Amplifikasi DNA Leptospira dengan Menggunakan Metode...

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

Amplifikasi DNA Leptospira dengan Menggunakan

Metode Insulated Isothermal Polymerase Chain Reaction

(ii-PCR)

SKRIPSI

SONIA ZULFA DESHI DANUZ

NIM. 109102000023

PROGRAM STUDI FARMASI

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN

UNIVERSITAS ISLAM NEGERI SYARIF HIDAYATULLAH

JAKARTA

JANUARI 2014

ii

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

Amplifikasi DNA Leptospira dengan Menggunakan


(ii-PCR)

SKRIPSI

Diajukan sebagai salah satu syarat memperoleh gelar Sarjana Farmasi

SONIA ZULFA DESHI DANUZ

NIM. 109102000023

PROGRAM STUDI FARMASI

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN

UNIVERSITAS ISLAM NEGERI SYARIF HIDAYATULLAH

JAKARTA

JANUARI 2014

iii

HALAMAN PERNYATAAN ORISINALITAS

Skripsi ini adalah hasil karya saya sendiri,

dan semua sumber baik yang dikutip, maupun dirujuk

telah saya nyatakan benar

Nama : Sonia Zulfa Deshi Danuz

NIM : 109102000023

Tanda Tangan :

Tanggal : Januari 2014

vi

ABSTRAK

Nama : Sonia Zulfa D

Program Studi : Farmasi

Judul : Amplifikasi DNA Leptospira dengan Menggunakan


(ii-PCR)

Leptospira merupakan bakteri patogen penyebab penyakit leptospirosis yang

banyak menimbulkan masalah infeksi serius dan dapat mengakibatkan

kematian pada manusia. Penelitian ini dilakukan untuk mengetahui metode

Insulated Isothermal Polymerase Chain Reaction (ii-PCR) dapat digunakan

untuk mengamplifikasi DNA Leptospira. Keunggulan penggunaan metode ii-

PCR dalam deteksi Leptospira adalah waktu pendeteksian lebih singkat dan

lebih mudah dalam pembacaan hasil. DNA Leptospira diamplifikasi dengan

menggunakan sepasang primer spesifik DNA Leptospira pada daerah 16S

Ribosomal RNA. Primer spesifik Leptospira mampu mengamplifikasi DNA

Leptospira sampai konsentrasi 0,002 ng/ 25µL dan amplifikasi DNA

Leptospira dengan metode ii-PCR yang menggunakan DNA Leptospira,

primer, dan probe spesifik menunjukkan rasio S/N 1,8062 dan memberikan

hasil positif dalam waktu 58 menit bila dibandingkan dengan metode PCR

konvensional yang membutuhkan waktu 150 menit dan diperlukan analisa

dengan gel elektroforesis.

Kata kunci : Leptospirosis, Leptospira, ii-PCR.

vii

ABSTRACT

Nama : Sonia Zulfa D


Judul : Amplification of Leptospira DNA using Insulated

Isothermal Polymerase Chain Reaction (ii-PCR)

Leptospira is a pathogen bacteria causing leptospirosis disease which could inflict

a serious infection problem and lead to human death. This study was conducted to

find out whether Insulated Isothermal Polymerase Chain Reaction could be used

to amplify Leptospira DNA. The excellences of iiPCR method in detecting

Leptospira are that it has short detection time and it is user friendly. Leptospira

DNA was amplified using a specific Leptospira DNA primer on 16S Ribosomal

RNA region. The specific Leptospira primer could amplify Leptospira until the

concentration of 0,002 ng/ 25µL and Leptospira DNA amplification with iiPCR

method using Leptospira DNA, spesific primer and probe showed a S/N ratio of

1,8062 and a positive result in 58 minutes, compared to PCR conventional method

that required 150 minutes and a further analysis using electrophoresis gel.

Key Words : Leptospirosis, Leptospira, ii-PCR

viii

KATA PENGANTAR

Puji dan syukur kepada Allah SWT, karena atas berkat rahmat dan hidayah-

Nya penulis dapat menyelesaikan tugas pembuatan skripsi yang berjudul

Amplifikasi DNA Leptospira dengan Menggunakan Metode Insulated

Isothermal Polymerase Chain Reaction (ii-PCR). Shalawat serta salam

tercurahkan kepada Nabi besar Muhammad SAW, yang telah menghantarkan kita

dari zaman kebodohan hingga menuju zaman yang syarat ilmu dan pengetahuan.

Penulis menyadari bahwa dalam menyelesaikan penulisan skripsi ini,

penulis mengalami berbagai kendala dan halangan yang tidak bisa dihindarkan,

karena itu penulis menyadari bahwa penulisan skripsi ini masih sangat jauh dari

kesempurnaan, untuk itu penulis mengharapkan saran, masukan, dan kritik positif

yang dapat membangun diri penulis.

Penulis menyadari sepenuhnya bahwa penulisan skripsi ini tersusun berkat

bantuan, bimbingan, dan dorongan dari berbagai pihak yang terkait. Untuk itu

pada kesempatan ini penulis menyampaikan ucapan terimakasih kepada:

1. Ibu Zilhadia M. Si., Apt, selaku pembimbing I dan Bapak DR. Wahyu

Pubowasito selaku pembimbing II yang telah memberikan waktu, semangat,

ilmu, dan bimbingan selama penulisan skripsi ini.

2. Balai Besar Penelitian Vektor dan Reservoir Penyakit Salatiga yang telah

bersedia memberikan DNA Leptospira yang sudah terisolasi kepada penulis.

3. Bapak Prof. DR. (hc) dr. M. K Tadjudin Sp. And, selaku Dekan Fakultas

Kedokteran dan Ilmu Kesehatan UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.

4. Bapak Drs. Umar Mansur M.Sc., Apt, selaku Ketua Program Studi Farmasi

FKIK UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.

5. Kepada ibu Yuni Anggraeni, S.Si., Apt selaku penasehat akademik Program

Studi Farmasi FKIK UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.

6. Bapak dan Ibu staf pengajar dan karyawan yang telah memberikan

bimbingan dan bantuan selama saya menempuh pendidikan di Program

Studi Farmasi FKIK UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.

ix

7. Kedua orang tuaku, Papa tercinta A. Nuzirwan H. M dan Mama tersayang

Sri Hidayati yang selalu memberikan kasih sayang, doa yang tidak pernah

putus, dan dukungan baik moril maupun meteril. Tiada apapun di dunia ini

yang dapat membalas semua kebaikan, cinta, dan kasih sayang yang telah

kalian berikan.

8. Untuk kedua adikku tersayang Tiffany Dwi Putri dan Nabila Ramadania

meskipun tidak terjun langsung dalam penulisan skripsi ini, tetapi tawa dan

candamu adalah semangatku.

9. Kak Yopi, Teh Leha, dan Bu Rahma yang sangat membantu penulis

memahami hal-hal sulit dalam bioteknologi.

10. Para staf dan karyawan BPPT yang telah banyak membantu penulis.

11. Kepada teman seperjuangan Evira Vivikananda, Sofiana Fajriah Rahmah,

dan Rahmat Azhari Kemal terima kasih untuk tawa, semangat, kesabaran,

saran, dan kritiknya.

12. Kepada teman-teman Farmasi angkatan 2009, terima kasih untuk

kebersamaan, dukungan, saran, dan kritiknya.

13. Teman-teman yang dengan senang hati menemani cerita suka dan duka

selama penelitian, Mbak Ily, Kak Dede, Mas Herman, Angel, Isna, Hami,

Hani, Ziah, Mimil, Mumut, dan Bella. Terima kasih untuk selalu menemani

mendukung, mendengarkan ceritaku, dan mendoakanku.

14. Serta semua pihak yang tidak dapat disebutkan satu persatu yang turut

membantu menyelesaikan skripsi ini.

Semoga apa yang kalian berikan dapat bermanfaat dan dibalas oleh Allah

SWT, amin. Penulis berharap bahwa tugas ini dapat bermanfaat khususnya

bagi penulis dan umumnya bagi para pembaca.

Jakarta, Januari 2014

Penulis

x

HALAMAN PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI

TUGAS AKHIR UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS

Sebagai sivitas akademik Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah

Jakarta, saya yang bertanda tangan di bawah ini :

Nama : Sonia Zulfa Deshi Danuz

NIM : 109102000023


Fakultas : Kedokteran dan Ilmu Kesehatan

Jenis Karya : Skripsi

Demi perkembangan ilmu pengetahuan, saya menyetujui skripsi/ karya ilmiah

saya dengan judul :

Amplifikasi DNA Leptospira dengan Menggunakan Metode Insulated

Isothermal Polymerase Chain Reaction (ii-PCR)

Untuk dipublikasikan atau ditampilkan di internet atau suatu media lain yaitu

Digital Library Perpustakaan Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah

Jakarta untuk kepentingan akademik sebatas sesuai dengan Undang-Undang Hak

Cipta.

Demikian pernyataan persetujuan publikasi karya ilmiah ini saya buat dengan

sebenarnya.

Dibuat di : Jakarta

Pada Tanggal : 15 Januari 2014

Yang Menyatakan,

( Sonia Zulfa Deshi Danuz )

xi

DAFTAR ISI

Halaman

HALAMAN JUDUL ............................................................................... ii

HALAMAN PERNYATAAN ORISINALITAS ................................... iii

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING .................................... iv

LEMBAR PENGESAHAN SKRIPSI .................................................... v

ABSTRAK ................................................................................................ vi

ABSTRACT .............................................................................................. vii

KATA PENGANTAR .............................................................................. viii

HALAMAN PERSETUJUAN PUBLIKASI TUGAS AKHIR ............ x

DAFTAR ISI ............................................................................................. xi

DAFTAR TABEL .................................................................................... xiii

DAFTAR GAMBAR ................................................................................ xiv

DAFTAR LAMPIRAN ............................................................................ xv

DAFTAR ISTILAH ................................................................................. xvi

BAB 1 PENDAHULUAN ...................................................................... 1

1.1 Latar Belakang ...................................................................... 1

1.2 Rumusan Masalah ................................................................. 3

1.3 Tujuan Penelitian .................................................................. 3

1.4 Manfaat Penelitian ................................................................ 3

BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA ............................................................. 4

2.1 Leptospirosis ......................................................................... 4

2.1.1 Pengertian Leptospirosis ........................................... 4

2.1.2 Epidemiologi ............................................................. 4

2.1.3 Cara Penularan Leptospirosis .................................... 4

2.1.4 Leptospira ................................................................. 5

2.1.4.1 Morfologi ...................................................... 5

2.1.4.2 Klasifikasi ..................................................... 5

2.1.5 Patofisiologi .............................................................. 6

2.1.6 Pemeriksaan Laboratorium ....................................... 7

2.2 DNA ...................................................................................... 10

2.2.1 Struktur DNA dan Sifat Kimia DNA ........................ 10

2.2.2 Isolasi DNA ............................................................... 12

2.3 Polymerasse Chain Reaction (PCR) .................................... 12

2.3.1 Komponen PCR ......................................................... 12

2.3.2 Tahapan PCR ............................................................ 15

2.4 Elektroforesis Gel Agarosa .................................................... 16

2.5 Insulated Isothermal Polymerase Chain Reaction (ii-PCR) .. 18

BAB 3 METODOLOGI PENELITIAN ................................................ 21

3.1 Waktu dan Tempat Penelitian ............................................... 21

3.2 Alat dan Bahan ...................................................................... 21

3.2.1 Alat ............................................................................ 21

xii

3.2.2 Bahan ........................................................................ 22

3.3 Tahapan Penelitian ................................................................ 22

3.4 Prosedur Kerja ...................................................................... 22

3.4.1 Persiapan Media Tumbuh E.coli ............................... 22

3.4.2 Peremajaan E.coli ...................................................... 23

3.4.3 Isolasi DNA E.coli .................................................... 23

3.4.4 Pembuatan Gel Agarosa dan Elektroforesis ............. 23

3.4.4.1 Pembuatan Gel Agarosa 1% ......................... 23

3.4.4.2 Elektroforesis ................................................ 24

3.4.5 Gel Documentation ................................................... 24

3.4.6 Amplifikasi PCR ....................................................... 24

3.4.7 Uji Spesifitas Primer ................................................. 24

3.4.8 Uji Sensitivitas Primer .............................................. 25

3.5 Insulated Isothermal PCR (ii-PCR) ...................................... 25

3.4.5 Amplifikasi Insulated Isothermal PCR (ii-PCR) ....... 25

3.6 Alur Penelitian ...................................................................... 26

BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN .................................................. 27

4.1 Isolasi DNA ........................................................................... 27

4.2 Polymerase Chain Reaction (PCR) ...................................... 30

4.2 Insulated Isothermal Polymerase Chain Reaction (ii-PCR) .. 32

BAB 5 KESIMPULAN DAN SARAN ................................................... 37

5.1 Kesimpulan ........................................................................... 37

5.2 Saran ..................................................................................... 37

DAFTAR PUSTAKA ............................................................................... 38

LAMPIRAN .............................................................................................. 42

xiii

DAFTAR TABEL

Halaman

Tabel 1 Ukuran Pemisahan Molekul DNA ............................................. 17

Tabel 2 Hasil Konsentrasi dan Kemurnian DNA Leptospira dan

E.coli ........................................................................................... 43

Tabel 3 Campuran Reaksi Master Mix PCR Konvensional ................... 45

Tabel 4 Campuran Reaksi Master Mix dengan KAPA2G™ Robust

PCR Kit dengan ii-buffer .......................................................... 46

Tabel 5 Campuran Reaksi Master Mix dengan KAPA2G™ Robust

PCR Kit dengan buffer kit ......................................................... 46

Tabel 6 Campuran Reaksi Master Mix Thermo Scientific™ Long PCR

Master Mix dengan ii-buffer ....................................................... 47

Tabel 7 Campuran Reaksi Master Mix Thermo Scientific™ Long PCR

Master Mix dengan buffer kit ..................................................... 47

Tabel 8 Nilai rasio S/N pada sampel hasil reaksi ii-PCR ....................... 48

xiv

DAFTAR GAMBAR

Halaman

1. Sel Leptospira dengan mikroskop elektron .......................................... 5

2. Klasifikasi Leptospirosis ...................................................................... 6

3. Arah khas Perkembangan Penyakit Leptospirosis ............................... 7

4. Struktur double helix DNA ................................................................... 11

5. Siklus PCR .......................................................................................... 16

6. Reaksi ii-PCR ....................................................................................... 19

7. Hasil Elektroforesis Isolasi Genom Leptospira dan E.coli .................. 30

8. Hasil Elektroforesis Produk PCR Menggunakan Primer Leptospira

Pada Uji Spesifitas Primer ................................................................... 31

9. Hasil Elektroforesis Produk PCR dengan Menggunakan Primer

Spesifik DNA Leptospira pada Uji Sensitivitas Primer ...................... 32

10. Hasil Reaksi ii-PCR dengan Taq DNA Polimerase Thermo

Scientific™ Long PCR Enzyme Mix ................................................... 34

11. Hasil Reaksi ii-PCR dengan Taq DNA Polimerase KAPA2G™

Robust PCR Kit .................................................................................... 34

12. Hasil Elektroforesis Produk ii-PCR ...................................................... 35

13. Hasil Peremajaan E.coli ....................................................................... 42

14. DNA Leptospira yang Sudah Terisolasi .............................................. 42

xv

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

1. Hasil Peremajaan E.coli dan DNA Leptospira yang Sudah

Terisolasi ............................................................................................... 42

2. Hasil Konsentrasi dan Kemurnian DNA Leptospira dan DNA

E.coli .................................................................................................... 43

3. Membuat Larutan Induk Primer dan Probe .......................................... 44

4. Campuran Reaksi Master Mix Untuk Amplifikasi DNA Untuk PCR

Konvensional ....................................................................................... 45

5. Campuran Reaksi Master Mix Untuk Amplifikasi DNA Untuk

ii-PCR ................................................................................................... 46

6. Rasio S/N pada Sampel Hasil Reaksi ii-PCR ...................................... 48

xvi

DAFTAR ISTILAH

CDV : Canine Distemper Virus

CFR : Case Fatality Rate

CFS : Cerebrospinal Fluid

CTAB : Cetyltrimetyl Ammonium Bromide

DNA : Deoxyribose-Nucleic Acid

dNTP : Deoxynucleotide Triphosphate

EDTA : Ethylene Diamine Tetra Acetic Acid

ELISA : Enzyme-Linked Immunosorbent Assay

IHHNV : Infectious Hypodermal and Hematopoetic

Necroses Virus

ii-PCR : Insulated Isothermal Polymerase Chain Reaction

LB : Luria Bertani

MAT : Microscopic Agglutination Test

PCI : Fenol-Kloroform-Isoamilalkohol

PCR : Polymerase Chain Reaction

RNA : Ribose-Nucleic Acid

SDS : Sodium Dodecyl Sulfate

TAE : Tris Acetate EDTA

TE : Tris-EDTA

WSSV : White Spot Syndrome Virus

1 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

BAB 1

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Perubahan lingkungan yang terjadi pasca banjir menyebabkan banyak

terdapat genangan air kotor dan sampah. Lingkungan yang kotor tersebut

menyebabkan sarang penyakit yang kerap muncul setelah musibah banjir dan

salah satu penyakit yang dapat terjadi pasca banjir adalah Leptospirosis (Ernawati,

2008). Leptospirosis adalah penyakit infeksi yang disebabkan oleh bakteri

patogenik yang disebut Leptospira yang ditularkan secara langsung atau tidak

langsung dari hewan ke manusia. Penularan yang terjadi dari hewan ke manusia

ini di sebut zoonosis (WHO, 2003).

Penyebaran Leptospirosis terjadi di seluruh dunia tetapi umumnya di area

tropis atau subtropis dengan curah hujan tinggi seperti di Nikaragua, Brazil, India,

Asia Tenggara, Malaysia, dan Amerika Serikat (WHO, 2003; Zavitsanou dan

Babatsikou, 2008; Tilahun, Reta dan Simenew, 2013). International Leptospirosis

Society (2001) menyatakan bahwa Indonesia merupakan negara dengan kejadian

Leptospirosis tinggi dan menempati peringkat ke-3 di dunia untuk mortalitas

(16,7%) setelah Uruguay dan India (Ernawati, 2008).

Pada tahun 2010 kasus Leptospirosis meningkat dibandingkan tahun 2009,

yaitu dari 335 kasus menjadi 409 kasus. Tahun 2010 kasus dilaporkan dari 6

provinsi sedangkan pada tahun sebelumnya hanya dilaporkan dari 3 provinsi.

Kasus terbanyak pada tahun 2009 dan 2010 dilaporkan dari Jawa Tengah dan DI

Yogyakarta. Pada tahun 2007 terdapat 664 kasus dengan 55 orang meninggal

(CFR: 8,28%), tahun 2008 terdapat 426 kasus dengan 22 orang meninggal (CFR:

5,16%), tahun 2009 terdapat 335 kasus dengan 23 orang meninggal (CFR:

6,87%), dan tahun 2010 ditemukan 409 kasus dengan 43 orang meninggal (CFR:

10,51%) (Anonim, 2011).

Diagnosis klinis sulit karena gejala klinik bervariasi dan tidak spesifik.

Leptospirosis sering salah didiagnosis sebagai meningitis aseptik, influenza,

penyakit hati atau demam yang tidak diketahui sebabnya (WHO, 2003; Faine. S,

1982). Oleh karena itu diagnosis tidak hanya didasarkan pada gejala klinik saja.

2

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

Diperlukan metode pemeriksaan lain yang dapat memberikan hasil pasti dan tepat

dari penderita yang menderita Leptospirosis. Metode pemeriksaan yang biasanya

digunakan didasarkan pada serum antibodi dengan uji serologis seperti uji

enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) atau microscopic agglutination test

(MAT) (Faine. S, 1982). Sedangkan pada manusia, uji ELISA dan MAT

menunggu sampai titer antibodi penderita dapat terdeteksi. Titer antibodi dapat

terdeteksi sekitar hari ketujuh sejak gejala timbul dan akibat dari timbulnya reaksi

antibodi ini, Leptospira akan hilang dari darah setelah sekitar 10 hari sakit. Di

tahap ini, beberapa bakteri mungkin telah berada dalam tubulus ginjal. (Bal, dkk.,

1994).

Pemeriksaan laboratorium sangat perlu untuk menegakkan diagnosis

penyakit Leptospirosis secara dini. Oleh karena itu diperlukan pemeriksaan

terhadap penyakit Leptospirosis yang cepat dan tepat dengan spesifitas dan

sensitivitas yang tinggi (WHO, 2003).

PCR (Polymerase Chain Reaction) merupakan alat yang sering digunakan

dalam aplikasi medis dan biologi termasuk tes genetik, deteksi, dan diagnosis

penyakit menular (Anonim, 2012). PCR adalah metode yang sensitif, spesifik, dan

teknik cepat yang telah berhasil diterapkan untuk mendeteksi beberapa

mikroorganisme dan virus dalam berbagai spesimen, termasuk sputum, serum,

cairan serebrospinal, urin, feses, dan berbagai jaringan tubuh (Bal, dkk., 1994)

dan metode ini dapat memberikan hasil positif pada fase dini penyakit sebelum

titer antibodi dapat dideteksi (Setiawan, 2008).

Meskipun metode PCR dapat memberikan hasil yang sensitif dan spesifik,

metode ini memerlukan analisa hasil reaksi lebih lanjut dengan menggunakan gel

elektroforesis yang membutuhkan waktu dan tenaga ahli khusus dalam

pembacaan hasil analisa (Kumari 2007; Setiawan 2008). Oleh karena itu

diperlukan metode pemeriksaan lain dengan waktu yang lebih singkat dan mudah

dalam pembacaan hasil analisa.

Metode pemeriksaan laboratorium yang akan dikembangkan adalah

dengan menggunakan ii-PCR (Insulated Isothermal Polymerase Chain Reaction).

Sejauh ini penelitian yang berkaitan dengan ii-PCR baru sebatas untuk deteksi

beberapa virus dan bakteri saja, di antaranya WSSV, IHHNV, CDV, Influenza A,

3


Avian Influenza H5, dan Salmonella spp (Anonim, 2012; Tsai, dkk., 2012) dan

pada penelitian ini, metode ii-PCR akan digunakan untuk mendeteksi DNA

Leptospira.

Insulated isithernal Polymerase Chain Reaction (ii-PCR) menggunakan

fenomena konveksi termal untuk menjalankan reaksi PCR di sebuah tube yang

telah didesain secara khusus di dalam chamber ii-PCR, yang merupakan alat PCR

konvektif dengan satu sumber panas. Ketika pemanasan pada suhu 95oC

diaplikasikan pada bagian bawah R-tube, gradien temperatur akan terbentuk,

dimana reaksi PCR berjalan mengikuti arus konveksi cairan. Karena hanya

menggunakan satu sumber panas dalam menjalankan reaksi ii-PCR tanpa perlu

mengatur perubahan suhu seperti pada PCR konvensional, alat ii-PCR hanya

memerlukan waktu yang singkat dalam proses reaksi PCR dibandingkan dengan

PCR konvensional. Alat ini juga tidak memerlukan analisa lebih lanjut dengan gel

elektroforesis karena hasil sudah terlihat pada layar touch panel dengan tanda “+”

dan “-“ (Setiawan, 2008; Anonim, 2012).

1.2 Rumusan Masalah

Apakah metode Insulated Isothermal Polymerase Chain Reaction (ii-PCR)

dapat digunakan untuk mengamplifikasi DNA Leptospira ?

1.3 Tujuan Penelitian

Mengetahui metode Insulated Isothermal Polymerase Chain Reaction (ii-

PCR) dapat digunakan untuk mengamplifikasi DNA Leptospira.

1.4 Manfaat Penelitian

Manfaat dari penelitian ini adalah memberikan informasi mengenai

metode alternatif dalam penggunaan teknologi PCR untuk mendeteksi

Leptospirosis.


BAB 2

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Leptospirosis

2.1.1 Pengertian Leptospirosis

Leptospirosis adalah penyakit infeksi yang disebabkan bakteri patogen

yang disebut Leptospira yang ditularkan secara langsung atau tidak langsung dari

hewan ke manusia. Penularan yang terjadi dari hewan ke manusia ini disebut

zoonosis (WHO, 2003).

2.1.2 Epidemiologi

Leptospirosis dapat ditemukan diseluruh dunia, daerah rasio tinggi adalah

kepulauan Karibia, Amerika Tengah dan Selatan, Asia Tenggara dan Kepulauan

Pasifik (Setadi dkk, 2001)

Di negara beriklim tropik kejadian Leptospirosis lebih banyak 1000 kali

dibandingkan dengan negara subtropik dengan resiko penyakit lebih berat (Bovet

dkk., 1999). Leptospirosis tersebar baik di Indonesia maupun di luar Indonesia

(Thornley dkk., 2001).

2.1.3 Cara Penularan Leptospirosis

Penularan Leptospirosis pada manusia ditularkan oleh hewan yang

terinfeksi kuman Leptospira. Hewan penjamu kuman Leptospira adalah hewan

peliharaan, seperti babi, lembu, kambing, kucing, anjing, serta beberapa hewan

liar, seperti tikus, bajing, ular, dan lain-lain (Ernawati, 2008).

Manusia terinfeksi Leptospira melalui kontak dengan air, tanah (lumpur),

tanaman yang telah dikotori oleh air seni dari hewan-hewan penderita

Leptospirosis. Bakteri Leptospira masuk ke dalam tubuh melalui selaput lendir

(mukosa) mata, hidung atau kulit yang lecet dan kadang-kadang melalui saluran

pencernaan dari makanan yang terkontaminasi oleh urin tikus yang terinfeksi

Leptospira. Penularan langsung dari manusia ke manusia jarang terjadi. Penularan

Leptospira dapat secara langsung dan tidak langsung. Penularan secara langsung

melalui darah, urin , cairan tubuh, hewan maupun manusia yang telah terinfeksi

5


Leptospira. Sedangkan penularan secara tidak langsung melalui genangan air,

sungai, danau, selokan saluran air dan lumpur yang tercemar urin hewan

(Ernawati, 2008; Riyaningsih dkk., 2012).

2.1.4 Leptospira

2.1.4.1 Morfologi

“Leptospira” berasal dari bahasa Yunani leptos (tipis) dan Latin Leptospira

(melingkar). Leptospira berdiameter hanya 0,1 m dengan panjang 6-20 m. Sel-

selnya meruncing di kedua sisinya, satu atau keduanya yang biasanya bengkok

dengan karakteristik pengait (Gambar 1) (Levett, 2001).

Gambar 1. Sel Leptospira dengan mikroskop elektron (perbesaran

60.000 x) (Levett, 2001).

2.1.4.2 Klasifikasi

Famili Leptospiraceae hanya terdiri dari tiga genera yaitu : Leptonema,

Turmeria, dan Leptospira. Genus Leptospira terdiri dari 10 genomospecies dan

yang paling penting adalah L.interrogens merupakan kelompok patogenik dan

L.biflexa merupakan kelompok non patogen. Masing-masing genomospecies

dibagi lagi menjadi 23 serogrup yang di dalamnya terdapat serovar yang memiliki

hubungan antigenik (Collins, 2006).

6


Gambar 2. Klasifikasi Leptospirosis (Collins, 2006)

2.1.5 Patofisiologi

Infeksi Leptospira menghasilkan manifestasi klinis dengan spektrum yang

lebar (Collins, 2006). Masa inkubasi biasanya 5-14 hari, dengan kisaran 2-30 hari

(WHO, 2003). Secara umum Leptospirosis bersifat bifasik, dengan fase

septikemia akut diikuti oleh fase imun (Gambar 3) (Collins, 2006).

Fase Septikemia

Fase septikemia, yang berlangsung sekitar empat sampai tujuh hari, ditandai

dengan tiba-tiba demam, sakit kepala hebat, nyeri otot, dan mual. Bakteri dapat

diisolasi dari kultur darah, cairan serebrospinal (CFS) dan sebagian besar jaringan.

Sekitar 90% pasien menderita anikterik ringan (yaitu tanpa jaundice) bentuk dari

penyakit, sementara 5-10% menderita lebih parah dari jaundice, gagal ginjal dan

manifestasi perdarahan, biasa dikenal dengan penyakit Weil.

Interfase

Selama periode satu sampai tiga hari peningkatan mengikuti tahap pertama,

suhu tubuh turun drastis dan pasien mungkin menjadi afebrile dan dengan gejala

yang berbeda. Demam kemudian terulang, mengindikasikan onset dari tahap

kedua.

7


Fase Imun

Fase imun berlangsung sebagai konsekuensi dari respon imun tubuh terhadap

infeksi, dan berlangsung sampai 30 hari atau lebih. Dimanifestasi oleh demam

dengan durasi yang pendek dan keterlibatan sistem saraf pusat (meningitis).

Gambar 3. Arah khas Perkembangan Penyakit Leptospirosis (Collins, 2006)

2.1.6 Pemeriksaan Laboratorium

Pemeriksaan laboratorium yang dilakukan pada penderita Leptospirosis

dapat dibagi menjadi pemeriksaan laboratorium yang bersifat umum dan

pemeriksaan laboratorium spesifik.

1. Pemeriksaan Laboratorium Klinik Umum

Pemeriksaan laboratorium klinik umum memberikan hasil berbeda antara

Leptospirosis yang ringan dan berat. Hasil pemeriksaan laboratorium penderita

dengan gejala Leptospirosis berat memperlihatkan kelainan hasil laboratorium

yang sangat jelas. Pemeriksaan laboratorium klinik didasarkan dari gejala-gejala

yang timbul, seperti mialgia hebat, demam, gangguan ginjal, dan lain-lain

(Setiawan, 2008; Setadi dkk., 2001).

2. Pemeriksaan Laboratorium Spesifik

2.a Pemeriksaan Bakteri

2.a.1 Pemeriksaan bakteri secara langsung dengan mikroskop

8


Leptospira dari spesimen klinik dilihat secara langsung menggunakan

mikroskop lapangan gelap atau menggunakan mikroskop cahaya setelah

preparat dicat dengan pewarnaan yang sesuai (Levet dkk., 2001). Leptospira

tampak sebagai organisme bergerak cepat, berbentuk spiral pegas yang

kurus, umumnya ditemukan dalam biakan, darah, dan urin (WHO, 2003).

Keuntungan pemeriksaan ini dapat digunakan untuk mengamati

Leptospira dalam biakan, terutama bila bakteri dalam jumlah banyak dan

untuk mengamati aglutinasi pada pemeriksaan MAT. Kelemahannya,

memerlukan tenaga ahli berpengalaman. Bila jumlah sedikit, Leptospira

sulit ditemukan (WHO, 2003).

2.b Pemeriksaan Serologis

Sebagian besar kasus Leptospirosis didiagnosa dengan tes serologi.

Antibodi dapat dideteksi di dalam darah 5-7 hari sesudah munculnya gejala.

Ada banyak metode serologis yang dapat digunakan dan yang dianggap

paling baik sampai saat ini adalah microscopic agglutination test (MAT)

(Setiawan, 2008).

2.b.1 Microscopic Agglutination Test (MAT)

Microscopic agglutination test (MAT) adalah tes untuk menentukan

antibodi aglutinasi di dalam serum penderita. Cara melakukan tes adalah

serum penderita direaksikan dengan suspensi antigen serovar Leptospira

hidup atau mati. Setelah diinkubasi, reaksi antigen-antibodi diperiksa di

bawah mikroskop lapangan gelap untuk melihat aglutinasi. Yang dipakai

batas akhir (end point) pengenceran adalah pengenceran serum tertinggi

yang memperlihatkan 50% aglutinasi (WHO, 2003). Metode ini dipakai

sebagai metode referensi untuk mengembangkan teknik lain dengan

membandingkan sensitivitas, spesifitas dan akurasi. MAT sering mengalami

beberapa kendala terutama di negara yang sedang berkembang, karena

memerlukan banyak jenis serovar dan tenaga ahli berpengalaman

(Saengjaruk dkk., 2002).

Kelebihan metode ini dapat dipakai untuk serosurvei epidemiologi dan

antigen yang dipakai dapat ditambah atau dikurangi sesuai dengan

kebutuhan. Sedangkan kelemahan metode MAT sangat rumit terutama saat

9


pengawasan, pelaksanaan, dan penilaian hasil. Seluruh biakan serovar hidup

harus dipelihara dengan baik. Perlakuan terhadap tes menggunakan

Leptospira hidup maupun mati harus sama. Memelihara biakan Leptospira

di dalam laboratorium cukup berbahaya bagi para petugas. Disamping itu,

sering terjadi kontaminasi silang antara serovar, sehingga perlu dilakukan

verifikasi serovar secara berkala (Levett dkk., 2001; WHO, 2003).

2.b.2 Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)

Tes ELISA sangat popular dan bahan yang diperlukan untuk

pemeriksaan sudah tersedia secara komersial dengan antigen yang

diproduksi sendiri (in house). Untuk mendeteksi IgM umumnya

menggunakan antigen spesifik genus yang bereaksi secara luas, teknik ini

kadang-kadang juga digunakan untuk mendeteksi antibodi IgG. Adanya

antibodi IgM merupakan pertanda adanya infeksi baru Leptospira atau

infeksi yang terjadi beberapa minggu terakhir (WHO, 2003).

Kelebihan test ELISA ini cukup sensitif untuk mendeteksi Leptospira

dengan cepat pada fase akut dan lebih sensitif dibandingkan dengan MAT.

Sedangkan kekurangan tes ini adalah waktu diagnosis yang dibutuhkan

cukup lama, menunggu sampai titer antibodi dapat dideteksi (WHO, 2003).

3. Pemeriksaan Molekuler

3.a Teknologi PCR

Metode ini sangat berguna untuk mendiagnosis Leptospirosis terutama

pada fase permulaan penyakit Leptospira beberapa hari setelah munculnya

gejala penyakit. Alat ini dapat mendeteksi Leptospira beberapa hari setelah

munculnya gejala penyakit. Akan tetapi alat ini belum tersedia secara luas

terutama di negara yang sedang berkembang (Yersin dkk., 1998).

Keterbatasan PCR adalah tidak mampu untuk mendeteksi jenis

serovar yang menginfeksi. Walaupun demikian PCR bermanfaat untuk

epidemiologi dan kesehatan masyarakat. Agar lebih bermanfaat, maka hasil

yang diperoleh dipotong dengan enzim restriksi endonuklease, kemudian

amplikon yang diperoleh disekuen langsung atau dianalisis dengan metode

konformasi untai tunggal (Natarajaseenivasan dkk., 2004).

10


Keuntungan pemeriksaan PCR adalah bila bakteri ada maka diagnosis

dapat dipastikan dengan cepat terutama pada fase dini penyakit sebelum

titer antibodi dapat dideteksi. Kelemahannya memerlukan peralatan dan

tenaga ahli khusus. Disamping itu, PCR dapat memberikan hasil positif

palsu, apabila terkontaminasi oleh DNA asing. Dia juga dapat memberikan

hasil negatif palsu, karena spesimen klinik yang diperiksa sering

mengandung inhibitor seperti heparin dan saponin (WHO, 2003).

2.2 DNA

2.2.1 Struktur DNA dan Sifat Kimia DNA

DNA dan RNA merupakan polimer linier (polinukleotida) yang tersusun

dari subunit atau monomer nukleotida. Komponen penyusun nukleotida terdiri

dari tiga jenis molekul, yaitu gula pentosa (deoksiribosa pada DNA atau ribosa

pada RNA), basa nitrogen, dan gugus fosfat (Gambar 4). Basa yang ditemukan

pada nukleotida adalah basa purin (adenin = A, guanin = G) dan basa pirimidin

(sitosin = C, timin = T, urasil = U). Monomer nukleotida mempunyai gugus

hidroksil pada posisi karbon 3’, gugus fosfat pada posisi karbon 5’ dan basa pada

posisi karbon 1’ molekul gula. Nukleotida satu dengan yang lainnya berikatan

melalui ikatan fosfodiester antara gugus 5’fosfat dengan gugus 3’hidroksil.

Struktur DNA mirip dengan struktur RNA. Perbedaan diantara keduanya terdapat

pada jenis gula dan basa pada monomernya serta jumlah untai penyusunnya. Pada

DNA, tidak terdapat gugus hidroksil pada posisi karbon 2’ dari molekul gula (2-

deoksiribosa) sementara pada RNA molekul gulanya adalah ribosa. Basa nitrogen

yang terdapat pada DNA adalah adenin, guanin, sitosin dan timin, sedangkan pada

RNA jenis basanya adalah adenin, sitosin, guanin dan urasil. RNA merupakan

polinukleotida yang membentuk satu rantai/untai sedangkan DNA merupakan

polinukleotida yang membentuk 2 untai (heliks ganda) (Gaffar, 2007).

Menurut Watson dan Crick DNA adalah untai ganda. Backbone dari

masing-masing untai adalah rantai dari ribosa (lima karbon gula) dan grup fosfat

yang memiliki basa nitrogen (A, T, C, dan G) ikatan hidrogen yang dibentuk oleh

pasangan basa (A-T dan C-G) bersama (Stone, 2004).

11


Struktur molekul DNA merupakan rantai heliks ganda yang memutar ke

kanan (Gambar 4). Kedua rantai polinukleotida memutar pada sumbu yang sama

dan bergabung satu dengan yang lainnya melalui ikatan hidrogen antara basa-

basanya. Basa guanin berpasangan dengan basa sitosin, sedangkan basa adenin

berpasangan dengan basa timin. Antara basa guanin dan basa sitosin terbentuk

tiga ikatan hidrogen, sedang antara basa adenin dan timin terbentuk dua ikatan

hidrogen. Sehingga dalam molekul DNA jumlah basa G akan selalu sama dengan

jumlah basa C, sedangkan jumlah basa A=T. Kemudian jumlah basa purin (A +

G) akan sama dengan jumlah basa pirimidin (C + T). Kedua untai DNA saling

berkomplementasi melalui basa penyusunnya dengan arah antiparalel (berlawanan

5’→ 3’ vs 3’→5’), ujung yang mengandung gugus fosfat bebas disebut ujung 5’

sedangkan pada ujung lainnya yang mengandung gugus hidroksil bebas disebut

ujung 3’. Kedua untai tersebut saling melilit satu sama lain membentuk struktur

heliks ganda. Gugus fosfat dan gula yang tersusun bergantian menjadi tulang

punggung (backbone) molekul DNA sementara pada bagian dalam terdapat basa

yang melekat pada molekul gula (Gaffar, 2007).

Gambar 4. Struktur double helix DNA (Purves dkk., 2003).

12


2.2.2 Isolasi DNA

Semua organisme disusun oleh sel yang mengandung elemen genetik yang

sama yaitu DNA yang terdapat dalam kromosom. Kromosom eukariot berbentuk

linear sedangkan kromosom prokariot berbentuk sirkular. Selain itu prokariot juga

mengandung satu atau lebih plasmid. Plasmid merupakan molekul DNA sirkular

dengan ukuran yang jauh lebih kecil dibanding kromosom (Gaffar, 2007).

Prinsipnya adalah memisahkan DNA kromosom atau DNA genom dari

komponen-komponen sel lain. Sumber DNA bisa dari tanaman, kultur

mikroorganise, atau sel manusia. Membran sel dilisis dengan menambahkan

detergen untuk membebaskan isinya, kemudian pada ekstrak sel tersebut

ditambahkan protease (yang berfungsi mendegradasi protein) dan RNase (yang

berfungsi untuk mendegradasi RNA), sehingga yang tinggal adalah DNA.

Selanjutnya ekstrak tersebut dipanaskan sampai suhu 90oC untuk menginaktifasi

enzim yang mendegradasi DNA (DNase). Larutan DNA kemudian di presipitasi

dengan etanol dan bisa dilarutkan lagi dengan air (Gaffar, 2007).

2.3 Polymerase Chain Reaction (PCR)

PCR adalah teknik cepat untuk mengamplifikasi fragmen DNA spesifik

secara in vitro dengan menggunakan 2 primer untai tunggal pendek. Dengan

teknik ini sejumlah kecil fragmen DNA yang diinginkan akan diamplifikasi secara

eksponensial sampai jutaan kali dalam beberapa jam (Sulistyaningsih, 2007;

Gaffar, 2007).

PCR melibatkan banyak siklus yang masing-masing terdiri dari tiga tahap

berurutan, yaitu pemisahan (denaturasi) rantai DNA template, penempelan

(annealing) pasangan primer pada DNA target dan pemanjangan (extension)

primer atau reaksi polimerisasi yang dialkalisis oleh DNA polimerase (Gaffar,

2007).

2.3.1 Komponen PCR

Komponen-komponen yang dibutuhkan untuk PCR antara lain fragmen

DNA yang akan diamplifikasi (template DNA), sepasang primer oligonukleotida

13


sintetik, enzim DNA polimerase yang tahan panas (Taq polimerase), semua

macam nukleotida (dATP, dGTP, dCTP, dan dTTP) serta buffer reaksi yang

mengandung MgCl2 Enzim reverse transcriptase, yang dapat mengubah RNA

menjadi sekuen DNA komplementernya, digunakan pada reverse transcription

PCR (Innis, 1990). Dan alat yang digunakan untuk proses PCR adalah

thermocycler, disini reaksi PCR akan berlangsung. Alat ini mampu secara cepat

mengubah temperatur yang dibutuhkan untuk siklus berulang PCR

(Sulistyaningsih, 2007).

a. Template DNA

Template DNA adalah molekul DNA untai ganda yang mengandung

sekuen target yang akan diamplifikasi. Ukuran DNA bukan merupakan

faktor utama keberhasilan PCR, berapapun panjangnya jika tidak

mengandung sekuen yang diinginkan maka tidak akan berhasil proses

suatu PCR, namun sebaliknya jika ukuran DNA tidak terlalu panjang tapi

mengandung sekuen yang diinginkan maka PCR akan berhasil


Konsentrasi DNA juga dapat mempengaruhi keberhasilan PCR. Jika

konsentrasinya terlalu rendah maka primer mungkin tidak dapat

menemukan target dan jika konsentrasi terlalu tinggi akan meningkatkan

kemungkinan mispriming. Disamping itu perlu diperhatikan kemurnian

template karena akan mempengaruhi hasil reaksi (Sulistyaningsih, 2007).

b. Primer

Primer merupakan oligonukleotida pendek rantai tunggal yang

mempunyai urutan komplemen dengan DNA template yang akan

diperbanyak. Panjang primer berkisar antara 20-30 basa. Untuk merancang

urutan primer, perlu diketahui urutan nukleotida pada awal dan akhir DNA

target. Primer oligonukleotida disintesis menggunakan suatu alat yang

disebut DNA synthesizer (Gaffar, 2007).

Konsentrasi primer biasanya optimal pada 0,1-0,5 M. Konsentrasi

primer yang terlalu tinggi akan menyebabkan mispriming (penempelan

pada tempat yang tidak spesifik) dan akumulasi produk non spesifik serta

meningkatkan kemungkinan terbentuk primer-dimer, sebaliknya bila

14


konsentrasi primer terlalu sedikit maka PCR menjadi tidak efisien

sehingga hasilnya rendah (Sulistyaningsih, 2007).

c. Enzim DNA Polimerase .

DNA polimerase adalah enzim yang mengkatalisis polimerisasi DNA.

Biasanya digunakan Taq polimerase yang stabil pada suhu tinggi karena

enzim ini diisolasi dari Thermus aquaticus yang hidup pada sumber air

panas. Konsentrasi enzim yang dibutuhkan untuk PCR biasanya 0,5-2,5

unit. Kelebihan jumlah enzim mengakibatkan akumulasi produk non

spesifik, sedangkan jika terlalu rendah maka dihasilkan sedikit produk

yang diinginkan (Sulistyaningsih, 2007).

d. Deoxynucleotide Triphosphate (dNTP)

Deoxynucleotide Triphosphate merupakan material utama untuk

sintesis DNA dalam proses PCR yang terdiri dari dATP, dGTP, dCTP, dan

dTTP. Konsentrasi dNTP masing-masing sebesar 20-200 M dapat

menghasilkan keseimbangan optimal antara hasil, spesifitas dan ketepatan

PCR. Konsentrasi masing-masing dNTP harus seimbang untuk

meminimalkan kesalahan penggabungan. Deoxynucleotide Triphosphate

akan menurunkan Mg2+

bebas sehingga mempengaruhi aktivitas

polimerase dan menurunkan annealing primer. Konsentrasi dNTP yang

rendah akan meminimalkan mispriming pada daerah non target dan

menurunkan kemungkinan perpanjangan nukleotida yang salah. Oleh

karena itu spesifitas dan ketepatan PCR meningkat pada konsentrasi dNTP

yang lebih rendah (Sulistyaningsih, 2007).

e. Larutan Buffer

Larutan buffer yang biasa digunakan untuk reaksi PCR mengandung

10 mM Tris-HCL pH 8,3, 50 mM KCl, dan 1,5 mM MgCl2. Optimalisasi

konsentrasi ion Mg2+

merupakan hal yang penting. Konsentrasi ion ini

mempengaruhi beberapa hal yaitu annealing primer, suhu pemisahan untai

template dan produk PCR, spesifitas produk, pembentukan primer-dimer

serta aktivitas dan ketepatan enzim Taq polimerase. PCR harus

mengandung 0,5-2,5 M Mg2+

dari total konsentrasi dNTP. Konsentrasi

yang lebih tinggi akan meningkatkan produk PCR tetapi menurunkan

15


spesifitasnya. Konsentrasi ion ini tergantung pada konsentrasi bahan-bahan

yang mengikatnya seperti dNTP, EDTA, dan fosfat (Sulistyaningsih,

2007).

2.3.2 Tahapan PCR

1. Denaturasi

Selama proses denaturasi, DNA untai ganda akan membuka

menjadi dua untai tunggal (Gaffar, 2007).

Suhu denaturasi dipengaruhi oleh sekuen target. Jika sekuen target

kaya akan G-C maka diperlukan suhu yang lebih tinggi. Suhu denaturasi

yang terlalu tinggi dan waktu denaturasi yang terlalu lama

mengakibatkan hilangnya atau berkurangnya aktivitas enzim Taq

polimerase. Waktu paruh aktivitas enzim Taq polimerase adalah >2 jam

pada suhu 92,5oC, 40 menit pada 95

oC dan 5 menit pada 97,5

oC


2. Penempelan Primer (Annealing)

Annealing primer dimaksudkan untuk proses penempelan primer

sekuen target DNA. Suhu dan lamanya waktu yang dibutuhkan untuk

annealing primer juga tergantung pada komposisi basa, panjang, dan

konsentrasi primer. Suhu annealing biasanya 5oC dibawah nilai Tm

primer, berada pada range 55-72oC (Sulistyaningsih, 2007).

3. Extension

Suhu extension ditujukan untuk proses perpanjangan sekuen DNA.

Suhu extension biasanya dipilih 72oC karena merupakan suhu optimum

enzim Taq polimerase. Suhu extension yang rendah bersamaan dengan

konsentrasi dNTP yang tinggi mengakibatkan misextension primer dan

perpanjangan nukleotida yang salah, sebaliknya kombinasi antara suhu

annealing/extension yang tinggi dengan dNTP yang rendah akan

menghasilkan ketepatan produk akhir PCR yang tinggi. Lamanya waktu

extension tergantung pada panjang sekuen target, konsentrasi sekuen

target, dan suhu extension (Sulistyaningsih, 2007).

16


Jumlah siklus yang optimum terutama tergantung pada konsentrasi

awal DNA template saat parameter lain telah dioptimasi, biasanya 25-35

siklus. Siklus yang terlalu sedikit akan memberikan hasil yang sedikit,

sebaliknya bila terlalu banyak akan meningkatkan jumlah dan

kompleksitas produk non spesifik (Sulistyaningsih, 2007).

Gambar 5. Siklus PCR yang terdiri dari denaturasi, penempelang primer, dan

polimerisasinya (Gaffar, 2007).

2.4 Elektroforesis Gel Agarosa

Metoda ini didasarkan pada pergerakan molekul bermuatan dalam media

penyangga matriks stabil di bawah pengaruh medan listrik. Media yang umum

digunakan adalah gel agarosa atau poliakrilamid. Elektroforesis gel agarosa

digunakan untuk memisahkan fragmen DNA yang berukuran lebih besar dari 100

pb dan dijalankan secara horizontal, sedangkan elektroforesis poliakrilamid dapat

memisahkan 1 pb dan dijalankan secara vertikal (Gaffar, 2007).

Untuk visualisasi maka ditambahkan larutan etidium bromida yang akan

masuk diantara ikatan hidrogen pada DNA, sehingga pita fragmen DNA akan

kelihatan dibawah lampu UV. Panjang amplikon bisa diperkirakan dengan

membandingkannya dengan pita DNA standar (Gaffar, 2007).

Faktor-faktor yang menentukan jarak migrasi DNA melalui gel agarosa

(Sambrook dan Russel, 2001).

17


1. Ukuran molekul DNA

Molekul besar berpindah lebih lambat karena membutuhkan usaha

yang besar dan kurang efisien melewati pori-pori gel dibandingkan

dengan molekul yang kecil.

2. Konsentrasi agarosa

Fragmen DNA linear memberikan jarak perpindahan yang berbeda

melalui gel yang mengandung konsentrasi yang berbeda.

Tabel 1. Ukuran pemisahan molekul DNA linear pada standar gel

agarosa

Sumber : Sambrook dan Russel, 2001

3. Konformasi DNA

DNA bentuk I (superhelical circular), bentuk II (nicked circular),

dan bentuk III (linear) berpindah melalui gel agarosa pada jarak

yang berbeda. Pergerakan relatif dari ketiga bentuk utamanya

bergantung pada konsentrasi dan tipe agarosa yang digunakan, selain

itu dipengaruhi juga oleh kekuatan arus listrik yang digunakan,

kekuatan buffer ionik dan bentuk superhelical dari DNA bentuk I.

Pada beberapa kondisi, DNA bentuk I lebih cepat daripada DNA

bentuk III, tetapi pada kondisi yang lain DNA bentuk III lebih cepat

daripada DNA bentuk I.

Konsentrasi agarosa

(% [w/v])

Jarak pemisahan DNA linear

(kb)

0,3 5-60

0,6 1-20

0,7 0,8-10

0,9 0,5-7

1,2 0,4-6

1,5 0,2-3

2,0 0,1-2

18


4. Voltase yang digunakan

Perpindahan molekul DNA di dalam gel dirangsang oleh arus listrik

yang mengalir dari kutub negatif menuju kutub positif. Pada voltase

rendah, DNA linear mengalami perpindahan secara proposional.

Semakin besar tegangan arus listrik, maka perpindahan molekul

DNA semakin cepat, demikian pula sebaliknya. Untuk mencapai

resolusi maksimum dari fragmen DNA dengan ukuran >2 kb, gel

agarosa harus dijalankan tidak boleh lebih dari 5-8 V/cm.

5. Tipe agarosa

Terdapat dua tipe utama dari agarosa yaitu agarosa standar dan

agarosa pada suhu rendah (low-melting temperature).

6. Buffer elektroforesis

Mobilitas elektroforesis DNA dipengaruhi oleh komposisi dan

kekuatan ionik buffer elektroforesis.

2.5 Insulated Isothermal PCR (ii-PCR)

Didasarkan pada reaksi teknologi beratai polimerase (PCR), yang

merupakan teknik biologi molekuler yang digunakan untuk amplifikasi asam

nukleat. Dengan sensitivitas tinggi dan spesifitas, PCR telah menjadi alat yang

ampuh dan sering sangat diperlukan dalam aplikasi medis dan biologis termasuk

pengujian genetik, deteksi, diagnosis penyakit menular, dan sidik jari genetik

untuk ilmu forensik dan pengujian paternitas (Anonim, 2012).

Insulated Isotermal PCR (ii-PCR) didasarkan pada teknologi isotermal

terisolasi yang memanfaatkan fenomena konveksi termal alami untuk mendorong

reaksi PCR. Reaksi ii-PCR dilakukan dalam tabung kapiler yang dirancang

khusus, R-tube yang merupakan perangkat PCR konvektif menyediakan isolasi

dengan sumber panas tunggal isotermal. Ketika pemanasan isotermal 95oC

diterapkan ke bagian bawah R-tube, solusi panas menjadi pematik api

menghasilkan arus untuk naik dan solusi pendingin di bagian atas menjadi lebih

berat untuk turun. Akibatnya, arus konveksi dengan gradien termal sepanjang R-

tube dihasilkan untuk reaksi PCR. Reaksi konvektif terus-menerus membuat

19


reaksi PCR sangat efisien dan dapat mengurangi waktu reaksi PCR rutin secara

signifikan tanpa mempengaruhi sensitivitas (Anonim, 2012).

Gambar 6. Reaksi ii-PCR

Beberapa komponen insulated isothermal PCR yang perlu diperhatikan

yaitu (Anonim, 2012) :

1. Buffer

Insulated isothermal PCR menggunakan Uni-ii buffer yang

mengandung reagen-reagen yang berfungsi untuk mengoptimasi laju

konveksi termal, menstabilisasi gradien temperatur, mengurangi

Keterangan gambar :

1. Reaksi terisolasi oleh perisai termal

2. Konveksi termal alami diinduksi oleh panas

3. Konveksi termal peredaran cairan dan hasil dalam reaksi PCR

4. Denaturasi dari dsDNA

5. Penempelan Primer

6. Perpanjangan dari strand baru

7. DNA diduplikasi dengan penyelesaian dari 1 perputaran dari konveksi termal

20


interaksi antara larutan dan R-tube, dan meningkatkan efisiensi DNA

polimerase untuk keberhasilan reaksi ii-PCR.

2. R-tube

Tube terbuat dari bahan plastik optik yang memastikan transmisi

fluoresensi yang optimal. Bahan plastik berkelas medis juga

memastikan bahwa produk bebas dari DNase dan RNase. Tube telah

dipatenkan dengan rasio diameter dan panjang tertentu yang

memastikan konveksi isotermal untuk reaksi ii-PCR yang optimal.

Tutup yang didesain secara khusus menjaga keamanan reaksi larutan

dan mencegah penguapan pada saat reaksi berlangsung yang dapat

menyebabkan kontaminasi.

3. Probe

Probe POCKIT harus:

a. Terdiri dari 40-80 % GC

b. Mempunyai panjang 15-30 basa, lebih pendek lebih baik.

c. Menghindari daerah target pada template yang dapat membentuk

struktur sekunder.

d. Membuat proses annealing antara probe 5’- dan template cukup

kuat dan bebas energi.


BAB 3

METODOLOGI PENELITIAN

3.1 Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Teknologi Gen, Balai

Pengkajian Bioteknologi-BPPT Serpong, Tangerang. Waktu pelaksanaan dari

bulan Maret 2013 sampai November 2013.

3.2 Alat dan Bahan

3.2.1 Alat

Alat yang digunakan adalah pipet mikro 0,1-2 l, 2-20 l, 20-200 l, 100-

1000 l [Finnpipette, BIO-RAD, Nichiryo, BenchMate], tip 10 l, 100 l, dan

1000 l [Sorenson], freezer -20oC [Angelantoni Scientifica], lemari pendingin 4

oC

[Glacio-TOSHIBA], mesin PCR [TaKaRa & BIO-RAD], thermostat & shaking

bath [Heto], tabung sentrifugasi 15 ml [Iwaki, Corning, FALCON, BIOLOGIX],

tabung mikrosentrifugasi 1,5 ml [Sorenson], tabung mikrosentrifugasi 200 l

[Axygen], rak tabung, mesin sentrifugasi [Beckman J2-HS & Tomy, timbangan

[Metter], ice maker [HOSHIZAKI], vorteks [Heidolph], magnetic stirrer

[Heidolph MR30001], inkubator [memmert], microwave [National], laminar air

flow, heat block [Thermolyne], spatula, gunting , elektroforesis tray [Bio-rad],

chamber elektroforesis [Mupid2], comb, gel documentation, spektrofotometer

Nano Drop ND-1000. Alat gelas yang digunakan adalah gelas ukur, labu

Erlenmeyer (100 ml & 250 ml), gelas Beker (600 ml & 1000 ml), tabung

penyimpanan bahan (50 ml, 100 ml, 250 ml & 500 ml)[Schott-DURAN], R-tube,

petri dish, ose, bunsen.

22


3.2.2 Bahan

Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah DNA Leptospira

interrogens yang sudah terisolasi yang diperoleh dari Balai Besar Penelitian

Vektor dan Reservoir Penyakit Salatiga, dan bakteri Eschericia coli DH5-Alpha.

Bahan lain yang digunakan CTAB (Cetyl Trimetyl Ammonium Bromide) 10%, TE

(Tris-EDTA) buffer 1X, SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) 10%, proteinase-K 18

mg/ml, NaCl (Natrium Klorida) 5M, buffer TAE (Tris Acetate EDTA) 0,5X,

kloroform, isoamilalkohol, isopropanol, etanol 70%, Fenol, Tripton, Yeast

Extract, Bacto Agar, Go Taq Green Master Mix, primer spesifik Leptospira,

agarosa, TAE 0,5 x, SYBR safe, probe, buffer ii-PCR.

3.3 Tahapan Penelitian

1. Persiapan sampel pembanding dan DNA Leptospira

2. Isolasi DNA pembanding

3. Cek DNA bakteri pembanding dengan elektroforesis

4. Amplifikasi DNA Leptospira dengan PCR konvensional

5. Pembuatan gel agarosa dan elektroforesis

6. Dokumentasi gel

7. Optimasi ii-PCR

3.4 Prosedur Kerja

3.4.1 Persiapan Media Tumbuh E. coli

Media Luria Bertani (LB) padat, sebanyak 1 gram tripton, 0,5 gram yeast

extract, 0,5 gram NaCl, dan 1,5 gram bacto agar di masukkan ke dalam

erlenmeyer, ditambahkan aqua dest 100 ml dan ditutup dengan sumbat kapas.

Campuran larutan diaduk hingga homogen dan disterilkan dalam autoklaf pada

suhu 121oC selama 15 menit. Larutan homogen yang sudah disterilkan di tuang

masing-masing sebanyak 25 ml ke dalam 4 petri dish dan biarkan hingga

mengeras. Setelah itu media disimpan di lemari pendingin pada suhu 4oC.

23


3.4.2 Peremajaan E. coli

Biakan stok E. coli dalam media LB padat dipindahkan sebanyak satu ose,

digoreskan secara zig zag ke dalam petri dish yang berisi media LB padat dan

diinkubasi pada suhu 37oC selama 16-18 jam.

3.4.3 Isolasi DNA E. coli

Satu koloni dipilih dengan menggunakan tusuk gigi steril dimasukkan ke

dalam tabung mikrosentrifugasi steril di tambahkan TE buffer sebanyak 557 l.

Campuran diresuspensi atau divortex. Tambahkan 30 l SDS 10% dan 3 l

proteinase-K. Campur dan diinkubasi selama 1 jam pada suhu 37oC. Setelah

diinkubasi tambahkan 100 l NaCl 5M dan dicampur. Ditambahkan 80 l CTAB

10%, inkubasi pada suhu 65oC selama 10 menit. Kemudian tambahkan kloroform

dan isoamilalkohol volume sama banyak. Sentrifus pada kecepatan 13.000 rpm

selama 5 menit pada suhu 4oC, dan pindahkan larutan ke tube baru. Tambahkan

PCI volume sama banyak dan aduk rata. Sentrifus pada kecepatan 14.000 rpm

selama 5 menit pada suhu 4oC dan pindahkan supernatan ke tube baru. Ulangi

ekstraksi kembali (kloroform : isoamilalkohol saja). Tambahkan 0,6 ml

isopropanol dan campur sampai DNA mengendap. Sentrifus pada kecepatan

13.000 rpm selama 5 menit pada suhu 4oC dan buang isopropanol. Tambahkan 1

ml etanol 70% untuk mencuci garam dari DNA. Sentrifus pada kecepatan 13.000

rpm selama 5 menit pada suhu 4oC dan buang etanol, keringkan pada suhu

ruangan. Resuspensi pelet dengan 50-100 l TE buffer dan simpan pada suhu

4oC.

3.4.4 Pembuatan Gel Agarosa dan Elektroforesis

3.4.4.1 Pembuatan Gel Agarosa 1%

Gel agarosa 1% dibuat dengan menambahkan 0,25 gr agarosa dalam 25 ml

buffer TAE 0,5x, dipanaskan hingga larut (1 menit) dalam microwave. Larutan

agarosa didinginkan hingga suhu 40oC dan ditambah dengan SYBR safe 0,5 l,

dituang ke dalam tray. Agarosa didinginkan hingga membeku selama 30-45 menit

24


3.4.4.2 Elektroforesis

Gel diangkat dari cetakan dan dimasukkan ke dalam chamber

elektroforesis kemudian ditambahkan buffer TAE 0,5x sehingga gel terendam

kira-kira 1 mm. Sebanyak 5 l sampel DNA dicampur dengan 21 l loading dye

kemudian dimasukkan ke dalam sumur gel dan ladder dimasukkan 3 l sebagai

marker. Alat elektroforesis dinyalakan (diberi arus listrik) selama 30 menit. DNA

akan bergerak menuju muatan positif. Hasil elektroforesis dilihat dengan

menggunakan dokumentasi gel (gel documentation).

3.4.5 Gel Documentation

Komputer dan kamera digital dinyalakan. Gel agarosa hasil dari

elektroforesis dimasukkan ke dalam UV transiluminator. UV transiluminator

dinyalakan dan pita DNA akan berpendar saat terkena sinar UV. Hasil gel agarosa

saat disinari UV didokumentasikan dalam komputer.

3.4.6 Amplifikasi PCR

Amplifikasi menggunakan dua jenis primer spesifik untuk Leptospira.

Amplifikasi DNA dilakukan dalam total volume 25 l (Lampiran 4).

Denaturasi awal DNA pada 93oC selama 3 menit, denaturasi pada 93

oC

selama 3 menit, annealing pada 50oC selama 1 menit, dan ekstensi 72

oC selama 1

menit. Akhir ekstensi diamplifikasi pada suhu 72oC selama 5 menit dan dilakukan

dalam 25 siklus.

Produk dianalisa di gel agarosa 1% dilihat di bawah pencahayaan UV dan

didokumentasikan

3.4.7 Uji Spesifitas Primer

Primer yang digunakan diuji spesifitasnya dengan menggunakan PCR

konvensional. Primer spesifik DNA Leptospira digunakan untuk mengamplifikasi

DNA dari E. coli dan DNA Leptospira. Hasil PCR kemudian dielektroforesis dan

dibandingkan. Primer spesifik DNA Leptospira dikatakan spesifik jika hanya

25


mengamplifikasi DNA dari Leptospira dan tidak dapat mengamplifikasi DNA

E.coli.

3.4.8 Uji Sensitivitas Primer

Sensitivitas PCR dilakukan dengan melakukan pengenceran DNA

Leptospira dengan konsentrasi yang digunakan 200 ng/25 l, 20 ng/25 l, 2 ng/25

l, 0,2 ng/25 l, 0,02 ng/25 l, 0,002 ng/25 l, dan 0,0002 ng/25 l. Masing-

masing konsentrasi diamplifikasi dengan kondisi PCR yang sama dan dilihat

sampai konsentrasi berapa primer yang digunakan dapat mengamplifikasi DNA

Leptospira yang digunakan.

3.5 Insulated Isotermal PCR (ii-PCR)

3.5.1 Amplifikasi Insulated Isothermal PCR (ii-PCR)

Amplifikasi PCR dilakukan dengan campuran reaksi total PCR (Lampiran

5) dan dibuat dalam volume 50 µL.

Setelah campuran reaksi total PCR dibuat, campuran reaksi tersebut

dimasukkan ke dalam R-tube dan diletakkan pada multiwell plate yang kemudian

diletakkan pada mesin insulated isothermal PCR. Kemudian program amplifikasi

dijalankan dan hasil amplifikasi DNA dapat dilihat pada akhir reaksi dalam

bentuk “+” atau “-“.

26


3.6 Alur Penelitian

DNA Leptospira yang

sudah terisolasi

Amplifikasi DNA dengan PCR

konvensional

Penentuan

Konsentrasi DNA

Isolasi Bakteri Pembanding

Ekstraksi DNA

bakteri Pembanding

DNA terisolasi DNA tidak terisolasi

Cek dengan elektroforesis

Primer Spesifik Primer tidak spesifik

Amplifikasi DNA dengani ii-PCR

Hasil

Cek dengan Elektroforesis


BAB 4

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Isolasi DNA

Penelitian ini diawali dengan mengisolasi DNA E. coli. Metode yang

umum digunakan dalam isolasi DNA yang banyak mengandung polisakarida

adalah dengan menggunakan metode CTAB (Cetyltrimetyl Ammonium Bromide).

Ada tiga langkah utama dalam isolasi DNA, yaitu perusakan dinding sel (lisis),

pemisahan DNA dari bahan padat seperti selulosa dan protein, serta pemurnian

DNA (Syafaruddin dan Tri Joko Santoso, 2011).

Langkah pertama yang dilakukan adalah perusakan dinding sel (lisis).

Perusakan dinding sel dilakukan dengan menggunakan TE buffer, SDS, dan

CTAB. Pemisahan bahan padat seperti selulosa dan protein dengan menggunakan

proteinase-K, NaCl, kloroform : isoamilalkohol (24:1), dan PCI (fenol : kloroform

: isoamilalkohol). Sedangkan pemurnian DNA dengan menggunakan isopropanol

dan etanol (K. Nishiguchi, Michele, dkk., 2002).

Sampel diisolasi sebanyak satu koloni, kemudian ditambahkan larutan TE

buffer, SDS, dan proteinase-K kemudian diinkubasi pada suhu 37oC selama satu

jam. Metode ini menggunakan TE buffer pH 8,0 yang terdiri dari 100 mM Tris-Cl

pH 8,0 dan 10 mM EDTA pH 8,0 (Sambrook dan Russel, 2001). Tris-Cl

merupakan dapar yang berfungsi untuk menjaga pH, sangat larut dalam air dan

inert untuk berbagai jenis reaksi enzimatik (Sambrook dan Russel, 2001).

Sedangkan EDTA (Ethylene Diamine Tetra Acetic Acid) berfungsi sebagai bahan

pengkhelat yang mengikat kation divalen, sehingga mengakibatkan

ketidakstabilan membran (Dale dan Malcom, 2002). Penggunaan SDS (Sodium

Dedosil Sulfate/Natrium Lauril Sulfat) sebagai detergen anonik untuk melisiskan

dinding sel dengan cara melarutkan membran lipid, sehingga dinding sel menjadi

rusak dan mengeluarkan komponen-komponennya, yaitu protein, lipid,

polisakarida, DNA, dan RNA (Dale dan Malcom, 2002; Surzycki, 2003).

Proteinase-K digunakan pada tahap pemecahan protein. Proteinase-K

disini yang merupakan salah satu dari enzim golongan serin protease yang

merupakan protease endolitik, memecah ikatan peptida sisi karboksilat pada

28


gugus alifatik dan aromatik khususnya alanin, sehingga digunakan untuk

menghilangkan kontaminan dari protein. (Sweeney dan Walker, 1993; Surzycki,

2003; Agrawal, 2008). Kemudian ditambahkan NaCl 5 M yang berfungsi sebagai

pengendap protein dan CTAB dalam larutan dengan ion yang tinggi (konsentrasi

NaCl >0,7 M) digunakan sebagai pengendap protein dimana CTAB akan

membentuk kompleks dengan protein dan polisakarida tetapi tidak akan

mengendapkan DNA (Sambrook dan Russel, 2001). NaCl dengan kandungan

garam yang tinggi dapat memisahkan polisakarida dari dinding sel (Syafaruddin

dan Tri Joko Santoso, 2011) yang dikenal dengan fenomena salting out, yaitu

fenomena penurunan kelarutan protein pada konsentrasi garam yang tinggi

(Holme, David. J dan Hazel Peck, 1998).

Residu dari protein dan lipid dapat dihilangkan dengan penambahan

kloroform dan isoamilalkohol dengan perbandingan 24:1 (K. Nishiguchi, Michele,

dkk., 2002). Kloroform dan isoamilalkohol memiliki fungsi sebagai pendenaturasi

protein, dimana DNA dan RNA sendiri tidak akan ikut terdenaturasi karena DNA

dan RNA ini tidak larut dalam pelarut organik seperti kloroform (Syafaruddin dan

Tri Joko Santoso, 2011). Kemampuan deproteinisasi dari kloroform didasarkan

pada kemampuan dari kloroform untuk mendenaturasi rantai polipeptida yang

sebagian masuk atau termobilisasi pada interfase air-kloroform sedangkan

isoamilalkohol digunakan untuk mempermudah dalam meningkatkan luas

tegangan permukaan dari air-kloroform, sehingga memudahkan dalam pemisahan

air dan kloroform (Agrawal, 2008). Pengendapan protein dengan polisakarida dan

komponen lain yang telah lisis selain dengan bantuan garam juga dipisahkan

dengan cara pengendapan dengan bantuan sentrifugasi.

Penambahan PCI (Fenol-Kloroform-Isoamilalkohol) juga membantu

dalam menghilangkan protein dari DNA (Sambrook dan Russel, 2001.

Penambahan kloroform-isoamilalkohol dengan PCI dilakukan dua kali untuk

memaksimalkan pemisahan DNA dengan komponen-komponen lain yang dapat

mengkontaminasi DNA.

DNA total kemudian dipisahkan dari larutan dengan cara pengendapan

dengan menggunakan isopropanol (Sambrook dan Russel, 2001) dan etanol 70%

(Agrawal, 2008; Surzycki, 2003). Etanol 70% selain berfungsi sebagai pengendap

29


DNA juga sebagai penghilang fenol-kloroform dan juga garam yang masih

terdapat dalam DNA (Sambrook dan Russel, 2001; Syafaruddin dan Tri Joko

Santoso, 2011).

Konsentrasi dari genom diukur dengan menggunakan Nano Drop ND-

1000 pada panjang gelombang 260 nm. Konsentrasi yang diperoleh dari

pengukuran genom Leptospira dengan menggunakan Nano Drop 225,5 ng/l dan

kemurnian 1,825. Sedangkan genom E. coli memberikan konsentrasi 546,8 ng/l

dengan kemurnian 2,065. Dari hasil pengukuran tersebut menunjukkan kualitas

dan kuantitas DNA baik.

Nilai kemurnian genom diperoleh antara perbandingan panjang gelombang

260 nm dan 280 nm (Harisha. S., 2007) dan dikatakan murni jika berada dalam

kisaran antara 1,8-2,0 (Sambrook, dkk, 1989). Sementara itu nilai kemurnian yang

ditunjukkan dari isolasi genom E. coli memberikan hasil lebih dari 2,0 yang

menunjukkan adanya kontaminasi dari RNA (Stephenson, 2003). Kontaminasi

dari RNA disebabkan tidak digunakannya RNase yang berfungsi untuk memecah

RNA yang dapat mengurangi adanya kontaminasi dari RNA (Surzycki, 2003) dan

adanya kontaminasi dari RNA dapat dibuktikan dengan adanya pola bayangan

smear di bawah pita DNA pada visualisai gel agarosa (Sauer, dkk., 1998).

Genom kemudian divisualisasikan dengan menggunakan elektroforesis gel

agarosa 1% dengan menggunakan tegangan 100 volt. Gel ditambahkan SYBR

safe yang digunakan untuk memvisualisasikan DNA di agarosa dan

diformulasikan khusus untuk menjadi alternatif yang lebih aman dibanding

etidium bromida (Anonim, 2013).

DNA yang akan dielektroforesis ditambahkan loading dye yang terdiri dari

glycerol dan bromphenol blue. Glycerol berfungsi sebagai pemberat yang

menyebabkan DNA berada di bawah sumur gel, sedangkan bromphenol blue

berfungsi sebagai visualisasi pada gel (Carson, 2006) sehingga proses

elektroforesis dapat terlihat dan tidak melebihi jarak yang diinginkan. Hasil

elektroforesis tersebut ditampilkan pada Gambar 7.

30


Keterangan :

1. Leptospira

2. E. coli

M. Ladder 100 bp

Gambar 7. Hasil elektroforesis isolasi genom dari Leptospira dan E. coli

Hasil pengamatan pada gel documentation (Gambar 7) menunjukkan hasil

isolasi dari genom E. coli dan Leptospira. Gambar ini menunjukkan pola

bayangan smear di bawah pita DNA yang menunjukkan DNA tidak utuh sehingga

menyebabkan timbulnya fragmen-fragmen yang berbeda ukuran dan tertahan pada

gel sesuai dengan ukurannya. Pola bayangan smear juga dapat menunjukkan

adanya kontaminasi dari RNA sedangkan hasil isolasi yang baik ditandai dengan

pita yang dihasilkan jelas dan tidak adanya pola bayangan smear di bawah pita

DNA(Sauer dkk., 1998).

4.2 Polymerase Chain Reaction (PCR)

Reaksi PCR dilakukan dengan menggunakan konsentrasi DNA template

200 ng/ 25 l. Konsentrasi ini optimal untuk mendapatkan amplikon yang tebal

pada 25 siklus. Suhu optimal annealing yang digunakan untuk primer Leptospira

adalah 50oC untuk dan waktu reaksi PCR untuk mengamplifikasi DNA Leptospira

dengan primer spesifik Leptospira adalah 150 menit.

Uji spesifitas dari primer Leptospira dilakukan untuk menguji kemampuan

dari primer Leptospira yang digunakan hanya mampu mengamplifikasi DNA

Leptospira dan tidak dapat mengamplifikasi DNA yang lain, yang dalam

penelitian ini yang digunakan sebagai pembanding adalah E. coli. Gambar 8

merupakan hasil uji spesifitas dari primer Leptospira yang digunakan.

31


Keterangan :

1. E. coli

2. Leptospira

M. Ladder 100 bp

139 bp

Gambar 8. Hasil elektroforesis produk PCR menggunakan primer Leptospira pada

uji spesifitas primer

Pada gambar 8 dapat terlihat bahwa primer Leptospira yang digunakan

hanya dapat mengamplifikasi DNA Leptospira, sedangkan DNA E. coli tidak

teramplifikasi sama sekali, sehingga dapat dikatakan bahwa primer Leptospira

yang digunakan spesifik. Proses amplifikasi DNA Leptospira menghasilkan

panjang produk 139 pasang basa yang terletak pada lokus 16S Ribosomal RNA.

Pasang basa yang dihasilkan diusahakan dalam kisaran pendek untuk

mempermudah dalam pengujian dengan menggunakan ii-PCR (Anonim, 2012).

Uji sensitivitas dari primer Leptospira ini dimaksudkan untuk mengukur

kemampuan dari primer Leptospira yang digunakan dalam mengamplifikasi

konsentrasi terendah dari DNA Leptospira yang digunakan dalam sampel.

Sensitivitas primer Leptospira dilakukan dengan melakukan pengenceran DNA

Leptospira dengan seri konsentrasi yang digunakan adalah 200 ng/25l,

20ng/25l, 2ng/25l, 0,2 ng/25l, 0,02 ng/25l, 0,002 ng/25l, dan 0,0002

ng/25l. Gambar 9 menunjukkan hasil elektroforesis dari uji sensitivitas dari

primer yang digunakan.

32


Keterangan :

1. Konsentrasi DNA 200 ng/25 µL

2. KonsentrasiDNA 20 ng/25 µL

3. KonsentrasiDNA 2 ng/25 µL

4. KonsentrasiDNA 0,2 ng/25 µL

5. KonsentrasiDNA 0,02ng/25 µL

6.KonsentrasiDNA 0,002ng/25 µL

7.KonsentrasiDNA 0,0002ng/25 µL

Gambar 9. Hasil elektroforesis produk PCR dengan menggunakan primer spesifik

DNA Leptospira pada uji sensitivitas primer.

Pada gambar 9 dapat terlihat, dari tujuh konsentrasi yang digunakan,

primer Leptospira mampu mengamplifikasi DNA Leptospira sampai dengan

konsentrasi 0,002 ng/25 µL, meskipun pada konsentrasi 0,002 ng/25 µL

menghasilkan pita yang tipis. Pada konsentrasi 0,0002 ng/25 µL tidak terlihat

adanya pita pada gel elektroforesis yang menandakan bahwa primer Leptospira

tidak dapat mengamplifikasi DNA Leptospira pada konsentrasi 0,0002 ng/25 µL,

sehingga dapat dikatakan bahwa primer spesfik Leptospira yang digunakan

sensitif dan mampu mengamplifikasi DNA Leptospira sampai konsentrasi 0,002

ng/25 µL.

4.3 Insulated Isothermal Polymerase Chain Reaction (ii-PCR)

Alat ii-PCR tidaksepertialat PCR konvensional, alat ii-PCR tidak

mempunyai pengaturan suhu dan waktu denaturasi, annealing ,dan ekstensi.

Reaksi ii-PCR dilakukan dalam tabung kapiler khusus yang disebut R-tube. R-

tube dirancang khusus karena R-tube terbuat dari bahan plastik optis untuk

memastikan transmisi dari fluoresensi optimal. Bahan plastik optis tersebut

memastikan tidak adanya kontaminasi dari DNA maupun RNase dari luar reaksi

33


yang tidak diinginkan. Desain dari struktur tabung dan rasio yang dihitung dari

diameter tabung atau panjang yang memastikan efisiensi dari reaksi konveksi

termal pada proses reaksi ii-PCR. Penutup karet R-tube juga didesain khusus

untuk membuat cairan reaksi aman dan mencegah penguapan selama reaksi yang

dapat menyebabkan terjadinya kontaminasi (Anonim, 2012).

Reaksi ii-PCR bergantung pada tiga temperatur yang digunakan, yaitu

denaturasi pada suhu 92-95oC, annealing pada suhu 37-65

oC, dan ekstensi pada

suhu 72oC (Anonim, 2012). Suhu annealing pada saat proses ii-PCR berlangsung

tidak dapat diketahui secara pasti dan suhu annealing dapat berbeda-beda di setiap

siklusnya, sehingga optimasi komposisi perlu dilakukan.

Optimasi komposisi campuran ii-PCR dengan melakukan variasi dari Taq

DNA polymerase dan buffer yang digunakan. Taq DNA polimerase yang

digunakan adalah dari Thermo Scientific™ Long PCR Enzyme Mix dan

KAPA2G™ Robust PCR Kit serta buffer yang digunakan adalah ii-buffer dan

buffer dari masing-masing Taq polimerase yang digunakan.

Pada akhir reaksi ii-PCR yang berlangsung selama 58 menit didapati hasil

positif dan negatif pada layar touch panel (Gambar 10). Gambar tersebut

menunjukkan hasil reaksi ii-PCR dengan ii-buffer dengan buffer dari Taq DNA

polimerase Thermo Scientific™ Long PCR Enzyme Mix yang keduanya

menggunakan Taq DNA polimerase Thermo Scientific™ Long PCR Enzyme

Mix.Gambar 11 menunjukkan hasil reaksi ii-PCR dengan ii-buffer danTaq DNA

polimerase KAPA2G™ Robust PCR Kit dengan buffer dari Taq DNA

KAPA2G™ Robust dimana keduanya menggunakan Taq DNA polimerase

KAPA2G™ Robust PCR Kit.

34


Gambar 10.Hasilreaksi ii-PCR denganTaq DNA polimerase Thermo

Scientific™ Long PCR Enzyme Mix (A) dengan ii-buffer dan (B)

dengan menggunakan buffer dari kit.

Gambar 11.Hasilreaksi ii-PCR dengan menggunakanTaq DNA polimerase

KAPA2G™ Robust(A) dengan menggunakan buffer dari kit dan (B)

dengan ii-buffer.

Pada Gambar 10 dan 11 dapat terlihat hasil positif diperoleh dengan

menggunakan Taq DNA polimerase KAPA2G™ Robust PCR Kit dengan ii-

buffer, sedangkan reaksi lainnya menunjukkan hasil negatif. Hal ini berkaitan

dengan jenis dari Taq DNA polymerase dan buffer yang digunakan. Jenis dari Taq

DNA polymerase berhubungan dengan panjang target yang akan diamplifikasi

dan efisiensi dari amplifikasi suatu produk (Handoyo, Darmodan Ari Rudiretna,

2001; Arezi, dkk., 2003). Taq DNA polymerase Thermo Scientific™ Long PCR

35


Enzyme Mix yang memiliki hasil dan ketepatan yang tinggi digunakan untuk hasil

amplifikasi dengan panjang basa yang lebih tinggi jika dibandingkan dengan Taq

DNA polymerase KAPA2G™ Robust PCR Kit dan membutuhkan proses reaksi

PCR yang cukup lama jika dibandingkan dengan Taq DNA polymerase

KAPA2G™ Robust PCR Kit, sedangkan proses reaksi yang terdapat pada ii-PCR

hanya dalam waktu singkat, sehingga efisiensi dari Taq DNA polymerase Thermo

Scientific™ Long PCR Enzyme Mix memberikan hasil yang tidak baik dan

memunculkan hasil negatif pada alat ii-PCR.

Reaksi PCR hanya akan berlangsung pada kondisi pH tertentu, oleh karena

itu untuk melakukan proses PCR diperlukan buffer PCR (Handoyo, Darmodan Ari

Rudiretna, 2001). Penggunaan buffer yang disarankan oleh alat ii-PCR adalah ii-

buffer yang berfungsi untuk menstabilkan gradient suhu, mengurangi interaksi

antara campuran reaksi dan R-tube, dan meningkatkan efisiensi DNA polymerase

untuk mensukseskan reaksi ii-PCR (Anonim, 2012). Oleh karena itu penggunaan

buffer selain ii-buffer memunculkan hasil negatif.

Hasil dari reaksi ii-PCR tersebut kemudian dielektroforesis untuk melihat

pita yang dihasilkan dari reaksi ii-PCR ini (Gambar 12).

Keterangan :

1. KAPA2G™ Robust + ii-

buffer

2. KAPA2G™ Robusrt +

buffer kit

3. Thermo scientific™ Long

PCR Enzyme Mix + buffer

kit

4. Thermo scientific™ Long

PCR Enzyme Mix + ii-

buffer

M. Ladder 100 bp

Gambar 12. Hasil elektroforesis produk ii-PCR

36


Pada Gambar 12 menunjukkan hasil elektroforesis dari reaksi ii-PCR

dengan menggunakan empat komposisi yang berbeda. Gambar ini menunjukkan

dua komposisi yang digunakan dapat teramplifikasi, yaitu dengan menggunakan

Taq DNA polimerase KAPA2G™ Robust, namun hanya reaksi yang

menggunakan komposisi no.1 yang terdeteksi positif oleh alat ii-PCR.

Hasil positif yang dimunculkan oleh alat ii-PCR disebabkan oleh

fluoresensi dari probe hidrolisis dapat dideteksi secara efisien oleh sistem optik di

dalam alat ii-PCR. Fluoresensi yang dihasilkan di dalam alat ii-PCR ditunjukkan

dalam rasio S/N (signal intensityafter/signal intensitybefore) yang mempunyai

ambang batas minimal 1,34 untuk dapat memberikan hasil positif pada alat ii-PCR

(Tsai, dkk., 2012). Pada sampel no. 1 menunjukkan rasio S/N 1,8062 sedangkan

pada sampel no.2 sampai dengan no.4 menunjukkan rasio S/N di bawah 1,34

(Lampiran 6). Rasio S/N yang dihasilkan sampel no.1 menunjukkan nilai ambang

batas di atas 1,34, sehingga memberikan hasil positif pada alat ii-PCR.

Pada Gambar 12 dapat terlihat juga bahwa hasil elektroforesis yang

didapat dari keempat hasil reaksi ii-PCR menunjukkan pita yang smear. Hasil pita

yang smear ini disebabkan oleh suhu annealing yang beragam dari alat ii-PCR

yang berkisar pada 37-65oC. Suhu annealing yang terlalu tinggi dari suhu

annealing optimum akan menyebabkkan primer tidak menempel dengan DNA

cetakan. Sedangkan jika suhu penempelan primer terlalu rendah dari suhu

penempelan primer optimum menyebabkan mispriming, yaitu penempelan primer

pada tempat yang salah pada DNA cetakan sehingga dihasilkan produk non

spesifik (Yuwono, 2006).


BAB 5

KESIMPULAN DAN SARAN

5.1 Kesimpulan

Primer spesifik Leptospira mampu mengamplifikasi DNA Leptospira

sampai konsentrasi 0,002 ng/25 µl dan amplifikasi DNA Leptopira dengan

metode ii-PCR yang menggunakan DNA Leptospira, primer, dan probe

spesifik menunjukkan rasio S/N 1,87 memberikan hasil positif dalam waktu 58

menit bila dibandingkan dengan metode PCR konvensional yang

membutuhkan waktu 150 menit dan diperlukan analisa dengan gel

elektroforesis.

5.2 Saran

Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut mengenai konsentrasi terendah dari

DNA Leptospira yang masih dapat diamplifikasi oleh alat ii-PCR.


DAFTAR PUSTAKA

Agrawal, Suraksha. 2008. Techniques in Molecular Biology. International Book

Distributing Co. : India.

Anonim. 2003. Human Leptospirosis: Guidance for Diagnosis, Surveillance and

Control. WHO.

Anonim. 2011. Profil Kesehatan Indonesia 2010. Kementrian Kesehatan

Republik Indonesia : Jakarta.

Anonim. 2012. http://www.iipcr.com/faq.php [12 Maret 2012, pukul 12.50].

Anonim. 2013. http://www.lifetechnologies.com/id/en/home/life-science/dna-rna-

purification-analysis/nucleic-acid-gel-electrophoresis/dna-stains/sybr-

safe.html [7 Desember 2013, pukul 08.10].

Arezi, Bahram, dkk. 2003. Amplification efficiency of thermostable DNA

polymerases. Analytical Biochemistry 321 (2003) 226-235.

Bal, A. E., dkk. 1994. Detection of Leptospires in Urine by PCR for Early

Diagnosis of Leptospirosis. J. Clin. Microbiol, Vol. 32.

Bovet, Pascal, dkk. 1999. Factors Assosiated with Clinical Leptospirosis: a

Population-Based Case-Control Study in the Seychelles (Indian Ocean).

Intl. J. Epidemiol 1999; 28: 583-590.

Carson, Susan. 2006. Manipulation and Expression of Recombinant DNA A

Sensitive Method to Identify Pork in Precessed and Unprocessed Food by

PCR Amplification of A New Spesific DNA Fragment. J Anim Sci. (79):

2108-2112.

Collins, Richard A. 2006. Leptospirosis. The Biomedical Scientist.

Dale, Jeremy W. dan Malcom von Schantz. 2002. From Genes to Genomes:

Concepts and Applications of DNA Technology. John Wiley & Sons, Ltd.

39


Ernawati, Kholis. 2008. Leptospirosis Sebagai Penyakit Pasca Banjir Serta Cara

pencegahannya. Fak. Kedokteran Universitas YARSI Jakarta.

Gaaffar, Shabarni. 2007. Buku Ajar Bioteknologi Molekul. Universitas

Padjadjaran: Bandung.

Handoyo, Darmo dan Ari Rudiretna. 2001. Prinsip Umum dan Pelaksanaan

Polymerase Chain Reaction (PCR). Unitas, Vol. 9. No.1.

Harisha, S. 2007. Biotechnology Procedures and Experimental Handbook, New

Delhi, India: Infinity Science Press LLC.

Holme, David. J. dan Hazel Peck. 1998. Analytical Biocemistry, third edition,

London: Pearson Education.

Jose, J dan R. Usha. 2000. Extraction of Geminiviral DNA from Highly

Mucilaginous Plant (Abelmoschus esculentus). Plant Molecular Biology

Reporter 18: 349-355.

K. Nishiguchi, Michele, dkk. 2002. DNA Isolation Procedures. Method and Tools

in Biosciences and Medicine Technique in molecular systematic and

evolution, ed . by Rob DeSalle, dkk. Birkhāuser Verlag

Basel/Switzerland.

Kumari, Rajni. 2007. Meat Species Identificatin by Real Time PCR.

Levett, Paul N. 2001. Leptospirosis. Clin. Microbiol. Rev. 2001, 14 (2): 296.

Levett, Paul N., dkk. 2001. Two Method for Rapid Serological Diagnosis of Acute

Leptospirosis. Clinical and Diagnostic Laboratorium Immunology, Vol. 8

Natarajaseenivasan, Kalimuthusamy, dkk. 2004. Human Leptospirosis in Erode,

South India: Serology, Isolation, and Characterization of the Isolates by

Randomly Amplified Polymorphic DNA (RAPD) Fingerprinting. Jpn. J.

Infect. Dis., 57, 193-197.

Purves, William K., dkk. 2003. Life, The Science of Biology Seventh Edition.

Sinauer Associastes and W.H. Freeman.

40


Riyaningsih, Suharyo Hadisaputro, dan Suhartono. 2012. Faktor Risiko

Lingkungan Kejadian Leptospirosis di Jawa Tengah (Studi Kasus di

Kota Semarang, Kabupaten Demak, dan Pati). Jurnal Kesehatan

Lingkungan Indonesia, Vol. 11, No. 1.

Saengjaruk, Patcharin, dkk. 2002. Diagnosis of Human Leptospirosis by

Monoclonal Antibody-Based Antigen Detection in Urine. J. Clin.

Microbiol, Vol. 40, No. 2.

Sambrook, J., dan Russell, D.W., 2001. Molecular Cloning, A Laboratory Manual

3rd

edition, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press.

Sambrook, J., Fritsch, E.F, dan Maniatis, T. 1989. Molecular Cloning. Cold

Spring Harbor Press. University of Texas South Western Medical Centre,

Texas.

Sauer, P., M. M ller, dan J. Kang. 1998. Quantitation DNA. Qiagen News 2: 23-

26.

Setadi, Bobby, dkk. 2001. Leptospirosis. Sari Pediatri, Vol 3, No.3, Desember

2001: 163-167.

Setiawan, I Made. 2008. Pemeriksaan Laboratorium Untuk Mendiagnosis

Penyakit Leptospirosis. Media Litbang Kesehatan Volume XVIII Nomor

1.

Shekatkar, Smita, Belgode Narasimha Harish, dan Subhash Chandra Parija. 2010.

Diagnosis of Leptospirosis by Polymerase Chain Reaction. International

Journal of Pharma and Bio Sciences, ISSN 0975-6299, Vol.1/Issue-

3/Jul-Sep 2010.

Stephenson, Frank, H. 2003. Calculations in MolecularBiology and

Biotechnology, A Guide to Mathematics in The Laboratory, Academic

Press, California, USA.

Stone, Carol Leth. 2004. The Basic of Biology. Greenwood Press : London .

41


Sulistyaningsih, Erma. 2007. Polymerase Chain Reaction (PCR): Era Baru

Diagnosis dan Manajemen Penyakit Infeksi. Biomedis, Vol. 1.

Surzycki, Stefan. 2003. Human Molecular Biology Laboratory. Blackwell

Publishing : USA.

Sweeney J. Patricia dan John M. Walker. 1993. dalam Michael M. Burrell,

Enzymes of Molecular Biology, New Jersey: Humana press inc.

Syafaruddin dan Tri Joko Santoso. 2011. Optimasi Teknik Isolasi dan Purifikasi

DNA yang Efisien pada Kemiri Sunan (Reutalis trisperna (Blanco) Airy

Shaw. Jurnal Litri Vol. 17 (1), Maret 2011 : 11-17.

Thornley, C.N, dkk. 2002. Changing Eidemiology of Human Leptospirosis in New

Zealand. Epidemiol. Infect, 128, 29-36.

Tilahun, Z, D. Reta, dan K. Simenew. 2013. Global Epidemiological Overview of

Leptospirosis. Intl. J. Microbiol. Res., 4 (1): 09-15, 2013

Tsai, Yun-Long, dkk. 2012. Development of TaqMan Probe-Based Insulated

Isothermal PCR (iiPCR) for Sensitive and Spesific On-Site Pathogen

Detection. Plos One ,Issue 9, Volume 7, September 2012.

Yersin, Claude, dkk. 1998. Human Leptospirosis in the Seychelles (Indian Ocean)

a Population-Based Study. Am. J. Trop. Med. Hyg., 59(6).

Yuwono, T. 2006. Teori dan Aplikasi Polymerase Chain Reaction. Yogyakarta :

Penerbit Andi.

Zavitsanou, Assimina, dan Fotoula Babatsikou. 2008. Leptospirosis:

Epidemiology and Preventive Measure. Health Science Journal, Volume

2, Issue 2.

42


Lampiran 1

Hasil peremajaan E.coli dan DNA Leptospira yang sudah terisolasi

Gambar 13. Hasil Peremajaan E.coli

DNA Leptospira yang sudah terisolasi yang diperoleh dari Balai Besar Penelitian

Vektor dan Reservoir Penyakit Salatiga

Gambar 14. DNA Leptospira yang sudah terisolasi

43


Lampiran 2

Hasil konsentrasi dan kemurnian DNA Leptospira dan DNA E. coli

Tabel 2. Hasil konsentrasi dan kemurnian DNA Leptospira dan DNA E.coli

diukur

dengan spektrofotometer Nano Drop ND-1000

Sampel ID Konsentrasi DNA

(ng/µL)

Kemurnian DNA

A260/A280

Leptospira 225.4 1.82

225.6 1,83

Rata-rata 225.5 1.825

E. coli 546.7 2.07

546.9 2.06

Rata-rata 546.8 2.065

44


Lampiran 3

Membuat Larutan induk primer dan probe

1. Membuat larutan induk primer dan probe 100 µM

Jenis Nama oligo µg To make 100 µM

Leptospira

Forward 479.75 Add 480 µL ddH2O

Reverse 431.13 Add 431 µL ddH2O

Probe 569.95 Add 570 µL ddH2O

2. Membuat larutan primer 10 µM dari larutan induk

V1 . M1 = V2 . M2

X . 100 µM = 100 µL . 10 µM

X =

= 10 µL

Maka, 10 µL diambil dari masing- masing primer 100 µM dan di add 90

µL ddH2O

3. Membuat larutan probe 5 µM dari larutan induk

V1 . M1 = V2 . M2

X . 100 µM = 100 µL . 5 µM

X =

= 5 µL

Maka, 5 µL diambil dari masing-masing probe 100 µM dan di add 95 µL

ddH2O

4. Rekomendasi konsentrasi untuk primer dipilih konsentrasi akhir 0,5 µM

(Tsai, 2012) untuk tiap primer

V1 . M1 = V2 . M2

X . 10 µM = 50 µL . 0.5 µM

X =

= 2.5 µL

Maka, diambil 2.5 µL dari larutan primer konsentrasi 10 µM

5. Rekomendasi konsentrasi untuk probe dipilih konsentrasi akhir 0,15 µM

(Tsai, 2012)

V1 . M1 = V2 . M2

X . 5 µM = 50 µL . 0.15 µM

X =

= 1.5 µL

Maka, diambil 1.5 µL dari larutan konsentrasi 5 µM

45


Lampiran 4.

Campuran reaksi master mix untuk amplifikasi DNA untuk PCR konvensional

Campuran reaksi master mix untuk PCR konvensional

Tabel 3. Campuran reaksi master mix PCR konvensional

Konsentrasi Lar.

Induk

Konsenrasi

Akhir

Volume yang

digunakan

GoTaq® Green

Master Mix

- - 12.5 µL

Primer Forward 10 µM 0,8 µM 2 µL

Primer Reverse 10 µM 0,8 µM 2 µL

DNA template 100 ng 8 ng 2 µL

ddH2O - - 6.5 µL

Total volume reaksi 25 µL

46


Lampiran 5

Campuran reaksi master mix untuk amplifikasi DNA untuk ii-PCR

1. Campuran reaksi master mix untuk ii-PCR dengan Taq DNA polymerase

KAPA2G™ Robust PCR Kit

Tabel 4. Campuran reaksi master mix dengan Taq DNA polymerase

KAPA2G™ Robust PCR Kit dengan ii-buffer

Konsentrasi Lar.

Induk

Konsentrasi

Akhir

Volume yang

digunakan

KAPA2G™

Robust PCR Kit

5 U/µL 2,5 U/50 µL 0.5 µL

dNTP 10 mM 0,2 mM 1 µL

Primer Forward 10 µM 0,5 µM 2.5 µL

Primer Reverse 10 µM 0,5 µM 2.5 µL

Probe 5 µM 0,15 µM 1.5 µL


ii-Buffer 1X 37 µL


Tabel 5. Campuran reaksi master mix untuk ii-PCR dengan Taq DNA

polymerase KAPA2G™ Robust PCR Kit dengan buffer dari kit

Konsentrasi

Lar. Induk

Konsentrasi

Akhir

Volume yang

digunakan

KAPA2G™

Robust PCR Kit

5 U/µL 2,5 U/50 µL 0.5 µL

dNTP 10 mM 0,2 mM 1 µL


Primer Reverse 10 µM 0,5µM 2.5 µL



Buffer A 5X - 10 µL

Nuclease Free

Water

27 µL

Total volume reaksi 50 L

47


2. Campuran reaksi master mix untuk ii-PCR dengan Taq DNA polymerase

Thermo Scientific™ Long PCR Master Mix

Tabel 6. Campuran reaksi master mix untuk ii-PCR dengan Taq DNA

polymerase Thermo Scientific™ Long PCR Master Mix dengan

ii-buffer

Konsentrasi Lar.

Induk

Konsentrasi

Akhir

Volume yang

digunakan

Thermo

Scientific™ Long

PCR Master Mix

5 U/µL 2,5 U/50 µL 0.25 µL

dNTP 2.5 mM 0,2 mM 4 µL





ii-Buffer 1X 34.25 µL


Tabel 7. Campuran reaksi master mix untuk ii-PCR dengan taq DNA

polymerase Thermo Scientific™Long PCR Master Mix dengan

buffer dari kit

Konsentrasi Lar. induk Volume yang

digunakan

Thermo

Scientific™ Long

PCR Master Mix

5 U/µL 2,5 U/50 µL 0.25 µL

dNTP 2.5 mM 0,2 mM 4 µL





Buffer with

MgCl2

10X - 5 µL

Nucluase Free

Water

- - 29.25 µL


48


Lampiran 6

Rasio S/N pada sampel hasil reaksi ii-PCR.

Tabel 8. Nilai rasio S/N pada sampel hasil reaksi ii-PCR

No. Sampel Rasio S/N

1 KAPA2G™ Robust + ii-buffer 1,8062

2 KAPA2G™ Robusrt + buffer kit 1,0014

3 Thermo scientific™ Long PCR Enzyme Mix + buffer kit 0,9799

4 Thermo scientific™ Long PCR Enzyme Mix + ii-buffer 0,9475

Amplifikasi DNA Leptospira dengan Menggunakan Metode...

Documents

Transcript of Amplifikasi DNA Leptospira dengan Menggunakan Metode...