BAB IPENDAHULUAN

1.1Latar BelakangMikroorganisme yang ada di alam ini mempunyai morfologi, struktur dan sifat-sifat yang khas begitu pula dengan bakteri. Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan kontras dengan air, dimana sel-sel bakteri yang ada di suspensikan. Salah satu cara unutk mengamati bentuk sel bakteri sehingga mudah di identifikasi adalah dengan cara metode pengenceran atau pewarnaan. Hal tersebut berfungsi untuk mengetahuisifat fisiologisnya yaitu mengetahui reaksi dinding sel bakteri melalui serangkaian pengecetan atau pewarnaan (Dwidjoseputro, 1998).Melihat dan mengamati bakteri dalam keadaan hidup sangat sulit, karena selain bakteri itu tidak berwarna juga transparan dan sangat kecil. Unutk mengatasi hal tersebut maka dikembangkan suatu teknik pewarnaan sel bakteri sehingga sel dapat terlihat jelas dan mudah diamati. Oleh karena itu teknik pewarnaan sel bakteri ini merupakan salah satu cara yang paling utama dalam penelitian-penelitian mikrobiologi (Dwidjoseputro, 1998).Berdasarkan hal tersebut maka dilakukan praktikum kali ini unutk mengetahui teknik pewarnaan mikroorganisme baik itu dengan cara pewarnaan sederhana, pengenceran negative, maupun pengenceran gram serta mengetahui morfologi mikroorganisme (Sutedjo, 1991).

1.2Tujuan Percobaan-Mengetahui macam-macam metode pewarnaan.-Dapat membedakan bakteri gram positif dan negative dengan metode pewarnaan.-Mengetahui macam-macam zat warna yang digunakan dalam pewarnaan.

BAB IITINJAUAN PUSTAKA

Bakteri atau mikroba lainya dapat di lihat dengan mikroskop biasa tanpa yaitu dengan cara-cara khusus, misalnya dengan cara tetesan bergantung,menggunakan kondensor medan gelap dan lain-lain.Tetapi pengamatan dari pewarnaan ini lebih sukar dan tidak di pakai untuk melihat bagian-bagian sel dengan teliti, karena sel bakteri dan mikroba lainya transparan. Melihat dan mengamati bakteri dalam keadaan hidup sangat sulit, karena selain bakteri itu tidak berwarna juga transparan dan sangat kecil untuk mengatasi hal tersebut maka di kembangkan suatu teknik pewarnaan bakteri ,sehingga sel dapat terlihat jelas dan mudah di amati. Oleh karena itu teknik pewarnaan sel bakteri ini merupakan salah satu cara yang paling utama dalam penelitian-penelitian mikrobiologi(Dwijoseputro, 2005). Macam macam pewarnaanA.Pewarnaan negatif Pada pewarnaan ini merupakan pewarnaan tidak langsung karena yang di warnai adalah latar belakangnya, sedangkan bakerinya sendiri tidak mengalami pewarnaan.Zat warna yang di gunakan adalah nigrosin.B.Pewarnaan sederhanaPewarnaan sederhana adalah pewrnaan yang menggunakan zat warna yang tunggal bertujuan untuk mengindentifikasi morfologi sel bakteri. Pada pewarnaan ini zat warna yang kami gunakan adalah gentiana violet.C.Pewarnaan gramPewarnaan gram atau metode gram adalah salah satu teknik pewarnaan yang paling penting dan luas di gunakan untuk mengidentifikasi bakteri. Dalam proses ini, olesan bakteri yang sudah terfiksasi di kenai larutan-larutan berikut zat pewaraan Kristal violet, larutan yodium, larutan akohol(bahan pemucat) dan zat pewarnaan tandinganya berupa zat warna safranin atau air fucshin. Metode ini di beri nama berdasarkan penemunya,ilmuwan DenmarkHans ChristianGram(1853-1938)yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1884 untuk membedakan antara pneumokokus dan bakteriKlebsiela, pneumonia.Bakteri yang telah diwarnai dengan metode ini dibagi menjadi dua kelompok yaitu, bakteri gram positf dan bakteri gram negatif. Bakteri garam positif akan memprtahankan zat pewarna kristal violet dan karenanya akan tampak berwarna ungu tua di bawah mikroskop.Adapun bakteri gram negatif akan kehilangan zat pewarna Kristal violet setelah dicuci dengan alkohol dan sewaktu diberi zat pewarna tandingnya yaitu dengan zat pewarn air fucshin atau safranin akan tampak berwarna merah. Perbedaan warna ini di sebabkan oleh perbedaan dalam struktur kimiawi dinding selnya(Pelczar,2007). Bakteri gram positif adalah bakeri yang mempertahankan zat warna metal ungu sewaktu proses pewarnaan gram.Bakteri jenis ini akan berwarna biru atau ungu di bawah mikroskop sedangkan bakteri gram negatif akan berwarna merah atau merah muda. Perbedaan klasifikasi antara kedua jenis bakteri ini terutama berdasarkan pada perbedaan struktur dinding sel bakteri .Bakteri gram negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat metal ungu pada metode pewarnaan gram. Bakteri gram-positif akan mempertaahankan warna ungu gelap setelah di cuci dengan alkohol.Sementara bakteri gram-negatif tidak. Pada uji pewarnaan gram suatu pewarnaan penimbal (conterstain)di tambahkan setelah metil ungu, yang membuat semua bakteri gram-negatif menjadi berwarna merah atau merah muda.Pengujian ini berguna untuk mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini perbedaan struktur dinding selnya. Banyak spesies organismeinang, sifat pathogen ini umumnya berkaitan dengan komponen tertentu pada dinding sel gram-negatif terutama lapisan lipopolisakarida (Pelczar, 2007).D.Pewaranaan spora/ flagelSpora bakteri adalah bentuk bakteri yang sedang dalam usaha mengamankan diri terhadap pengaruh buruk dari luar.spora bakteri mempunyai fungsi yang sama sepertti kristal amoeba, sebab bakteri dalam bentuk spora dan amoeba dalam bentuk Kristal merupakan suatu fase di mana kedua mikroorganisme itu berubah bentuk untuk melindungi diri terhadap faktor luar yang tidak menguntungnkan. Endospora hanya terdapat pada bakteri merupakan tubuh dinding yang tebal yang sangat refraktif, dan sangat resisten. Dihasilkan oleh semua spesies basillus, clostidum, dan sporosarcina. Bakteri yang mampu membentuk endospora dapat tumbuh dan bereproduksi selama banyak generasi sehingga sel vegetatif. Namun pada beberapa tahapan di dalam pertumbuhanya, terjadi sintesis protoplasma baru dalam sitoplasma vegetatifnya yang di maksudkan untuk menjadi spora (Pelczar, 2007).Bentuk spora ada yang bulat, adapula yang bulat panjang. Hal ini tergantung oleh spesisesnya endospora ada yang lebih kecil ada pula yang lebih besar dari pada diameter sel induk.Letak sel di dalam sel serta ukurannya dalam pembentukanya tidaklah sama bagai semua spesies. Sebagai contoh beberapa spora adalah sental yang dibentuk ditengah-tengah sel, yang kedua adalah terminal yang dibentuk diujung, ketiga yaitu subterminal yang dibentuk di dekat ujung. Pada umumnya sporulasi itu mudah terjadi jika keadaan medium memburuk dan zat-zat yang timbul sebagai zat-zat pertukaran zat bertimbun-timbun dan faktor-faktor luar lainya merugikan tetapi pada beberapa spesies mampu membentuk spora meskipun tidak terganggu oleh faktor luar. Sporulasi dapat di cegah, jika selalu diadakan pemindahan piaraan ke medium yang baru, beberapa spesies bakteri dapat kehilangan kemampuanya untuk membentuk spora-spora dapat tumbuh lagi menjadi bakteri apabila keadaan di luar menguntungkan.Mula-mula air meresap ke dalam spora, kemudian spora mengembang dan kulit spora menjadi retak karenanya keretakan ini dapat terjadi pada salah satu ujung. Tetapi juga dapat terjadi di tengah-tengah spora. Hal ini merupakan cirri khas bagi beberapa spesies bacillus, jika kulit spora pecah di tengah-tengah maka masing-masing pecahan akan merupakan suatu tutup pada kedua ujung bakteri (Pelczar, 2001).Adapun faktor-faktor yang mempengaruhi pewarnaan bakteri sebagai berikut:1.FiksasiFiksasi perlu dilakukan sebelum pewarnaan bakteri karena berguna merekatkan sel bakteri pada gelas objek, membunuh bakteri, melepaskan granula (butiran) protein menjadi gugusan reaktif (NH3+) membuat sel-sel lebih kuat, mencegah terjadinya otolisis sel, mengubah avinitas, fiksasi dapat dilakukan secara fisik atau dengan bahan kimia.2.Peluntur zat warnaPeluntur zat warna berguna untuk menghasilkan kontras yang lebih baik pada bayangan mikroskop. Pada umumnya, sel-sel yang mudah diwarnai akan lebih mudah pula dilunturkan warnanya. Sedangkan sel-sel yang sukar diwarnai akan lebih sukar dilunturkan warnanya.3.SubstrataMerupakan zat warna asam atau basa dapat bereaksi dengan senyawa-senyawa tertentu. Oleh karena itu, senyawa-senyawa organik seperti protein, karbohidrat, lemak dan asam nukleat akan mempengaruhi pewarnaan. Berdasarkan jenis zat warna yang diserap oleh sel, maka dapat dibedakan tiga macam sel yaitu: sel-sel asidofil, basodill dan sudanofil.4.Intensifikasi warnaZat warna dapat diintensifikasikan dengan cara menambahkan mordan, yaitu zat kimia yang dapat menyebabkan sel-sel bakteri dapat diwarnai lebih intensif karena zat warna terikat lebih kuat daripada jaringan sel. Mordan dibagi atas dua macam, yaitu mordan asam dan mordan basa. Mordan asam adalah mordan yang bereaksi dengan zat-zat warna basa. Sedangkan mordan basa adalah mordan yang bereaksi dengan anion zat warna asam.5.Zat warna penutup atau zat warna lawanZat warna lawan adalah suatu zat warna basa yang berbeda warnanya dengan zat warna mula-mula yang digunakan. Gunanya adalah untuk memberikan warna pada sel-sel yang berbeda warnanya dengan zat warna mula-mula. Zat warna penutup diberikan pada akhir pewarnaan dengan tujuan untuk memberikan kontras pada sel-sel yang tidak menyerap zat warna utama (Sutedjo, 1991).

BAB IIIMETODE KERJA

3.1Waktu dan tempatPraktikum mikrobiologi mengenai pewarnaan di laksanakan pada hariRabu 06April 2011 pukul 10.00-12.00 WITA. Bertempat di laboratoriumMikrobiologi danBioteknologiFakultasMatematika danIlmuPengetahuanAlamUniversitasMulawarmanSamarinda .3.2Alat dan bahan3.2.1Alat-alat-Lampu bunsen-Pipel-Objek glass(kaca presparat dan penutup)-Tabung reaksi-Jarum oase-Mikroskop-Kipas angin-Kaca tipis-Spatula-Gunting-Spritus-Kertas saring-Pinset-Cover glass-Pensil-Kertas3.2.2Bahan- bahan-Aquades-Alkohol 95 % + 70 %-Biakan murnisatu jenis bakteri-Zat warna Kristal violet-Nigrosin-Larutan logols-Malachite green-Tissue-Crystal violet-Safranin-Methylen-Media Na-Nigrap-Tinta cina3.3 Cara kerja3.3.1 Pewarnaan sederhana1.Disterilkan kaca preparat dengan alkohol 70%2.Dikeringkan (dilap) dengan tissue3.Difiksasi diatas lampu bunsen4.Ditetesi akuades5.Difiksasi sampai tetesan akuades menyerap dan berbekas diatas kaca preparat6.Diambil secara aseptis suatu koloni dengan menggunakan jarum ose7.Difiksasi diatas lampu bunsen, setelah kering, ditetesi larutan crystal violet, biarkan 1-2 menit8.Cuci dengan air mengalir sampai zat warnanya hilang9.Keringkan kaca preparat10.Amati dengan mikroskop, dan catat hasilnya3.3.2 Pewarnaan negatif1.Disterilkan kaca preparat dengan alkohol 70%2.Dikeringkan (dilap) dengan tissue3.Difiksasi diatas lampu bunsen4.Ditetesi akuades5.Difiksasi sampai tetesan akuades menyerap dan berbekas diatas kaca preparat6.Diambil secara aseptis suatu koloni dengan menggunakan jarum ose7.Diambil larutan nigrosin (tinta cina)8.Keringkan (anginkan) kaca preparat9.Amati dibawah mikroskop dan catat hasilnya3.3.3 Pewarnaan gram1.Disterilkan kaca preparat dengan alkohol 70%2.Dikeringkan (dilap) dengan tissue3.Difiksasi diatas lampu bunsen4.Ditetesi akuades5.Difiksasi sampai tetesan akuades menyerap dan berbekas diatas kaca preparat6.Diambil secara aseptis suatu koloni dengan menggunakan jarum ose7.Keringkan dan fiksasi diatas lampu bunsen8.Setelah kering, teteskan zat warna crystal violet sebanyak 2-3 tetes dan diamkan selama 1 menit9.Cuci dengan air mengalir dan keringkan10.Teteskan lagi dengan larutan lugol, dan biarkan selama 1 menit, lalu cuci dengan air mengalir, dan keringkan.11.Cuci lagi dengan alkohol 70% selam 30 detik12.Cuci dan keringkan13.Berikan larutan basil fuchsin atau safrina selama 2 menit14.Cuci dengan air mengalir dan keringkan15.Amati dengan mikroskop dan catat hasilnya3.3.4 Pewarnaan spora1.Disterilkan kaca preparat dengan alkohol 70%2.Dikeringkan (dilap) dengan tissue3.Difiksasi diatas lampu bunsen4.Ditetesi akuades5.Difiksasi sampai tetesan akuades menyerap dan berbekas diatas kaca preparat6.Diambil secara aseptis suatu koloni dengan menggunakan jarum ose7.Tutup koloni tersebut dengan menggunakan kertas saring8.Teteskan 2-3 tetes malachite green9.Difiksasi diatas lampu bunsen10.Diamkan selama 1 menit, setelah itu lepas kertas saring11.Bilas dengan akuades selama 30 detik12.Teteskan safranin selama 30 detik13.Keringkan14.Amati dengan mikroskop dan catat hasil

BAB IVHASIL DAN PEMBAHASAN

4.1Hasil pengamatanTabel hasil pengamatan pewarnaan dan cara-cara pewarnaanNoPewarnaanKeterangan

1.Pewarnaan sederhana-Perbesaran 40 x 10-Bentuk sel seperti batang yang biasa disebut basil-Berwarna ungu

2.Pewarnaan negative

-Perbesaran 40 x 10-Bentuk sel seperti batang atau sering disebut basil.-Berwarna ungu kemerah-merahan.

3.Pewarnaan gram

-Perbesaran 40 x 10-Bentuknya batang yang sering du sebut dengan basil.-Berwarna merah dan sekitarnya berwarna orange.

4.Pewarnaan spora

-Perbesaran 40 x 10-Bentuk bakteri basil-Sporanya berwarna hijau-Mikrobannya berwarna orange

4.2Pembahasan Macam-macam pewarnaan yang di lakukan dalam praktikum tentang cara-cara pewarnaan antara lain :a.Pewarnaan sederhanaTujuan dari pewarnaan sederhana adalah mengidentifikasi morfologi sel bakteri dengan menggunakan zat warna tunggal. Prinsipnya yaitu pewarnaan ini hanya menggunakan satu macam zat warna saja. Sebelum zat warna difiksasi terlebih dahulu pewarnaan ini dipakai untuk melihat bentuk-bentuk bakteri. Zat warna yang di gunakan adalah Methylen blue, Crystal violet, basic fuchin atau safranin.Fungsi zat warna: Crystal violet merupakan pewarna primer (utama)yang akan memberiwarna mikrioorganisme target. Crystal violet bersifat basa sehingga mampu berikatan dengan sel mikroorganisme yang bersifat asam(Sutedjo, 1991).b.Pewarnaan NegatifTujuan dari pewarnaan negatif adalah untuk mengetahui bentuk mikroba dengan pewarnaan-pewarnaan tidak langsung. Prinsippewarnaan negatif adalah cara pengamatan mikrobiologi yang dapat di lakukan untuk membedakan spesies kecil dan cairan optiknya. Pewarnaan ini merupakan pewarnaan yang di gunakan untuk melihat secara tidak langsung, karena yang diwarnai adalah latar belakangnya, sedangkan bakterinya sendiri tidak mengalami pewarnaan. Pada pewarnaan ini tidak di lakukan fiksasi karena itu dapat digunakan untuk melihat bentuk-bentuk sel yang sesungguhnya dan untuk menentukan ukuran bakteri, karena bakteri praktis tidak mengalami perubahan. Berbeda dengan pewarnaan lain,pewarnaan negatif memungkinkan bakteri terlihat transparan dan tampak jelas.Fungsi zat warna: Safranin merupakan pewarnaan tandingan atau pewarna skunder, zat ini berfungsi untuk mewarnai sel-sel yang telah kehilangan warna utama dengan kata lain memberikan warna pada bakteri non target(Pelczar, 2007).c.Pewarnaan GramTujuan dari pewarnaan gram adalah untuk melakukan pengamatan morfologi bakteri dengan pewarnaan diferensial.Prinsippewarnaan gram termasuk pewarnaan diferensial (untuk membedakan) karna dapat membedakan bakteri-bakteri yang bersifat gram negatif dan positif. Pewarnaan ini ditemukan pertama kali pada tahun 1884 oleh Criestian Gram.Bakteri garam positif ialah bakteri yang mengikat warna utama (crystal violet) dengan kuat sehingga tidak dapat di lunturkan oleh peluntur dan tidak diwarnai lagi oleh zat warna lawan (safranin) pada mikroskop sel-sel bakteri tampak berwarna ungu.Bakteri gram negatif ialah bakteri yang mempuyai daya mengikat zat warna utama tidak kuat sehingga dapat dilunturkan oleh peluntur dan dapat diwarnai oleh zat warna lawan (safranin) pada pengamatan mikroskop sel-sel bakteri tampak berwarna merah. Fungsi zat warna:Crystal violet yang berfungsi membentuk ikatan mg-Ribonucleid acid pada membran/dinding sel bakteri sehingga membentuk kompleks mg-Ribonucleid acid- crystal violet. Kompleks ini merupakan senyawa yang tidak luntur dengan alkohol.Lugols ladin yang berfungsi sebagai penguat ikatan pada kompleks mg-Ribonuclead acid.Alkohol 95% berfungsi mencuci lemak pada dinding sel bakteri.Safranin berfungsi sebagai zar warna tandingan (lawan) luruh nya kompleks mg-Ribonucleid acid- crystal violet dari dinding sel bakteri gram negatif(Pelczar, 2007).d.Pewarnaan SporaTujuan dari pewarnaan spora yaitu mengenal dasar-dasar kimiawi pada pewarnaan spora dan kinerja dari prosedur untuk membedakan spora bakteri dan bentuk vegetatif.Prinsippada pewarnaan ini pemanasan akan mengembangkan lapisan luar spora sehingga brwarna hijau. Melalui pendinginan utama akan terperangkap didalam spora dengan pencucian zat warna utama yang da pada sel vegetatif akan terlepas, sehingga pada pewarnaan yang kedua(safranin) sel vegetatif akan berwarna merah.Fungsi zat warnamalachite green merupakan pewarna yang kuat yang dapat berpenetrasi kedalam endospora(Dwidjoseputro, 2005).Pada praktikum kali ini hasil yang diperoleh yaitu bakteri yang diamati bulat lonjong memanjang dengan serabut ekor bewarna merah. Bakteri ini identik dengan bakteri garam positif sebab bakteri yang di lihat dominan violet, di dalam kolono ini juga terdapat spora yang berwarna hijau.Bakteri garam positif ialah bakteri yang mengikat warna utama (crystal violet) dengan kuat sehingga tidak dapat di lunturkan oleh peluntur dan tidak diwarnai lagi oleh zat warna lawan (safranin) pada mikroskop sel-sel bakteri tampak berwarna ungu.Contoh bakteri garam positif yaitu:Bacillus subtilis,Stepcoccussplactis;Staphylococcus aureus.Bakteri gram negatif ialah bakteri yang mempuyai daya mengikat zat warna utama tidak kuat sehingga dapat dilunturkan oleh peluntur dan dapat diwarnai oleh zat warna lawan (safranin) pada pengamatan mikroskop sel-sel bakteri tampak berwarna merah.Contoh bakteri garam negatif:Corynebacterium diphteri,Eschercia colidanSalmanela thypora(Sutedjo,1991).Perbedaan dan ciri-ciri bakteri garam positif dan bakteri garam negatif:Bakteri garam negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna crystal violet sewaktu proses pewarnaan gram, sehingga akan berwarna merah jika diamati dengan mikroskop. Disisi lain bakteri garam negatif sepertiEschercia colimemiliki sistem membran ganda di mana membran plasmanya diselimuti oleh membran luar permeabel. Bakteri ini mempunyai dinding sel tebal berupa peptidoglikanyang terletak di antara membran dalamdan luarnya,bakteri ini juga bersifat patogen yang berarti mereka berbahaya bagi organisme inang. Sifat patogen ini umumnya berkaitan dengan komponen tertentu pada dinding gram negatif terutama lapisan lipopolisakarida(dikenal juga dengan lapis atau endotoksin).Disisi lain, bakteri gram positif akan berwarna ungu perbedaan keduanya didasarkan pada perbedaan struktur dinding sel yang berbeda dan dapat dinyatakan oleh prosedur pewarnaan gram. Bakteri gram negatif sepertiStaphylococcus aureus(bakteri pathogen yang umumnya pada manusia) hanya memiliki membrane plasma tunggal yang dikelilingi membrane plasma tebal berupa peptidoglika sekitar 90% dari dinding sel tersebut tersusun atas peptidoglika sedangkan sisanya berupa molekul lain bernama asam teikoat (Pelczar, 2007).Fiksasi adalah proses yang dilakukan untuk pewarnaan yang dapat berpenetrasi kedalam endospora.Yang membuat praktikum kurang akurat disebabkan oleh faktor kesalahan adapun faktor kesalahan sebagai berikut:Fiksasi yang kurang tepat dapat mengakibatkan bakteri mati,Pemberian zat warna yang terlalu berlebihan dapat memperlambat pengeringan tanpa fiksasi dan memperlambat proses pengamatan,Sentuhan atau geseran pada preparat yang telah berisi bakteri dapat menganggu struktur bakteri.

BAB VPENUTUP

5.1 Kesimpulan Dari praktikum pewarnaan dan cara-cara pewarnaan dapat diambil kesimpulan sebagai berikut :-Dalam praktikum kali ini digunakan 4 macam metode pewarnaan, yaitu: Pewarnaan Sederhana (pada pewarnaan ini bakteri berwarna ungu), pewarnaan negative (pada pewarnaan ini bakteri berwarna merah menyala dengan ujung kepala orange dengan dasar hitam pekat), pewarnaan gram pada pewarnaan ini bakteri yang didapat dominan violet, jadi termasuuk dalam bakteri garam positif), pewarnaann spora (pada pewarnaan spora yang terbentuk berwarna hijau).-Bakteri terbagi atas dua yaitu:a.Bakteri gram positif yaitu bakteri yang mengikat zat warna utama dengan kuat sehingga tidak dapat dilunturkan oleh peluntur dan tidak dapat diwarnai lagi oleh zat warna lawan.(pada pengamatan kali ini bakteri bewarna violet).b.Bakteri gram negative yaitu bakteri yang bersifat kebalikan dari gram positif (yang pada kali ini bakteri tampak berwarna merah).-Zat warna yang digunakan dalam pewarnaan kali ini adalah: crystal violet,safranin,lugols lodin,dan malachite green.

5.2 Saran Sebaiknya pada praktikum selanjutnaya praktikum lebih berhati-hati dan teliti pada saat pengerjaan agar hasil yang diperoleh lebih valid. Selain itu kerjasama antar praktikum dan asisten juga lebih di tingkatkan lagi agar praktikum berjalan dengan lancer.

DAFTAR PUSTAKA

Dwidjoseputro, D.2005.Dasar-Dasar Mikrobiologi.Jakarta: Djambatan.Pelczar,M.J.2007.Dasar-Dasar Mikrobiologi. Jakarta: UI Press.Sutedjo,M.1991.Mikrobiologi Tanah. Jakarta: Rhineka Cipta