Bab v, Tesis (Repaired)
Transcript of Bab v, Tesis (Repaired)
33
BAB 5
HASIL PENELITIAN
5.1 Peremajaan Streptococcus mutans
Peremajaan S. mutans dari stok lama dilakukan dalam media padat TYC,
yang terdiri dari tripton 15g/L, yeast extract 5g/L, L-cystine 0,2g/L, Na2SO3
0,1g/L, NaCl 1g/L, Na2HPO4 0,8g/L, Na2CO3 2g/L, CH3COONa 12g/L, Sukrosa
50g/L, dan Agar 12g/L (Stoppelaar, 1967). S. mutans yang ditanam pada media
agar yang mengandung sukrosa mempunyai karakteristik sebagai berikut, yaitu
ukuran koloni 0,5-1 mm, berwarna putih, permukaan koloni kasar, melekat erat
pada agar, di sekitar koloni dibasahi produk polimer glukan. S. mutans ini
termasuk anaerob fakultatif tetapi tumbuh optimum pada kondisi anaerob
(Rahardjo dan Kriswandini, 2004).
Pertumbuhan sel S. mutans dalam media padat TYC tampak setelah
diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37oC dalam candle jar, seperti tampak pada
Gambar 5.1.
Gambar 5.1 Pertumbuhan S.mutans dalam media TYC.
33
34
5.2 Pertumbuhan Streptococcus mutans dalam Media BHIB
Pertumbuhan S. mutans dalam media cair BHIB dilakukan dengan
memasukkan koloni tunggal S. mutans dari media padat TYC ke dalam media cair
BHIB 10ml. Media cair BHIB dibuat dengan melarutkan BHIB 37g/l dalam
akuades. Kultur S. mutans diinkubasi pada 37oC selama 24 jam dalam candle jar.
Pertumbuhan sel S. mutans dalam media BHIB dicirikan dengan warna putih
kekuningan, yang sebagian besar menempel di dasar erlenmeyer. S. mutans
tumbuh sangat baik dalam media BHIB pada keadaan anaerob (Nolte, 1982).
Bakteri S. mutans apabila ditanam pada medium yang diperkaya seperti
pada Brain Heart Infusion Broth (BHIB) berbentuk coccus dengan formasi rantai
panjang (Clark, 1924). Pertumbuhan S. mutans pada media BHIB seperti tampak
pada Gambar 5.2.
Gambar 5.2 Pertumbuhan S. mutans dalam media BHIB. (a) Pertumbuhan S. mutans pada media BHIB (b) Pertumbuhan S. mutans
pada dasar tabung erlenmeyer.
35
5.3 Pertumbuhan Biofilm Streptococcus mutans dalam Media BHIBS
Biofilm S. mutans tumbuh menempel pada slide glass setelah diinkubasi
selama 24 jam. Biofilm S. mutans yang menempel pada slide glass berwarna
putih kekuningan. Komposisi biofilm terdiri dari mikroorganisme, produk
tambahan ekstraseluler, polisakarida sebagai bahan pelekat yaitu glukan, dan air
(Watnick, et al., 1999).
Gambar 5.3 Pertumbuhan biofilm S. mutans dalam media BHIBS. (a) Pertumbuhan biofilm S. mutans dalam media BHIBS (b) Skematik
pertumbuhan biofilm S. mutans dalam media BHIBS.
5.4 Lisis Biofilm Streptococcus mutans
Lisis biofilm S. mutans dilakukan menggunakan metode ultrasonikasi
dengan kekuatan 7 x 30s, 40Hz (Cury, et al., 2007) dalam bufer TEM (10mM
Tris-HCl [pH 6,8], 1mM EDTA, 5mg MgSO4) (Welin, et al., 2004). Pada
awalnya, lisis dikerjakan dengan menggunakan kekuatan 10 x 1s, 40Hz (Welin,
2004). Tetapi, setelah dilakukan analisis protein terhadap crude protein hasil lisis
hanya ditemukan sebuah pita protein yang sangat tipis. Sehingga lisis terhadap
36
biofilm dengan kekuatan tersebut dianggap belum mampu memecah secara
keseluruhan komponen penyususn biofilm yang lebih kompak setelah diinkubsi
selama 24 jam.
Selanjutnya lisis dilakukan dengan kekuatan 40Hz selama 7 x 30s. Dengan
pertimbangan bahwa biofilm setelah diinkubasi selama 24 jam memiliki struktur
yang lebih kompak dibandingkan jika biofilm diinkubasi selama 2 jam (Cury, et
al., 2007) . Kekompakan struktur biofilm berbanding lurus dengan lama inkubasi
biofilm (Donlan, 2002). Inkubasi terhadap biofilm selama 24 jam bertujuan untuk
mendapatkan massa biofilm yang lebih banyak. Lisis dianggap berhasil setelah
beberapa pita protein terlihat pada hasil analisis menggunakan SDS-PAGE 12%.
37
5.5 Analisis Profil Protein Biofilm S. mutans dengan SDS-PAGE 12%
Hasil analisis profil protein biofilm S. mutans dengan variasi pengenceran
seperti tampak pada Gambar 5.4.
Gambar 5.4 Profil protein biofilm S. mutans. M: Marker protein, S: Sampel protein biofilm S. mutans (S1: pengenceran 2x;
S2: tanpa pengenceran; S3: pengenceran 1x)
Menurut Rantam 2003, penentuan berat molekul (BM) protein dilakukan
dengan menghitung nilai Rf (Retardation factor) dari masing-masing pita (band)
dengan rumus seperti di bawah.
97,4 kDa
66,3 kDa
55,4 kDa
36,5 kDa
31 kDa
21,5 kDa
14,4 kDa
Jarak pergerakan protein dari tempat awal
Jarak pergerakan warna dari tempat awalRf =
M S1
200 kDa
116,3 kDa
S3S2
6,0 kDa
38
Selanjutnya dicari nilai Rf dari marker, kemudian dibuat kurva standar.
Data untuk pembuatan kurva standar seperti tampak pada Tabel 5.1.
Tabel 5.1 Data pembuatan kurva standar penentuan BM protein.
BM markerMigrasi protein
marker RF (X) Log BM (Y)200.0 0,5 0,01 2,301116.3 9,75 0,17 2,06697.4 11,25 0,20 1,98866.3 20 0,36 1,82255.4 22,5 0,41 1,74436.5 34,25 0,62 1,56231.0 39,25 0,71 1,49121.5 50 0,91 1,33214.4 52 0,94 1,1586.0 54 0,98 0,984
Gambar 5.5 Kurva standar penentuan BM protein.
Berat molekul protein sampel ditentukan dengan cara mengkonversi data
nilai Rf sampel pada persamaan Y = 0,359X2 – 1,422X + 2,294. Dengan X nilai
Rf, sedang Y adalah nilai logaritma berat molekul protein. Nilai Rf sampel seperti
tampak pada Tabel 5.2.
39
Tabel 5.2 Nilai Rf sampel dari gel SDS-PAGE 12%.
Pita ke-Migrasi protein
sampelRF protein sampel
(X)1 0,6 0,012 1 0,023 2 0,034 4 0,075 11 0,206 15 0,277 20 0,368 24 0,439 25,5 0,4610 30 0,5411 31 0,5612 39 0,7113 43 0,7814 46 0,8315 50 0,9116 53 0,9617 54 0,98
Dari perhitungan berat molekul protein masing-masing pita sampel pada
lampiran 2, maka diketahui berat molekul masing-masing pita protein dari sampel
biofilm S. mutans adalah: 181, 176, 172, 154, 108, 90, 70, 58, 53, 43, 41, 28, 22,
19, 16, 14, dan 13 kDa.
5.6 Analisis Protein Antigenik Biofilm S. mutans dengan Western blot
Analisis protein antigenik biofilm S. mutans dilakukan dengan metode
Western blot, menggunakan sampel saliva dari individu karies (sIgA rendah) dan
non karies gigi (sIgA tinggi). Proses analisis protein menghabiskan waktu sekitar
7 jam, dengan rincian proses sebagai berikut: proses transfer protein pada
213 kDa
40
membran nitrocellulose 2,5 jam; inkubasi dengan antibodi primer (saliva) 2 jam;
inkubasi dengan antibodi sekunder (antihuman IgA) 1 jam; inkubasi dengan SA-
HARP selama 1 jam; dan inkubasi dengan substrat TMB 15 menit. Sampel saliva
yang memiliki sIgA rendah (sampel 1,2,3, dan 4) menunjukkan pita protein yang
lebih tipis dibandingkan dengan sampel yang memiliki sIgA tinggi (sampel 5,6,7,
dan 8). Data hasil analisis protein antigenik seperti tampak pada Gambar 5.7.
Gambar 5.6 Hasil analisis protein antigenik biofilm S. mutans. (Sampel 1, 2, 3, dan 4: sIgA rendah; Sampel 5, 6, 7, dan 8: sIgA tinggi).
Penentuan berat molekul protein antigenik dilakukan dengan cara
membandingkan pita protein hasil Western blot dengan profil protein hasil SDS-
PAGE 12% dan marker protein yang digunakan pada proses Western blot. Pita
protein hasil analisis Western blot yang merupakan protein antigenik biofilm
41
S. mutans sebagai biomarker risiko karies gigi sebanyak 4 buah, dengan berat
molekul 108, 43, 41, dan 28 kDa.