PENDAHULUAN

Asam ribonukleat (RNA) merupakan salahsatu biomolekul yang memiliki beberapafungsi yang berbeda. Salah satu turunan dariRNA adalah ribozim yang mengkatalisisreaksi biokimia sebagaimana kerja enzim padaumumnya. Sejak fungsi RNA yang dapatberdisosiasi dengan DNA dan protein dapatdiketahui, RNA dianggap molekul biologisorisinil sebagai bentuk molekul evolusi antaraDNA dengan protein.

Molekul RNA berperan penting padaekspresi gen dan biosintesis protein (KoolmanJ et al 2000). Semua fungsi sel dan jaringandiatur oleh ekspresi gen, oleh karena itualasan memilih untuk mempelajari ataumeneliti RNA sebagai salah satu parameterbiokimia seluler adalah karena keragamanpopulasi intraseluler RNA itu sendiri (FarrellRE 1993).

Molekul RNA adalah polimer panjangyang tidak bercabang dari gugusribonukleotida monofosfat yang digabungkandengan ikatan fosfodiester. Secara kimia danbiologi, molekul RNA bersifat tidak stabilterutama pada suhu tinggi dan dalam keadaanbasa (Farrell RE 1993). Sifat molekul RNAyang tidak stabil merupakan sebuah hambatanuntuk melakukan penelitian yangmenggunakan RNA sebagai parameterpenelitian. Karena RNA bila disimpan dalamwaktu yang lama akan terdegradasi. Padaumumnya penelitian yang melibatkan RNA,molekul RNA harus disimpan pada suhu dibawah -700C.

Telah diketahui sebelumnya bahwa padaisolasi RNA tumbuhan, sodium asetat danetanol absolut sangat berperan penting yaituuntuk mengendapkan RNA. Oleh sebab itudiharapkan dengan penelitian ini dapatmenghasilkan suatu inovasi barupenyimpanan RNA tanaman denganpenambahan sodium asetat dan etanol absolut.

Sampel RNA tanaman yang semuladisimpan dalam lemari pendingin dengan suhu-700C dapat disimpan pada suhu -200C, 40Catau pada suhu ruang dengan penambahanSodium asetat dan etanol absolut atau etanolabsolut dengan memperoleh konsentrasi dantingkat kemurnian yang relatif tetap samaserta tidak terdegradasi setelah disimpandalam jangka waktu tertentu. Sehinggamemudahkan membawa RNA tanaman darisuatu laboraorium yang mempunyai materialatau sampel RNA tetapi tidak mempunyaiteknologi yang berhubungan dengan RNA kelaboratorium lainnya yang mempunyai

teknologi yang berhubungan dengan RNAtetapi tidak mempunyai material atau sampel.

Penelitian ini bertujuan untuk mencaripelarut yang tepat untuk penyimpanan RNAtanaman guna mempertahankankestabilannya.

Hipotesis penelitian ini adalah campuransodium asetat dan etanol absolut (0,1:3) atauetanol absolut dapat memperpanjang masapenyimpanan RNA tanaman.

Manfaat dari hasil penelitian inidiharapkan dapat menemukan suatu metodebaru untuk penyimpanan RNA tanamansehingga mempermudah penanganan RNAdari suatu tempat ke tempat lainnya yangselanjutnya akan membantu penelitian-penelitian yang berhubungan dengan ekspresigen.

TINJAUAN PUSTAKA

Asam Ribonukleat (RNA)

Asam ribonukleat (RNA) senyawa yangmerupakan bahan genetik dan memiliki peranutama dalam ekspresi gen. Dalam dogmapokok (central dogma) genetika molekuler,RNA menjadi perantara antara informasi yangdibawa DNA dan ekspresi fenotip yangdiwujudkan dalam bentuk protein.

Molekul RNA merupakan polimer panjangyang tidak bercabang dari gugusribonukleotida monofosfat yang digabungkandengan ikatan fosfodiester. Monomer RNAdisebut nukleotida, strukturnya terdiri atas tigakomponen utama, yaitu pentosa (ribosa ataugula berkarbon 5), gugus fosfat, dan basanitrogen (purin dan pirimidin). Basa nitrogenberikatan dengan pentosa membentuknukleosida. Selanjutnya ketika gugus fosfatbergabung dengan nukleosida dengan ikatanfosfodiester maka akan membentuknukleotida (Farrell RE 1993). Polimertersusun dari ikatan berselang-seling antaragugus fosfat suatu nukleotida dengan gugusribosa dari nukleotida yang lain.

Asam ribonukleotida (RNA) adalah salahsatu molekul asam nukleat yang dibentuk olehasam dioksiribonukleotida (DNA) yangberfungsi untuk mensintesis protein di dalaminti sel. Berdasarkan letak dan fungsinya RNAdibagi tiga, yaitu messenger RNA (mRNA),transport RNA (tRNA), dan ribosome RNA(rRNA). mRNA berfungsi sebagai cetakandalam sintesis protein. tRNA berfungsi untukmenterjemahkan kode-kode yang dibawa olehmRNA. Sedangkan rRNA tersimpan dalam

ribosom dan berperan aktif dalam prosessintesis protein (Nurhadryani Y et al 2004).

Secara kimiawi, perbedaan utama antaraDNA dengan RNA adalah (1) gugus hidroksilpada RNA bergabung dengan karbon posisi 2pada gula ribosa sedangkan pada DNA tidak;(2) pada RNA tidak terdapat basa timin tetapisebagai gantinya adalah basa urasil. Lebihkhusus, RNA disusun oleh prekursorribonukleotida sedangkan DNA disusun dariprekursor deoksiribonukleotida. Selain itujuga secara kimiawi dan biologis molekulRNA lebih tidak stabil dibandingkan denganmolekul DNA, terutama pada suhu tinggi dandalam keadaan basa (Farrell RE 1993).

Reverse Transcriptase Polimerase ChainReaction (RT PCR)

Teknik ini merupakan pengembangan dariteknik PCR yang awal mulanya ditemukanoleh Karry B. Mullis pada tahun 1985.Metode PCR adalah suatu metode enzimatisuntuk melipatgandakan secara eksponensialsuatu sekuen nukleotida tertentu dengan carain-vitro.

Teknik RT PCR merupakan suatupengembangan dari teknik PCR untukmelakukan analisis terhadap RNA hasiltranskripsi yang hanya terdapat dalam jumlahyang sedikit di dalam sel. Teknik RT PCRyang dikembangkan sangat spesifik, sehinggadapat digunakan walaupun jumlah RNA yangakan dianalisis sedikit (Yowono T 2006).

Oleh karena PCR tidak dapat dilakukandengan menggunakan RNA sebagai cetakanmaka harus terlebih dahulu dilakukantranskripsi balik (reverse transcription)terhadap molekul RNA sehingga diperolehmolekul cDNA (complementary DNA).Molekul cDNA tersebut selanjutnyadigunakan sebagai cetakan untuk proses PCRselanjutnya. Kegunaan teknik RT PCR antaralain adalah untuk mendeteksi ekspresi gen,untuk amplifikasi RNA sebelum dilakukankloning dan analisis, maupun untuk diagnosisagensia infektif maupun penyakit genetik(Yowono T 2006).

Teknik RT PCR memerlukan enzimtranskriptase balik (reverse transcriptase).Enzim transkriptase balik adalah enzim yangdigunakan untuk mensintesis cDNA denganmenggunakan RNA sebagai cetakan. cDNAyang disintesis akan bersifat komplementerdengan RNA cetakan. Beberapa enzimtranskriptase yang dapat digunakan antara lainmesophilic viral reverse transcriptase (RTase)yang dikode oleh virus Avian myoblastosis

(AMV) maupun oleh virus Moloney murineleukemia (M-MuL V), dan Tth DNApolymerase (Yowono T 2006).

Sodium Asetat

Sodium asetat merupakan garam sodiumdari asam asetat. Bahan ini merupakan bahankimia yang murah dan dapat digunakan secaraluas. Sebagai konjugat basa dari asam asetat,sodium asetat merupakan senyawa yang relatifbersifat basa kuat. Sebagai konjugat basa dariasam lemah, larutan sodium asetat dan asamasetat dapat berperan sebagai bufer untukmenjaga pH konstan. Kegunaan ini sangatpenting terutama dalam aplikasi biokimiayang reaksinya bergantung pada pH. Padaisolasi RNA sodium asetat dapat digunakanuntuk mengendapkan RNA. Struktur sodiumasetat dapat dilihat pada Gambar 1.

Etanol Absolut

Etanol merupakan jenis alkohol yangsering digunakan dalam kehidupan sehari-hari. Etanol berupa cairan jernih yang mudahterbakar dengan titik didih sebesar 78.50C dantitik beku sebesar -114.50C dan tergolongdalam golongan asam lemah, oleh karena ituetanol dapat digunakan sebagai bahan antibeku. Selain itu etanol dapat mengubahprotein dan dapat melarutkan lipid. Etanoldapat dibuat melalui sintesis kimia antara gasetilen dengan uap air dan asam sebagaikatalis, umumnya katalis yang seringdigunakan adalah asam fosfat.

Etanol terbagi dalam beberapa tipe, salahsatunya adalah etanol absolut. Etanol absolutatau alkohol anhidrat, biasa juga disebutetanol terpurifikasi yaitu etanol yangmengandung tidak lebih dari 1 persen air.Struktur etanol dapat dilihat pada Gambar 2.

C

H

H

H

C

O

O -Na+

Gambar 1 Struktur sodium asetat

C

H

H

H

C

H

H

OH

Gambar 2 Struktur etanol

BAHAN DAN METODE

Bahan dan Alat

Bahan-bahan yang digunakan adalahnitrogen (N2) cair, pereaksi pre-bufer ekstraksi(pre-BE), LiCl 8 M, Sodium asetat 3,3M pH5,2, bufer ekstraksi (BE),fenol:kloroform:isoamilalkohol (25:24:1),dietil pirokarbonat (DEPC), akuabides,polivinil pirolidin (PVP), polivinil polipirolidon (PPVP) kloroform:isoamilalkohol(24:1), etonol 70%, etanol absolut, Kit sintesisfirst stand cDNA (Fermentas), bufer PCR,deoksi nukleotida trifosfat (dNTP), MgCl2,primer , enzim Taq polimerase, agarosa,etidium bromida (EtBr) dan akuades sertasampel tumbuhan. Sampel yang digunakanadalah kulit batang karet (stimulan denganeter dan nonstimulan), lateks (stimulandengan eter dan nonstimulan), daun karet,bunga kakao, daun kopi (transgenik dannontransgenik), sawit hibrida dan embriokakao.

Alat-alat yang digunakan adalah penangasair, sentrifus BECKMAN COULTERAllegraTM dengan fixed angle rotor modelF0630-300 6x30ml, sentrifus DNA speed-vac®

DNA 110, pipet volumetrik, mikropipet,pengaduk, tabung sentrifus, lemari pendingin,autoklaf, tip, GeneAmp PCR (PoyimeraseChain Reaction) system 2400,spektrofotometer UV-VIS BECKMANCOULTER-DU®530 , UV T2201 Sigma,neraca analitik, mesin pengaduk, timbangan,lemari asam, cetakan gel agarosa dan tabungeppendroft.

Metode Penelitian

Isolasi RNA Tanaman

Isolasi RNA Kulit Batang Karet, DaunKaret, dan Kopi (Chaidamsari T 2005).Sebanyak 2 gram sampel digerus dengan N2

cair, lalu ditambahkan dengan 10 ml buferekstraksi untuk RNA kulit batang dan daun.Campuran tersebut dikocok dengan kuat danditambah dengan 1 volume fenol:kloroform:isoamilalkohol (25:24:1) yang kemudian diaduk dengan mesin pengaduk 3 x 30 detik.Selanjutnya campuran tersebut disentrifusdengan kecepatan 15.000 rpm selama 15menit pada suhu 40C, lalu lapisan atasdipindahkan ke dalam tabung sentrifus baruyang kemudian diekstraksi lagi dengankloroform:isoamilalkohol (24:1) dandisentrifus dengan kecepatan 15.000 rpm

selama 15 menit pada suhu 40C. Lapisan atasyang diperoleh setelah sentrifus dipindahkanke dalam tabung sentrifus baru danditambahkan dengan 1/30 volume Sodiumasetat 3,3 M pH 5,2 serta 1/10 etanol absolutyang kemudian dikocok perlahan dandisimpan di dalam es selama 30 menit.Kemudian larutan tersebut disentrifus dengankecepatan 15.000 rpm selama 25 menit padasuhu 40C, supernatan yang diperoleh dibuangsedangkan pellet dicuci dengan alkohol 70%dingin (8.000 rpm, 5 menit), lalu sisa etanoltersebut diuapkan dan endapan dilarutkandengan larutan DEPC sebanyak 750 µl.selanjutnya RNA dipisahkan dari DNAdengan menambahkan LiCl 8 M sebanyak 250µl (konsentrasi akhir 2 M), larutan tersebutdisimpan di dalam kulkas selama semalam.Setelah disimpan selama semalam, larutantersebut sentrifus kembali dengan kecepatan15.000 rpm selama 20 menit pada suhu 40C,lalu endapan dibilas dengan etanol 70%dingin (5.000 rpm, 5 menit) yang kemudiandilarutkan dengan larutan DEPC sebanyak 50-100 µl.

Isolasi RNA Lateks (CIRADModification 2007). Lateks beku yang telahditambahkan bufer ekstraksi untuk RNAlateks dipanaskan dalam penangas air padasuhu 500C selama satu jam, lalu disentrifusdengan kecepatan 15.000 rpm pada suhu 200Cselama 30 menit. Setelah sentrifugasi, fraksiputih dipindahkan ke dalam tabung sentrifusbaru dan diekstraksi dengan 1 volume fenol:kloroform:isoamilalkohol (25:24:1), lalusentrifus dengan kecepatan 10.000 rpm padasuhu 40C selama 10 menit. Selanjutnyalapisan atas dipindahkan ke dalam tabungsentrifus dan diekstraksi dengan 1 volumekloroform:isoamilalkohol (24:1), lalu sentrifusdengan kecepatan 10.000 rpm pada suhu 40Cselama 10 menit. Kemudian lapisan atasdipindahkan ke dalam tabung sentrifus barudan ditambah dengan 1/3 volume LiCl 8 Mdan disimpan pada suhu 40C selama satumalam. Setelah disimpan satu malam,disentrifus dengan kecepatan 10.000 rpm padasuhu 40C selama 30 menit. Selanjutnyasupernatan dibuang dan pellet dilarutkandengan 400 µl akuabides, lalu dipindahkan kedalam tabung kecil. Ekstraksi kembali dengan1 volume fenol: kloroform: isoamilalkohol(25:24:1), lalu sentrifus dengan kecepatan10.000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit.Selanjutnya diekstraksi dengan 1 volumekloroform:isoamilalkohol (24:1), lalu sentrifusdengan kecepatan 10.000 rpm pada suhu 40C

selama 10 menit. Lapisan atas dipindahkan kedalam tabung baru dan ditambahkan dengan0,1 volume sodium asetat dan 3 volume etanolabsolut. Kemudian disimpan pada suhu -400Cselama 3 jam. Setelah itu disentrifus dengankecepatan 12.000 rpm pada suhu 40C selama30 menit, lalu cuci dengan etanol 70% dingin(8.000 rpm, 5 menit). Sisa etanol diuapkandan pellet dilarutkan dengan 50-100 µlakuabides.

Isolasi RNA Bunga Kakao(Chaidamsari T 2005). Sebanyak 1 gramsampel bunga dan 0,3 gram PVP digerusdengan nitrogen cair, lalu dimasukkan kedalam 20 ml bufer ekstraksi untuk bunga yangtelah ditambahkan 250 µl β-merkaptoetanoldan telah dipanaskan pada penangas air 650C.Kocok kuat dengan mesin pengaduk, laluinkubasi dalam penangas air pada suhu 650Cserta kocok setiap 15 menit. Selanjutnyadidiamkan pada suhu kamar selama 5 menit,kemudian diekstraksi dengan 1 volume fenol:kloroform: isoamilalkohol (25:24:1), lalusentrifus dengan kecepatan 12.000 rpm padasuhu 250C selama 15 menit. Selanjutnyalapisan atas dipindahkan ke dalam tabungsentrifus dan diekstraksi dengan 1 volumekloroform:isoamilalkohol (24:1), lalu sentrifusdengan kecepatan 12.000 rpm pada suhu 250Cselama 15 menit. Kemudian lapisan atasdipindahkan ke dalam tabung sentrifus barudan ditambah dengan LiCl 10 M hinggakonsentrasi akhir 2 M dan disimpan pada suhu40C selama satu malam. Setelah disimpan satumalam, disentrifus dengan kecepatan 17.000rpm pada suhu 40C selama 30 menit.Selanjutnya supernatan dibuang dan pelletdilarutkan dengan 500 µl akuabides, laludipindahkan ke dalam tabung kecil. Ekstraksikembali dengan 1 volume fenol: kloroform:isoamilalkohol (25:24:1), lalu sentrifusdengan kecepatan 12.000 rpm pada suhu 40Cselama 15 menit. Selanjutnya diekstraksidengan 1 volume kloroform:isoamilalkohol(24:1), lalu sentrifus dengan kecepatan 12.000rpm pada suhu 40C selama 15 menit. Lapisanatas dipindahkan ke dalam tabung baru danditambahkan dengan 0,1 volume sodiumasetat dan 3 volume etanol absolut. Kemudiandisimpan pada suhu -400C selama kuranglebih 3 jam. Setelah itu disentrifus dengankecepatan 12.000 rpm pada suhu 40C selama30 menit, lalu cuci dengan etanol 70% dingin(8.000 rpm, 5 menit). Sisa etanol diuapkandan pellet dilarutkan dengan 50-100 µlakuabides.

Pengukuran Konsentrasi dan PengecekanKemurnian RNA.

Pengukuran Konsentrasi RNA.Sebanyak 3 µl RNA dilarutkan dengan 297 µllarutan DEPC. Selanjutnya larutan tersebutdiukur absorbansinya pada panjanggelombang 230 nm, 260 nm, 280 nm.Konsentrasi RNA dapat dengan rumus:Konsentrasi RNA = A 260 x 40 ng/ml x fpdengan A260 adalah absorbansi pada panjanggelombang 260 dan fp adalah faktorpengenceran.

Kemurnian RNA dapat dihitung denganperbandingan absorbans 260 nm/230 nm. Bilaperbandingannya lebih dari 2,0 maka dapatdikatakan bahwa RNA tersebut murni.

Pengecekan Kualitas RNA denganElektroforesis Gel Agarosa 1%.

Sebelum melakukan elektroforesisagarosa, harus terlebih dahulu dibuat gelagarosa 1%. Gel agarosa 1% dibuat dengancara mencampurkan 0,3000 gram agarosadengan 30 ml TBE 0,5x. Selanjutnyacampuran tersebut dipanaskan sampai larut,lalu didinginkan dan ditambah dengan 1,5 µletidium bromida (EtBr). Kemudian larutantersebut dimasukkan ke dalam cetakan dan ditunggu sampai padat.

Larutan RNA dicampurkan loading bufferdengan perbandingan 1: 5. Sementara itu geltersebut dimasukkan ke dalam wadah yangberisi TBE 0.5x sampai gel tersebut terendam.Selanjutnya campuran tersebut dimasukkan kedalam sumur yang ada pada gel agarosadengan mikropipet yang kemudian dialiridengan arus listrik sebesar 50 atau 25 voltselama 60 sampai 120 menit.

Penyimpanan RNA

Sampel RNA bunga kakao, lateksstimulan dan lateks nonstimulan yang telahdiketahui konsentrasinya dan kemurniannyakemudian di bagi menjadi 6 bagian, bagianpertama langsung disimpan pada suhu -400Csebagai kontrol positif. Bagian kedua danketiga ditambahkan dengan 0,1 volumeSodium asetat 3,3 M pH 5,2 dan 3 volumeetanol absolut dan masing-masing disimpanpada suhu -200C dan pada 40C. BagianKeempat dan bagian kelima ditambahkandengan etanol absolut dan masing-masingdisimpan pada suhu 40C dan pada suhu ruang.Bagian keenam langsung disimpan pada suhu

ruang sebagai kontrol negatif. Penyimpanandilakukan selama 2 bulan.

Setelah dilakukan penyimpanan, RNAkembali diukur konsentrasinya dan dipisahkandengan elektroforesis gel agarosa 1%.Pengukuran konsentrasi dan elektroforesisdilakukan untuk melihat konsentrasi dankemurnian RNA setelah penyimpanan selama2 bulan dengan perlakuan dan kontrol yangkemudian akan dibandingkan dengankonsentrasi RNA sebelum penyimpanan.Sehingga diperoleh metode penyimpananRNA yang terbaik.

Metode terbaik yang diperoleh kemudiandiulangi kembali pada sampel kulit batangkaret (stimulan dan nonstimulan), daun karet,sawit hibrida, kopi (transgenik dannontransgenik), lateks (stimulan dannonstimulan), dan embrio kakao. Selanjutnyasetelah disimpan dengan perlakuan RNAtersebut diukur konsentrasi dan dielektroforesis gel agarosa untuk mengetahuikonsentrasi, kemurnian dan keutuhannya,setelah itu RNA tersebut di RT-PCR untukmengetahui dapat atau tidaknya terekspresigen.

Reverse Transcriptase Polimerase ChainReaction (RT PCR)

Selain dengan mengukur konsentrasi danelektroforesis gel agarosa RNA juga di RT-PCR untuk mengetahui dapat atau tidaknyaRNA tersebut terekspresi gen setelahperlakuan dan penyimpanan. Sintesis cDNAdilakukan dengan cara melarutkan 2 µg RNAdengan 1µl dNTP dan 1µl oligo dT, laluditambahkan dengan akuabides hinggavolume 12 µl. Selanjutnya dipanaskan denganmesin PCR pada suhu 650C selama 5 menit.Setelah itu segera dimasukan ke dalam es danditambahkan dengan 4 µl bufer RT, 2 µl DTTdan 1 µl inhibitor RNAse, lalu kocok pelan-pelan dan inkubasi pada suhu 420C selama 2menit pada mesin PCR. Kemudian buka tutupPCR dan langsung tambahkan dengan 1 µlenzim reverse transcriptase (revert Aid M-MulV). Selanjutnya inkubasi pada suhu 420Cselama 50 menit, lalu dengan suhu 700Cselama 15 menit. Setelah itu keluarkan darimesin PCR dan simpan pada suhu -400C.Total cDNA yang diperoleh adalah 20 µl.

Reaksi PCR dilakukan dengan caramelarutkan 1 µl cDNA dengan 5 µl bufer, 0,5µl MgCL2, 1 µl dNTP, 1 µl primer geneforward, 1 µl primer gene backward, 1 µlprimer actin forward, 1 µl primer actinbackward dan 1 µl enzim Taq polimerase, lalu

ditambahkan dengan larutan DEPC hinggavolume total 50 µl. Selanjutnya dimasukkanke dalam mesin PCR yang telah diprogramdengan suhu denaturasi 940C, suhu annealing550C dan suhu elongasi 720C.

Untuk mengetahui hasil RT-PCR RNAyang telah disimpan dengan perlakuan dankontrol, cDNA hasil RT-PCR dengan RNA(kontrol dan perlakuan) yang telah disimpansebagai cetakan dipisahkan denganelektroforesis gel agarosa 1%. Hasilelektroforesis ini juga akan dibandingkanantara cDNA dengan cetakan RNA yangmengalami perlakuan dengan cDNA denganRNA tidak mengalami perlakuan (kontrol).

HASIL DAN PEMBAHASAN

Hasil Pengukuran Konsentrasi danKualitas RNA Setelah Isolasi

Kuantitas RNA dapat diperoleh dengancara mengukur konsentrasi RNA sampel,untuk bunga kakao diperoleh konsentrasisebesar 1.488 ng/µl, lateks stimulan sebesar3.616 ng/µl dan lateks nonstimulan sebesar1.628 ng/µl (Tabel 1). Sedangkan untuksampel kulit karet, daun karet, kopi, sawithibrida, dan embrio kakao diperolehkonsentrasi yang bervariasi mulai dari yangterendah sebesar 288 ng/µl untuk RNA sawithibrida sampai yang terbesar sebesar 744ng/µl untuk RNA lateks stimulan (Tabel 2).Pengukuran konsentrasi RNA dilakukandengan menggunakan spektrofotometer padapanjang gelombang 260 nm. Selanjutnyadengan absorbansi RNA pada panjanggelombang tersebut dihitung konsentrasinyadengan rumus: [RNA] = A 260 x 40 x fp.dengan A 260 adalah absorbansi pada panjanggelombang 260 nm dan fp adalah faktorpengenceran. Selain pada panjang gelombang260 nm RNA juga diukur absorbansinyapada panjang gelombang 280 nm untukmengetahui kemurnian RNA tersebut.Molekul RNA yang murni mempunyaiperbandingan absorban pada panjanggelombang 260/280 nm lebih dari 2,0. Bilaperbandingan absorbans pada panjanggelombang 260/280nm kurang dari 2.0, padaRNA tersebut masih terdapat pengotor (FarrellRE 1993).

Sampel RNA bunga kakao, lateks stimulandan lateks nonstimulan mempunyai kualitasyang baik dengan menghasilkan 2 pita yangutuh ketika dipisahkan dengan elektroforesisgel agarosa 1% (Gambar 3). Begitu pula untuk

Tabel 1 Hasil pengukuran konsentrasi RNA dengan spektrofotometerSampel A 260 nm A 280 nm A260/280 Konsentrasi

(ng/µl)Bungan kakao 0,372 0,229 1,624 1.488Lateks stimulan 0,904 0,471 1,919 3.616Lateks nonstimulan 0,407 0,214 1,902 1.628

Tabel 2 Hasil pengukuran konsentrasi RNA dengan spektrofotometerNo Sampel A 260 A 280 A 230 260/280 260/230 []

(ng/µl)1 Kulit karet stimulan 0,120 0,089 0,300 1,339 0,339 4802 Kulit karet nonstimulan 0,146 0,110 0,436 1,325 0,336 5843 Daun karet 0,177 0,104 0,180 1,700 0,988 7084 Sawit hibrida 0,072 0,058 0,063 1,239 1,132 2885 Kopi non trangenik 0,118 0,081 0,095 1,457 1,240 4726 Kopi transgenik 0,068 0,035 0,034 1,954 2,005 2727 Lateks stimulan 0,186 0,087 0,094 2,144 1,964 7448 Lateks nonstimulan 0,117 0,056 0,066 2,075 1,576 4689 Embrio kakao 0,137 0,066 0,077 2,070 1,788 548

untuk sampel RNA kulit karet, daun karet,kopi, sawit hibrida, dan embrio kakao jugamempunyai kualitas RNA yang baik denganmenghasilkan 2 pita yang utuh ketikadipisahkan dengan elektroforesis gel agarosa1% (Gambar 4). Kualitas RNA diamatidengan melakukan elektroforesis gel agarosa1%. Adanya RNA yang utuh ditandai denganadanya 2 buah pita yang utuh pada gel agarosaketika dilihat dengan menggunakan sinarultraviolet, semakin tebal pita tersebut terlihatsemakin bagus pula RNA yang diperoleh. Bilapada gel agarosa hanya terlihat 2 pita yangtidak utuh maka RNA yang diperoleh telahterdegradasi atau rusak (Farrell RE 1993).

Sebelum dilakukan pengukurankonsentrasi dan kualitas RNA, terlebih dahuludilakukan isolasi RNA dari sampel tanamanyang akan digunakan untuk penelitian. IsolasiRNA tanaman terdiri atas 3 tahap yaitu tahappemecahan dinding sel yang meliputipenggerusan sampel dengan N2 cair danpenambahan bufer ektraksi yang berfungsiuntuk memecah dinding sel, selanjutnyaadalah tahap isolasi RNA yang meliputiekstraksi dengan fenol:kloroform:isoamilalkohol (25:24:1), kloroform:isoamilalkohol (24:1) yang berfungsi untukmemisahkan lemak, protein dan glukosa sertapengotor lainnya, dan pengendapan RNAdengan etanol absolut dan sodium asetat,tahap selanjutnya adalah tahap pemurnianRNA yang meliputi penambahan LiCl 8M yang berfungsi untuk memisahkan DNAdengan RNA dan pencucian dengan etanol70%.

Penyimpanan RNA dengan BeberapaPerlakuan

Setelah RNA yang diperoleh disimpanselama 2 bulan dengan beberapa perlakuan.RNA tersebut diukur kembali konsentrasi dankualitas dengan menggunakanspektrofotometer dan elektroforesis gelagarosa 1%. Konsentrasi RNA tertinggisetelah dilakukan penyimpanan selama 2bulan diperoleh pada perlakuan denganmenambahkan sodium asetat dan etanolabsolut serta disimpan pada suhu 40C.Konsentrasi RNA yang diperoleh padaperlakuan tersebut adalah 456 ng/µl untukRNA bunga kakao, 2.358 ng/µl untuk RNAlateks stimulan dan 1.368 ng/µl untuk RNAlateks nonstimulan . Konsentrasi tersebutmasih lebih rendah dibandingkan dengankonsentrasi RNA kontrol positif yaitu 1.204ng/µl untuk RNA bunga kakao, 3.408 ng/µluntuk RNA lateks stimulan dan 1.374 ng/µluntuk RNA lateks nonstimulan . Konsentarsiyang lebih rendah dari pada konsentrasi RNA

1 2 3Gambar 3 Hasil elektoforesis gel agarosa 1%

RNA tanaman. Keterangan: (1)RNA bunga kakao, (2) RNAleteks stimulan, (3) RNA lateksnonstimulan

1 2 3 4 5 6 7 8 9Gambar 4 Hasil elektoforesis gel agarosa 1%

RNA tanaman. Keterangan: (1&2)RNA kulit batang karet stimulandan nonstimulan , (3) RNA daunkaret, (4) RNA sawit hibrida,(5&6) RNA kopi transgenik dannon trasngenik, (7&8) RNA lateksstimulan dan nonstimulan , (9)RNA embrio kakao

dengan penambahan sodium asetat dan etanolabsolut dan disimpan pada 40C diperolehpada perlakuan-perlakuan yang lainnya.Konsentrasi RNA yang diperoleh denganpenambahan sodium asetat dan etanol absolutserta disimpan pada suhu -200C adalah 402ng/µl untuk RNA bunga kakao, 1.200 ng/µluntuk RNA lateks stimulan dan 1.074 ng/µluntuk RNA lateks nonstimulan , denganpenambahan etanol absolut dan disimpanpada suhu 40C diperoleh konsentrasi RNAsebesar 276 ng/µl untuk RNA bunga kakao,1.446 ng/µl untuk RNA lateks stimulan dan546 ng/µl untuk RNA lateks nonstimulan, dandengan penambahan etanol serta disimpanpada suhu ruang diperoleh konsentrasi RNAsebesar -54 ng/µl untuk RNA bunga kakao,3.732 ng/µl untuk RNA lateks stimulan dan684 ng/µl untuk RNA lateks nonstimulan(Tabel 3).

Selain diperoleh kuantitas, juga diperolehkualitas RNA setelah penyimpanan selama 2bulan dengan perlakuan. Sampel RNA yangdisimpan pada suhu 400C sebagai kontrolpositif mempunyai kualitas RNA yang sangatbaik dengan menghasilkan 2 pita yang utuhdan tebal ketika dipisahkan denganelektroforesis gel agarosa 1% (Gambar 5).Berbeda dengan sampel RNA yang disimpanpada suhu ruang sebagai kontrol negatif akanterdegradasi dan mengalami kerusakan, ketikadipisahkan dengan elektroforesis tidakmenunjukkan 2 pita yang utuh (Gambar 6).Penyimpanan RNA pada 40C denganpenambahan sodium asetat dan etanol absolutmempunyai kualitas RNA yang baik setelahpenyimpanan walaupun pita yang terbentukketika elektroforesis tidak setebal pita yangterbentuk pada kontrol positif (Gambar 7).Begitu pula untuk penyimpanan pada suhu -200C dengan penambahan sodium asetat danetanol absolut (Gambar 8) dan penyimpananpada suhu 40C dengan penambahan etanolabsolut (Gambar 9) juga memiliki kualitasRNA yang baik. Sedangkan padapenyimpanan pada suhu ruang denganpenambahan etanol absolut akan mengalamikerusakan (Gambar 10).

Walaupun RNA yang diberi perlakuankualitasnya berkurang tetapi karenakonsentrasinya masih tinggi, RNA tersebutmasih bisa digunakan untuk penelitianselanjutnya. Metode penyimpanan RNAterbaik berdasarkan perlakuan yang dilakukanadalah RNA yang ditambahkan sodium asetat

Tabel 3 Perbandingan konsentrasi RNA antar perlakuan setelah penyimpanan selama 2 bulanPerlakuan Suhu

penyimpananSampel Konsentrasi setelah

penyimpananBunga kakao 1.204Lateks stimulan 3.408RNA - 400CLateks nonstimulan 1.374Bunga kakao 756Lateks stimulan 5.192RNA Suhu ruangLateks nonstimulan 2.248Bunga kakao 456Lateks stimulan 2.358

RNA denganpenambahan sodiumasetat dan etanol absolut

40CLateks nonstimulan 1.368Bunga kakao 402Lateks stimulan 1.200

RNA denganpenambahan sodiumasetat dan etanol absolut

-200CLateks nonstimulan 1.074Bunga kakao 276Lateks stimulan 1.446

RNA denganpenambahan etanolabsolut

40CLateks nonstimulan 546Bunga kakao -54Lateks stimulan 3.732

RNA denganpenambahan etanolabsolut

Suhu ruangLateks nonstimulan 684

1 2 3Gambar 5 Elektoforesis gel agarosa 1% RNA

tanaman yang disimpan pada -400C. Keterangan: (1) RNA bungakakao, (2) RNA leteks stimulan,(3) RNA lateks nonstimulan

1 2 3Gambar 6 Elektoforesis gel agarosa 1% RNA

tanaman yang disimpan pada suhuruang Keterangan: (1) RNA bungakakao, (2) RNA leteks stimulan,(3) RNA lateks nonstimulan

1 2 3Gambar 7 Elektoforesis gel agarosa 1%

RNA tanaman yangditambah sodium asetat dan etanolabsolut serta disimpan pada 40Cselama 2 bulan. Keterangan: (1)RNA bunga kakao, (2) RNAleteks stimulan, (3) RNA lateksnonstimulan

dan etanol absolut serta disimpan pada suhu40C, karena selain masih utuh, RNA tersebutjuga memiliki konsentrasi tertinggidibandingkan dengan RNA pada perlakuanyang lain. Oleh karena itu, untuk lebihmembuktikan bahwa metode tersebut dapatdigunakan untuk penyimpanan RNA. Metodetersebut diuji kembali dengan beberapasample serta diuji ekspresi gen dengan RT-PCR.

Penyimpanan RNA dengan PenambahanSodium Asetat dan Etanol Absolut Serta

Disimpan pada Suhu 40C

Setelah penyimpanan pada suhu 40Cdengan penambahan sodium asetat dan etanolabsolut selama 2 bulan. Sampel RNA diukurkembali konsetrasi dan kualitasnya. Lalu jugadilakukan RT-PCR yang kemudiandibandingkan dengan hasil RT-PCR RNAtanpa perlakuan. Konsentrasi RNA yangditambah sodium asetat dan etanol absolut

1 2 3Gambar 8 Elektoforesis gel agarosa 1% RNA

tanaman yang ditambah sodiumasetat dan etanol absolut sertadisimpan pada -200C selama 2bulan. Keterangan: (1) RNAbunga kakao, (2) RNA leteksstimulan, (3) RNA lateksnonstimulan

1 2 3Gambar 9 Elektrofresis gel agarosa 1% RNA

tanaman yang ditambah etanolabsolut serta disimpan pada 40Cselama 2 bulan. Keterangan: (1)RNA bunga kakao, (2) RNAleteks stimulan, (3) RNA lateksnonstimulan

1 2 3Gambar10 Elektoforesis gel agarosa 1% RNA

tanaman yang ditambah etanolabsolut serta disimpan pada suhuruang selama 2 bulan. Keterangan:(1) RNA bunga kakao, (2) RNAleteks stimulan, (3) RNA lateksnonstimulan

serta disimpan pada suhu 40C lebih rendahdibandingkan dengan konsentrasi RNA awal.Hal tersebut menunjukkan bahwa sebagianRNA tetap mengalami kerusakan ketikadisimpan dengan penambahan sodium asetatdan etanol absolut. Konsentrasi RNA sampelyang tidak diberi perlakuan mencapai 744ng/µl tetapi setelah ditambah dengan etanolabsolut serta disimpan pada suhu 40C,konsentrasi RNA yang diperoleh hanyamencapai 324 ng/µl (Tabel 4). Selain itu,ketika dilakuan elektroforesis, sampel RNAyang tidak diberi perlakuan lebih utuhdibandingkan dengan RNA yang telahditambah sodium asetat dan etanol absolutserta disimpan pada suhu 40C (Gambar 11).

Walaupun konsentrasi dan kualitas RNAsetelah ditambah sodium asetat dan etanolabsolut serta disimpan pada suhu 40C selamadua bulan lebih rendah dibandingkan dengan

RNA awal, sampel RNA tersebut masihmemungkinkan untuk dipergunakan padapenelitian yang lebih lanjut. Hal tersebutdapat dilihat pada hasil RT-PCR RNAyang ditambah dengan sodium asetat danetanol absolut serta disimpan pada suhu40C (Gambar 12), RNA tersebutmemberikan hasil ekspresi gen yang sama

dengan hasil RT-PCR RNA awal tanpaperlakuan dan penyimpanan (Gambar 13).Kulit karet stimulan, kulit karet nonstimulan,lateks stimulant, lateks nonstimulan, dandaun karet memberikan ekspresi gen pada275 Kb sedangkan sawit hibrida, kopitransgenik, kopi nontransgenik dan embriokakao memberikan ekspresi pada 516 Kb.

Tabel 4 Hasil pengukuran konsentrasi RNA yang ditambah sodium asetat dan etanol absolutkemudian disimpan pada suhu 40C selama 2 bulan

No Sampel A 260 A 280 A 230 260/280 260/230 [](ng/µl)

1 Kulit karet stimulan 0,015 0,010 0,031 1,418 0,480 602 Kulit karet nonstimulan 0,039 0,028 0,094 1,407 0,416 1563 Daun karet 0,032 0,019 0,032 1,687 0,995 1284 Sawit hibrida 0,024 0,020 0,023 1,214 1,044 965 Kopi non trangenik 0,024 0,014 0,017 1,702 1,446 966 Kopi transgenik 0,023 0,014 0,016 1,717 1,483 927 Lateks stimulan 0,081 0,043 0,052 1,898 1,560 3248 Lateks nonstimulan 0,037 0,022 0,030 1,689 1,229 1489 Embrio kakao 0,045 0,025 0,033 1,787 1,337 180

1 2 3 4 5 6 7 8 9Gambar 11 Elektroforesis agarosa 1%

setelah penyimpanan denganpenambahan sodium asetat danetanol absolut pada 40C.Keterangan:(1&2) RNA kulitbatang karet stimulannonstimulan, (3) daun karet, (4)RNA sawit hibrida, (5&6) kopitransgenik nontrangenik, (7&8)lateks stimulan nonstimulan, (9)embrio kakao

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10Gambar 12 Hasil RT-PCR RNA sampel.

Keterangan (1) marker, (2) lateksstimulan, (3) lateks nonstimulan,(4) kulit karet stimulan, (5) kulitkaret nonstimulan, (6) daun karet,(7) kopi trangenik, (8) kopinontransgenik, (9) embrio kakao,(10) sawit hibrida

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10Gambar 13 Hasil RT-PCR RNA setelah

penyimpanan 2 bulan denganpenambahan sodium asetat danetanol absolut. Keterangan (1)marker, (2) lateks stimulan, (3)lateks nonstimulan, (4) kulit karetstimulan, (5) kulit karetnonstimulan, (6) daun karet, (7)kopi transgenik, (8) kopi nontransgenik, (9) embrio kakao, (10)sawit hibrida

SIMPULAN DAN SARAN

Berdasarkan penelitian dapat disimpulkanbahwa RNA tanaman dapat disimpan padasuhu 40C selama dua bulan denganpenambahan sodium asetat dan etanol absolut.

Sebagai saran perlu disiapkan RNAberlebih bila menyimpannya pada suhu 40Cdengan penambahan sodium asetat dan etanolabsolut, karena berkurangnya konsentrasiRNA ketika disimpan. Selain itu juga perludilakukan penelitian lebih lanjut untukmengetahui waktu penyimpanan optimum.

250 Kb

500 Kb

250 Kb

500 Kb