11

BAB III. METODE PENELITIAN

3.1 Tempat dan Waktu

Waktu yang digunakan dalam pelaksanaan penelitian ini dimulai bulan

Oktober 2018 – Januari 2019, bertempat di Laboratorium Bioteknologi Universitas

Muhammadiyah Malang.

3.2 Alat dan Bahan

3.2.1 Alat

Adapun alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah Autoklaf, Laminar

Air Flow, pH Meter, Spektofotometri Shimadzu UV-1601, Oven, Microwave,

Centrifuge, Labu Takar, Tabung Reaksi, Tube 2 ml, Pipet Ukur, Vortex,

Timbangan analitik.

3.2.2 Bahan

Bahan yang digunakan di dalam penelitian ini adalah tanah reklamasi bekas

tambang kapur PT. Semen Indonesia yang berlokasi di Kabupaten Tuban, Jawa

Timur sebagai sumber isolat. Media isolasi dan pengujian indeks zona bening yang

digunakan adalah media agar Pikovskaya (Tabel 2) dengan modifikasi sumber P

menggunakan Ca3(PO4)2 sebanyak 5 g dalam 1 L media. Pengujian kadar fosfat

terlarut yang mampu di hasilkan menggunakan media Pikovkaya cair dengan

sumber P menggunakan Ca3(PO4)2 sebanyak 5 g dalam 1 L media. Media tumbuh

pengujian hormone Indole Acetic Acid dan pengujian kemasaman aluminium sulfat

menggunakan media NB (Nutrient Broth) (Tabel 3). Media NB dengan

penambahan L-Trypthophan 100 ppm digunakan pada pengujian Hormon IAA dan

media NB dengan penambahan Aluminium Sulfat (Tabel 5) digunakan pada

12

pengujian kemasaman. Pengujian hormon IAA secara kualitatif menggunakan

reagen Gordon & Weber (Tabel 4).

3.3 Diagram Alur Penelitian

3.4 Rancangan Penelitian

Rancangan yang digunakan pada pelaksanaan kegiatan penelitian ini

menggunakan rancangan penelitian deskriptif kualitatif. Metode ini ditujukan untuk

Pikovkaya Agar

Positif

Negatif

(+) Al2SO4

(+) L-Trypthopan 100 ppm

Pikovkaya Cair

Pikovkaya Agar

Pembuatan Media Tumbuh

Terbentuk Zona Bening

Uji Indeks Zona Bening

Uji Fosfat Terlarut

Uji Toleransi Kemasaman

Aluminium Sulfat

Uji Hormon IAA

Sterilisasi Alat

Sampling Tanah

Isolasi

Pemurnian

Identifikasi Mikro

Identifikasi Makro

Pewarnaan Gram

Pikovkaya

Nutrient

Broth

Isolat Murni

Isolat bakteri dengan kemampuan melarutkan fosfat, toleran

terhadap kemasaman, dan mampu menyintesis hormon IAA

Gambar 4. Diagram alur penelitian

13

mengetahui kemampuan bakteri dalam melarutkan fosfat, mensistesis fitohormon

dan toleransi terhadap kondisi masam. Data yang disajikan berupa data kualitatif

dan kuantitatif.

3.5 Pelaksanaan Penelitian

3.5.1 Sterilisasi Alat

Peralatan laboratorium direndam pada larutan NaOCl 10% selama 24 Jam

kemudian dibilas dengan air. Sterilisasi alat menggunakan autoclave dengan suhu

121°C pada tekanan 1 Atm selama 60 menit dan untuk tabung reaksi dan

erlemenyer, bagian mulut labu dan tabung ditutup terlebih dahulu dengan

menggunakan Aluminium Foil dan dibungkus dengan plastik Wrap (Santosa,

2007).

3.5.2 Pembuatan Media Pikovskaya

Tabel 2. Komposisi Media Pikovskaya (Nautiyal, 1999)

Komposisi Gram/Liter

Glucose 10,000

Ca3(PO4) 5,0000

Yeast Extrak 0,5000

NACL 0,2000

KCL 0,2000

MnSO4.H2O 0,0025

MgSO4.7H2O 0,1000

FeSO4.7H2o 0,0025

(NH4)2SO4 0,5000

Bahan yang digunakan pada tabel 2 ditimbang sesuai komposisi dan

ditambahkan 1 L Aquades dalam labu takar, pembuatan media Pikovkaya padat di

tambahkan agar mikrobiologi sebagai aglinat media padat sebanyak 20 g/L.

14

sterilisasi media menggunakan autoclave pada suhu 121°C, tekanan 1 Atm selama

15 menit. Alur pembuatan media Pikovkaya padat disajikan pada gambar 5.

3.5.3 Pembuatan Media NB

Tabel 3. Komposisi media Nutrient Broth Merck

Komposisi Gram/Liter

Meat extract 1,00

Yeast extract 2,00

Peptone 5,00

NaCl 5,00

Nutrient Broth yang digunakan merupakan kit Nutrient Broth No 3 dari

Merck. Sebanyak 13g bubuk media NB di larutkan kedalam 1000 mL aquadest.

Media yang telah homogen disterilisasi menggunakan autoclave dengan suhu

Timbang bahan sesuai komposisi

Larutkan bahan 1 L Aquadest

Homogenkan

Sterilisasi Autoclave

15 menit, 121°C, 1

ATM

Tuang 10ml ke

Petridish

Pikovkaya Cair

Steril

Pikovkaya cair

20 g Agar

Pikovkaya padat

+

Pikovkaya Padat

Steril

Gambar 5. Alur pembuatan media Pikovkaya cair dan padat

15

121°C, pada tekanan 1 Atm selama 15 menit. Alur pembuatan media Nutrient Broth

disajikan pada Gambar 6

3.5.4 Sampling Tanah

Sampel tanah yang digunakan untuk mendapatkan isolat bakteri yang

mampu melarutkan fosfat adalah tanah reklamasi bekas tambang kapur PT. Semen

Indonesia berlokasi di Kabupaten Tuban. Kondisi lingkungan di wilayah

Kabupaten Tuban yang berkapur menjadi prioritas sebagai tempat yang berpotensi.

Kondisi lingkungan ini diharapkan mendapatkan bakteri indigenous yang hidup

pada lingkungan berkapur. Denah pengambilan sampel diukur menggunakan GPS

dengan mengukur titik kordinat tempat pengambilan sampel.

Titik pengambilan sampel dilakukan sebanyak lima titik dengan dengan luas

sampling sebesar 1000m2. Lokasi pengambilan sampel tanah dapat dilihat pada

Gambar 7. Sampel tanah diambil sebanyak 500 g untuk setiap titik pengambilan.

Sebanyak 5 sampel tanah di beri kode P1, P2, P3, P4, dan P5 pada titik pengambilan

Timbang bahan sesuai komposisi

Larutkan bahan 1 L Aquadest

Homogenkan

Sterilisasi Autoclave

15 menit, 121°C, 1

ATM

Nutrient Broth

Steril

Gambar 6. Alur pembuatan media Nutrient Broth

16

sampel tanah. Titik tanah disebar pada setiap sudut area sampling dan titik tengah

area sampling.

Gambar 7. Lokasi pengambilan sampel tanah (www.maps.google.com)

3.5.5 Isolasi & Identifikasi

Isolasi setiap sampel tanah dilakukan menggunakan metode pengenceran

bertingkat, untuk memperoleh bakteri pelarut fosfat menggunakan media agar

selektif Pikovskaya dengan memodifikasi sumber P menggunkan Ca3(PO4)2 untuk

mendapatkan bakteri pelarut fosfat (Santosa, 2007). Sebanyak 1 g sampel tanah

dilarutkan ke dalam 9 ml akuades steril pada tabung reaksi dan dihomogenkan, 1

ml larutan dari pengenceran dilarutkan kembali ke dalam 9 ml aquades steril hingga

deret pengenceran ke 10-8. Pengenceran yang digunakan yaitu pengenceran ke

17

empat, ke enam dan ke delapan. Penggunaan pengenceran tersebut mengacu kepada

penelitian (Darmayasa, et al., 2014).

Pipet masing masing 100 µl larutan dari pengenceran dan secara aseptik

tuang ke dalam cawan petri yang berisi media Pikovskaya padat, goyang kekanan

dan kekiri hingga seluruh permukaan agar rata dengan larutan pengenceran.

Identifikasi bakteri yang mampu melarutkan fosfat ditandai dengan terbentuknya

zona bening pada media Pikovskaya, semakin lebar zona bening, secara kualitatif

10-1 10-2 10-3 10-4 10-

5

10-6 10-7 10-8

9

mL

9

mL

9

mL

9

mL

9

mL

9

mL

9

mL

9

mL

1 Gr

Tanah

1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL

100 µL

Gambar 8. Pengenceran bertingkat isolasi bakteri pelarut fosfat (Darmayasa, et

al., 2014)

18

dapat dianggap sebagai tanda bakteri pelarut fosfat semakin besar dalam

melarutkan fosfat dalam media (Santosa, 2007).

3.5.6 Pemurnian & Karakterisasi

Isolat bakteri yang dimurnikan dipilih dari koloni yang membentuk zona

bening dari setiap sampel tanah sehingga didapatkan bakteri yang berpotensi

melarutkan fosfat dari lima sampel tanah. Pemurnian dilakukan dengan metode

goresan T pada media agar Pikovskaya. Isolat murni yang telah didapatkan di

karakterisasi secara makroskopis dan mikroskopis.

Gambar 9. Panduan karakterisasi koloni bakteri (Putra, 2018)

Karakterisasi bakteri secara makroskopis meliputi bentuk koloni,

permukaan koloni (elevasi), tepi koloni (Margin), warna koloni dengan panduan

Gambar 9. Karakterisasi bakteri secara mikroskopis meliputi bentuk sel dan

pewarnaan gram. Pewarnaan gram dilakukan dengan cara meneteskan aquades

pada kaca objek ditambahkan 1 ose biakan sample lalu difiksasi di atas api

19

kemudian ditetesi dengan kristal violet dan biarkan selama 1 menit, di cuci dengan

aquades steril mengalir dan di tetesi dengan lugol selama 1 menit, dicuci kembali

dengan aquades steril mengalir, selanjutnya di tetesi alkohol 96% selama 1 menit

dan dicuci kembali. Langkah selanjutnya ditetesi safranin selama 1 menit dan

dibilas menggunakan aquades steril tahap terakhir mengeringkan dengan tisu dan

mengamati dengan menggunakan mikroskop. Alur pewarnaan gram terlihat pada

Gambar 10.

Isolat murni yang telah di dapatkan ditumbuhkan pada media miring

Pikovskaya padat sebagai stok dan perbanyakan isolat bakteri. Sebanyak 1 ose

jarum sampel di tumbuhkan pada media Pikovskaya padat pada tabung reaksi 15

1 Ose Isolat

Aquades Steril

Tetesi Kristal Violet

Bilas

Aquades Steril

Tetesi Lugol

Bilas

Aquades Steril

Tetesi Safranin

Bilas

Aquades Steril

Tetesi Alkohol 96%

Bilas

Amati di bawah mikroskop

Gram Positif : Ungu Kebiruan

Gram Negatif : Merah Muda

Diamkan

1 Menit

Diamkan

1 Menit

Diamkan

1 Menit

Diamkan

1 Menit

Gambar 10. Alur pewarnaan gram (Hadioetomo, 1985)

20

ml kemudian diinkubasi pada suhu ruang suhu 5°C di dalam lemari pendingin untuk

menjaga bakteri tetap hidup.

3.5.7 Pengujian Kadar Fosfat Terlarut

Isolat yang telah di murnikan dilakukan uji pemberian fosfat pada media

pikovskayas cair yang telah di modifikasi dengan pemberian Ca3(PO4)3OH sebagai

sumber fosfat secara aseptik. Sebanyak 1 ose jarum isolat di tumbuhkan di media

cair dan di inkubasi di atas shaker selama 72 Jam pada kecepatan 120 Rpm

(Tabatabaei, et al., 2016). Setelah masa inkubasi dihitung kadar fosfat tersedia

dengan cara media uji disaring menggunakan kertas saring whatman no 1 dan

disentrifus dengan kecepatan 6000 rpm selama 15 menit sampai pemisahan antara

filtrat dan endapan bakteri pelarut fosfat terjadi. Pengukuran kandungan P-tersedia

menggunakan metode Bray-II dan nilai absorbandi dibaca dengan metode

kolorimetri dengan panjang gelombang 710 nm (Santosa, 2007).

3.5.8 Pengujian Indeks Zona Bening

Seluruh isolat bakteri yang telah murni diuji indeks potensi zona bening

yang terbentuk. Pengukuran indeks potensi zona bening menggunakan media

Pikovkaya padat untuk melihat seberapa besar zona bening yang terbentuk pada

media tersebut. Pengukuran indeks potensi zona bening menggunakan rumus dari

Santosa, (2007) yaitu:

𝑰𝑷 = 𝑫𝒁𝑩

𝑫𝑲

Keterangan: DZB = Luas zona bening (cm)

DK = Luas koloni bakteri atau jamur pelarut fosfat (cm)

21

Pengukuran luas zona bening dan luas koloni bakteri menggunakan metode

kualitatif citra visual dengan menggunakan software ImageJ. Konsep pengukuran

luas menggunakan citra visual ialah mengukur hasil luas objek dibandingkan

dengan luas standart (Robot, et al., 2018). Pembuatan luas standart menggunakan

kertas HVS berwarna kontras dengan bentuk persegi berukuran 1 × 1 cm.

Pengambilan citra visual menggunakan kamera sony a5000, pengambilan citra

visual pada objek diikuti dengan luas standart yang telah di buat.

Gambar 11. Format foto untuk citra visual menggunakan imageJ A) Standart luas

pembanding 1 cm2: B) Koloni bakteri

3.5.9 Pengujian Hormon Indole Acetic Acid

Pengujian hormon indole acetic acid menggunakan metode kolorimetri

spektofotometri dengan pereaksi Gordno & Weber (Gordon & Weber, 1950).

Pembuatan pereaksi mengikuti komposisi tetapan Gordon & Weber, sebanyak 8,12

g FeCl3 dilaurkan dengan air deionisasi dalam labu takar 100 ml dan cukupkan

volume sampai 100 ml. Campurkan 1ml larutan FeCl3 dengan 50 ml HClO4 35%

dalam botol gelap. Komposisi pelarut Gordon & Weber dapat dilihat pada Tabel 4.

22

Tabel 4. Komposisi pereaksi Gordon & Weber

Bahan Komposisi

0,5 M FeCl3 1 mL

HCLO4 35% 50 mL

Sebanyak 20 ml kultur di sentrifuse pada kecepatan 8.000 rpm pada suhu

4°C selama 10 menit lalu saring supernatan dengan membran filter 0,45 μm. 1 ml

supernatan yang telah disaring di pipet ke dalam tabung reaksi bersih lalu ditambah

4 ml pereaksi Gordon & Weber. Kocok lalu inkubasi campuran supernatan dan

pereaksi selama 15 menit, kemudian diukur absorbansinya pada λ = 530 nm dengan

spektofotometri (Yuniarti & Purwani, 2007).

3.5.10 Pengujian Kemasaman Aluminium Sulfat

Isolat yang mampu melarutkan fosfat di uji kembali menggunakan media

NB modifikasi dengan merubah tingkat kemasaman media dengan menambahkan

larutan Al2(SO4)3 dengan kadar perlakuan sebagai berikut

Tabel 5. Perlakuan tingkat keasaman

Perlakuan Kadar ppm Al2(SO4)3 pH Media

A 0 ppm 6,8

B 100 ppm 4,5

C 200 ppm 4,2

D 400 ppm 4,1

E 600 ppm 4,0

F 800 ppm 3,9

G 1000 ppm 3,6

Pertumbuhan bakteri diamati secara kolorimetri setiap 2 jam selama 24 jam

dengan panjang gelombang λ 420 nm, data dibaca sebanyak tiga kali setiap

pengamatan dan hasil yang digunakan kemudian di rata-rata.

23

3.6 Variabel Pengamatan

Variabel yang diamati meliputi:

1. Isolasi & identifikasi bakteri pelarut fosfat

Indentifikasi bakteri yang mampu melarutkan fosfat ditandai dengan

terbentuknya zona bening di sekikar koloni bakteri. Zona bening yang

terbentuk menandakan fosfat terikat mampu dipecah oleh bakteri

sehingga menghasilkan zona bening.

2. Karakteriasi bakteri pelarut fosfat

Karakterisasi bakteri secara makroskopis meliputi bentuk koloni,

permukaan koloni (elevasi), tepi koloni (Margin), warna koloni dengan

panduan Gambar 9. Karakterisasi bakteri secara mikroskopis meliputi

bentuk sel dan pewarnaan gram.

3. Analisis indeks zona bening

Pengukuran luas zona bening dan luas koloni bakteri menggunakan

metode kualitatif citra visual dengan menggunakan software ImageJ.

Konsep pengukuran luas menggunakan citra visual ialah mengukur

hasil luas objek dibandingkan dengan luas standart

4. Analisis kuantitatif fosfat terlarut

Analisis kuantitatif fosfat terlarut dengan mengukur kandungan P-

tersedia dengan metode Bray-II dan diukur dengan metode kolorimetri

dengan panjang gelombang 710 nm (Santosa, 2007)

24

5. Analisis kuantitatif fitohormon

Pengujian hormon indole acetic acid menggunakan metode kolorimetri

spektofotometri dengan pereaksi Gordno & Weber (Gordon & Weber,

1950).

6. Analisis pertumbuhan bakteri pada kondisi kemasaman Al2SO4

Analisis nilai OD sel bakteri dibaca menggunakan metode kolorimetri

dengan panjang gelombang 420 nm. Pertumbuhan bakteri diamati

secara kolorimetri setiap 2 jam selama 24 jam dengan panjang

gelombang λ 420 nm, data dibaca sebanyak tiga kali setiap pengamatan

dan hasil yang digunakan kemudian di rata-rata.