ANALISIS HPLC

Prinsip dasar dari HPLC adalah memisahkan setiap komponen dalam sample untuk selanjutnya diidentifikasi (kualitatif) dan dihitung berapa konsentrasi dari masing-masing komponen tersebut (kuantitatif). Sebetulnya hanya ada dua hal utama yang menjadi krusial point dalam metode HPLC. Yang pertama adalah proses separasi/pemisahan dan yang kedua adalah proses identifikasi. Dua hal ini mejadi faktor yang sangat penting dalam keberhasilan proses analisa.

Aplikasi analisis HPLC adalah untuk penentuan kualitatif dan penentuan kuantitatif.

Penentuan Kualitatif

HPLC digunakan untuk analisa kualitatif didasarkan pada waktu retensi untuk identifikasi. Identifikasi dapat diandalkan apabila waktu retensi sampel dibandingkan dengan larutan standar.

Penentuan Kuantitatif

Beberapa hal yang harus diperhatikan agar HPLC dapat dipergunakan untuk penentuan secara kuantitatif adalah:

Parameter percobaan sama antara standar dan sampel Penentuan berdasarkan waktu retensi sampel dan standar yang sama Penentuan kadar dilakukan berdasarkan hubungan (korelasi) dengan menggunakan larutan standar

seri pada waktu retensi tertentu. Berdasarkan area kromatogram Berdasarkan tinggi puncak kromatogram

Hasil analisa HPLC diperoleh dalam bentuk signal kromatogram. Dalam kromatogram akan terdapat peak-peak yang menggambarkan banyaknya jenis komponen dalam sample.

Sample yang mengandung banyak komponen didalamnya akan mempunyai kromatogram dengan banyak peak. Bahkan tak jarang antar peak saling bertumpuk (overlap). Hal ini akan menyulitkan dalam identifikasi dan perhitungan konsentrasi. Oleh karena itu biasanya untuk sample jenis ini dilakukan tahapan preparasi sample yang lebih rumit agar sample yang siap diinjeksikan ke HPLC sudah cukup bersih dari impuritis. Sample farmasi biasanya jauh lebih mudah karena sedikit mengandung komponen selain zat aktif. Sample ini umumnya hanya melalui proses pelarutan saja.

Kesulitan biasanya dihadapi ketika akan mengidentifikasi suatu kromatogram yang terdiri atas banyak peak. Untuk mengetahui peak mana yang merupakan milik analit (zat target analisa) kromatogram dibandingkan dengan kromatogram standard. Cara yang paling umum untuk mengidentifikasi adalah dengan melihat Retention Time (RT). Peak yang mempunyai RT yang sama dengan standard umumnya akan langsung di vonis sebagai peak milik analit. Memang senyawa/zat yang sama akan mempunyai RT yang juga sama, dengan catatan sample dan standard dijalankan dengan kondisi dan sistem HPLC yang sama. Namun bukan berarti RT yang sama pasti merupakan zat/senyawa yang sama.

Jadi, melihat RT sebetulnya belumlah cukup untuk mengidentifikasi suatu zat. Hal lain yang perlu dilihat adalah spektrum 3D dari signal kromatogram. Zat yang sama akan mempunyai spektrum 3D yang juga sama. Sehingga jika spektrum 3D antara dua zat berbeda, maka kedua zat tersebut juga dipastikan adalah zat yang berlainan, meskipun memiliki RT yang sama.

Beberapa parameter penting yang perlu diperhatikan di dalam analisis HPLC adalah :

A. Kolom

Sebuah kolom sederhana memiliki diameter internal 4.6 mm (dan mungkin kurang dari nilai ini) dengan panjang 150 sampai 250 mm. Kolom yang biasa digunakan untuk analisa adalah bentuk kolom fase balik. Kolom diisi dengan partikel silika yang dimodifikasi menjadi non polar melalui pelekatan rantai-rantai hidrokarbon panjang pada permukaannya secara sederhana baik berupa atom karbon 8 atau 18. Sebagai contoh, pelarut polar digunakan berupa campuran air dan alkohol seperti metanol.

Dalam kasus ini, akan terdapat atraksi yang kuat antara pelarut polar dan molekul polar dalam campuran yang melalui kolom. Atraksi yang terjadi tidak akan sekuat atraksi antara rantai-rantai hidrokarbon yang berlekatan pada silika (fase diam) dan molekul-molekul polar dalam larutan. Oleh karena itu, molekul-molekul polar dalam campuran akan menghabiskan waktunya untuk bergerak bersama dengan pelarut.

Senyawa-senyawa non polar dalam campuran akan cenderung membentuk atraksi dengan gugus hidrokarbon karena adanya dispersi gaya van der Waals. Senyawa-senyawa ini juga akan kurang larut dalam pelarut karena membutuhkan pemutusan ikatan hydrogen sebagaimana halnya senyawa-senyawa tersebut berada dalam molekul-molekul air atau metanol misalnya. Oleh karenanya, senyawa-senyawa ini akan menghabiskan waktu dalam larutan dan akan bergerak lambat dalam kolom.Ini berarti bahwa molekul-molekul polar akan bergerak lebih cepat melalui kolom.

Ada kolom yang digunakan untuk beberapa jenis analisa, misalnya kolom C18 yang dapat digunakan untuk analisa carotenoid, protein, lovastatin, dan sebagainya. Namun ada juga kolom yang khusus dibuat untuk tujuan analisa tertentu, seperti kolom Zorbax carbohydrat (Agilent) yang khusus digunakan untuk analisa karbohidrat (mono-, di-, polysakarida). Keberhasilan proses separasi sangat dipengaruhi oleh pemilihan jenis kolom dan juga fasa mobil.

B. Komposisi Eluen

Komposisi eluen meliputi jenis dan perbandingan eluen yang digunakan. Ada 2 macam eluen, yakni pelarut nonpolar untuk fase normal, seperti heksan, dan pelarut polar untuk fase balik, seperti campuran air dan alkohol, yakni metanol.

C. Volume Injeksi

Sampel yang akan dipisahkan dimasukkan ke dalam kolom secara otomatis atau manual melalui injeksi. Volume injeksi sangat tepat karena mempunyai sampel loop dengan variabel volume (misalnya 20 – 500 μL). Injeksi sampel dapat dilakukan melalui manual (menggunakan jarum suntik), step-flow injection, dan sampling value.

D. Detektor

Detektor merupakan suatu bagian integral dari sebuah peralatan analitik kromatografi cair yang modern. HPLC mempunyai keunggulan dibanding kromatografi lain, yaitu mempunyai banyak pilihan detektor yang dapat digunakan.

Secara garis besar, detektor dalam HPLC dapat dikelompokan :

Berdasarkan pengukuran diferensial suatu sifat yang dimiliki baik oleh molekul sampel maupun fase gerak (bulk property detector). Detektor dapat dibedakan menjadi :

• Detektor Indeks Bias

Detektor indeks bias merupakan detektor yang juga luas penggunaannya setelah detektor ultraviolet. Dasarnya ialah pengukuran perbedaan indeks bias fase gerak murni dengan indeks bias fase gerak yang berisi komponen sampel, sehingga dapat dianggap sebagai detektor yang universal pada HPLC.

Detektor ini kurang sensitif dibanding dengan detektor ultraviolet dan sangat peka terhadap perubahan suhu.

• Detektor konduktivitas

• Detektor tetapan dielektrika

Berdasar pengukuran suatu sifat yang spesifik dari molekul sampel (disebut solute property detector).Jenis yang kedua ini dibedakan lagi menjadi :

1) Tidak memerlukan adanya pemisahan fase gerak,

• Detektor-detektor fotometer (uv-vis dan inframerah)

Pada detektor ultraviolet/visibel, deteksi komponen sample didasarkan pada absorpsi sinar ultraviolet (untuk detektor ultraviolet) dan sinar tampak (untuk detektor visibel). Detektor ultraviolet merupakan detektor yang paling luas digunakan karena sensitivitas dan reprodusibelitasnya yang tinggi serta mudah operasinya. Detektor UV terutama digunakan untuk pendeteksian senyawa-senyawa organic. Detektor UV dilengkapi dengan pengatur panjang gelombang sehingga panjang gelombang UV yang digunakan dapat dipilih disesuaikan dengan jenis cuplikan yang diukur. Walaupun demikian, biasanya panjang gelombang UV yang digunakan adalah pada 254 nm karena kebanyakan senyawa organic menyerap sinar UV pada sekitar panjang gelombang tersebut. Detektor fotometer inframerah juga dapat digunakan pada HPLC. Dengan detektor ini dapat dibuat pola spektrum infra merah dari komponen sampel sehingga gugus-gugus fungsionalnya dapat diketahui.

• Detektor Polarografi dan radioaktif;

Detektor ini dipengaruhi oleh variasi laju aliran.

E. Chart Speed

Diagram kecepatan dapat diketahui bila sampel diinjeksikan secara manual (Clark, 2007)

Clark, James. 2007. High Performance Liquid Chromatography – HPLC. Tersedia di http://www.chemguide.co.uk/analysis/chromatography/hplc.html. Diakses pada tanggal 11 November 2013