analisisproteinBAB IPENDAHULUAN1.1 Latar BelakangElektroforesis merupakan suatu proses bergeraknya molekul yang bermuatan didalam suatu medan listrik dimana molekul yang bergerak ini tergantung pada muatan yang dimiliki, bentuk dan ukurannya. Sehingga dengan elektroforesis ini dapat digunakan untuk separasi makromolekul seperti asam nukleat danprotein. Protein merupakan molekul penyusun tubuh kita yang terbesar setelah air. Hal ini mengindikasikan pentingnya protein dalam menopang seluruh proses kehidupan dalam tubuh. Pada kenyataannya, kode genetik yang tersimpan dalam rantaian DNA digunakan untuk membuat protein, kapan, dimana dan seberapa banyak. Didalam tubuh, protein ini berfungsi sebagai penyimpan dan pengantar seperti hemoglobin yang memberikan warna merah pada sel darah merah, bertugas mengikat oksigen dan membawanya ke bagian tubuh yang memerlukannya. Selain itu juga menjadi penyusun sel dalam tubuh, seperti keratin di rambut yang banyak mengandung asam amino cysteine sehingga menyebabkan bau yang khas bila rambut terbakar karena banyaknya kandungan atom sulfur di dalamnya (Sudarmanto, 2008). Melalui metode elektroforesis ini maka dapat dilakukan separasi protein sebagai tahapan awal untuk mendapatkan untuk melakukan penelitian lebih lanjut sehingga praktikum ini perlu untuk dilakukan.1.2 TujuanTujuan yang ingin dicapai dariPraktikumSDS PAGE ini yaitu untuk mengetahui metode yang tepat untuk melalukan separasi protein sampel yang telah diisolasi dari praktikum sebelumnya.1.3 ManfaatManfaat yang ingin dicapai dari praktikum ini yaitu untuk mengetahui dan memahami metode SDS PAGE yang tepat sehingga nantinya dapat dianalisis sesuai kebutuhan dalam penelitian selanjutnya.BAB IITINJAUAN PUSTAKA2.1 Pengertian ProteinProtein merupakan molekul penyusun tubuh kita yang terbesar setelah air. Hal ini mengindikasikan pentingnya protein dalam menopang seluruh proses kehidupan dalam tubuh. Pada kenyataannya, kode genetik yang tersimpan dalam rantaian DNA digunakan untuk membuat protein, kapan, dimana dan seberapa banyak. Protein berfungsi sebagai penyimpan dan pengantar seperti hemoglobin yang memberikan warna merah pada sel darah merah, bertugas mengikat oksigen dan membawanya ke bagian tubuh yang memerlukannya. Selain itu juga menjadi penyusun sel dalam tubuh, seperti keratin di rambut yang banyak mengandung asam aminoCysteinesehingga menyebabkan bau yang khas bila rambut terbakar karena banyaknya kandungan atom sulfur di dalamnya. Enzim merupakan salah satu jenis dari protein yang berfungsi sebagai katalis alam tubuh. Dengan adanya enzim, organisme dapat hidup dengan baik. Enzim memiliki beberapa kelebihan terhadap katalisator non-biologis pada kecepatan reaksi serta spesifikasi terhadapsubstratyang tinggi (Sudarmanto, 2008).Protein memiliki fungsi banyak fungsi bagi tubuh, diantaranya yaitu sebagai katalis biokimia seperti enzim; sebagai struktur seperti kolagen yang merupakan komponen penting pada tulang dan tendon; sebagai pergerakan, contohnya aktin dan myosi; sebagaitransportseperti hemoglobin yang membawa oksigen dalam aliran darah danserum albuminyang membawa asam lemak; sebagai zat pengatur, contohnya hormon insulin yang mengontrol gula darah dan sitokin seperti interleukin yang mengatur pembelahan sel dan diferensiasi; sebagai proteksi, contohnya antibodi dan protein yang telibat dalam pembekuan darah; sebagai penyimpanan, contohnya feritin yang menyimpan besi dalam darah dan gliadin yang menyimpan asam amino dalam biji gandum dorman (WordPress, 2009).2.2 SDS PAGESodium dodecyl sulfat atau disebut juga SDS merupakan detergen yang dapat memecah molekul hidrofobik tetapi juga memiliki muatan negatif yang dihubungkan dengan hal tersebut. Oleh karena itu jika sel diinkubasi dengan SDS maka membran akan dihancurkan dan seluruh protein akan soluablized oleh detergen dan seluruh protein akan dilindungi dengan banyak muatan negatif seperti pada gambar 1. yang menghasilkan dua hal penting yaitu seluruh protein akan dalam struktur primer dan seluruh protein memiliki muatan negatif yang banyak (Davidson, 2001).Gambar 1. Cara kerja SDS (Davidson, 2001)Polyacrylamide gel electrophoresis atau disingkat PAGE ini merupakan suatu kemungkinan dari teknikanalisisyang digunakan untuk separasi dan karakterisasi protein yang banyak digunakan. Solution dari acrylamide dan bisacrylamide merupakan polymerisasi. Bisacrylamide dimasukkan secara crosslinks diantara rantai polyacrilamide. Ukuran porinya ditentukan berdasarkan rasio dari acrilamide untuk bisacrylamid, dan oleh konsentrasi acrilamid. Tinggi rasio dari bisacrilamid pada acrilamid dan tinggi konsentrasi acrilamid menyebabkan mobilitas elektroforesis menjadi pelan. Polimerisasi dari akrilamid dan monomer bisakrilamid merupakan induksi oleh ammonium persulfat (APS) (Williams, 2001).SDS ini merupakan detergen yang ampipatik yang berikatan nonkovalen dengan protein, dengan stoikiometri dari sekitar satu molekul SDS tiap dua asam amino. SDS ini menyebabkan protein terdenaturasi dan disassociate, dengan keberadaan SDS, muatan dari protein tersembunyi. Selama SDS PAGE berlangsung, seluruh protein bergerak menuju anoda yang bermuatan positif (Williams, 2001).Gambar 2. Gel Elektroforesis (Williams, 2001)Gambar 3. Metode Gel Elektroforesis Protein (Molekular station, 2008).BAB IIIMETODOLOGI3.1 Waktu dan TempatPraktikum dengan judul SDS PAGE dilaksanakan di Laboratorium Biologi Molekuler Jurusan Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Brawijaya pada tanggal 07 Mei 2009.3.2 SDS PAGE3.2.1 Separating Gel 12,5%Dalam separating gel ini yang dilakukan yaitu dengan memasukkan bahan-bahan kedalam tabung falkon 50 ml secara berurutan. Bahan yang digunakan yaitu stok akrilamid 30% sebanyak 3,125 ml, 1M tris pH 8,8 sebanyak 2,75 ml, 1,505 ml aquades, 100 l SDS 10%, dan 100 l APS 10%. Setelah itu larutan dituang dalam plate sampai tanda batas. Setelah gel sedikit memadat dengan membandingkan pada sisa gel yang ada. Setelah sedikit memadat ditambahkan aquades secukupnya diatas gel tersebut. Dibiarkan gel hingga memadat sempurna, selanjutnya aquades diserap dengan tisu.3.2.2 Stacking Gel 5%Dalam membuat stacking gel ini, semua bahan dicampur dalam falkon 50 ml secara berurutan, bahan yang digunakan yaitu 0,45 ml akrilamid-bis 30%, 0,38 ml 1M Tris pH 6,8, 2,11 ml aquades, 40 l SDS 10%, 30 l APS 10%, dan 5 l TEMED. Setelah itu larutan dituang diatas separating gel yang telah memadat. Kemudian sisir dipasang pada stacking gel dan dibiarkan hingga memadat sempurna. Setelah padat, lepaskan sisir dan rapikan sumuran yang terbentuk dengan jarum dari spuilt.3.2.3 Preparasi GelSampel yang telah diencerkan ditambah RSB dengan perbandingan 1:1 kemudian dipanaskan pada suhu 1000C selama 5 menit.3.2.4 Running GelPlate yang berisi separating dan stacking gel dilepas karet pengamannya kemudian plate berisi gel tersebut dimasukkan dalam chamber elektroforesis. Selanjutnya dituang running buffer hingga bagian atas dan bawah gel terendam larutan. Selanjutnya sampel yang telah disiapkan dimasukkan dalam sumuran sesuai peta sumuran yang telah dibuat. Untuk memulai running, perangkat elektroforesis dihubungkan dengan power supply, selanjutnya running dilakukan pada arus 30 mA selama 3-4 jam atau sampai tracking dye mencapai jarak 0,5 cm dari dasar gel. Setelah selesai matikan listrik dan buang running buffer dan ambil gel dari plate.3.2.5 PewarnaanDalam proses ini, hal pertama yang dilakukan yaitu dengan merendam gel dalam larutan staining sambil digoyang selama 15 menit. Setelah 15 menit buang larutan staining dan cuci gel dengan aquades beberapa kali hingga bersih. Selanjutnya gel direndam dalam larutan destaining selama 30 menit atau hingga band terlihat sambil digoyang, saat perendaman ini, gel dilapisi dengan kertas saring. Selanjutnya gel dicuci dengan aquades beberapa kali hingga bersih.BAB IVHASIL DAN PEMBAHASAN4.1 Analisa ProsedurPada praktikum ini dilakukan pembuatan dua jenis gel berbeda, yaitu separating gel dan stacking gel. Separating gel ini berfungsi untuk memisahkan atau menseparasi protein berdasarkan berat molekulnya, bahan yang digunakan dalam praktikum yaitu akrilamid 30% sebagai bahan untuk membentuk pori-pori dalam gel agar protein dapat terpisah berdasarkan ukurannya, 1M Tris pH 8,8 untuk menstabilkan pH buffer agar muatan dari protein tidak berubah, aquades digunakan sebagai pelarut polar dan sebagai media polar untuk aliran listrik dalam gel, SDS digunakan untuk memutuskan ikatan disulfida dari protein agar menjadi unfolding dan menyelubungi protein dengan muatan negatif, APS digunakan sebagai katalisator dalam polimerasi gel poliakrilamid, dan TEMED digunakan sebagai katalisator pembentukan radikal bebas dari ammonium persulfat dan sebagai pemadat sehingga pencampurannya dilakukan terakhir agar larutan tidak menjadi padat terlebih dahulu sebelum seluruh bahan tercampur. pH yang digunakan dalam separating gel yaitu 8,8 untuk mendapatkan pori-pori yang lebih kecil sehingga protein akan terseparasi dengan baik saat running. Larutan gel yang telah dibuat dimasukkan dalam plate untuk mencetak gel, lalu pemberian aquades diatas separating gel yang setengah padat bertujuan untuk membuat permukaan separating gel datar. Setelah padat aquades diserap agar dapat dilakukan proses selanjutnya yaitu penambahan stacking gel diatas separating gel. Gel kedua yaitu stacking gel yang berfungsi untuk tempat menata sampel protein sebelum proses running dimulai. Bahan yang digunakan dalam pembuatan stacking gel ini yaitu akrilamid-bis sebagai pembentuk pori-pori untuk memisahkan protein berdasarkan ukuran yang dimilikinya, Tris pH 6,8 untuk mempertahankan pH proein agar tidak berubah, aquades sebagai pengencer, pelarut, dan pemberi kondisi polar untuk melancarkan arus listrik, SDS digunakan untuk memutuskan ikatan disulfide protein agar menjadi unfolding dan dapat menyelubungi protein dengan muatan negatif, APS digunakan sebagai katalisator dalam polimerasi gel poliakrilamid, dan TEMED digunakan sebagai katalisator pembentukan radikal bebas dari ammonium persulfat dan sebagai pemadat sehingga pencampurannya dilakukan terakhir agar larutan tidak menjadi padat terlebih dahulu sebelum seluruh bahan tercampur. Setelah seluruh bahan dicampur kemudian dituang diatas separating gel yang telah memadat untuk membuat satu rangkaian gel poliakrilamid yang dapat digunakan untuk SDS PAGE. Sisir dipasang untuk mencetak sumuran tempat sampel dimasukkan dalam gel.pH yang digunakan dalam separating gel yaitu 8,8 agar didapatkan protein tetap dalam keadaan muatan negatif. pH stacking gel yang dibuat yaitu 6,8 agar kondisi pH dari stacking gel berada di bawah isoelektrik protein (pH 8) sehingga protein akan tersusun secara berjajar pada bagian bawah dari stacking gel (Janson, 1998).Dalam preparasi sampel digunakan penambahan Reducing Sample Buffer atau RSB dengan perbandingan 1:1 karena RSB ini mampu memutus ikatan disulfida protein sehingga didapatkan protein dalam bentuk linier yang nantinya akan memudahkan separasi protein tersebut dalam gel saat running. Didalam RSB terdapat kandungan 1M Tris-Cl pH 6,8 untuk menjaga kondisi pH dari sampel protein, gliserol 50% berfungsi untuk menambah berat sampel sehingga mudah turun, SDS 10% berfungsi sebagai agen pereduksi yang memutuskan ikatan disulfida sehingga protein berbentuk linier dan member muatan negatif pada protein, fungsi pembentukan muatan negatif ini untuk memudahkan separasi menuju kutub positif saat dilewatkan arus (Janson, 1998). Kandungan yang lain yaitu terdapat 2-merkaptoethanol yang berfungsi untuk membantu reaksi SDS dalam memecah ikatan disulfida dari protein, dan bromophenol Blue 1% sebagai penanda atau sebagai tracking dye yang memudahkan dalam mengamati pergerakan protein saat running (janson, 1998). Tetapi RSB yang digunaka dalam sampel tanaman sedikit berbeda dari sampel non tanaman, yaitu pada RSB untuk tanaman perlu ditambahkan DTT dan EDTA. Penambahan DTT ini untuk memecah ikatan disulfide dengan mendegradasi ikatan alifatik disulfide menjadi rantai polipeptida tunggal. Pada tanaman banyak terdapat jenis metabolit sekunder, sehingga untuk memaksimalkan pemecahan disulfida yang dilakukan oleh SDS dan 2-merkaptoethanol diperlukan penambahan DTT dan EDTA (Janson, 1998). Setelah penambahan RSB, sampel protein dipanaskan pada suhu 1000C bertujuan untuk mengoptimalkan pendenaturasian protein.Running yang dilakukan pada praktikum digunakan arus 30 mA selama 3-4 jam untuk mendapatkan hasil yang baik karena digunakan arus yang lebih kecil sehingga protein dapat terseparasi dengan baik. Running ini dilakukan untuk menseparasi protein berdasarkan berat molekul yang dimilikinya. Running buffer dengan pH 8,3 untuk menjaga kondisi fisiologis dari protein dan gel agar tetap bermuatan negatif karena berada diatas titik isoelektrik. Bagian atas dan bawah gel harus terendam running buffer karena system yang digunakan dalam elektroforesis yaitu wet sistem dan digunakan arus listrik, jika salah satu bagiannya tidak terendam maka arus listrik tidak dapat mengalir. Setelah running selesai, yang selanjutnya digunakan untuk analisis hanya separating gelnya saja sedangkan stacking gelnya dibuang karena band-band protein hanya terdapat pada separating gel saja.Langkah selanjutnya yaitu staining atau pewarnaan. Pewarnaan ini perlu untuk dilakukan untuk membantu dalam pengamatan band protein yang terseparasi. Larutan staining yang digunakan dalam praktikum ini yaitu CBB R-250 (Coomasie Brilliant Blue), CBB ini sensitif terhadap protein yang memiliki ukuran yang beriksar antara 0,5 hingga 20 mikrogram (Heidsamp, 2008). Penggoyangan perlu dilakukan untuk megoptimalkan reaksi staining yang dilakukan oleh CBB. Pencucian dengan aquades berfungsi untuk membilas dan menghilangkan CBB yang mungkin masih tersisa pada gel. Selanjutnya dilakukan perendaman pada larutan destaining untuk menghilangkan CBB yang tersisa dan memperjelas band protein yang terbentuk serta untuk menghilangkan CBB yang tidak berada pada band protein. Pemberian kertas saring saat perendaman pada larutan destaining bertujuan untuk memaksimalkan pembersihan larutan CBB. Setelah itu dilakukan pencucian lagi dengan aquades untuk menghilangkan sisa larutan destaining dan menghentikan pewarnaan yang dilakukan oleh larutan destaining. Selanjutnya gel dapat discan untuk mendapatkan visualisasi lebih baik untuk analisis selanjutnya.4.2 Analisa HasilKelemahan yang dimiliki dari staining menggunakan CBB ini antara lain yaitu CBB tidak dapat mewarnai protein yang mimiliki ukuran yang sangat kecil, dalam proses pewarnaan yang dilakukan memerlukan waktu yang lebih lama, bahan penyusun larutan stainingnya mudah menguap dan bersifat asam sehingga diperlukan penanganan tersendiri untuk membuat larutan staining ini. Selain kelemahan, kelebihan yang dimiliki oleh larutan staining CBB ini yaitu bahan yang digunakan tergolong murah dan mudah didapatkan dan lebih mudah dalam menghilangkan sisa-sisa pewarnanya (Janson, 1998). Jenis larutan staining lain yang dapat digunakan yaitu Colloidal Coomasie Brilliant Blue (G-250) yang mampu mewarnai protein yang berukuran hingga 30 ng dan sesuai dengan masa untuk analisis spektofotometri, Blue Silver (CoomasieG-250) yang mampu mewarnai protein yang berukuran 1-5 ng, dan kompatibel terhadap mass spektrofotometri (Missouri University, 2002).14 13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1Gambar 4 Hasil running bebrapa sampel protein dengan SDS PAGE yang telah diwarnai dengan CBBKeterangan :1. RSB2. Marker3. Ikan (non presipitasi)4. Bayam (non presipitasi)5. Hepar (non presipitasi)6. E.coli kel 5 (non presipitasi)7. E.coli kel 6 (non presipitasi)8. Ikan (presipitasi)9. Bayam (presipitasi)10. Hepar (presipitasi)11. E.coli kel 5 (presipitasi)12. E.coli kel 6 (presipitasi)13. Serum (presipitasi)Gambar 5. Kurva standar Berat MolekulTabel 1. Tabel Kurva standar Berat Molekula b Rf BM Log BM0,5 5,4 0,092593 116 2,0644581,7 5,4 0,314815 66,2 1,8208582 5,4 0,37037 45 1,6532132,5 5,4 0,462963 35 1,5440683,5 5,4 0,648148 25 1,397944,5 5,4 0,833333 18,4 1,2648185,5 5,4 1,018519 14,4 1,158362Hasil pembuatan kurva standar berat molekul protein dapat digunakan sebagai patokan dalam pengukuran berat molekul protein sampel, didapatkan persamaan linier y = 0,145x + 2,141 dengan nilai R2 = 0.983. Berdasarkan R yang didapat dari persamaan dengan nilai mendekati 1 maka kurva tersebut dapat dijadikan standar baku penentuan berat molekul suatu sampel protein. Dengan menghitung nilai Rf menggunakan persamaan tersebut akan diperoleh berat molekul tiap sampel protein yang digunakan dalam praktikum. Sampel pada praktikum memiliki Berat molekul yang berbeda-beda, hanya pada sampel hepar hasil presipitasi dan non presipitasi yang mendekati dengan protein marker yaitu -galactosidase. Sedangkan sampel protein lain memiliki berat molekul yang jauh dari berat molekul marker. Jumlah protein terbanyak juga dimiliki oleh sampel hepar baik itu hasil presipitasi atau non presipitasi, jumlah protein yang terdapat tiap sampel berbeda-beda tergantung dari kadar protein yang terkandung oleh tiap sampel dan juga teknik isolasi protein yang dilakukan. Keberadaan jenis protein yang terdapat pada sampel dilihat dari band protein yang muncul dari gel, Nampak pada gel terdapat pita yang tebal dan tipis yang dipengaruhi oleh bentuk dan ukuran dari protein-protein tersebut, selain itu juga dapat diakibatkan adanya smear. Band protein nampak dari sampel protein yang berasal dari presipitasi dan non presipitasi menunjukkan perbedaan cukup signifikan, pada sampel protein non presipitasi memiliki jenis protein yang lebih banyak dari pada protein hasil presipitasi, hal ini karena protein hasil presipitasi berupa protein-protein yang spesifik akibat adanya presipitasi jadi hanya protein tertentu saja yang masih terdapat didalam sampel yang dapat dianalisis, sedangkan protein non presipitasi yang masih berupa protein campuran sehingga band protein yang nampak juga lebih banyak.BAB VPENUTUP5.1 KesimpulanKesimpulan yang didapatkan dari praktikum kali ini yaitu metode yang tepat dalam melakukan separasi protein dengan teknik SDS PAGE yaitu dilakukan pada gel poliakrilamid yang kemudian dilakukan visualisasi dengan larutan staining CBB. Hasil pengukuran kadar protein pada protein didapatkan sampel hepar memiliki kadar protein tertinggi, sampel protein hasil presipitasi memiliki jenis protein yang lebih sedikit daripada protein non presipitasi. Jenis protein yang ditemukan dalam praktikum yaitu -galactosidase dengan berat molekul yang berkisar sekitar 116,0 kDa yang terdapat pada sampel hepar hasil presipitasi dan non presipitasi.5.2 SaranSaran yang dapat diberikan guna perbaikan praktikum dan menjadikan praktikum selanjutnya lebih baik adalah agar diperhatikan urutan metode yang ada dan ketepatan mengambil larutan sehingga hasil dan data yang diperoleh lebih akurat.DAFTAR PUSTAKADavidson. 2001. SDS PAGE.http://www.bio.davidson.edu/COURSES/GENOMICS/method/SDSPAGE/SDSPAGE.html. Diakses tanggal 04 Mei 2009.Janson, J.C, L.Ryden. 1998. Protein Purification Principles, High-Resolution Methods and Applications. Second Edition. John Wiley & Sons, Inc. CanadaMissouri University. 2002. Acrylamide gel protein detection methods.http://proteomics.missouri.edu/protocols/proteinDetection.html. Diakses tanggal 24 Mei 2009.Molekular station. 2008. Role of SDS in SDS-PAGE Gel Electrophoresis.http://www.molecularstation.com/sds-page-gel -electrophoresis/. Diakses tanggal 04 Mei 2009.Sudarmanto, Arie. 2008. Protein.http://ariebs.staff.ugm.ac.id. html. Diakses tanggal 05 April 2009.Williams. 2001. SDS PAGE Gel Elektrophoresis.http://web. chemistry .gatech.edu/~williams/bCourse_Information/4581/techniques/gel_elect/page_protein.html. Diakses tanggal 04 Mei 2009.Wordpress. 2009. Tertiary.http://uth3.files. wordpress. Com /2008/10/tertiary.jpg. Tanggal akses 5 April 2009.