Slide 1

Kekurangan besi ditunjukkan dengan gejala klorosis dan daun menguning atau nekrosa. Daun muda memutih karena kurang klorofil. Selain itu terjadi karena kerusakan akar. terlihat potongan-potongan akar yang mati.Mempengaruhi hasil(kualitas & Kuantitas)Seperti yang diharapkan, pertumbuhan ketiga strain yeast didukung pada medium dengan Urasil (Gambar 1A., 28C, SC),

media kurang suplemen urasil (Gbr. 1A, 28C, SD) tidak mendukung pertumbuhan strain tersebut.

fenotip pertumbuhan dari strain mutan sec27/SEC27, sec24/SEC24 menunjukkan sifat yang sama baik di 37C dan 28C (Gbr. 1A, 37C dan 28C, SC), sehingga mutan tidak dipengaruhi oleh suhu.

Transformasi strain ini dengan vektor pYES-Ura saja (kontrol) dan pYES-Ura-OsSEC27 menolong kerusakan pertumbuhan keterbatasan urasil dari Strain yeast sec27/SEC27, sec24/SEC24, masing-masing, pada kedua suhu (Gbr. 1A, 28C dan 37C, SD).pertumbuhan sec27/SEC27, sec24/SEC24 dan sel transforman vektor secara bertahap terganggu ketika pH eksternal meningkat dari pH 4.0 sampai 8,5, dan bahkan sepenuhnya berhenti pada pH 9.0 (Gambar. 1B).

Sebaliknya, OsSEC27-transgenik sec24/SEC24 menampilkan kinerja yang lebih baik dari pH 4.0 sampai pH 9.0 (Gambar. 1B, kiri).

pertumbuhan OsSEC27-transgenik sec27/SEC27 terhambat pada pH 8,5 dibandingkan dengan OsSEC27-transgenik sec24/SEC24 (Gambar. 1B, kanan).

Hasil ini menunjukkan bahwa eksogen OsSEC27 memberikan lebih banyak toleransi terhadap tingkat pH tinggi daripada SEC24 endogen pada yeast (Gambar. 1B, pH 9.0). Mengingat bahwa OsSEC27 bisa menggantikan secara fungsional SEC24 tetapi tidak SEC27 pada yeast, protein ini ditunjuk sebagai OsSEC24.

transforman OsSEC24-GFP menampilkan pemasukan H+ yang dilemahkan dan meningkatkan efflux H+ (Gbr. 2A).

Rataan laju penghabisan (efflux) H+ pada transforman OsSEC24-GFP adalah nyata lebih tinggi dibanding transforman GFP (Gbr. 2B).

Tidak ada perbedaan yang signifikan pada aliran H+ antara sec24/SEC24 dan transforman GFP (p>0,05, Uji t;. Gambar 2B).

Selanjutnya, pada pH 9.0, kinetika dan tingkat rataan aliran H+ menunjukkan bahwa transforman OsSEC24-GFP menunjukkan aliran keluar H+ lebih kuat dibandingkan dengan pada pH 6,0 (Gambar. 2A dan B).

Dengan demikian, sec24/SEC24 OsSEC24-transgenik pada pH tinggi meningkat sekresi H+. Hasil ini dapat menjelaskan mengapa transformasi OsSEC24 meningkatkan Toleransi strain sec24/SEC24 pada pH tinggi dalam uji dari komplementasi fungsional pada yeast (Gambar. 1B).Panjang akar dalam tembakau yang ditranformasikan adalah ditemukan pada kenaikan nyata dari pH 4,0 sampai pH 8,0, terlepas dari status besi, efek yang lebih diperlihatkan di bawah kondisi pH tinggi (pH8.0, 3A Gambar, pH 4,0-8,0.).Perbandingan morfologi dari jenis liar dan tembakau transgenik menunjukkan bahwa tembakau tipe liar, secara umum, menampilkan penghambatan pertumbuhan akar pada pH 8,0 (Gambar 3A., PH 8,0). Konsisten dengan perbedaan fenotipik, tes Biostatistik mengungkapkan bahwa panjang akar rata-rata dari tembakau transgenik di sextuplicate pada pH 8,0 (Gambar. 3B, pH 4.0- 8.0). Tembakau OSSEC24 transgenik yang tumbuh di bawah -Fe pada pH 8,0 menunjukkan peningkatan yang signifikan dalam jumlah akar dibandingkan dengan tanaman transgenik tumbuh di bawah +Fe dan jenis liar (Gambar. 3A dan B, pH 8,0). Setelah mengukur pH dari larutan kultur, ditemukan bahwa rerata pH SD (n = 5) untuk tembakau transgenik menurun dibandingkan dengan jenis tanaman liar, kecenderungan yang dilemahkan menjadi lebih jelas di bawah -Fe (Gambar. 3C).menunjukkan bahwa di bawah -Fe, rambut akar tembakau transgenik menunjukkan tingkat efflux H+ signifikan lebih tinggi daripada mereka yang di bawah +Fe dan kontrol tipe liar (Gambar. 4A dan B). OsSEC24 meningkatkan sekresi H+, terutama di bawah -Fe, lanjut menjelaskan mengapa tanaman tembakau transgenik OSSEC24 lebih toleran terhadap -Fe daripada jenis liar (Gambar 3A., PH 8,0, -Fe).Untuk mengkonfirmasi apakah ekstrusi H+ ditingkatkan dengan OsSEC24 terkait dengan PM H+-ATPase, satu agen farmakologis, vanadat, penghambat PM H+-ATPase sel tanaman [34], diaplikasikan pada akar transgenik dan tembakau tipe liar setelah perlakuan -Fe dan +Fe, masing-masing (Gambar. 4A dan B, vanadat).kedua jenis liar dan akar padi transgenik menunjukkan efflux H+ terus menerus dibawah -Fe dan +Fe, masing-masing (Gambar. 5A). besarnya efflux H+ pada padi transgenik di bawah -Fe hampir 1-kali lipatan lebih tinggi daripada di bawah +Fe dan >2 kali lipat lebih tinggi dibandingkan yang pada jenis liar (Gambar. 5B).

Oleh karena itu, percobaan dengan vanadat di kedua tembakau dan padi menunjukkan bahwa sekresi H+ yang didorong oleh OsSEC24 di bawah -Fe disebabkan oleh PM H+-ATPase.analisis filogenetik menunjukkan bahwa OsPMA1, OsPMA2, dan OsPMA3 kemungkinan berbagi fungsi yang sama (Gambar 6A., Bawah). Analisis PCR dengan primer gen spesifik menunjukkan bahwa 4 dari 10 isogene H+-ATPase tipe P (OsPMA1 ke OsPMA10) diekspresikan pada akar (Gambar. 6B).gen OsPMA1 dan OsPMA2 menampilkan tingkat transkripsi yang jauh lebih tinggi di bawah -Fe daripada di bawah +Fe (Gambar. 6C).Transkrip OsPMA3 ditemukan akan sedikit di up-regulasi, sedangkan gen OsPMA7, salah satu isoform H+-ATPase utama diekspresikan dalam akar, tidak diatur secara transkripsional oleh -Fe (Gambar. 6C).Pada tipe liar OsPMA2-mCherry transgenik, mayoritas dari OsPMA2 ditunjukkan pada PM; sebaliknya, pada strain sec24/SEC24 OsPMA2-mCherry-transgenic, OsPMA2 dipisahkan dengan sitoplasma dengan tidak ada sinyal spesifik yang ditemukan dekat dengan PM. Penemuan ini mengindikasikan bahwa coat protein SEC24 memainkan peranan penting dalam pemilahan PM dari OsPMA2 (gambar 7A, atas). Dapat dikatakan bahwa introduksi OsSEC24 memperbaiki kerusakan pada target PM dari OsPMA2 pada strain sec24/SEC24 (gambar 7A, bawah). Alhasil, OsSEC24 memperlihatkan pola dispersive pada sitoplasma (gambar 7A, bawah). transforman double OsPMA2-mCherry dan OsSEC24-GFP memperlihatkan peningkatan signifikan dalam angka efflux yang dibandingkan dengan transforman single OsPMA2- mCherry, mCherry ditambah transforman vektor ganda GFP dan jenis liar (Gambar. 7B).Tingkat rata-rata aliran H+ dalam ekspresi transforman baik OsPMA 2- mCherry dan OsSEC24-GFP itu 1 kali lipat lebih tinggi daripada yang hanya transforman OsPMA2-mCherry dan hampir 9 kali lipat lebih tinggi daripada di mCherry ditambah transforman vektor ganda GFP dan tipe liar, masing-masing (Gambar. 7C). setelah 24 jam kultur pada pH 5,8, tingkat pH dalam media kultur dengan transforman double OsPMA2-mCherry- dan OsSEC24- GFP menurun secara signifikan dibandingkan dengan transforman OsPMA2- mCherry atau mCherry ditambah transforman ganda GFP (Gambar. 7D). Protein mantel SEC24 adalah kontributor kunci untuk pemilahan PM dari OsPMA2; OsSEC24 menyelamatkan hilangnya SEC24 pada sec24/SEC24; sementara eksogen OsSEC24 memiliki kapasitas yang lebih kuat untuk sekresi H+ daripada SEC24 endogen pada yeast, yang dapat menjelaskan mengapa pertumbuhan sec24/SEC24 transgenik OsSEC24 didukung pada pH 9,0 berbeda dengan tipe liar Setelah pewarnaan Biru Putih, co-lokalisasi OsSEC24-GFP dengan pewarna biru-putih menunjukkan bahwa OSSEC24sitosol diterima di ER untuk pengangkutan tunas vesikel dari ER (Gambar. 8A, atas, panah). Dan co-lokalisasi PMA2-mCherry dengan pewarna biru-putih menunjukkan bahwa OsPMA2 disintesis di ER sebelum dipisahkan ke PM (Gambar. 8A, bawah). Data inspeksi visual di bawah mikroskop konfokal bahwa OsPMA2-mCherry itu dikolokalisasi dengan OsSEC24-GFP dalam sitoplasma menganjurkan bahwa protein OsPMA2 dikemas dalam vesikel OsSEC24 (sekitar 20-23 jam) (Gambar. 8B, atas). Akhirnya, sinyal OsPMA2 spesifik ditemukan di dekat PM, tapi OsSEC24 telah dibongkar (sekitar 23-25 jam) (Gambar. 8B, bawah). Pengukuran tingkat aliran H+, kinetika real-time, dan rata-rata laju aliran H+ menunjukkan bahwa efflux bersih H+ dalam protoplas padi transgenik ganda OsSEC24-GFP dan OsPMA2-mCherry ditingkatkan, dibandingkan dengan sel transgenik OsPMA2-mCherry dan mCherry ditambah sel transgenik ganda GFP (Gambar. 8C dan D).

Data ini menunjukkan bahwa OsPMA2 keluar dari ER dilapisi oleh OsSec24 untuk transportasi vesikel dan ekspresi OsSec24 pada protoplas padi meningkatkan ekstrusi H+ yang diperantarai oleh OsPMA2.