfat yang berwarna kuning orange. Setelah itu, sampel yang telah direaksikan diukur nilai serapan cahaya atau absorbansinya dengan menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 420 nm dan dibandingkan dengan standar fosfor yang telah diketahui konsentrasinya, sehingga kadar fosfor pada bahan tersebut dapat diketahui (Rahmalisa et al 2014).

Pereaksi Vanadat-Molibdat merupakan hasil pelarutan antara amonium vanadat, amonium molibdat, asam nitrat pekat, dan air suling. Pencampuran pereaksi vanadat dan molibdat harus dilakukan beberapa hari sebelum digunakan karena cenderung mengendap. Bahan bahan organik yang turut tercampur harus terlebih dahulu dihilangkan agar tidak mengganggu warna yang dihasilkan menggunakan pereaksi pengoksidasi. Adapun pada metode Fardiaz et al (1996), penggunaan pereaksi vanadat molibdat bertujuan agar terbentuk kompleks asam vanadimolibdifosfat yang berwarna kuning orange, sehingga dapat diukur dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 400 nm.Asam sitrat berfungsi untuk mengubah warna larutan ortofosfat yang terbentuk menjadi kuning orange dan membentuk kompleks asam vanadimolibdifosfat. Intensitas warna yang terbentuk inilah yang dapat digunakan untuk menetapkan kadar fosfor (Rahmalisa et al 2014).

Fosfor merupakan mineral kedua terbanyak di dalam tubuh setelah kalsium, yaitu 1% dari berat badan. Seseorang yang memiliki berat badan 65 kg kurang lebih mengandung fosfor dalam tubuhnya sebanyak 600 g. Fosfor merupakan anion utama dalam cairan intraseluler. Sekitar 85% fosfor terletak dalam tulang dan gigi, 14% dalam jaringan lunak, dan kurang dari 1% dalam cairan

ekstraseluler . Fosfor terdapat juga di dalam semua sel tubuh, baik di dalam otot maupun di dalam cairan ekstraselular (Lawrence 2000). Fosfor dalam tubuh ada yang berupa fosfolipid sebagai komponen struktural dinding sel dan juga sebagai fosfat organik yang berperan dalam penyimpanan atau pelepasan energi dalam bentuk Adenin Trifosfat (ATP) (Murray 2012). Fosfor penting untuk fungsi otot dan sel-sel darah merah, pembentukan adenosine trifosfat (ATP) dan 2,3-difosfogliserat (DPG), dan pemeliharaan keseimbangan asam-basa, juga untuk sistem saraf dan perantara metabolisme karbohidrat, protein, dan lemak (Poedjiadi 2009). Selain itu, Fosfor berperan pula dalam mempertahankan keseimbangan asam-basa dan untuk pembentukan tulang dan gigi (Winarno 1992). Enzim dalam saluran pencernaan membebaskan fosfor yang anorganik dari ikatannya dengan bahan organik. Sebagian besar fosfor diserap tubuh dalam bentuk anorganik, khususnya di bagian atas duodenum yang bersifat kurang alkalis 70% yang dicerna akan diserap (Winarno 1992).

Percobaan ini bertujuan menganalisis fosfor darah sehingga mahasiswa mengrti prinsip biokimia yang terjadi dalam proses analisis tersebut.

METODE

Waktu dan Tempat Penelitian

Praktikum dilakukan pada hari Selasa, 3 Maret 2015 pukul 08.00–11.00 WIB di Laboratorium Pendidikan Departemen Biokimia IPB.

Bahan dan Alat

Bahan-bahan yang digunakan dalam percobaan ini adalah larutan fosofr standar dengan berbagai konsentrasi, serum darah, larutan molibdovandat dan satu bagian volume HCl 5 M, TCA 5 %, serta akuades. Peralatan yang digunakan dalam percobaan ini adalah Pipet mikro, mikroplate, Sentrifuge, nano spektrofotometer.

Prosedur Penelitian

Reagen campuran yang terdiri dari satu bagian volume larutan molibdovanadat dan satu bagian HCl 5 M, larutan fosfor standar dalam beberapa konsentrasi dari 0- 120 mikrogram per mg. Sebanyak 1 mL serum ditambahkan dengan 4 mL TCA 5% kemudian divortex selama 15 menit untuk diambil supernatannya sebanyak 2 mL. Kemudian takaran,blanko, standar serta sampel diatur dengan ketentuan sebagai berikut :

Filtrat terdiri dari 2 mL sampel dan 6 mL akuades. Standar terdiri dari 2 mL larutan fosfor dan 6mL akuades. Blanko terdiri dari 8 mL akuades. Ketiga perlakuan diberikan persamaan perlakuan yaitu dengan menambahkan reagen campuran sebanyak 2 mL setelah pengocokan. Kemudian seluruh rangkaian perlakuan diuji serapannya pada panjang gelombang 400 nm.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Penentuan kadar fosfor berdasarkan reaksi antara fosfor yang terkandung dalam serum dengan molibdovanadat dan HCl sehingga menimbulkan kompleks warna yang diukur dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 400 nm. Hasil pengukuran absorbansi dapat dilihat pada Tabel 1.

Tabel 1 Pengukuran absorbansi larutan fosfat pada λ= 380 nmNo. Sampel Optical density (A) OD terkoreksi (A)1. Blanko 0.098 0.0002. Standar 1 (20 µg/mL) 0.282 0.1843. Standar 2 (40 µg/mL) 0.398 0.3004. Standar 3 (80 µg/mL) 0.501 0.4035. Standar 4 (120 µg/mL) 0.901 0.8036. Standar 5 (160 µg/mL) - -7. Standar 6 (200 µg/mL) - -

Prinsip penentuan kadar fosfor dengan spektrofotometer adalah berdasarkan hukum Lambert-Beer yang menyatakan bahwa konsentrasi larutan standar berbanding langsung dengan nilai serapan cahaya (absorban) (Bintang 2010). Penggunaan pereaksi vanadat molibdat bertujuan agar terbentuk kompleks asam vanadimolibdifosfat yang berwarna kuning orange, sehingga dapat diukur dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 400 nm. Senyawa kompleks tersebut dihasilkan melalui reaksi kompleksometri, yaitu reaksi ortofosfat darah dengan vanadat-molibdat (Rahmalisa et al 2014). Penambahan asam klorida bertujuan untuk membentuk suasana asam sehingga reaksi pembentukan warna kuning cepat terjadi. Penambahan TCA bertujuan mengendapkan protein agar fosfat dapat larut terpisahkan ketika disentrifugasi.

Grafik 1 Hubungan konsentrasi standar dan absorbansi

Tabel 2 Pengukuran absorbansi sampel PO43- di serum darah 2 mL pada λ=380

nmNo. Sampel OD OD terkoreksi Konsentrasi (µg/dL)1. Sampel 1 0.244 0.146 548.52. Sampel 2 0.263 0.165 453.5

Contoh perhitungan:y = ax + bAbsorbansi = slope x konsentrasi + intersept

Konsentrasi =

Konsentrasi = 548.5 µg/dL

Berdasarkan persamaan regresi yang dibuat. Regresi yang ditemukan tidak linier. Terdapat dua data yang kosong yang tidak diperhatikan kelompok kami ketika menganalisis menggunakan sperktrofotometer nano. Hal ini berdampak pada kadar forfor sebenarnya yang terdapat dalam serum.Kadar fosfor normal pada plasma darah sapi adalah 5.34 – 7.38 mg/dL Kadar fosfor dalam manusia yaituo 2.5 -4.5 mg/dL (Poedjiadi 2009). Sedangkan kadar fosfor yang terhitung adalah lebih tinggi dari literatur yang ada.

Jika dikaitkan dengan kadar fosfor yang diperoleh saat ini maka pemilik serum ini menderita hiperfosfatemia (Hariweni 2005). Sel mengandung fosfat dalam jumlah banyak, sehingga keadaan yang menyebabkan perpindahan antarsel dari ICF ke ECF dapat menyebabkan hiperfosfatemia. Kemoterapi yang terutama dilakukan untuk mengobati penyakit keganasan hematologis dapat menyebabkan terjadinya lisis sel dan pelepasan fosfat. Otot mengandung banyak timbunan fosfat, sehingga kerusakan otot pada rhabdomiolisis (yang kadang terjadi pada putus alkohol) dapat menyebabkan terjadinya hiperfosfatemia. Gagal ginjal akut ataupun kronis hingga saat ini merupakan penyebab hiperfosfatemia yang paling penting, dan hal ini selalu terjadi bila laju filtrasi glomerulus (GFR) menurun hingga 25 sampai 50% dari normal. Penurunan sekresi PTH pada hipoparatiroidisme menyebabkan menurunnya ekskresi fosfat urin. Akromegali atau pemberian hormon pertumbuhan menyebabkan terjadinya hiperfosfatemia sedang. Terapi bifosfonat untuk mengatasi hiperkalsemia yang disebabkan oleh keganasan dapat menyebabkan terjadinya hiperfosfatemia sebagai penyulit karena terjadi peningkatan reabsorpsi fosfat di tubulus ginjal (Lawrence 2000).

Hiperfosfatemia dapat disebabkan oleh kelebihan asupan laksatif yang mengandung fosfat atau oleh pemberian fosfat secara IV. Pengobatan dengan vitamin D yang berlebihan atau abnormalitas sekresi vitamin D pada penyakit sarkoidosis atau tuberkulosis dapat menyebabkan meningkatnya absorpsi fosfat di usus (Wilson 2012).

Hormon yang berpengaruh dalam metabolisme fosfat adalah parathormon (PTH) dan vitamin D (1,25-dihidroksi-kolekalsiferol/1,25-(OH)2D3). Kerja PTH pada tulang adalah membebaskan kalsium ke dalam aliran darah, fosfat dan konstituen juga dimobilisasi. Dalam ginjal, PTH meningkatkan reabsorpsi Ca2+ di tubulus ginjal, dan menekan reabsorpsi fosfat sehingga terjadi penurunan ekskresi kalsium dan peningkatan pengeluaran fosfat, sedangkan vitamin D, mulanya prekusor-prekusor vitamin D mengalami hidroksilasi di hati dan kemudian diubah oleh ginjal menjadi bentuk dihidroksi. Produk ginjal ini mengalir ke organ-organ

sasarannya, usus halus dan tulang. Penyerapan kalsium dan fosfat dari makanan ditingkatkan oleh 1,25-(OH)2D3 yang juga meningkatkan efek PTH dalam mobilisasi kalsium dan fosfor tulang. Kadar fosfat serum yang rendah mendorong pembentukan 1,25-(OH)2D3 oleh ginjal, hipokalsemia merangsang pembentukan PTH, kemudian meningkatkan sintesis 1,25-(OH)2D3 di ginjal (Lawrence 2000).

Metode yang digunakan dalam percobaan ini cukup akurat untuk memberikan data mengenai konsentrasi dari suatu larutan karena pengukurannya menggunakan nano spektrofotometer yang mampu mengukur absorbansi dalam volume skala yang kecil. Kelemahan dari metode ini adalah metode ini mudah diganggu oleh kontaminan, senyawa dari luar atau peralatan yang dapat menghalangi fosfor untuk teroksidasi sehingga fosfor juga terperangkap dan terendapkan pada pelet dan tidak dapat diukur saat diukur menggunakan spektrofotometer. Selain metode Fardiaz metode lain yang dapat digunakan adalah metode Briggs yang berprinsip pengendapan protein dahulu dengan larutan TCA. Filtrat yang diperoleh akan memiliki pH rendah sehingga reaksinya dengan asam molibdat membentuk senyawa kompleks. Kompleks ini kemudian direduksi oleh larutan hidrokuinon membentuk warna biru. Untuk menstabilkan warna digunakan Na-tiosulfat 20%. Serapan diukur dengan spektrofotometer (Bintang 2010).

SIMPULAN DAN SARAN

Simpulan

Praktikum yang dilakukan terhadap serum adalah kadar fosfor dalam darah. Hasil pengukuran dengan menggunakan spektrofotometer menunjukkan bahwa regresi yang diperoleh tidak bagus karena terdapat dua data yang tidak terisi sehingga praktikan mengaitkan data dengan literatur bahwa serum uji memiliki kondisi kelebihan fosfat atau hiperfosfatemia.

Saran

Kebersihan diri sebaiknya dijaga dengan baik dengan melakukan perlindungan diri seperti memakai sarung tangan dan masker. Selain itu, praktikan dituntut untuk lebih teliti dalam mengkolektifkan data. Bila perlu, setiap praktikan diberikan hak untuk melakukan keseluruhan percobaan secara invidu.

DAFTAR PUSTAKA

Bintang M. 2010. Biokimia Teknik Penelitian. Jakarta (ID): Erlangga Medical Series

Hariweni, Trie. 2005. Pengaruh Metabolit Tumor Akibat Sindrom Tumor Lisis pada Terjadinya Gagal Ginjal Akut Serta pada Anak. Sari Pediatri, Vol. 7, No. 2, September 2005: 93 – 96.

Lawrence Kaplan. 2000. Clinical Chemitstry Fourth Edititon. St Louis (USA) : Mosby.

Murray RK, Granner DK, Mayes PA, Rodwell VW. 2012. Biokimia Harper. Jakarta (ID): EGC.

Poedjiaji A. 2009. Dasar-dasar Biokimia. Jakarta (ID): UIP.

Rahmalisa T. A., Hanifah S., Anita. 2014. Analisis Nitrogen , Fosfor dan Kalium Pada Sedimen Kolam Instalasi Pengilahan Air Limbah (IPAL TPA Muara Fajar Pekanbaru. Jurnal Universitas Riau Vol : 2 : 1-6

Wilson, Lorraine M., Sylvia A. Price. 2012. Gangguan Volume, Osmolalitas, dan Elektrolit Cairan dalam Patofisiologi Edisi 6. Jakarta: EGC.

Winarno FG. 1992. Kimia Pangan dan Gizi. Jakarta: Gramedia Pustaka Utama.