10

BAHAN DAN METODE

Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian dilaksanakan mulai Januari hingga Juli 2010, bertempat di

Rumah Kaca Kebun Percobaan IPB Cikabayan Darmaga, Bogor dan

Laboratorium Virologi Tumbuhan, Departemen Proteksi Tanaman, Fakultas

Pertanian, Institut Pertanian Bogor.

Bahan dan Alat

Bahan yang digunakan pada penelitian ini adalah larutan kitosan 1% dan

kitosan 0,1%, tanaman kacang panjang kultivar Parade, air, tanah, pupuk,

inokulum bergejala VMKP, mercaptoethanol, carborundum, aquades, antiserum

BCMV strain Peanut Stripe, dan general Potyvirus, Bufer phosphat, PNP, serta

bufer-bufer ELISA.

Alat yang digunakan adalah gelas ukur, mortar, pistil, sarung tangan,

timbangan digital, hand sprayer, polybag, pipet mikro, plate ELISA, dan ELISA

Reader.

Metode Penelitian

Perbanyakan Inokulum

Daun tanaman kacang panjang yang bergejala mosaik sebelumnya

dideteksi secara serologi dengan metode ELISA menggunakan antiserum BCMV

strain Peanut Stripe dan general Potyvirus. Hasil deteksi menunjukkan bahwa

sampel negatif terhadap BCMV strain Peanut Stripe dan positif terhadap

antiserum general Potyvirus. Hasil perunutan DNA parsial gen coat protein

mengkonfirmasi bahwa VMKP yang digunakan adalah Bean common mosaic

virus (Damayanti 2010; data sekuen tidak dipublikasikan). Inokulum kemudian

diinokulasi dan diperbanyak ke tanaman kacang panjang yang sehat untuk sumber

inokulum. Inokulasi dilakukan pada tanaman kacang panjang yang berumur 7 hari

setelah tanam (HST).

Penanaman Kacang Panjang

Kacang panjang yang digunakan adalah kacang panjang kultivar Parade.

Kacang panjang ditanam pada media tanam tanah dan pupuk kandang dengan

11

perbandingan 2:1 di dalam polybag. Untuk setiap polybag ditanam 3 benih kacang

panjang. Pada saat tanaman telah berumur 7 hari, setiap polybag dipilih satu

tanaman dengan pertumbuhan yang baik. Pada saat tanaman telah berumur 18

hari, setiap polybag diberi ajir yang berguna untuk memudahkan tanaman tumbuh

menjalar dan diikat dengan menggunakan tali rafia.

Pembuatan Larutan Kitosan

Konsentrasi Kitosan yang digunakan pada penelitian ini sebesar 0,1% dan

1%. Kitosan diperoleh dari Laboratorium Teknologi Hasil Perikanan FPIK IPB

dengan konsentrasi 6%. Kitosan dengan konsentrasi 0,1% dan 1 % diperoleh

dengan cara diencerkan. Kitosan dengan konsentrasi 6% diencerkan menggunakan

aquades dengan pengenceran 6 kali untuk kitosan 1% dan pengenceran 60 kali

untuk memperoleh kitosan 0,1%.

Perlakuan

Adapun perlakuan yang digunakan adalah sebagai berikut ;

(1) Perlakuan kitosan 0,1% pada benih (PB0,1)

(2) Perlakuan kitosan 1% pada benih (PB1)

(3) Perlakuan kitosan 0,1% sebelum inokulasi (SB0,1)

(4) Perlakuan kitosan 1% sebelum inokulasi (SB1)

(5) Perlakuan kitosan 0,1% setelah inokulasi (ST0,1)

(6) Perlakuan kitosan 1% setelah inokulasi (ST1)

(7) Kontrol tanpa perlakuan kitosan yang diinokulasi dengan virus (K+)

(8) Kontrol sehat (K-)

Perlakuan kitosan sebelum inokulasi (SB) dilakukan pada saat tanaman

berumur 5 HST sedangkan perlakuan kitosan setelah inokulasi (ST) dilakukan

pada saat tanaman berumur 9 HST. Penyemprotan pada daun dilakukan merata

keseluruh permukaan daun.

Inokulasi Tanaman Uji

Tanaman kacang panjang yang telah berumur 7 HST siap untuk

diinokulasi dengan virus. Inokulum digerus menggunakan mortar dan pistil steril

bersama bufer phosphat yang mengandung 1% mercaptoethanol (ditambahkan

sebelum digunakan), dengan perbandingan inokulum dan bufer adalah 1:10.

Inokulum yang terdapat pada mortar dipersiapkan di atas es. Daun pertama

kacang panjang ditaburi

mekanis. Setelah diinokulasi daun dibilas dengan aquades.

Adapun parameter pengamatan yang diamati adalah sebagai berikut;

Perkembangan Penyakit

Parameter yang digunakan

yaitu waktu inkubasi, kejadian penyakit, keparahan penyakit, dan akumulasi virus

yang dideteksi dengan ELISA. Masa

sampai terjadinya gejala pertama yang muncul pada tanaman sedangkan kejadian

penyakit diamati hingga akhir penelitian.

Perhitungan keparahan penyakit ditentukan dengan menggunakan skala

yang telah ditentukan sebelum

pada saat tanaman berumur 2 MSI dan 4 MSI. Adapun skala yang digunakan

seperti yang telah digunakan oleh

berikut:

0 = Tanaman tidak menunjukkan gejala

1 = Gejala mosaik rin

2 = Gejala mosaik sedang

3 = Gejala mosaik berat

4 = Gejala mosaik berat dengan malformasi daun yang parah, kerdil, atau mati.

Gambar 1 Skala untuk kearahan penyakit. (a) skor 0; (b) skor

skor 3;(e)

Nilai akumulasi virus dari hasil ELISA digunakan untuk menghitung

persentase penghambatan virus akibat perlakuan kitosan dengan rumus sebagai

berikut:

Inokulum yang terdapat pada mortar dipersiapkan di atas es. Daun pertama

kacang panjang ditaburi carborundum 600 mesh, lalu sap diinokulasi secara

mekanis. Setelah diinokulasi daun dibilas dengan aquades.

Parameter Pengamatan

meter pengamatan yang diamati adalah sebagai berikut;

Perkembangan Penyakit

Parameter yang digunakan untuk mengetahui perkembangan penyakit

yaitu waktu inkubasi, kejadian penyakit, keparahan penyakit, dan akumulasi virus

yang dideteksi dengan ELISA. Masa inkubasi dihitung sejak inokulasi virus

sampai terjadinya gejala pertama yang muncul pada tanaman sedangkan kejadian

diamati hingga akhir penelitian.

Perhitungan keparahan penyakit ditentukan dengan menggunakan skala

yang telah ditentukan sebelum dilakukan pengamatan. Pengamatan dilakukan

pada saat tanaman berumur 2 MSI dan 4 MSI. Adapun skala yang digunakan

seperti yang telah digunakan oleh Kurnianingsih (2010) (Gambar 1) sebagai

0 = Tanaman tidak menunjukkan gejala

1 = Gejala mosaik ringan disertai pemucatan tulang daun

2 = Gejala mosaik sedang

3 = Gejala mosaik berat

4 = Gejala mosaik berat dengan malformasi daun yang parah, kerdil, atau mati.

Skala untuk kearahan penyakit. (a) skor 0; (b) skor 1; (c) skor 2;(d)

skor 3;(e) skor 4

Nilai akumulasi virus dari hasil ELISA digunakan untuk menghitung

persentase penghambatan virus akibat perlakuan kitosan dengan rumus sebagai

12

Inokulum yang terdapat pada mortar dipersiapkan di atas es. Daun pertama

600 mesh, lalu sap diinokulasi secara

meter pengamatan yang diamati adalah sebagai berikut;

untuk mengetahui perkembangan penyakit

yaitu waktu inkubasi, kejadian penyakit, keparahan penyakit, dan akumulasi virus

inkubasi dihitung sejak inokulasi virus

sampai terjadinya gejala pertama yang muncul pada tanaman sedangkan kejadian

Perhitungan keparahan penyakit ditentukan dengan menggunakan skala

dilakukan pengamatan. Pengamatan dilakukan

pada saat tanaman berumur 2 MSI dan 4 MSI. Adapun skala yang digunakan

(2010) (Gambar 1) sebagai

4 = Gejala mosaik berat dengan malformasi daun yang parah, kerdil, atau mati.

; (c) skor 2;(d)

Nilai akumulasi virus dari hasil ELISA digunakan untuk menghitung

persentase penghambatan virus akibat perlakuan kitosan dengan rumus sebagai

Nilai rata-rata

penghambatan penyakit,

Pertumbuhan Tanaman

Pertumbuhan tanaman yang diamati adalah tinggi tanaman, diameter

batang, masa berbunga, jumlah daun dan bobot kering tanaman. Penghitungan

tinggi dan diameter tanaman dilakukan pada 2, 4, 6, 8 minggu se

(MSI) (2, 4, 6, 8 MSI = 21, 35, 49, 63 HST) . Jumlah daun dihitung pada 7 MSI

dan bobot kering dihitung diakhir masa penelitian.

Konsentrasi virus pada tanaman kacang panjang ditentukan

dengan ACP-ELISA (

menggunakan antiserum

dengan manual pembuatnya

menggunakan ELISA

Percobaan ini disusun dalam Rancangan acak l

perlakuan dengan masing

analisis sidik ragam dan

pada taraf nyata α = 5%

rata skoring keparahan digunakan untuk meghitung persentase

penghambatan penyakit, dengan rumus sebagai berikut:

Pertumbuhan Tanaman

Pertumbuhan tanaman yang diamati adalah tinggi tanaman, diameter

batang, masa berbunga, jumlah daun dan bobot kering tanaman. Penghitungan

tinggi dan diameter tanaman dilakukan pada 2, 4, 6, 8 minggu se

(MSI) (2, 4, 6, 8 MSI = 21, 35, 49, 63 HST) . Jumlah daun dihitung pada 7 MSI

dan bobot kering dihitung diakhir masa penelitian.

ELISA

Konsentrasi virus pada tanaman kacang panjang ditentukan

ELISA (Antigen coated-plate enzyme-linked immunosorbent assay

menggunakan antiserum Potyvirus (DSMZ). Prosedur yang digunakan

dengan manual pembuatnya (DSMZ). Kuantifikasi virus dilakukan dengan

menggunakan ELISA Reader pada panjang gelombang 405 nm.

Analisis Data

Percobaan ini disusun dalam Rancangan acak lengkap (RAL)

asing-masing perlakuan 9 tanaman uji. Data diolah dengan

dan dilanjutkan dengan uji selang berganda Duncan

α = 5% menggunakan SAS versi 6.12.

13

oring keparahan digunakan untuk meghitung persentase

Pertumbuhan tanaman yang diamati adalah tinggi tanaman, diameter

batang, masa berbunga, jumlah daun dan bobot kering tanaman. Penghitungan

tinggi dan diameter tanaman dilakukan pada 2, 4, 6, 8 minggu setelah inokulasi

(MSI) (2, 4, 6, 8 MSI = 21, 35, 49, 63 HST) . Jumlah daun dihitung pada 7 MSI

Konsentrasi virus pada tanaman kacang panjang ditentukan secara serologi

linked immunosorbent assay)

Prosedur yang digunakan sesuai

. Kuantifikasi virus dilakukan dengan

engkap (RAL) terdiri dari 8

masing perlakuan 9 tanaman uji. Data diolah dengan

Duncan (DMRT)