CARA PEMERIKSAAN GRAM PREPARAT

I. Pendahuluan

Pemeriksaan gram preparat (mikrospkopik) merupakan petunjuk awal dari

identifikasi dalam upaya penentuan genus hingga species bakteri dengan melihat

bentuk, sifat gram, ada tidaknya: flagel, spora, kapsul dan sebagainya.

Dengan pewarnaan gram bakteri akan menyerap warna tertentu yaitu kristal violet.

Dengan penguatan lugol, bakteri gram positif akan tetap mengikat warna ungu

meskipun ada penambahan alcohol dan fuchsin/safrain. Sedangkan bakteri gram

negative akan melepaskan warna ungu dengan adanya penambahan alcohol 96%

dan akan mengikat safrnin/fuchsin sehingga sel bakteri berwarna merah.

II. Tujuan

Untuk mengetahui bentuk, sifat gram, ada tidaknya spora, kapsul, dan sebagainya

dari sel kuman.

III. BAHAN/SAMPEL/SPESIMEN

Eksudat/pus, biakan bakteri

IV. MEDIA/REAGEN

- Urine

- Gentian violet

- Lugol/iodine

- Alkohol 96%

- Safranin

V. ALAT – ALAT

- Objek gelas

- Lampu Bunsen

- Lidi kapas

- Pinset

1

- Rak tabung

- Rak pewarnaan

- OSE (sengkelit)

- Tabung reaksi

- Spait

VI. CARA KERJA

a. Membuat gram preparat

Preparat langsung

- Dipanaskan OSE dengan sudut 450

- Objek glass dipanaskan untuk menghilangkan lemak yang terdapat pada

objek glass

- Ditulis kode pada sudut objek glass

- Kode ditulis menghadap ke bawah

- Sampel diambil menggunakan OSE

- Sampel digoreskan pada objek glass (jangan terlalu tipis dan jangan terlalu

tebal)

- Objek glass diletakkan dengan posisi dimiringkan dan di diamkan sampai

kering pada suhu kamar

Gram preparat tidak langsung (preparat dalam biakan)

Koloni bakteri e. coli

- Objek gelas dibersihkan dengan tisu untuk menghilangkan lemak yang

terdapat pada objek gelas

- Ditetesi 1 tetes aquades dengan menggunakan spait

- OSE dipanaskan, didinginkan sesaat agar tidak membunuh bakteri saat

pengambilan di dalam media

- OSE diletakkan pada media yang kosong agar OSE tidak terlalu panas saat

pengambilan bakteri

- Koloni yang diambil menggunakan OSE dicampur dengan aquadest yang

telah ditetesi pada objek glass hingga merata (tidak tebal dan tidak tipis).

2

- Keringkan dalam suhu ruangan sampai kering dengan cara di miringkan

agar ada preparat bagian tebal dan tipis.

- Setelah kering dilanjutkan dengan fiksasi.

Fiksasi

Tujuan:

- Untuk membunuh kuman

- Untuk melekatkan hapusan di kaca

- Agar tidak merubah struktur dan morfologi bakteri,

- Mengawetkan sediaan (fiksasi yang benar dapat bertahan bertahun-tahun)

Cara Kerja

- Objek gelas yang berisi hapusan dihadapkan ke atas

- Lewatkan di atas api bunsen hapusan bagian bawah sebanyak 3 kali

- Diletakkan di rak pewarna (rak pewarna harus dekat dengan keran)

b. Pengecatan Gram

Tujuan:

Agar sampel berwarna sehingga dapat dengan mudah membedakan bakteri

gram positif dan bakteri gram negatif.

Cara kerja:

- Gentian violet diteteskan pada hapusan secukupnya

- Didiamkan selama 60 detik

- Dicuci dengan air mengalir

- Ditambahkan lugol/iodine

- Didiamkan selama 60 detik

- Dicuci dengan air mengalir

- Ditambahkan alcohol 96%

- Didiamkan selama 30 detik

- Dicuci dengan air mengalir

- Ditambahkan dengan safranin

3

- Didiamkan selama 60 detik

- Di cuci dengan air mengalir

- Diletakkan dalam rak pengering

- Dikeringkan dalam suhu kamar

c.Pembacaan dan interpretasi hasil

Setelah kering, di amati di bawah mikroskop dengan pembesaran 10 x 100

menggunakan minyak emersi

Hasil

Preparat I

Gram positif, coccus positif

Preparat II

Gram negatif, coccus positif

4

PEMERIKSAAN KULTUR BAKTERIOLOGIK

MIKROORGANISME UMUM

(DARAH, EKSUDAT/PUS, URINE & CAIRAN OTAK)

I. PENDAHULUAN

Dalam keadaan normal darah bersifat steril, tidak dikenal adanya flora

normal dalam darah. Ditemukan bakteri dalam darah disebut bakterimia.

Eksudat/pus didapat pada penderita adalah tanda bahwa sudah ada infeksi oleh

kuman tertentu pada penderita. Kuman tersebut dapat disolasi dari pus.

Kegagalan dalam pembiakan kuman dari bahan pus terutama karena pasien

sudah minum antibiotika. Pada orang sehat, urine semestinya steril. Apabila di

dalam urine ditemukan adanya mikroorganisme (kuman) yang jumlahya ≥

100000/ml merupakan suatu indikasi bahwa orang tersebut mengalami

infeksi. Untuk mengetahui jenis kuman-kuman yang menginfeksi, dapat

dilakukan pemeriksaan urine kultur. Seperti halnya darah dan urine dalam

keadaan normal cairan otak bersifat steril. Bila terjadi peradangan/terinfeksi,

cairan otak dapat menjadi purulen disebut Meningitis purulenta atau dapat

juga menjadi serosa disebut meningitis serosa.

II. TUJUAN

Untuk isolasi dan identifikasi jenis bakteri yang terdapat dalam sampel

III. BAHAN / SAMPEL / SPESIMEN

Eksudat/pus

IV. MEDIA/REAGEN

1. Blood agar

2. MC Conkey agar

3. Tio glicolate

4. TSI, SIM, Simon Citrate

5. Media gula-gula

5

6. Reagen oksidase (Tetrametil phenylene diamonium diklorit) dan katalase

test

V. ALAT-ALAT

- Inkubator

- Tabung reaksi

- Petri dish

- Ose / sengkelit

- Pinset

- Bunsen

- Objek glass

- Sungkup lilin / anaerobic jar

- Pensil kaca/

VI. CARA KERJA

1. Makroskopis

a. Diambil Petri dish yang berisi koloni

b. Diamati bentuk koloni.

2. Mikroskopis

a. Api Bunsen dinyalakan

b. Objek glass diambil

c. Kaca objek dipanaskan

d. Di isi kode dengan pensil kaca

e. Di tetesi aquades 1 tetes

f. OSE dipanaskan

g. Biakan di ambil menggunakan OSE

h. Di oleskan pada kaca gelas dengan merata

i. Diletakkan dengan posisi miring

j. Difiksasi

k. Diwarnai dengan pewarnaan gram

6

3. Uji Biokimia

Khusus untuk kuman gram negative

Cara Kerja:

- Disusun gula-gula

- Dari kanan diurutkan glukosa, laktosa, manitol, maltosa, sakarosa

- Dari kiri di sebelahnya disusun TSI, SIM, Simon Citrat

- OSE dipanaskan, kemudian tusukkan pada TSI sampai di dasar TSI,

digesekkan pada dindingnya, kemudian OSE dikeluarkan dan

dipanaskan

- OSE dipanaskan, kemudian tusukkan pada SIM ¾ bagian TSI,

digesekkan pada dindingnya kemudian OSE dikeluarkan dan

dipanaskan

- OSE dipanaskan, gesekkan pada dinding Simon Citrat, kemudian OSE

dikeluarkan

- OSE dipanaskan, panaskan tabung reaksi wadah glukosa, celupkan

OSE, panaskan tabung reaksi dan tutup.

- OSE dipanaskan, panaskan tabung reaksi wadah laktosa, celupkan

OSE, panaskan tabung reaksi dan tutup.

- OSE dipanaskan, panaskan tabung reaksi wadah manitol, celupkan

OSE, panaskan tabung reaksi dan tutup.

- OSE dipanaskan, panaskan tabung reaksi wadah maltosa, celupkan

OSE, panaskan tabung reaksi dan tutup.

- OSE dipanaskan, panaskan tabung reaksi wadah sakarosa, celupkan

OSE, panaskan tabung reaksi dan tutup.

- Dimasukkan ke Inkubator

4. Uji Katalase

Cara Kerja

- Gelas objek diambil

- Ditetesi H2O2

- Diambil koloni yang single dengan OSE

7

- Diamati, jika ada gelembung berarti katalase positif

terjadi reaksi H2O2 H2O + O2

5. Uji Oksidase

Cara kerja

- Teteskan aquades ke dalam tutup cawan Petri

- Diletakkan reagen bentuk padat yang kecil-kecil

- Diaduk dengan OSE

- Kertas saring dirobek

- Diletakkan diatas cawan

- Kuman diletakkan diatas kertas dengan membuat garis

- Diamati

Berubah warna ungu (+) oksidase

Tidak ada perubahan warna (-) oksidase

VII. HASIL

Hasil uji biokimia

TSI : berwarna kuning dan ditemukan gas-gas

SIM

- H2S2 : + (ada warna hitam)

- Gerak : +

- Simon Citrat : (-)

:

- glukosa : adanya gelembug (+)

- lakstosa : (-)

- manitol : (+)

- maltose : (+)

- sakaraosa : (+)

VIII. Kesimpulan

Berdasarkan praktikum yang telah dilakukan, dapat disimpulkan bahwa:

8

- Tes oksidase bertujuan untuk mengamati sampel yang dicurigai

mengandung bakteri psedumonas atau aeromonas, dimana menggunakan

media mac conkey dan reagen tertametil phenylee diamonium diklorit

- Tes katalase bertujuan mengamati sampel yang dicurigai mengandung

bakteri staphylococcus (untuk gram positif) dengan menggunakan reagen

hydrogen peroksida (H2O2).

- Uji biokimia, tidak dilakukan jika menggunakan media mac conkey karena

media mac conkey hanya bisa ditumbuhi kuman gram negatif.

9

PEMERIKSAAN UJI KEPEKAAN KUMAN TERHADAP ANTIBIOTIKA

I. PENDAHULUAN

Uji kepekaan kuman sering dilakukan untuk tindakan pengobatan terhadap

penderita yang mengalami infeksi kuman tertentu (pathogen).

II. TUJUAN

- Untuk mengetahui sensitivitas kuman tertentu terhadap berbagai macam

antibiotika

- Untuk menentukan antibiotika yang paling efektif yang dapat digunakan pada

pengobatan terhadap infeksi yang disebabkan oleh kuman tertentu.

III. BAHAN/SAMPEL/SPESIMEN

Sekret genital, urine, darah, sputum, pus dan lain-lain.

IV. MEDIA/REAGEN

- Mueller Hinton Agar (ketebalan 4 mm)

- Garam fisiologis

- Larutan hipoklorit 2 %

- Mueller Hinton Broth

V. ALAT-ALAT

- Incubator

- Tabung reaksi

- Petri dish

- OSE/Sengkelit

- Pinset

- Bunsen/lampu spiritus

- Sungkup lilin/ anaerobic jar

- Jangka sorong

- Lidi kapas steril

- Tabel Zone Diameter Intertive

Standard

- Label/pensil kaca

VI. CARA KERJA

a. Pengujian terhadap mikroorganisme umum:

10

- Disiapkan larutan standard kekeruhan Mc Farland 0,5

- Persiapan inokulum (suspense umum): dengan menggunakan ose, diambil 3-5

koloni kuman yng sama dan suspensikan ke dalam tabung yang berisi larutan

NaCl fisiologis steril ± 5 ml. Kemudian OSE dibakar dan OSE diletakkan pada

tempatnya.

- Dibandingkan kekeruhan suspense kuman dengan standar kekeruhan Mc Farland

0,5

- Dengan lidi kapas steril, diambil suspense bakteri (inokulum), kemudian kapas

ditekan-tekan pada permukaan tabung untuk membuang kelebihan suspense yang

terserap kapas.

- Lidi kapas dihapuskan di permukaan media MH secara merata, kemudian tutup

cawan petri dan di diamkan 3-5 menit (max 15 menit)

- Cakram antibiotika diletakkan pada permukaan agar, dan sedikit ditekan dengan

pinset sampai melekat sempurna. Jarak antara cakram satu dengan cakram lain

minimal 15 mm. Cakram yang sudah ditempelkan pada permukaan media agar,

tidak boleh dipindahkan ataupun digeser. Di diamkan 15 menit.

- Di inkubasi pada suhu 35-370C selama 18-24 jam dalam posisi cawan terbalik.

Untuk uji kepekaan kuman golongan Streptococcus, Haemophylus dan Neisseria,

digunakan sungkup lilin/anaerobic jar (CO2 5-10%).

- Diamati zone hambatan yang terbentuk dengan mengukur diameter zone

hambatan. Pengukuran dilakukan dengan mengunakan jangka sorong.

- Dicatat diameter zone hambatan hasil pengukuran kemudian dibandingkan

dengan Tabel Zone Diamater intertive standard.

VII. PEMBACAAN AN INTERPRETASI HASIL

Hasil pengujian dikatakan sensitive (S), intermediet (I) atau Resiste ®

disesuaikan dengan “Tabel Zone Diameter Intertive Standard (NCCLS)” 1. Uji

degradasi.

11

JAMUR

I. PENDAHULUAN

a. Pemeriksaan jamur

- Preparat jamur / (KOH) jamur

- Kultur Jamur

b. Preparat Jamur/KOH jamur

- Mencari ada tidaknya hipa, spora atau sel ragi.

c. Kultur jamur

- Pembiakkan jamur dengan pembiakan dextrose. Jika tidak ada, dapat

menggunakan mac conkey. Tetapi kelemahannya bakteri akan lebih mudah

tumbuh daripada jamur.

II. Tujuan

Untuk isolasi dan identifikasi jenis jamur yang terdapat pada sampel.

III. Bahan/sampel

Kerokan kulit,

IV. Media/Reagen

KOH 10% untuk kulit dan selaput lender

KOH 20% untuk kuku dan rambut

V. Alat-alat

- Scalpel

- Lidi kapas

- OSE

- Cover geas

- Kaca gelas

VI. CARA KERJA

12

a. Kerokan kulit:

- Preparat diisi KOH

- Dikerok jamur pada kulit dengan scalpel

- Kerokan kulit diletakkan pada preparat dan diaduk

- Ditutup dengan cover gelas

- Diperiksa di bawah mikroskop

b. Kultur jamur dari swab vagina

- Diambil swab vagina

- Dioleskan sekali pada media

- OSE dipanaskan

- OSE dioleskan pada media dengan melewati media yang telah dioleskan

swab vagina

- Di inkubasi selama 1-3 minggu

c. Dermatophita

Dermatophita (jamur hitam-hitam)

Identifikasi

1. Mikroskopis

Cara kerja:

- KOH ditetesi pada kaca objek

- OSE dipanaskan

- Diambil jamur, caranya tancapkan dan congkel

- Fungsi KOH untuk melisikan sampel

- Oleskan jamur pada kaca objek

- Ditutup dengan cover gelas

- Usahakan agar tidak ada gelembung saat menutup dengan cover gelas.

13

Mengetahui,

Denpasar, 16 Juni 2010

Pembimbing Pratikum Ketua Kelompok

I Made Birnawan, S.Si Cahya Septia Sardiawan

14