EVY ROSSIEVY ROSSI

JURUSAN TEKNOLOGI HASIL PERTANIANJURUSAN TEKNOLOGI HASIL PERTANIANFAKULTAS PERTANIAN UNIVERSITAS RIAU FAKULTAS PERTANIAN UNIVERSITAS RIAU SEMESTER GANJIL 2010/2011SEMESTER GANJIL 2010/2011

Analisis Protein dan Senyawa Bernitrogen

1.Secara kualitatif terdiri atas ;

a. reaksi Xantoprotein

b. reaksi Hopkins-Cole

c. reaksi Millon

d. reaksi Nitroprusida

e. reaksi Sakaguchi

2.Secara kuantitatif terdiri dari ;

• metode Kjeldahl

• metode spektrofotometri visible (Biuret)

• metode Lowry

• metode titrasi formol

• metode spektrofotometri UV.

Analisis Protein dan Senyawa Bernitrogen dapat dilakukan dengan beberapa Methode

1. Reaksi XantoproteinLarutan asam nitrat pekat ditambahkan dengan hati-hati ke dalam larutan protein. Setelah dicampur terjadi endapan putih yang dapat berubah menjadi kuning apabila dipanaskan. Reaksi yang terjadi ialah nitrasi pada inti benzena yang terdapat pada molekul protein. Reaksi ini positif untuk protein yang mengandung tirosin, fenilalanin dan triptofan.

Methode Kualitatif

2. Reaksi Hopkins-ColeLarutan protein yang mengandung triptofan dapat direaksikan dengan pereaksi Hopkins-Cole yang mengandung asam glioksilat. Pereaksi ini dibuat dari asam oksalat dengan serbuk magnesium dalam air. Setelah dicampur dengan pereaksi Hopkins-Cole, asam sulfat dituangkan perlahan-lahan sehingga membentuk lapisan di bawah larutan protein. Beberapa saat kemudian akan terjadi cincin ungu pada batas antara kedua lapisan tersebut.

3. Reaksi MillonPereaksi Millon adalah larutan merkuro dan merkuri nitrat dalam asam nitrat. Apabila pereaksi ini ditambahkan pada larutan protein, akan menghasilkan endapan putih yang dapat berubah menjadi merah oleh pemanasan. Pada dasarnya reaksi ini positif untuk fenol-fenol, karena terbentuknya senyawa merkuri dengan gugus hidroksifenil yang berwarna.

4. Reaksi NatriumnitroprusidaNatriumnitroprusida dalam larutan amoniak akan menghasilkan warna merah dengan protein yang mempunyai gugus –SH bebas. Jadi protein yang mengandung sistein dapat memberikan hasil positif.

5.Reaksi SakaguchiPereaksi yang digunakan ialah naftol dan natriumhipobromit. Pada dasarnya reaksi ini memberikan hasil positif apabila ada gugus guanidin. Jadi arginin atau protein yang mengandung arginin dapat menghasilkan warna merah.

6.Metode BiuretLarutan protein dibuat alkalis dengan NaOH kemudian ditambahkan larutan CuSO4 encer. Uji ini untuk menunjukkan adanya senyawasenyawa yang mengandung gugus amida asam yang berada bersama gugus amida yang lain. Uji ini memberikan reaksi positif yaitu ditandai dengan timbulnya warna merah violet atau biru violet.

• Metode Kjeldahl merupakan metode yang sederhana untuk penetapan nitrogen total pada asam amino, protein dan senyawa yang mengandung nitrogen.

• Sampel didestruksi dengan asam sulfat dan dikatalisis dengan katalisator yang sesuai sehingga akan menghasilkan amonium sulfat.

Methode Kjeldahl

• Setelah pembebasan dengan alkali kuat, amonia yang terbentuk disuling uap secara kuantitatif ke dalam larutan penyerap dan ditetapkan secara titrasi.

• Metode ini telah banyak mengalami modifikasi.

• Metode ini cocok digunakan secara semimikro, sebab hanya memerlukan jumlah sampel dan pereaksi yang sedikit dan waktu analisa yang pendek.

• Penetapan nilai protein kasar dilakukan secara tidak langsung, karena analisis inididasarkan pada penentuan kadar nitrogen yang terdapat dalam bahan. • Kandungan nitrogen yang diperoleh

dikalikan dengan angka 6,25 sebagai angka konversi menjadi nilai protein. • Nilai 6,25 diperoleh dari asumsi bahwa

protein mengandung 16% nitrogen (perbandingan protein : nitrogen =100 :16 = 6,25:1).

Prinsip

• Angka 6,25 berasal dari angka konversi serum albumin yang biasanya mengandung 16% nitrogen.

• Untuk beras, kedelai, dan gandum angka konversi berturut-turut sebagai berikut: 5,95, 5,71, dan 5,83.

Asam Sulfat pekat• Asam Chorida ( yang sudah diketahui normalitasnya)• Natrium Hydroxsida 40%• Katalis campuran (yang dibuat dari CuSO4.5H2O dan K2SO4 dengan perbandingan 1:5• Asam borax 5%• Indikator Bahan ( zat kimia) :• campuran ( brom cresolgreen : Methyl merah = 4 : 5. sebanyak 0,9 gram campuran dilarutkan dalam alkohol 100 mL)

Alat : • Labu Kjeldahl 300 mL• Satu set alat destilasi• Erlenmeyer 250 cc• Buret 50 cc skala 0,1 mL• Timbangan analitik

Alat dan Bahan

• Destruksi sudah di anggap selesai bila larutan sudah berwarna hijau jernih, setelahitu dinginkan

1. Destruksi • Timbang contoh sampel kering

oven sebanyak ± 1 gram ( catat

sebagai A gram).• Masukan ke dalam labu

kjeldhal dengan hati-hati, dan

tambahkan 6 gram katalis campuran.• Tambah 20 mL Asam Sulfat

pekat.• Panaskan dalam nyala api kecil

di lemari asam. Bila sudah tidak

berbuih lagi destruksi

diteruskan dengan nyala api

yang besar.

Prosedur Analisis

• Basakan larutan bahan dari

destruksi dengan menambah

40-60 mL NaOH 40% melalui

corong samping. Tutup kran

corong segera setelah larutan

tersebut masuk ke labu didih• Nyalakan pemanas bonsen dan

alirkan air ke dalam kran

pendingin tegak.• Lakukan destilasi sampai semua N dalam larutan dianggap telah tertangkap olehasam borax yang ditandai dengan menyusutnya larutan dalam labu didih sebanyak 2/3bagian (atau sekurang-kurangnya sudah tertampung dalam erlenmeyer sebanyak 15mL

• Siapkan alat destilasi

selengkapnya, pasang

dengan hati-hati jangan

lupa batu didih, vaselin

dan tali pengaman• Pindahkan larutan hasil

destruksi ke dalam labu

didih, kemudian bilas

dengan aquades sebanyak

lebih kurang 50 mL.• Pasangkan erlenmeyer

yang telah diisi asam borax 5%

sebanyak 5 mL untuk

menangkap gas amonia, dan

telah diberi indikator

campuran sebanyak 2 tetes.

2. Destilasi

• Erlenmeyer berisi sulingan tadi diambil (jangan lpa membilas bagian yang terendam dalam air sulingan)

• Kemudian titrasi dengan HCl yang sudah diketahui normalitasnya catat sebagai B, titik titrasi dicapai dengan ditandai perubahan warna hijau ke abu-abu. Catat jumlahlarutan HCl yang terpakai sebagai C mL

Titrasi

• Akhir titrasi ditandai dengan tepat perubahan warna larutan menjadi merah muda dan tidak hilang selama 30 detik bila menggunakan indikator PP.

% N = ml HCl (sampel-blanko) x B

Berat sampel (g) x 1000

B = Normalitas HCl x 14.008 x 100%

% protein = % N x faktor protein (6,25)

• Methode ini adalah salah satu cara terbaik untuk menentukan kadar protein suatu larutan.

• Methode ini memerlukan 1-10 mg protein per ml

• Dalam kondisi zat alkali (Cu 2+) yang membentuk kompleks dengan ikatan peptida yang menghasilkan warna ungu dengan absorban pada 540 nm.

• Hanya sedikit senyawa-senyawa lain yg mengganggu reaksi misalnya: urea yang mengandung gugus CO dan NH dan gula pereduksi yang mengandung ion Cu 2+

• Pereaksi : Larutan Biuret dan larutan protein standar berupa larutan bovine serum albumin dlm air

2. Metode Spektrofotometri Visible (Biuret)

• Sentrifuse• SpektofotometerPeralatan

•Waring Blender

Pembuatan larutan induk bovin serum albumin (BSA):Ditimbang 500 mg bovin serum albumin dilarutkan dalam aquades sampai 10,0 ml sehingga kadar larutan induk 5,0% (Li). Penetapan kadar (Metode Biuret) :

Pembuatan reagen Biuret :Larutkan 150 mg tembaga (II) sulfat (CuSO4. 5H2O) dan kalium natrium tartrat (KNaC4H4O6. 4H2O) dalam 50 ml aquades dalam labu takar 100 ml. Kemudian tambahkan 30 ml natrium hidroksida 10% sambil dikocok-kocok, selanjutnya tambahkan aquades sampai garis tanda.

Prosedure

Pembuatan kurva Standar :1. Masukkan ke dlm tabung reaksi 0 (blanko), 0.1, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8

dan 1 ml larutan protein standar. Tambahkan air sampai volume

totalnya masing-masing 4 ml.

2. Tambahkan 6 ml pereaksi Biuret ke dlm masing2 tabung reaksi dan

homogenkan.

3. Simpan tabung reaksi pada suhu 37oC selama 10 min. atau pd suhu

kamar selama 30 min. Kemudian ukur absorbannya pada 520 nm.

• Ambil sejumlah tertentu sampel protein yang terlarut misal albumin, endapkan dahulu dengan penambahan amonium sulfat kristal (jumlahnya tergantung dari jenis proteinnya, kalau perlu Sampai mendekati kejenuhan amonium sulfat dalam larutan).

• Pisahkan protein yang mengendap dengan sentrifus 11.000 rpm selama 10 menit, pisahkan supernatannya.

• Presipitat yang merupakan proteinnya kemudian dilarutkan kembali dengan dapar asam asetat pH 5 misal sampai 10,0 ml.

• Ambil sejumlah µL larutan tersebut secara kuantitatif kemudian tambahkan reagen Biuret dan jika perlu tambah dengan dapar asetat pH 5 untuk pengukuran kuantitatif.

• Setelah 10 menit dari penambahan reagen Biuret, baca absorbansinya pada panjang gelombang 550 nm terhadap blanko yang berisi reagen Biuret dan dapar asetat pH 5. Perhatikan adanya faktor pengenceran dan absorban sampel sedapat mungkin harus masuk dalam kisaran absorban kurva standar.

Cara mempersiapkan sampel :

Prinsip

• Reaksi antara Cu 2+ dgn ikatan peptida dan reduksi asam fosfo monolobdad dan asam fosfotungstat oleh tirosin dan triptofan yang akan menghasilkan warna biru.

• Warna yang terbentuk tergantung pada kadar tirosin dan triptofan

• Lebih sensitif (100x) dari methode Biuret.

3. Methode Lowry

Pembuatan reagen Lowry A : Merupakan larutan asam fosfotungstat-asam fosfomolibdat dengan perbandingan (1 : 1)

Pembuatan reagen Lowry B :Campurkan 2% natrium karbonat dalam 100 ml natrium hidroksida 0,1N. Tambahkan ke dalam larutan tersebut 1 ml tembaga (II) sulfat 1% dan 1 ml kalium natrium tartrat 2%

Prosedur :

Pembuatan kurva Standar Siapkan larutan bovin serum albumin dengan

konsentrasi 300 µg/ml (Li). Buat seri konsentrasi dalam tabung reaksi, misal dengan komposisi berikut :

Tambahkan ke dalam masing-masing tabung 8 ml reagen Lowry B dan biarkan selama 10 menit, kemudian tambahkan 1 ml reagen Lowry A. Kocok dan biarkan selama 20 menit. Baca absorbansinya pada panjang gelombang 600 nm tehadap blanko. (Sebagai blanko adalah tabung reaksi no.1 pada tabel di atas)

Prosedur

•Ambil sejumlah tertentu sampel protein yang terlarut misal albumin, endapkan dahulu dengan penambahan amonium sulfat kristal (jumlahnya tergantung dari jenis proteinnya, kalau perlu sampai mendekati kejenuhan amonium sulfat dalam larutan). • Pisahkan protein yang mengendap dengan sentrifus 11.000 rpm selama 10 menit, pisahkan supernatannya. • Presipitat yang merupakan proteinnya kemudian dilarutkan kembali dengan dapar asam asetat pH 5 misal sampai 10,0 ml. •Ambil volume tertentu dan lakukan penetapan selanjutnya seperti pada kurva standar mulai dari penambahan 8 ml reagen Lowry A sampai seterusnya.

Penyiapan Sampel