BAB VPEMBAHASAN

Isolasi mikroba adalah pemisahan mikroba satu dengan mikroba lain yang berasal dari campuran berbagai mikroba untuk dapat mempelajari sifat biakan, morfologi, dansifat mikroba lainnya. Pada penelitian ini, dilakukan isolasi terhadap bakteri asam laktat (BAL) dari sampel susu kambing. Bakteri asam laktat merupakan jenis bakteri yang mampu menghasilkan asam laktat, hidrogen peroksida, antimikroba dan hasil metabolisme lain. Bakteri asam laktat diisolasi untuk menghasilkan antimikroba yang dapat digunakan sebagai probiotik. Manfaat bagi kesehatan yang berkaitan dengan bakteri asam laktat, diantaranya memperbaiki daya cerna laktosa, mengendalikan bakteri patogen dalam saluran pencernaan, penurunan serum kolesterol, menghambat tumor, antimutagenik dan antikarsionogenik, menstimulasi sistem imun, pencegahan sembelit, produksi vitamin B, produksi bakteriosin dan inaktivasi berbagai senyawa beracun (Bachrudin et al., 2000).Susu kambing telah terbukti kaya manfaat. Susu kambing mengandung lemak dan protein yang sangat dibutuhkan oleh tubuh. Bakteri asam laktat yang diisolasi dari bahan segar susu juga memiliki potensi untuk produksi makanan probiotik. Namun dibandingkan dengan BAL yang diisolasi dari feses cairan rumen, beberapa asinan sayur dan buah, BAL yang berhasil diisolasi terbukti kurang memiliki potensi yang besar untuk fermentasi. Isolasi bakteri asam laktat (BAL) dari sampel susu kambing bertujuan untuk mendapatkan isolat murni BAL yang tumbuh secara spontan dari bahan yang mengandung sumber nutrisi mikroorganisme dan memperoleh senyawa metabolit sekundernya yang dapat bersifat sebagai antimikroba.Tahap awal yang dilakukan dari isolasi yaitu pengenceran sampel dari 10-1 sampai 10-7. Sampel yang sudah diencerkan kemudian diambil sebanyak 0,1 ml dan dimasukkan ke dalam masing-masing cawan petri. Medium MRSA yang telah ditambahkan CaCO3 dimasukkan ke dalam cawan petri dan kemudian diinkubasi pada suhu 37C selama 2-4x24 jam. Setelah masa inkubasi diperoleh isolat pada Gambar 1.

Gambar 1. Isolat awal pengenceran 10-5

Medium MRSA yang digunakan mengandung glukosa sebagai sumber karbon yang kemudian akan diuraikan oleh BAL menjadi asam laktat dan metabolit lainnya. Ekstrak yeast dan pepton merupakan sumber asam amino atau nitrogen yang penting untuk merangsang pertumbuhan BAL. Sedangkan penambahan CaCO3 ke dalam medium berfungsi untuk memudahkan pengamatan. Ketika CaCO3 ditambahkan ke dalam medium MRSA, medium yang awalnya bening akan berubah menjadi keruh karena CaCO3 tidak larut dalam medium. Apabila terdapat BAL yang tumbuh pada medium, maka koloni BAL akan menghasilkan asam laktat yang dapat beraksi dengan CaCO3 membentuk kalsium laktat yang larut dalam medium dan terbentuk zona bening di sekitar koloni.Setelah didapatkan koloni BAL yang membentuk zona bening di sekitarnya (dari pengenceran 10-5), koloni BAL diinokulasikan ke dalam medium MRSA + CaCO3 yang baru dan diinkubasi selama 1x24 jam pada suhu 37C. Tujuan penginokulasian BAL ke medium yang baru yaitu untuk menegaskan bahwa koloni yang diperoleh benar-benar koloni BAL dan memurnikan koloni BAL dari kontaminan-kontaminan. Apabila terbentuk zona bening di sekitar daerah goresan, maka dapat dipastikan bahwa koloni yang diinokulasikan merupakan koloni BAL. Koloni BAL pada medium baru kemudian diinokulasikan ke agar miring MRSA sebagai bakteri stok. Koloni yang diinokulasikan ke agar miring diambil dari hasil inokulasi Bal 2, karena pada hasil inokulasi Bal 1 diperoleh kontaminan dan BAL tidak dapat diidentifikasi secara jelas. Isolat yang diperoleh dari tahap pemurnian dan penegasan ditunjukkan oleh gambar 2 dan gambar 3.

Gambar 2. Hasil inokulasi Bal 1 ke medium baru

Gambar 3. Hasil inokulasi bal 2 ke medium baru

Tahap selanjutnya yaitu uji antagonis, yang bertujuan untuk mengamati kemampuan BAL dalam menghambat pertumbuhan mikroorganisme lain. Mikroorganisme uji yang digunakan yaitu E.coli, P. aeruginosa, B. subtilis, dan V. cholerae. Suspensi bakteri uji diambil sebanyak 0,1 ml dan dimasukkan ke dalam masing-masing cawan petri dan dimasukkan juga medium Nutrien Agar (NA) ke dalam cawan petri. Setelah medium memadat, diambil potongan agar dari hasil pemurnian BAL lalu ditempelkan ke medium NA yang telah mengandung suspensi bakteri dan diinkubasi selama 1x24 jam pada suhu 37C. Hasil yang diperoleh yaitu BAL hanya mampu membentuk zona bening di sekitar koloni bakteri E.coli dan V.cholerae. Hasil uji antagonis ditunjukkan oleh gambar 4, gambar 5, gambar 6, dan gambar 7.

Gambar 4. Uji antagonis terhadap E. coli Gambar 5. Uji antagonis terhadap V. cholerae

Gambar 6. Uji antagonis terhadap P. aeruginosa Gambar 7. Uji antagonis terhadap B.subtilis

Langkah selanjutnya yaitu pembenihan dan produksi, medium yang digunakan adalah medium starter (MYB), medium MRSB, serta medium produksi. Dibuat dua medium starter masing-masing sebanyak 10 ml, BAL dari stok bakteri agar miring diinokulasikan ke dalam masing-masing medium starter dan diinkubasi selama 1x24 jam pada suhu 37C. Tujuan dibiakkannya BAL dalam starter adalah mengadaptasikan sel terhadap medium produksi. Dengan adanya adaptasi pada medium starter ini diharapkan fase lag sebagai tahap awal fermentasi dilewati. Biakan diusahakan tepat berada pada akhir fase logaritma. Dengan demikian pertumbuhan sel BAL akan maksimum dalam waktu yang relatif singkat. Medium starter yang telah diinkubasi masing-masing ditambahkan dengan medium produksi dan medium MRSB hingga volumenya cukup 100 ml, kemudian kembali diinkubasi selama 7x24 jam pada suhu 37C dan di-shaker selama 1 jam setiap harinya. Tujuan dilakukannya shaker yaitu untuk mempemrudah difusi oksigen ke dalam medium sehingga semua sel bakteri dapat menggunakan oksigen pada proses fermentasi.Medium yang telah diinkubasi masing-masing ditambahkan etil asetat hingga volumenya 200ml dan digojog selama 15 menit, kemudian dimasukkan ke dalam corong pisah, dan digojog secara kuat selama 15 menit hingga terbentuk 2 lapisan. Laipsan yang diambil yaitu lapisan atas (lapisan etil asetat) lalu didiamkan sampai etil asetat menguap dan ekstrak benar-benar kering.Setelah diperoleh ekstrak metabolit sekunder dilakukan uji aktivitas antimikroba terhadap bakteri uji yang dihambat pertumbuhannya oleh BAL pada uji antagonis. Ekstrak dilarutkan dalam DMSO (Dimethyl sulfoxide) dan paper disk dicelupkan ke dalamnya. Dibuat juga paper disk kontrol yang hanya mengandung DMSO. DMSO digunakan sebagai pelarut karena DMSO merupakan bahan inert. Suspensi bakteri uji dan medium NA dimasukkan ke dalam cawan petri lalu ditempelkan paper disk di atas medium yang telah memadat. Karena digunakan 2 medium starter pada proses pembenihan dan produksi, maka diperoleh 2 ekstrak yang berbeda. Hasil yang diperoleh yaitu kedua ekstrak mampu menghambat pertumbuhan bakteri E.coli dan V.cholerae. Hasil dapat dilihat pada gambar 8 dan gambar 9.

Gambar 8. Uji Aktivitas Antimikroba BAL terhadap bakteri Escherichia coli

Gambar 9. Uji Aktivitas antimikroba BAL terhadap bakteri Vibrio cholerae

Dari pengamatan, diperoleh zona bening yang lebih besar pada ekstrak yang menggunakan medium MRSB dibanding dengan ekstrak yang menggunakan medium produksi. Aktivitas antimikroba isolat dari Medium MRSB lebih besar dibanding medium Produksi yakni Medium MRSB terhadap bakteri Escherichia coli dan Vibrio cholerae berturut-turut 5.66 mm dan 5.12 mm. Sedangkan dari medium Produksi berturut-turut 5.57 mm dan 4.25 mm. Hal ini berarti medium MRSB merupakan medium yang menyediakan nutrisi bagi BAL untuk melakukan proses fermentasi sehingga hasil yang diperoleh lebih baik daripada medium produksi. Zona bening yang terbentuk cukup luas dan lebih besar daripada zona bening yang dibentuk kontrol, sehingga dapa disimpulkan bahwa BAL yang diisolasi dari susu kambing mampu menghasilkan metabolit sekunder yang memiliki aktivitas antimikroba yang mampu menghambat pertumbuhan bakteri lainnya.