8

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Tanaman Kacang Panjang

Kacang panjang bukan tanaman asli Indonesia, tetapi diduga berasal dari

India dan Afrika Tengah. Tanaman ini menyebar diseluruh daerah Asia Tropika

sehingga banyak dikenal kacang panjang jenis lokal yang sesuai dengan keadaan

lingkungan tempatnya tumbuh (Haryanto et al.,1999).

Kacang panjang termasuk dalam tumbuhan divisi Spermatophyta, kelas

Angiospermae, ordo Rosales, family Leguminosa, genus Vigna, spesies Vigna

sinensis, L. (Haryanto et al.,1999). Bunga kacang panjang berbentuk kupu-

kupu,warna bunga ada yang putih, biru atau ungu. Bunga kacang panjang dapat

menyerbuk sendiri. Ibu tangkai bunga keluar dari ketiak daun. Setiap ibu tangkai

bunga mempunyai 3 sampai 5 bunga. Penyerbukan dengan serangga dapat terjadi

dengan kemungkinan 10%. Buah kacang panjang berbentuk polong bulat panjang

dan ramping. Panjang polong sekitar 10-80 cm. Warna polong hijau muda sampai

hijau keputihan. Setelah tua warna polong putih kekuningan dan polong menjadi

liat. Pada satu polong berisi 8-20 biji kacang panjang (Nazaruddin, 2003).

Kacang panjang dapat tumbuh didataran rendah maupun dataran tinggi

dengan ketinggian antara 0-1500 m di atas permukaan laut (dpl). Kacang panjang

biasanya digolongkan sebagai sayuran dataran rendah karena tanaman ini tumbuh

lebih baik dan banyak diusahakan di dataran rendah pada ketinggian kurang dari

600 m dpl. Suhu harian yang sesuai untuk tanaman kacang panjang adalah sekitar

9

18-32° C dengan suhu optimim 25° C. Kacang panjang dapat ditanam sepanjang

musim, baik musim kemarau maupun musim hujan. Tanaman kacang panjang

membutuhkan curah hujan sekitar 600-2000 mm/tahun dan membutuhkan banyak

sinar matahari. Oleh karena itu lahan terbuka di dataran rendah lebih disukai,

sedangkan apabila dinaungi produksinya kurang memuaskan (Hutapea,1994).

Jenis tanah yang cocok untuk tanaman kacang panjang adalah tanah

berstektur liat berpasir dengan pH optimal yang dibutuhkan adalah 5,5-6,5. Tanah

yang terlalu asam dibawah pH 5,5 dapat menyebabkan tanaman tumbuh kerdil

karena keracunan garam aluminium (Al) yang larut dalam tanah (Nazzarudin,

2003).

Produksi rata-rata kacang panjang Indonesia pada tahun 1997 sampai

tahun 2000 adalah 400.66 ton, sedangkan produksi rata-rata pada tahun 2011

sampai tahun 2014 mengalami penurunan menjadi 313.743 ton (BPSRI , 2014).

penurunan produksi kacang panjang disebabkan karena luasan panen mengalami

penurunan sebanyak 12% (sekitar 70.000 ha), produktivitas tanaman yang rendah

yakni 10,09 ton/ha, penggunaan benih dengan mutu yang kurang baik, dan

gangguan hama penyakit tanaman.

2.2 Hama dan Penyakit Tanaman Kacang Panjang

Hama penting yang dilaporkan menyerang kacang panjang antara lain,

tungau merah Tetranychus bimaculatus (Acarina: Tetranychidae), kutukebul

Bemisia tabaci (Hemiptera : Aleyrodidae), penggerek polong Riptortus linearis

(Hemiptera: Alydidae), kutu daun Aphis craccivora (Hemiptera : Aphisidae) dan

ulat penggerek polong Maruca restualis (Lepidoptera : Crambidae) (Anwar et al.

10

2005). Upaya yang banyak dilakukan untuk mengendalikan hama-hama tersebut

adalah dengan melakukan pergiliran tanaman, melakukan pengendalian secara

biologi dengan menggunakan musuh alaminya yaitu kumbang Scymnus sp dan

laba-laba.

Beberapa penyakit yang menyerang tanaman kacang panjang diantaranya

layu cendawan (Fusarium sp.), Antraknosa (Colletotricum lindemuthianum), puru

akar (Meloidogyne sp), penyakit sapu (Cowpea Witches-broom Virus/Cowpea

Stunt Virus), layu bakteri (Pseudomonas solanacearum) dan penyakit mosaik

yang disebabkan oleh Bean common mosaic virus (BCMV), Bean yellow mosaic

virus (BYMV) dan Cowpea aphis borne mosaic virus (CABMV) (Anwar et al.,

2005). Penyakit mosaik vein banding yang dilaporkan oleh Damayanti et al.,

(2009) disebabkan oleh Bean common mosaic virus (BCMV) dan Cucumber

mosaic cucumovirus (CMV).

2.3 Penyakit Mosaik Vein Banding pada Kacang Panjang

Penyakit mosaik vein banding pada tanaman kacang-kacangan merupakan

penyakit yang disebabkan oleh virus yang dikenal dengan nama BCMV (Bean

common mosaic virus). Virus ini umumnya menginfeksi tanaman kacang-

kacangan seperti pada buncis (Phaseolus vulgaris), kacang tunggak (Vigna

unguiculata), kacang hijau (V.radiata) dan dari family Leguminosae lainnya

(Morales & Bos,1988).

Penyakit mosaik yang disebabkan oleh BCMV merupakan penyakit

penting pada tanaman kacang-kacangan. BCMV mempunyai kisaran inang tidak

11

terbatas pada tanaman Phaseolus spp., tetapi dapat juga menyerang tanaman

leguminosae yang lain (Palukaitis et al., 1997). BCMV dapat ditularkan secara

mekanis melalui beberapa spesies kutu daun secara nonpersisten dan melalui

benih. Adapun yang dapat menjadi vektor BCMV antara lain Aphis gossypii,

Aphis craccivora, Myzus persicae dan M.solanifolii.

Variasi gejala penyakit yang disebabkan oleh BCMV tergantung dari

strain BCMV, suhu dan genotip inang. Lebih dari 15 strain BCMV yang telah

diketahui diantaranya Blackeye, US1, US5, NL2, NL3, NL4, NL5, NL6, NL7 dan

NL8 (Morales & Bos, 1988). Gejala BCMV ditunjukkan dengan mosaik berupa

perubahan warna daun yang memperlihatkan warna hijau tua dan hijau muda,

dan terjadi penebalan pada tulang daunnya (vein banding). Tanaman yang

terinfeksi secara sistemik, khususnya dari infeksi benih menunjukkan gejala daun

dengan pola mosaik, daun menggulung dan mengkerut sepanjang tulang daun

(malformasi). Secara umum tanaman yang diinokulasi dengan virus biasanya akan

muncul gejala pada 7-10 hari setelah inokulasi (Dijkstra & Dejeger , 1998).

Cucumber mosaic virus (CMV) termasuk dalam kelompok Cucumovirus,

bersama-sama dengan Peanut stunt virus (PStV) dan Cabaio aspermy virus

(CAV). Virus ini mempunyai kisaran inang terluas diantara virus tanaman yang

diketahui saat ini, dan dilaporkan dapat menginfeksi lebih dari 800 spesies

tumbuhan dan dapat menyebabkan kerugian besar pada berbagai jenis tanaman

(Palukaitis et al., 1997). Gejala yang ditimbulkannya oleh CMV beragam karena

memiliki kisaran inang yang luas (Siregar, 1996). CMV mempunyai kisaran inang

12

yang sangat luas, terdapat pada tanaman sayuran, hias dan buah-buahan. Selain

menyerang mentimun, CMV juga menyerang tanaman melon, labu, cabai, bayam,

tomat, seledri, bit, polong-polongan, pisang, tanaman famili crucifereae,

delphinium, gladiol, lili, petunia, tulip, zinia, dan beberapa jenis gulma (Agrios,

2005).

Infeksi CMV pada cabai dapat menyebabkan berbagai perubahan pada

daun seperti perubahan warna (mosaik/mosaic atau belang/mottle); perubahan

bentuk (menggulung,menyempit, mengkerut atau berubah seperti tali

sepatu/shoestring, berukuran lebih kecil), dan mengalami nekrosis (membentuk

cincin-cincin nekrotik). Gejala pada batang adalah batang menjadi kerdil. Gejala

pada buah berupa distorsi, diskolorasi, deformasi, sunken areas, black spot,

bercak dan cincin-cincin nekrotik, serta buah bengkok. Gejala CMV pada daun

cabai dapat berupa gejala mosaik yang parah. Pada daun yang lebih tua akan

tampak gejala nekrotik cincin, buah akan mengalami malformasi bentuk, serta

terdapat bercak atau cincin berwarna kuning di tengah, pada buah dari tanaman

yang terserang CMV (Clark dan Adams, 1997).

Penyebaran CMV dapat dilakukan oleh lebih dari 60 spesies kutu daun,

khususnya oleh Aphis gossypii dan Myzus persicae secara non-persisten. Virus ini

bisa ditularkan hanya dalam waktu 5-10 detik dan ditranslokasikan dalam waktu

kurang dari satu menit. Kemampuan CMV untuk ditranslokasikan menurun kira-

kira setelah 2 menit dan biasanya hilang dalam 2 jam. Selain itu, beberapa isolat

dapat kehilangan kemampuannya untuk ditularkan oleh spesies kutudaun tertentu

13

tetapi tetap dapat ditularkan oleh spesies kutudaun yang lain. Berbagai spesies

gulma dapat menjadi inang CMV, oleh karenanya dapat menjadi sumber virus

bagi tanaman budidaya lain (Khetarpal et al., 1998). Pada daerah subtropis CMV

dapat melewati musim dingin dan bertahan pada gulma tahunan (Agrios, 2005).

2.4 Karakter Umum Potyvirus

Bean common mosaic virus (BCMV) termasuk dalam famili Potyviridae

dan genus Potyvirus (Agrios, 2005). Potyvirus merupakan grup terbesar dari 34

grup virus tanaman . Genus ini terdiri dari setidaknya 180 anggota definitif (91

spesies resmi dan 89 spesies tentatif. Sebanyak 30% dari semua virus tanaman

yang diketahui menyebabkan kerugian signifikan dalam bidang pertanian,

tanaman pakan ternak, tanaman hortikultura dan tanaman hias adalah Potyvirus

(Ward & Shukla 1991).

Partikel Potyvirus berbentuk filamen lentur (Gambar 2.1), tanpa envelop

berukuran panjang 680-900 nm dan lebar 11-15 nm. Material genetik Potyvirus

berupa poliprotein tunggal, untai tunggal, utas positif dengan panjang 10 kb.

14

Gambar 2.1. Partikel Potyvirus (Sumber :Winterhalter 2005)

Genom RNA terdiri dari satu open reading frame (ORF) yang

mengekspresikan satu poliprotein prekusor berukuran 350 kDa. Prekursor

poliprotein tersebut kemudian ditranslasi menjadi tujuh protein kecil yang

memiliki berbagai fungsi, dinotasikan sebagai P1, helper component (HC), P3,

cylindrical inclusion (Cl), nuclear inclusion A (Nla), nuclear inclusion B (Nlb),

capsid protein (CP), serta dua protein putatif kecil yang dikenal sebagai 6K1 dan

6K2 (Shukla et al.,1994) (Tabel 2.1 dan Gambar 2.2). Pada bagian terminal 3

diakhiri dengan motif poly-A tail (Hari et al.,1979; Takahashi, et al., 1997).

15

Tabel 2.1 Organisasi Genom Potyvirus

Protein Fungsi P1 Proteinase; Cell-to-cell movement. HC-Pro transmission oleh Aphid, Proteinase; Cell-to-cell movement. P3 Belum diketahui Cl Replikasi genome (RNA helicase); Membrane attachment,

stimulasiasam nukleat aktivitas ATPase ; Cell-to-cell movement. CP EncapsidaRNA; berperan dalam transmisi oleh vektor; Cell-to-

cell-movement. Nla-VPg Replikasi genome (Primer untuk inisiasi sintesis RNA). Nla-Pro Proteinase Nlb Replikasi genome (RNA-dependent RNA polimerase [RdRp]). 6K1 & 6K2 Belum diketahui, namun diduga berperan pada: Replikasi RNA,

pengatur untuk penghambatan translokasi nuclear Nla, membran pengikat proses replikasi.

(Sumber: Winterhalter, 2005).

Genom Potyvirus diekspresikan melalui translasi poliprotein dari genom

virus. Poliprotein mengalami pemotongan menjadi protein fungsional dan

struktural sesuai dengan gen yang disandikannya yang terjadi di dalam sitoplasma.

Selama dan sesudah translasi terjadi pemotongan poliprotein oleh protease yang

berasal dari ekspresi dari genom Potyvirus. Poliprotein yang diekspresikan oleh

genom virus diproses menjadi 10 protein fungsional oleh tiga jenis enzim

proteinase yang dihasilkan oleh virus itu sendiri (Hull, 2002).

P1 HC-Pro P3 Cl VPg Nla-Pro Nlb CP

Gambar 2.2. Organisasi Genom Potyvirus (Shukla et al., 1994)

Protein inklusi (CI) dan protein selubung (CP) berguna untuk pergerakan

dari satu sel inang ke sel inang lainnya melalui plasmodesmata. CP juga

digunakan untuk pergerakan virion protein dalam jaringan vaskuler melalui

VPg

6K1 6K2 JUTR

Poly-A

16

interaksi dengan Hc-Pro pada domain C- dan N- terminalnya.HC-Pro dengan

menggunakan antiviral yang disebut RNA silencing, berfungsi menekan

mekanisme pertahanan tanaman. Viral genome-linked protein (VPg) merupakan

protein multifungsi yang berperan pada saat amplifikasi dan pergerakan virus

yang berada pada ujung 5 genom virus. Protein ini merupakan bagian N-proximal

dari protein inklusi inti (NIa) dan terpisah secara autokatalik dari domain C-

proximal proteinase (NIa-Pro). VPg berikatan secara kovalen dengan ujung 5'

RNA virus melalui ikatan fosfodiester pada residu asam amino tirosin yang

terletak di bagian N-proximal. VPg mempunyai peranan penting untuk proses

infeksi virus. VPg juga berinteraksi dengan faktor inisiasi translasi (eIF(iso)4E),

dan diperlukan untuk infeksi secara sistemik. Genom Potyvirus mempunyai

bagian yang tidak berubah (conserved) dan daerah yang bervariasi. Hc-Pro dan

Nlb merupakan bagian yang tidak berubah. Daerah yang bervariasi adalah PI,

P3, dan CP (Ward & Shukla, 1991).

Penelitian keragaman genetik pada genus Potyvirus telah banyak

dilakukan berdasarkan gen-gen yang terlibat didalam pembentukan selubung

protein dan daerah 3'UTR. Daerah tersebut diketahui merupakan daerah yang

bervariasi diantara kelompok Potyvirus. Shukla & Ward (1988) menggunakan

runutan asam amino selubung protein (CP) untuk menilai hubungan kekerabatan

berbagai virus dalam kelompok Potyvirus. Kesamaan runutan asam amino CP

38% hingga 71% untuk strain virus yang berbeda, dan tingkat kesamaannya

mencapai 90% sampai 99% untuk strain dari virus yang sama.

17

2.5 Identifikasi dan Deteksi Virus

Pengamatan gejala penyakit saja tidak cukup untuk mendeteksi dan

mengidentifikasi virus pada tanaman. Beberapa virus dapat menimbulkan gejala

yang sama pada tanaman yang sama, satu virus dapat menghasilkan variasi gejala

tergantung strain virusnya, campuran beberapa virus atau strain virus dapat

mempengaruhi gejala. Selain itu, suatu virus dapat menimbulkan gejala yang

berbeda pada tanaman yang berbeda. Kondisi lingkungan dan iklim juga

berpengaruh terhadap tipe gejala yang muncul (Hull, 2002).

Deteksi dan identifikasi menggunakan karakter molekuler umumnya

dilakukan dengan dua cara yaitu berdasarkan sifat protein dengan uji serologi dan

sifat asam nukleat dengan hibridisasi DNA, ekstraksi dsDNA/dsRNA serta

PCR/RT-PCR (Foster & Taylor 1992; Hull, 2002).

2.5.1 Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)

Teknik serologi merupakan salah satu cara deteksi dan identifikasi suatu

patogen dalam suatu inang, yang memanfaatkan reaksi spesifik anatara antigen

dan antiserum (Crowther, 1995). Metode ini mengalami perkembangan yang

sangat pesat dan aplikasinya di bidang penyakit tumbuhan sudah sangat umum

digunakan, yaitu untuk mendeteksi suatu patogen khususnya virus dalamn

tanaman. Kegunaan yang lain dari uji serologi ini adalah untuk menentukan

konsentrasi virus dalam jaringan tanaman, mendeteksi virus tumbuhan dalam

tubuh serangga vektor dan untuk mengetahui hubungan kekerabatan antar virus

(Agrios, 2005).

18

Keberhasilan dan ketelitian teknik serologi untuk mendeteksi dan

mengidentifikasi virus sangat tergantung pada ketersediaan pereaksi diagnostik

seperti antiserum, dengan kualitas yang baik (Kumari et al. 2006). Antiserum

adalah serum yang mengandung antibodi (Noordam,1973). Antobodi adalah

molekul immunoglobulin yang dihasilkan oleh sistem imun dari hewan sebagai

tanggapan terhadap suatu rangsangan molekul asing (antigen) (Crowther, 1995).

Clark & Adams (1997) memperkenalkan ELISA untuk ilmu penyakit

tanaman. Sejak saat itu, ELISA sering digunakan untuk pengujian virus tanaman

dan patogen tanaman lainnya (Sutula et al.,1986). Pada ELISA, antigen atau

antibodi melekat pada sumuran pelat mikrotiter (Dijkstra & De Jager, 1998). Pelat

mikrotiter polistiren selain sebagai wadah sekaligus juga sebagai substrat

pengikat antigen atau antibody karena permukaannya mempunyai molekul-

molekul yang bermuatan positif (Wahyuni, 2005).

Prosedur ELISA dibagi menjadi dua metode yaitu direct-ELISA dan

indirect-ELISA. Pengujian direct-ELISA atau (DAS)-ELISA dalam virologi

tumbuhan biasanya memiliki dua atau tiga tahap penggunaan antibodi. Antibodi

dimasukkan secara langsung pada pelat mikrotiter untuk pengikatan antibodi

dengan tujuan untuk mengikat antigen secara spesifik ke pelat mikrotiter.

Antibodi kedua (biasanya dari sumber yang sama dengan antibodi pertama)

dikonjugasikan dengan enzim yang berfungsi sebagai pendeteksi antibodi (Martin

1998). Kerugian direct-ELISA adalah harus disiapkan konjugat secara terpisah

untuk masing-masing virus yang diuji. Pada metode indirect-ELISA, keberadaan

antigen-antibodi pertama terdeteksi oleh antibody yang diproduksi pada spesies

19

hewan yang berbeda dengan hewan sumber antibody pertama. Antibodi tersebut

biasanya disebut antibodi kedua yang telah dilabel enzim. Antibodi kedua dapat

digunakan untuk mendeteksi virus-virus yang berbeda. Antibodi tersebut

merupakan konjugat “universal”. Kespesifikan reaksi indirect-ELISA biasanya

lebih rendah dari pada metode DAS-ELISA (Dijkstra & De Jager, 1998).

Reaksi positif antara antigen dan antibody ditandai dengan perubahan warna

cairan kompleks antigen dan antibodi yang terkonjugasi dengan enzim menjadi

kuning atau biru toska, tergantung pada macam substrat yang digunakan.

Misalnya reaksi menggunakan p-nitrophenil phosphate akan menjadi berwarna

kuning. Intensitas warna yang bervariasi mencerminkan konsentrasi virus yang

terkandung dalam cairan tersebut. Intensitas warna yang terjadi dikonversikan

menjadi angka oleh spektrum cahaya pada A 405 nm dan alat untuk membacanya

disebut ELISA-reader. Inkubasi dengan enzim substrat berkisar 20 sampai 40

menit, dan tidak boleh lebih dari dua jam karena kontrol negatif akan ikut berubah

warnanya (Wahyuni, 2005).

2.5.2 Polymerase Chain Reaction (PCR)

Karakterisasi virus tanaman dapat dilakukan juga melalui sifat asam

nukleat virus tersebut. Saat ini metode deteksi dan identifikasi virus yang akurat

banyak dilakukan berbasis pada pengetahuan biologi molekuler yang telah

berkembang sangat pesat. Teknik PCR merupakan cara cepat untuk

mengamplifikasi DNA secara invitro, sangat berguna dalam mengidentifikasi

virus yang menginfeksi tanaman, hewan dan manusia. Identifikasi virus dengan

20

teknik PCR didasarkan pada sifat primer yang spesifik (Sambrook et al., 1973).

Oleh karena itu penentuan primer sangat menentukan spesifik hasil deteksi.

PCR adalah suatu metode enzimatis dan banyak digunakan untuk berbagai

macam manipulasi dan analisis genetik, misalnya untuk melipatgandakan suatu

molekul DNA. Dengan metode ini, segmen tertentu pada DNA dapat digandakan

hingga jutaan kali lipat dalam waktu relatif singkat. Kelebihan lain metode PCR

adalah bahwa reaksi dapat dilakukan dengan menggunakan komponen dalam

jumlah sangat sedikit, misalnya DNA cetakan yang diperlukan hanya sekitar 5 μg,

oligonukleotida yang diperlukan hanya sekitar 1 mM, dan reaksi ini biasa

dilakukan dalam volume 50- 100 μl (Yuwono, 2006).

Menurut Muladno (2010), PCR merupakan suatu reaksi in vitro untuk

menggandakan jumlah molekul DNA pada target tertentu dengan cara mensintesis

molekul DNA baru yang berkomplemen dengan molekul DNA target tersebut

melalui bantuan enzim dan oligonukleotida sebagai primer dalam suatu

thermocycler. Panjang target DNA berkisar antara puluhan sampai ribuan

nukleotida yang posisisnya diapit sepasang primer. Primer yang berada sebelum

daerah target disebut sebagai forward primer dan yang berada setelah daerah

target disebut reverse primer. Enzim yang digunakan sebagai pencetak rangkaian

molekul DNA baru dikenal sebagai enzim polymerase (Muladno, 2010). Reaksi

pelipatgandaan suatu fragmen DNA dengan cara PCR terdiri dari tiga tahapan

atau tiga reaksi, yaitu denaturasi, penempelan primer (annealing), dan

pemanjangan primer (extension).

21

Denaturasi. Tahapan pertama dimulai dengan melakukan denaturasi DNA

cetakan sehinggga rantai DNA yang berantai ganda (double stranded) akan

terpisah menjadi rantai tunggal (single stranded). Denaturasi DNA dilakukan

dengan menggunakan panas (95ºC) selama 1-4 menit (Yuwono 2006). Denaturasi

yang tidak lengkap mengakibatkan DNA mengalami renaturasi (membentuk DNA

untai ganda kembali) secara cepat, dan ini mengakibatkan gagalnya proses PCR.

Adapun waktu denaturasi yang terlalu lama, mungkin dapat mengurangi aktivitas

enzim Taq polymerase (Muladno 2010).

Penempelan Primer (Annealing). Tahap kedua yaitu penempelan primer

(annealing) pada DNA cetakan yang telah terpisah menjadi rantai tunggal yang

dilakukan pada suhu 55ºC selama 1 menit. Primer akan membentuk jembatan

hidrogen dengan cetakan pada daerah sekuen yang komplementer dengan sekuen

primer (Yuwono 2006). Pada tahapan ini, primer forward yang runutan

nukleotidanya berkomplemen dengan salah satu untai tunggal akan menempel

pada posisi komplemennya. Demikian juga primer reverse akan menempel pada

untai tunggal lainnya (Muladno 2010).

Pemanjangan Primer (Extension). Setelah kedua primer menempel pada

posisinya masing-masing, enzim Taq polymerase mulai mensintesis molekul

DNA baru yang dimulai dari ujung 3’ masing-masing primer (Muladno 2010).

Sintesis DNA ini terjadi pada suhu 72ºC selama 1-2 menit. Pada suhu ini, DNA

polymerase akan melakukan proses polimerasi rantai DNA yang baru berdasarkan

informasi yang ada pada DNA cetakan dengan bantuan enzim Taq DNA

polymerase (Yuwono 2006).

22

Setelah terjadi polimerasi, rantai DNA yang baru akan membentuk

jembatan hidrogen dengan DNA cetakan. DNA rantai ganda yang terbentuk

dengan adanya ikatan hidrogen antara rantai DNA cetakan dengan rantai DNA

baru hasil polimerasi selanjutnya akan didenaturasi lagi dengan menaikkan suhu

inkubasi menjadi 95ºC. Rantai DNA yang baru tersebut selanjutnya akan

berfungsi sebagai cetakan bagi reaksi polimerasi berikutnya. Ketiga tahapan

9tersebut diulangi lagi sampai 25-30 siklus sehingga pada akhir siklus akan

didapatkan molekul-molekul DNA rantai ganda yang baru hasil polimerasi dalam

jumlah yang jauh lebih banyak dibandingkan dengan jumlah DNA cetakan yang

digunakan (Yuwono 2006)

Identifikasi secara tepat spesies yang menginfeksi tanaman sangat penting

untuk tindakan yang akan diterapkan dalam hal mengendalikan penyakit tersebut.

Untuk virus yang memiliki tipe genom RNA digunakan teknik RT-PCR.

Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction (RT-PCR)

Teknik RT-PCR dikembangkan untuk melakukan analisis terhadap

molekul RNA hasil transkripsi yang terdapat dalam jumlah sangat sedikit di

dalam sel. Oleh karena PCR tidak dapat dilakukan dengan menggunakan RNA

sebagai cetakan, maka terlebih dahulu dilakukan proses transkripsi balik (reverse

transcription) terhadap molekul RNA sehingga diperoleh molekul cDNA

(complementary DNA). Molekul cDNA tersebut kemudian digunakan sebagai

cetakan dalam proses PCR. Teknik RT-PCR ini sangat berguna untuk mendeteksi

ekspresi gen, untuk amplifikasi RNA sebelum dilakukan kloning dan analisis,

maupun untuk diagnosis agensia infektif maupun penyakit genetik (Yuwono

23

2006). Enzim transkriptase balik (reverse trancriptase) yang digunakan dalam

RT- PCR adalah enzim DNA polimerase dan molekul RNA yang berperan

sebagai cetakan didalam mensintesis molekul DNA (cDNA) yang komplementer.

RT-PCR adalah metode yang sangat sensitif, cepat dan banyak digunakan untuk

mendeteksi virus tanaman seperti ChiVMV, Chysanthemum B carlavirus (CBV)

(Tsai et al., 2008).

Metode RT-PCR adalah metode yang lebih dapat dipercaya dan lebih

sensitif sebagai metode pendeteksian virus atau indexing. Pada kajian biologi,

sering terjadi bahwa virus tidak terdeteksi, tetapi menunjukkan hasil positif

dengan metode serologi dan RT-PCR yang dapat mendeteksi virus pada

konsentrasi rendah (Moury et al., 2011). Metode RT-PCR juga mempunyai

kelemahan yaitu tidak dapat membedakan virus pada pengelompokan virus yang

sama atau tidak dapat mengetahui variabilitas yang terjadi diantara strain-strain

virus itu sendiri.

Keunggulan masing-masing metode deteksi sangat ditentukan oleh

berbagai faktor. Identifikasi virus dengan kajian biologis memerlukan waktu yang

cukup lama karena harus mempersiapkan tanaman indikator, tetapi biaya yang

digunakan tidak banyak. Metode serologi dan RT-PCR adalah metode yang lebih

dapat dipercaya dan lebih sensitif sebagai metode pendeteksi virus atau indexing,

dibandingkan dengan kajian biologi. Sering terjadi bahwa virus tidak terdeteksi

pada kajian biologi, tetapi menunjukkan hasil posistif dengan metode serologi dan

RT-PCR yang dapat mendeteksi virus pada konsentrasi rendah (Ram et al,. 2005).

Namun demikian ELISA dan RT-PCR harus ditunjang dengan laboratorium yang

dilengkapi dengan sarana alat-alat ELISA dan PCR.

24

2.6 Analisis Filogenitika

Filogenetika molekuler mengkombinasikan teknik biologi molekuler

dengan statistik untuk merekonstruksi hubungan filogenetika. Filogenetika

digambarkan sebagai klasifikasi secara taksonomi dari suatu organisme

berdasarkan pada sejarah evolusi yaitu filogeni merupakan bagian integral dari

ilmu pengetahuan yang sistematik yang mempunyai tujuan untuk menentukan

filogeni dari organisme berdasarkan karakteristiknya. Analisis filogenetika sekuen

asam amino dan protein biasanya akan menjadi penting dalam analisis sekuen.

Analisis filogenetika juga digunakan untuk mengikuti perubahan yang terjadi

secara cepat yang mampu mengubah suatu spesies, seperti virus. Pohon evolusi

adalah sebuah grafik dua dimensi yang menunjukkan hubungan diantara

organisme atau lebih spesifik lagi adalah sekuengen dari organisme. Pemisahan

sekuen disebut taxa (atau taxon jika tunggal) yang didefinisikan sebagai jarak

filogenetika unit pada sebuah pohon. Pohon terdiri dari cabang-cabang luar (outer

branches) atau daun-daun (leaves) yang merepresentasikan taxa dan titik-titik

(nodes) dan cabang merepresentasikan hubungan diantara taxa

Dengan pesatnya perkembangan teknik-teknik di dalam biologi molekuler,

seperti PCR (polymerasechain reaction) dan sikuensing DNA, penggunaan sikuen

DNA dalam penelitian filogenetika telah meningkat pesat dan telah dilakukan

pada semua tingkatan taksonomi, misalnya famili, marga, dan species. Sikuen

DNA dijadikan karakter dalam penelitian filogenetika karena beberapa fakta.

Yaitu : (1), sikuen DNA menawarkan data yang akurat melalui pengujian

homologi yang lebih baik terhadap karakter-karakter yang ada. (2), sikuen DNA

25

menyediakan banyak character states karena perbedaan laju perubahan basa-basa

nukleotida di dalam lokus yang berbeda adalah besar. dan (3) sikuen DNA telah

terbukti menghasilkan sebuah hubungan kekerabatan yang lebih alami (natural).

Sumber karakter DNA dapat diperoleh dari inti (nDNA), kloroplas (cpDNA), dan

mitokondria (mtDNA). Paling sedikit, ada tiga tahap penting dalam analisis

filogenetika molekuler, yaitu sequence alignment, rekonstruksi pohon

filogenetika, dan evaluasi pohon filogenetika dengan uji statistik.

Saat ini terdapat dua program komputer utama yang sering digunakan

untuk merekonstruksi pohon filogenetika, yaitu PAUP dan Mr Bayes. PAUP

(Phylogeny Analysis of Using Parsimony) merupakan paket yang menyediakan

banyak program untuk menyelesaikan berbagai aspek dalam analisis filogenetika

molekuler yang antara lain terdiri dari program untuk menyusun format data

sikuen DNA atau protein, untuk merekonstruksi pohon filogenetika (berdasarkan

metode parsimoni), dan untuk evaluasi pohon filogenetika. Perlu dicatat bahwa

program PAUP dapat me-run set data selain molekuler, misalnya morfologi.

Program PAUP dapat dijalankan baik dengan menggunakan computer ber-OS

(operating system) Macintosh maupun Windows. Program MrBayes merupakan

program multi fungsi untuk merekonstruksi pohon filogenetika (berdasarkan

metode Bayesian).

26

2.7 Penularan Virus

2.7.1 Penularan Virus Secara Mekanis

Secara umum, virus tumbuhan hanya dapat masuk ke dalam sel melalui

luka, oleh sebab itu virus tumbuhan sangat tergantung pada agensia eksternal yang

membantu membawa virus sampai ke tanaman inang. Manusia melalui kegiatan

pemanenan, penumbuhan tunas dan kegiatan budidaya lainnya dapat

memindahkan virus dari satu tanaman ke tanaman lain (Wahyuni, 2005).

Penularan secara mekanis banyak dipakai sebagai metode penularan untuk

percobaan di laboratorium.Virus yang menginfeksi tanaman hanya terbatas pada

floem atau pembuluh tapis tidak dapat ditularkan secara mekanis, karena inokulasi

itu hanya dapat mengintroduksi virus pada sel epidermis tanaman. Inokulasi

secara mekanik dilakukan dengan cara mengoleskan sap (ekstrak daun) pada

permukaan daun tanaman yang mengalami luka. Inokulasi virus dapat dilakukan

dengan penambahan karborundum (silicon karbida) ke dalam sap atau ditaburkan

pada permukaan daun. Karborundum berfungsi sebagai agensia abrasi saat ekstrak

dioleskan pada daun tanaman (Hidayat, 2007).

Keberhasilan inokulasi secara mekanis tergantung pada konsentreasi virus

dalam sap, sumber inokulum, metode penyiapan inokulum, ketahanan virus dalam

sap dan tanaman inang. Kondisi lingkungan sebelum dan sesudah inokulasi

seperti cahaya dan suhu juga mempengaruhi keberhasilan inokulasi (Sulandari, et

al., 2006).

Metode penyiapan inokulum juga menjadi faktor penentu keberhasilan

penularan virus secara mekanis. Selama penggerusan daun, berbagai metabolit

27

dari sel daun akan terlepas secara bersamaan dengan virus. Beberapa senyawa itu

dapat merusak virion atau dapat menghambat keinfektifan virus. Oleh sebab itu

ekstrak daun yang akan digunakan sebagai inokulum harus dikondisikan pada pH

yang sesuai untuk virus yang ditularkan (Harjosudarmo, 2008).

Prosedur umum pembuatan inokulum dilakukan dengan menggerus

jaringan tanaman yang terinfeksi dalam larutan potassium posphat pada pH 7-7,5.

Tingkat keasaman sangat penting diperhatikan karena pada umumnya pH optimal

untuk aktivitas beberapa enzim ribonuklease berada pada pH 5-6. Penggunaan pH

yang lebih tinggi akan mengurangi aktivitas nuclease yang dapat merusak virus.

Penggunaan pH 8-9 banyak digunakan untuk partikel virus yang mudah rusak.

Kehilangan infektifitas virus akibat adanya senyawa tannin dapat dihindari dengan

menggerus daun dalam suasana basa (Sulandari et al., 2006)

2.7.2 Penularan Virus Melalui Benih

Sampai saat ini telah diketahui 21 genus virus tumbuhan yang dapat

ditularkan melalui benih dan sekitar 18% dari virus itu dapat ditularkan melalui

benih dari satu atau lebih spesies tanaman inang. Walaupun hanya sebagian kecil

saja dari virus yang menginfeksi tanaman dan mengakibatkan biji tanaman

mengandung virus, tetapi biji yang membawa virus tersebut sangat besar

peranannya dalam penyebaran virus melalui benih yang secara ekonomi akan

sangat merugikan petani (Susetio, 2011).

Beberapa virus tumbuhan dapat ditularkan melalui biji atau polen. Kultivar

kentang yang baru hasil penyilangan dari tanaman yang terinfeksi virus, ternyata

tidak mengandung virus. Hal ini dianggap sebagai ketidakmampuan virus menular

28

melalui biji. Namun pada tahun 1910, TMV dapat ditularkan melalui biji. Pada

tahun 1918, telah dibuktikan pula bahwa BCMV tanaman kacang kacangan dapat

ditularkan melalui biji Phaseolus (Shukla et.al., 1994).CMV ditemukan dalam biji

mentimun liar (Echinocystis lobata), LMV (lettuce mosaicvirus) dalam biji selada

(1923) dan virus kedelai dalam biji kedelai ( 1924). Lebih dari 100 jenis virus

telah diketahui sebagai virus yang tular benih. Setiap biji yang terinfeksi dapat

menghasilkan sumber infeksi baru pada musim berikutnya atau tempat lain

(Shukla et.al., 1994).

Penularan virus melalui biji terjadi tepat di dalam biji atau pada jaringan

embrio. Kecuali untuk beberapa virus yang sangat stabil seperti TMV (Tobbaco

mosaic virus) dan CGMMV (Cucumber green mottle mosaic virus) dapat menular

walaupun berada pada kulit biji. Namun kebanyakan virus tidak dapat bertahan

pada kondisi kering sehingga akan hilang sejalan dengan pemasakan biji (Suryadi,

2003).

Tanaman kacang panjang di Thailand dilaporkan dapat ditularkan melalui

benih sebesar 75% yang diperoleh secara langsung di lapangan (Sorensen, 1996).

Penularan benih yang terinfeksi BCMV dapat terjadi melalui tanaman induk yang

terinfeksi pada saat kondisi tanaman masih muda. Efisiensi penularan akan

meningkat sebesar 83% melalui perantara vektor spesies kutu daun (Shukla et,al.,

1994).

29

2.7.3 Penularan Virus Melalui Vektor

Secara alami atau dalam praktek, virus dapat ditularkan atau

ditransmisikan oleh vektor serangga. Ada 3 jenis virus yang dapat ditularkan oleh

serangga vektor yaitu:

1. Virus nonpersisten. Serangga dengan tipe mulut menghisap membawa virus

pada stiletnya disebut virus nonpersisten. Serangga virus nonpersisten

umumnya mendapatkan virus melalui stilet setelah makan pada tumbuhan

sakit hanya selama beberapa detik (30 detik atau kurang) dan dapat

mentransmisi virus tersebut setelah pindah dan makan pada tumbuhan sehat

dalam waktu yang pendek, beberapa detik. Salah satu vektor virus

nonpersisten adalah aphis (kutu daun). Panjang waktu aphis tetap bersifat

viruliverous (menularkan virus) setelah mendapatkan virus bervariasi dari

beberapa menit sampai beberapa jam, setelah itu serangga tersebut tidak dapat

lagi mentransmisi virus. Kutu daun merupakan serangga vektor virus

tumbuhan yang sangat penting dan sebagian besar (kira-kira 160 jenis)

mentransmisi semua virus. Pada vektor stilet-borne, nampaknya virus tersebut

terbawa pada ujung stilet, dengan mudah hilang melalui penggosokan yang

terjadi selama menusuk sel inang dan tidak dapat bertahan melalui pergantian

kulit atau telur. Spesies kutu daun yang sama dapat mentransmisi beberapa

jenis virus, tetapi pada banyak kasus vektor virus bersifat agak spesifik. Yang

termasuk dalam virus nonpersisten antara lain: Potyvirus misalnya Bean

common mosaic virus, Carlavirus, Caulimovirus (Wahyuni, 2005).

30

2. Virus semipersisten. Pada virus semipersisten virus dapat bertahan dalam

vektornya lebih lama. Virus ini ditelan ke dalam saluran pencernaan

serangga dan peroide waktu makan agak lama dibandingkan dengan virus non

persisten (dari beberapa menit sampai beberapa jam). Kemampuan penularan

akan meningkat dengan meningkatnya periode makan akuisisi (priode yang

dibutuhkan serangga vektor untuk menghisap cairan sel dan memindahkan

virus ke tanaman sehat). Beberapa virus yang termasuk virus semipersisten

adalah Clasterovirus, misalnya Beet yellow virus dan Citrus tristeza virus

(Wahyuni, 2005).

3. Virus persisten. Virus persisten adalah virus yang dapat terbawa dari stilet ke

dalam alat pencernaan serangga vektor, kemudian masuk ke dalam darah,

kelenjar ludah, ke ludah dan melalui stilet lagi masuk ke dalam tanaman

sehat, ini artinya virus tetap persisten dalam tubuh vektor. Pada beberapa

kasus kutu daun mentransmisi virus sirkulatif, kutu daun tertentu tidak dapat

mentransmisi virus dengan segera tetapi harus menunggu beberapa jam

setelah mendapatkannya dengan makan pada tumbuhan sumber virus, tetapi

setelah kutu daun dapat mentransmisi virus, maka mereka terus dapat

mentransmisi virus dalam beberapa hari (transmisi persisten). Beberapa virus

yang termasuk virus persisten adalah Carrot Mottle Virus, Beet Western

Yellow (Sulandari, et al., 2006).

31

2.7.4 Peran Kutu Daun Sebagai Serangga Vektor Virus

Vektor patogen adalah organisme yang bertindak sebagai agens pembawa

patogen, dan dapat menularkannya ke tumbuhan lain. Serangga vektor virus yang

terbanyak termasuk dalam ordo Hemiptera dan Thysanoptera. Serangga vektor

yang termasuk ordo Hemiptera diantaranya kutudaun, kutu kebul, wereng daun

yang merupakan vektor utama virus dan menjadi vektor hampir 400 spesies virus.

(Fereres and Moreno, 2009).

Jumlah vektor dan ketergantungannya pada musim merupakan faktor

penting dalam epidemiologi penyakit virus. Efisiensi penularan virus oleh kutu

daun erat kaitannya dengan konsentrasi virus dan jumlah kutu daun,

karenasemakin banyak koloni kutudaun pada pertanaman maka proses kecepatan

multiplikasi virus semakin meningkat dan mempercepat perkembangan epidemic

penyakit. Faktor lain yang mempengaruhi diantaranya kemampuan kutu daun

dalam membawa dan menularkan virus, periode yang diperlukan kutu daun untuk

memperoleh cairan sel tanaman, periode untuk menghisap cairan sel dan untuk

memindahkan virus ke tanaman sehat, dan periode makan akuisisi selesai sampai

kutu daun mampu menularkan virus ke tanaman sehat (Bos ,1994).

2.7.4.1 Aphis craccivora

Menurut Borror et al. (1992) Aphis craccivora diklasifikasikan sebagai

Berikut:

Klasifikasi

Kingdom : Animalia

Phylum : Arthropoda

Kelas : Insekta

32

Ordo : Hemiptera

Famili : Aphididae

Genus : Aphis

Spesies : Aphis craccivora

Siklus hidup A.craccivora pada kondisi lingkungan yang sesuai berkisar

antar 5-6 hari, dengan rata-rata 5,5 hari. Di daerah yang beriklim sedang

keperidian dapat mencapai 60 ekor. Walaupun demikian mortalitas pada nimfa

cukup besar, Serangga bersayap hanya menghasilkan kira-kira separuh dari

jumlah keturunan yang dapat dihasilkan serangga tidak bersayap (Jurgen et al.

1977).

Nimfa yang baru lahir panjangnya 0,35 mm dan lebarnya 0,18 mm

(Sutarjo, 1978). Serangga dewasa A. craccivora yang partonegenesis terdiri dari

dua bentuk, yakni bentuk tidak bersayap (apterae) dan bentuk bersayap (alateae)

(Cottier 1953; Eastop 1961).

Imago yang tidak bersayap kepalanya berwarna hitam dengan mata

berwarna merah gelap hampir hitam dan sepasang antena yang panjangnya dua

pertiga panjang tubuh dan terdiri dari 6 ruas. Antena tidak mempunyai sensorial

sekunder (Cottier 1953; Eastop 1961). Tubuhnya berukuran + 1,5-2 mm,

berwarna hitam (biasanya mengkilat) dan kadang – kadang sedikit bertepung

putih.

Bentuk imago bersayap dewasa hampir sama dengan serangga tidak

bersayap. Rata-rata ukuran tubuhnya lebih kecil dibandingkan serangga yang

33

tidak bersayap (Cottier, 1953). A.craccivora biasanya menyerang tanaman

Leguminoceae dengan kepadatan populasi yang berbeda-beda, tetapi pada musim

kemarau A craccivora dapat bertahan pada gulma. Serangga-serangga ini

menghuni permukaan bawah daun pada bagian atas tanaman. Pada saat

pembentukan bunga, populasi akan berkurang (Jurgen et al. 1997).

2.7.4.2 Myzus persicae

Menurut Borror et al. (1992) Myzus persicae diklasifikasikan sebagai

berikut:

Kingdom : Animalia

Filum : Arthropoda

Kelas : Insekta

Ordo : Hemiptera

Famili : Aphididae

Genus : Myzus

Spesies : Myzus persicae

M. persicae adalah kutu daun yang berwarna kuning kehijauan atau

kemerahan. Baik kutu muda (nimfa atau aptera) maupun dewasa (imago)

mempunyai antena yang relatif panjang, kira-kira sepanjang tubuhnya. Panjang

tubuh ± 2 mm, tubuh lunak seperti buah pir (Tarumingkeng, 2001). M. persicae

ada yang bersayap dan ada yang tidak bersayap. Siklus hidup serangga ini adalah

± 18 hari. Kutu daun dewasa dapat menghasilkan keturunan (nimfa) tanpa melalui

perkawinan. Sifat ini disebut parthenogenesis, satu ekor dewasa dapat

menghasilkan kira-kira 40 ekor nimfa. Selama tidak mengalami gangguan dan

makanan cukup tersedia, kejadian tersebut berlangsung terus menerus sampai

populasi menjadi padat (Tarumingkeng 2001). Lama stadium tersebut tergantung

34

pada suhu udara, yaitu pada suhu 25°C dan 3 minggu pada suhu 15°C

(Ditlin, 2008).

Hidup M. persicae berkelompok pada bagian bawah helaian daun atau

pada pucuk tanaman. Nimfa dan imago mempunyai sepasang tonjolan pada ujung

abdomen yang disebut kornikel. Ujung kornikel pada kutu daun berwarna hitam.

Perkembangan M. persicae dapat tumbuh secara optimal pada saat tanaman

bertunas (Ditlin, 2008).

M. persicae adalah hama penting pada beberapa tanaman budidaya. Hal itu

disebabkan karena sifatnya yang polifag, reproduksi partenogenetik dan siklus

hidup pendek. Ketiga sifat itu menyebabkan kutu daun tersebut berkembang pesat

dan dapat ditemukan di berbagai tempat (Blackman & Eastop, 2000; Hill, 1995).

Di samping itu kutu daun tersebut merupakan vektor berbagai penyakit virus

tanaman (Harris & Maramorosch, 1997). M. persicae merupakan vektor lebih dari

150 strain virus (Pracaya, 2007), hal tersebut sesuai dengan Departemen Pertanian

(2009) bahwa M. persicae merupakan salah satu vektor penyakit virus mosaik

pada tanaman cabai.

2.7.4.3 Aphis gossypii

Menurut Borror et al. (1992) Aphis gossypii diklasifikasikan sebagai

berikut:

Klasifikasi

Kingdom : Animalia

Phylum : Arthropoda

Kelas : Insekta

Ordo : Hemiptera

35

Famili : Aphididae

Genus : Aphis

Spesies : Aphisgossypii

Di daerah tropis penyebaran A.gossypii cukup luas, termasuk di beberapa

kepulauan daerah pasifik (Blackman & Eastop, 2000). A.gossypii bersifat

kosmopolit dan merupakan spesies yang sangat polifag (Kalshoven, 1981). Stadia

nimpa A.gossypii bervariasi dari 3-20 hari dengan rata-rata 7,3 hari, masa

reproduksi 2-31 hari dengan rata-rata 15,6 hari, masa pasca reprodukdi 0-21 hari

dengan rata-rata 5,3 hari dan lama hidup 9-29 hari dengan rata-rata 28,4 hari.

Seekor imago dapat melahirkan 1-14 ekor nimfa dengan rata-rata 4,3 ekor nimfa

per hari, sedang keperidian dengan rata-rata imago 67 nimfa (Ebeling, 1959).

Pada umumnya kutu daun yang ditemukan di lapangan tidak bersayap,

(Kalshoven, 1981).

Dilaporkan oleh Romoser (1998) kutu daun tidak hanya menghisap sari

makanan tanaman, tetapi juga sebagai agen penyebar penyakit virus. Penularan

virus dilakukan secara nonpersisten yaitu kutu daun dapat langsung menularkan

virus ke tanaman sehat segera setelah makan akuisisi pada tanaman sakit sumber

virus. Namun demikian kutu daun akan hilang kemampuannya untuk menularkan

virus setelah makan inolukasi pada tanaman sehat. Kutu daun infektif (membawa

virus) yang mendatangi pertanaman cabai akan segera menularkan virus pada

tanaman yang baru dihinggapinya, sehingga walaupun kutu daun tersebut mati

akibat pestisida yang diaplikasikan namun tanaman sudah terlanjur tertular virus

(Eka, 2011).