27

BAB 3. METODOLOGI PENELITIAN

3.1 Jenis Penelitian

Jenis penelitian yang digunakan adalah True Experimental Laboratories

(Pratiknya, 1993). Penelitian ini menggunakan desain post test only control

group design.

3.2 Rancangan Penelitian

KI I OI

KII I OII

KII I OIII

KI I OIV

KV OV

Gambar 3.1 (Skema Rancangan Penelitian)

Keterangan:

M : mencit

R : randomisasi

KI,II,III,IV,V : kelompok perlakuan 1, 2, 3, 4, dan 5

PI : mencit distimulasi dengan ekstrak Bangle dosis 22,6

mg/25gBB/hari

P0 : mencit tidak distimulasi ekstrak Bangle

I : mencit diinfeksi dengan Plasmodium berghei

SI : mencit diterapi ekstrak Bangle dengan dosis 22,6mg/25gBB/hari

M

R

PI

PI

A

SI

SII

SIII

SIV

P0

P0

E0

28

SII : mencit diterapi ekstrak Bangle dengan dosis 22,6 mg/25gBB/hari

dan artemisin dosis 0,728 mg/25gBB/hari

SIII : mencit diterapi artemisin dengan dosis 0,728 mg/25gBB/hari

SIV : mencit tidak diterapi

Eo : mencit tidak diberi stimulasi dan tidak diterapi

OI,II,III,IV,V : observasi perlakuan 1, 2, 3, 4, dan 5

A : analisis data

3.3 Populasi dan Sampel Penelitian

3.3.1 Populasi Penelitian

Populasi yang digunakan dalam penelitian ini adalah mencit Balb/C

karena strain ini dapat menimbulkan respon imunitas pada Plasmodium berghei

dengan berat antara 20-30 gram dan umur 2-3 bulan.

3.3.2 Jumlah Sampel

Sampel dibagi ke dalam 5 kelompok, yaitu : Kelompok I, II, III, IV, dan

V. Jumlah sampel minimal yang digunakan dalam penelitian ini adalah 4 ekor

tikus wistar betina untuk masing-masing kelompok sehingga jumlah total sampel

adalah 20 ekor mencit. Sebanyak 15 ekor mencit untuk uji produksi NO,

sedangkan 15 ekor mencit lainnya untuk uji produksi MDA.

3.4 Waktu dan Tempat Penelitian

3.4.1 Waktu Penelitian

Penelitian dilaksanakan pada bulan Maret 2013 sampai Juli 2013..

3.4.2 Tempat Penelitian

Proses ekstraksi etanol Bangle dilakukan di Laboratorium Biologi

Fakultas Farmasi (Biofarmasi) Universitas Jember dan Laboratorium

Farmakologi Fakultas Kedokteran Universitas Jember, uji jumlah produksi

Nitric Oxide (NO) dilaksanakan di Laboratorium Parasitologi Fakultas

Kedokteran Universitas Gajah Mada dan uji jumlah produksi Malondialdehyde

29

(MDA) dilaksanakan di Laboratorium Biokimia Fakultas Kedokteran

Universitas Gajah Mada.

3.5 Variabel

3.5.1 Variabel Bebas

Variabel bebas pada penelitian ini adalah pemberian ekstrak etanol

Bangle (Zingiber cassumunar Roxb.).

3.5.2 Variabel Terikat

Variabel terikat pada penelitian ini adalah produksi Malondialdehyde

(MDA) dan Nitric Oxide (NO), diukur jumlah NO dari supernatan serum

menggunakan reagen Griess dengan modifikasi menurut Green et al. (1982) dan

Ding et al. (1988).

3.5.3 Variabel Terkendali

Variabel terkendali dalam penelitian ini meliputi umur hewan coba, jenis

kelamin dan galur hewan coba, lama perlakuan pada hewan coba, berat badan

hewan coba, dosis artemisin, Plasmodium berghei serta pemeliharaan dan

perlakuan pada hewan coba.

3.5.4 Variabel Tidak Terkendali

Variabel tidak terkendali dalam penelitian ini meliputi imunitas,

psikologis, dan faal mencit.

3.6 Validitas dan Realibilitas

3.6.1 Validitas

Validitas merupakan derajat ketepatan antara data yang terjadi pada

objek penelitian dengan data yang dapat dilaporkan oleh peneliti. Dengan

demikian data yang valid adalah data yang tidak berbeda antara data yang

dilaporkan oleh peneliti dengan data yang sesungguhnya terjadi pada objek

penelitian (Sugiyono, 2007).

30

Validitas pada penelitian ini dijaga dengan :

a. Menyamakan kondisi mencit.

b. Mengambil mencit secara acak.

c. Menggunakan kriteria standar dalam menilai jumlah produksi

Malondialdehyde (MDA) dan Nitric Oxide (NO) mencit dan

menggunakan alat ukur yang sama.

3.6.2 Realibilitas

Reliabilitas berkenaan dengan derajat konsistensi dan stabilitas data atau

temuan. Dalam pandangan positifistik (kuantitatif), suatu data dinyatakan

reliable apabila dua atau lebih peneliti dalam obyek yang sama menghasilkan

data yang sama, atau peneliti sama dalam waktu berbeda menghasilkan data

yang sama, atau sekelompok data bila dipecah menjadi dua menunjukkan data

yang tidak berbeda (Sugiyono, 2007).

Reliabilitas data pada uji produksi NO dijaga dengan replikasi enam kali,

sedangkan pada uji produksi MDA dijaga dengan replikasi tiga kali.

3.7 Definisi Operasional

3.7.1 Ekstrak Bangle (Zingiber cassumunar roxb.)

Rimpang Bangle didapatkan dari Desa Andongrejo, Kecamatan

Tempurejo, Kabupaten Jember. Rimpang Bangle yang diambil adalah rimpang

yang menjalar dan berdaging, bentuknya hampir bundar sampai jorong atau

tidak beraturan, tebal 2-5 mm. Permukaan luar tidak rata, berkerut, kadang-

kadang dengan parut daun, warnanya coklat muda kekuningan, bila dibelah

berwarna kuning muda sampai kuning kecoklatan. Rasanya tidak enak, pedas,

dan pahit

Larutan ekstrak etanolik 96% dari rimpang Bangle (Zingiber cassumunar

Roxb.) diberikan kepada kelompok perlakuan mencit Balb/C ( yang diinfeksi

Plasmodium berghei ) melalui sonde lambung dengan dosis 22,6

mg/25grBB/hari.

31

3.7.2 Plasmodium berghei

Plasmodium berghei merupakan salah satu parasit malaria yang

menginfeksi mamalia selain manusia. Parasit ini analog dengan parasit malaria

pada manusia pada hampir semua aspek penting seperti struktur, fisiologi, dan

siklus hidupnya (Carter dan Diggs, 1977). Pada penelitian ini, Plasmodium

berghei diperoleh dari Laboratorium Parasitologi Fakultas Kedokteran

Universitas Gajah Mada.

3.7.3 Produksi Malondialdehyde (MDA)

Parameter kadar Malondialdehyde (MDA) serum merupakan nilai

penanda kerusakan oksidatif pada membran sel yang disebabkan radikal bebas.

Pengambilan darah melalui medial canthus sinus orbitalis dan intrakardial.

Pemeriksaan MDA dengan metode Thiobarbituric Acid Reactive Substances

(TBARS).

3.7.4 Produksi Nitric Oxide (NO)

Parameter kadar Nitric Oxide (NO) serum dihasilkan oleh inducible

(iNOS), endothelial (eNOS), dan neural (nNOS). Produksi NO oleh iNOS

dihasilkan dari makrofag selama infeksi dengan cara mengaktifkan transkripsi

gen yang mengkodekan enzim nitric oxide synthase. Produksi NO serum adalah

konsentrasi NO dengan satuan µM yang terdapat dalam supernatan serum yang

diukur dengan reagen Griess.

3.8 Alat dan Bahan

3.8.1 Alat

Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah oven, rotavapour,

blender, beaker glass, spatula, saringan, perkolator, kapas, kertas saringan, kaki

tiga, statif, cawan petri, hot plate, gelas ukur, timbangan digital, sonde lambung,

kandang hewan coba, sentrifus, mikroskop cahaya, microplate 96 well, tabung

ependorf, automated microplate reader, spektrofotometer, penangas air, tabung

reaksi, tabung, sentrifuse, pipet mikro, kuvet, kuvet mikro,dan refrigator.

32

3.8.2 Bahan

Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah sampel yang diambil

dari darah yang diambil dari medial canthus sinus orbitalis dan intrakardial.

Plasmodium bergrhei dan pakan mencit diperoleh dari Laboratorium

Parasitologi Fakultas Kedokteran Universitas Gajah Mada. Bahan perlakuan

adalah ekstrak Bangle dan artemisinin. Reagen yang dibutuhkan untuk

pembuatan ekstrak adalah alkohol 96% dan suling steril. Reagen untuk uji

produksi NO adalah 2%, N-(1-naphthyl)ethylenediamine dihydrochloride =

NED (Sigma), Sulfanilamide (Sigma), 5%phosphoric acid, ZnSO4, PBS dan

NaNO2. Reagen untuk uji produksi MDA adalah larutan TCA 100%, larutan

sodium TBA, HCl 0,1 N, dan Na sitrat.

3.9 Ethical Clearance

Sebelum melakukan penelitian, prosedur penelitian telah dimintakan ijin

ethical clearance dari Komisi Etika Penelitian Kedokteran Fakultas Kedokteran

Universitas Jember.

3.10 Prosedur Penelitian

3.10.1 Ekstraksi Bangle (Zingiber cassumunar Roxb.)

Bahan yang digunakan adalah rimpang Bangle (Zingiber cassumunar

Roxb.). Bahan didapat dari Desa Andongrejo Kecamatan Tempurejo, Jember

yang telah diidentifikasi di Herbarium Jemberiense, Jurusan Biologi, Fakultas

MIPA Universitas Jember.Rimpang Bangle setelah dicuci bersih, kemudian

dipotong kecil-kecil, selanjutnya diangin-anginkan. Potongan kecil rimpang

Bangle dikeringkan dalam alat pengeringan (oven) bersuhu 500C, selama 4 hari

dan setiap hari dibalik untuk mempercepat pengeringan. Setelah kering,

potongan tersebut dimasukkan ke dalam penggilingan dengan besar lubang

untuk menyaring adalah 0,75 mm.

Pembuatan sediaan ekstrak rimpang Bangle dilakukan dengan cara

perkolasi. Serbuk rimpang Bangle sebanyak 600 g dibasahi dengan 300 ml

etanol, lalu dimasukkan ke dalam bejana tertutup dan didiamkan selama 3 jam.

33

Filtrat sedikit demi sedikit dituangkan ke dalam perkolator sambil ditekan

perlahan-lahan. Penambahan larutan etanol secukupnya ke dalam perkolator

sampai cairan menetes dan di atas serbuk masih terdapat larutan etanol.

Perkolator ditutup dan dibiarkan selama 24 jam. Cairan filtrat dibiarkan menetes

dengan kecepatan 1 ml per menit. Larutan etanol secukupnya ditambahkan

berulang-ulang ke dalam perkolator agar selalu terdapat larutan etanol di atas

permukaan simplisia. Lebih kurang 200 ml cairan filtrat pertama ditampung dan

dipisahkan. Perkolasi dilanjutkan sampai didapat titik akhir perkolasi dengan

petunjuk warna perkolat yang jernih. Hasil dari perkolasi diperas dan cairan

perasan dicampur ke dalam perkolat. Pada penyaringan lanjutan ini didapat

filtrat lebih kurang 4.500 ml. Filtrat pertama dan kedua dipindahkan ke dalam

bejana tertutup, dibiarkan selama 2 hari di tempat yang sejuk dan terlindung dari

cahaya. Pemekatan hasil filtrasi menggunakan alat rotavapor pada suhu 480C

dengan kecepatan 200 rpm sehingga cairan habis terdestilasi. Penguapan air

yang masih tersisa di dalam ekstrak dilanjutkan dengan waterbath pada ekstrak,

sehingga hasil akhir ekstrak yang didapat adalah ekstrak kental.

3.10.2 Standarisasi Ekstrak Rimpang Bangle

Standarisasi ekstrak dilakukan sesuai dengan prosedur dalam parameter

standar umum ekstrak tumbuhan obat yang diterbitkan oleh Departemen

Kesehatan RI (2000). Standarisasi dilakukan teradap beberapa parameter.

Pertama, parameter non spesifik, yakni susut pengeringan. Kedua, parameter

spesifik yang meliputi organopletik, kadar senyawa yang terlarut dalam pelarut

air dan etanol. Ketiga, parameter kandungan kimia ekstrak yang meliputi pola

kromatogram dan kadar total golongan kandungan kimia.

a. Parameter Susut Pengeringan

Tujuan pengukuran susut pengeringan adalah memberikan batasan

maksimal tentang besarnya senyawa yang hilang pada proses pengeringan.

Ekstrak ditimbang secara seksama sebanyak 1-2 gram dan dimasukkan ke

dalam botol timbang dangkal tertutup yang sebelumnya telah dipanaskan

pada suhu 1050C selama 30 menit dan telah ditara. Sebelum ditimbang

34

ekstrak diratakan hingga merupakan lapisan setebal 5-10 mm. Pengeringan

ekstrak dilakukan pada suhu 1050C hingga bobot tetap, hitung susut

pengeringannya dalam persen.

b. Organoleptik

Tujuan pemeriksaan organoleptik adalah pengenalan awal yang

sederhana dan seobyektif mungkin. Pemeriksaan menggunakan panca

indera untuk mendeskripsikan bentuk, warna, bau, dan rasa. Pemeriksaan

dilakukan paling sedikit 20 orang.

c. Kadar Senyawa yang Terlarut dalam Air dan Etanol

Tujuan penentuan kadar senyawa yang larut dalan air dan etanol adalah

memberikan gambaran awal jumlah senyawa kandungan. Maserasi sejumlah

5 gram ekstrak selama 24 jam dengan 100 ml air kloroform menggunakan

labu tersumbat sambil berkali-kali dikocok selama 6 jam pertama kemudian

dibiarkan selama 18 jam. Saring, uapkan 20 ml filtrat hingga kering dalam

cawan dangkal berdasar rata yang telah ditara, panaskan residu pada suhu

1050C hingga bobot tetap. Hitung kadar dalam persen senyawa yang larut

dalam air dihitung terhadap ekstrak awal. Hal yang sama dilakukan dengan

mengganti pelarutnya dengan etanol.

d. Pola Kromatogram

Pola kromatogram dapat memberikan gambaran awal komposisi

kandungan kimia berdasarkan pola kromatogram. Pola kromatogram

ditemukan dengan metode KLT-densitometri pada lempeng silica gel GF254,

fase gerak kloroform:benzene:methanol (80:15:5). Setelah discan dengan

densitometer, bercak yang ada dideteksi dengan pereaksi Dragendorf untuk

mengetahui bercak yang mengandung flavonoid yang ditunjukkan dengan

timbulnya warna bercak yang berkisar antara kuning sampai jingga.

e. Kadar Total Golongan Kandungan Kimia

Pada penetapan kadar total golongan kandungan kimia, yang ditetapkan

adalah kadar total flavonoid dalam hal ini adalah kurkumin.

35

3.10.3 Penentuan Dosis Bangle dan Artemisinin

a. Dosis Bangle

Dosis kurkumin yang diperlukan mencit sebagai dosis imunostimulan

adalah 30mg/hari. Sedangkan dalam 1mg Bangle terdapat 33.2 mg. Dengan

rumus perhitungannya adalah

Dosis Bangle = Dosis kurkumin untuk mencit1mg Kurkumin dalam Bangle

Dosis Bangle = 30 33.2

Dosis Bangle = 0.9037 untuk 1 grBB mencit. Maka dosis Bangle pada

penelitian ini adalah 22.6mg/25grBB mencit.

b. Dosis Artemisinin

Dalam 1 tablet dihidroartemisinin piperaquin mengandung 3,2mg/kgBB

dihidroartemisinin dan 16mg/kg BB piperaquin. Dengan rumus perhitungannya

untuk 25grBB mencit adalah

Dosis artemisinin= Dihidroartemisinin x nilai konversi x BB manusia x 25 20

Dosis artemisinin= 3,2 x 0.0026 x 70 x 1.25

Dosis artemisinin= 0.728mg/25grBB mencit.

3.10.4 Stimulasi Ekstrak Bangle

Sampel diadaptasikan selama 7 hari di Laboratorium dan diberi pakan

standar. Sejumlah 30 ekor mencit Balb/C jantan dibagi dalam 5 kelompok

masing-masing terdiri atas 6 ekor mencit.

Mencit distimulasi dengan ekstrak Bangle dosis 22,6 mg/25gBB/hari.

Stimulasi ini dilakukan selama 14 hari dengan tujuan meningkatkan respon imun

mencit terhadap infeksi termasuk malaria.

3.10.5 Induksi Plasmodium berghei pada Hewan Coba

Stok darah terinfeksi Plasmodium berghei dari simpanan beku dicairkan

pada suhu kamar. Darah tersebut disuntikkan pada mencit donor 100-200 µl

secara intraperitoneal. Bila tingkat parasitemia mencit donor telah mencapai 20-

36

30% maka dilakukan pengambilan darah secara intrakardial. Darah tersebut

kemudian diencerkan dengan larutan fisiologis hingga diperoleh tingkat

parasitemia 108 eritrosit terinfeksi parasit per ml. Sejumlah 0,2 ml larutan ini

(2x107) diinjeksikan secara intraperitoneal atau intravenous ke kelompok mencit

coba.

3.10.6 Pemberian Ekstrak Bangle

Terapi ekstrak Bangle dengan dosis 22,6 mg/25gBB/hari ataupun dengan

artemisin dosis 0,728 mg/25gBB/hari diberikan apabila telah ditemukan adanya

plasmodium di dalam darah mencit. Lama pemberian terapi selama 4 hari.

Selama 4 hari perlakuan, derajat parasitemia tetap diperiksa.

3.10.7 Pengambilan serum mencit

Mencit diterminasi dengan narkose menggunakan kloroform. Darah

mencit dapat diambil melalui medial canthus sinus orbitalis dan intrakardial.

Darah dari intrakardial dapat diambil dengan menggunakan spuit 3cc, sedangkan

darah dari medial canthus sinus orbitalis diambil dengan menggunakan pipa

kapiler hematokrit. Selanjutnya, darah yang telah diambil dimasukkan ke dalam

tabung ependorf dan setelah itu diinkubasi pada suhu kamar selama 30 menit.

Pada tahap berikutnya, darah disentrifus dengan kecepatan 10.000 rpm selama

10 menit. Supernatan yang telah terbentuk dipindahkan ke tabung ependorf

lainnya. Serum disimpan dengan suhu -200C pada refrigator.

3.10.8 Uji Produksi Nitric Oxide (NO).

Serum mencit sebanyak 200μl diencerkan dengan PBS 200μl kemudian

ditambahkan dengan ZnSO4 sebanyak 20μl kemudian disentrifus dengan

kecepatan 10.000 rpm selama 5 menit. Penambahan ZnSO4 ini bertujuan untuk

deproteinase. Selanjutnya, supernatan yang telah terbentuk diambil sebanyak

100μl dan kemudian dimasukkan ke dalam sumuran pada microplate 96 wells.

Reagen Griess (reagen chromogenic) ditambahkan sebanyak 100μl dan

dimasukkan dalam setiap sumuran. Standar NO juga dimasukkan sebanyak

37

100μl dan ditambahkan juga dengan 100μl reagen griess pada sumuran yang

masih kosong. Selama 5 menit kemudian, diobservasi adanya perubahan warna

dan stabilisasi. Pengukuran absorbansi pada 550 nm menggunakan automated

microplate reader. Pada tahap pembacaan nitrit standar digunakan analisis

regresi linier sederhana atau simple setelah itu dihitung konsentrasi nitrit dalam

sampel berdasarkan kurva standar atau rumus regresi.

Pembuatan reagen chromogenic melalui beberapa tahap. Pertama,

pembuatan reagen A memerlukan N-(1-naphthyl)ethylenediamine

dihydrochloride=NED (Sigma) sebanyak 0,1g kemudian dilarutkan dalam 100

ml air suling. Kedua, pembuaten reagen B memerlukan Sulfanilamide (Sigma)

sebanyak 1g kemudian dilarutkan dalam 100 ml 5% phosphoric acid. Reagen A

dan B harus disimpan pada lemari pendingin dalam botol gelap dan dapat

digunakan dalam 6 minggu atau selama tidak berubah warna menjadi lebih

gelap. Selanjutnya, kedua reagen tersebut dicampurkan dengan volume sama

banyak dan dapat digunakan 1 jam setelah disiapkan.

Pembuatan nitrit standar memerlukan 69 mg NaNO2 kemudian dilarukan

dalam 500 ml air suling (2 mM stock), selanjutnya dibuat pengenceran

bertingkat dari 0 – 200 μM dengan cara melarutkan larutan stok menggunakan

PBS.

3.10.9 Uji Sekresi Malondialdehyde (MDA) serum

Sebanyak 3 ml darah mencit diambil melalui medial canthus sinus

orbitalis. Darah tersebut dimasukkan ke dalam tabung yang mengandung Na

sitrat. Selanjutnya, darah disentrifus pada 3000 rpm selama 15 menit dan

kemudian darah yang telah disentrifus diambil serumnya. Serum darah tersebut

diambil sebanyak 0,5 ml untuk tiap masing-masing tabung, tabung sebagai tes

dan kontrol. Pada masing-masing tabung ditambahkan sebanyak 100 ul TCA

100% kemudian divortex. Setelah itu ditambahkan lagi 250 ul HCL 0,1N

kemudian divortex kembali. Pada tahap berikutnya, tabung tes dan kontrol

disentrifus pada 3000 rpm selama 10 menit dan kemudian diambil

supernatannya serta disaring dengan glass wool. Untuk tabung tes, ditambahkan

38

100 ul sodium thio barbituric acid, sedangkan tabung kontrol tidak

ditambahkan. Selanjutnya, semua tabung tersebut divortex dan setelahnya

dipanaskan dengan waterbath 1000C selama 25 menit. Angkat hasilnya dan

biarkan dalam suhu ruang. Pada tahap terakhir, hasil yang didapat dibaca pada

spektrofotometer λ 531,6 nm.

3.11 Analisis Data

Data hasil penelitian dengan uji produksi Nitric Oxide (NO) dan

Malondialdehyde (MDA) plasma dianalisis menggunakan uji One Way ANOVA

dan dilanjutkan uji Post Hoc LSD. Perbedaan dianggap bermakna apabila nilai

p<0,05 dengan 95% interval kepercayaan. Analisis statistik dibantu dengan

program SPSS 13 for windows.

disortasidicuci

dikeringkan

diblenderdiayak

Diperkolasi sampai didapat titik akhir perkolasi dengan petunjuk warna perkolat yang jernih

39

3.12 Alur Penelitian

Gambar 3.2 Alur Penelitian

simplisia kering

Ekstrak Bangle (dosis)

Artemisinin

K IV

Ekstrak etanol

analisis data

Data

Kesimpulan

KIIIKIIKI

pengumpulan data

rimpang Bangle segar

Infeksi Plasmodium berghei

Stimulasi Ekstrak Bangle (dosis)

Ekstrak Bangle (dosis)

dan Artemisinin

K V