Acara2 (Disosiasi Jaringan, penentuan kepadatan dan viabilitas sel)NEW.docx

7/23/2019 Acara2 (Disosiasi Jaringan, penentuan kepadatan dan viabilitas sel)NEW.docx

1/13

DISOSIASI JARINGAN, PENENTUAN KEPADATAN DAN VIABILITAS

SEL

Oleh :

Nama : Bagus Henda!an

NI" : B#J$#%#&'

R(m)(ngan : I

Kel(m*(+ : '

LAPORAN PRAKTIKU" KULTUR JARINGAN HEAN

KE"ENTERIAN PENDIDIKAN DAN KEBUDA-AAN

UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIR"AN

.AKULTAS BIOLOGI

PUROKERTO

/$#0


2/13

I1 PENDAHULUAN

A1 La2a Bela+ang

Kultur jaringan adalah metode yang digunakan untuk mengisolasi bagian

dari organisme dan kemudian ditumbuhkan kembali dalam kondisi aseptik agar

bagian-bagian tersebut dapat beregenerasi menjadi organisme baru. Kultur

dilakukan di dalam laboratorium agar hasil kultur yang diperoleh tidak tergantung

dari musim dan faktor lingkungan lain. Faktor yang membatasi hasil yang

diinginkan hanya ketersediaan tenaga, fasilitas, dan kemungkinan kontaminasi

(Livy, 199!.

Kultur sel merupakan suatu proses saat sel hidup ditempatkan ke dalam

suatu media yang dapat membuat sel tersebut berkembang biak atau tumbuh

se"ara in vitro (#a$at, %11!. Kultur sel penting karena kemampuan organisme

eukariot untuk menghasilkan protein komersial se"ara in vivo lebih rendah

dibandingkan bakteri yang mudah dikembangkan dalam media buatan.

&engembangan metode dilakukan untuk meningkatkan hasil produk protein

komersial dari organisme eukariot melalui teknik kultur se"ara in vitro, yaitu

dengan teknik kultur jaringan'kultur sel (oosen et al., 199)!. #edia kultur

buatan yang digunakan untuk menumbuhkan sel di luar tubuh organisme dibuat

semirip mungkin dengan "airan biologis pada saat sel berada dalam tubuh

organisme (*"halier, 199+!.

Kultur sel dapat berupa kultur sel primer maupun "ell line. Kultur sel primer

merupakan kultur yang dimulai dari sel, jaringan, organ yang diperoleh langsung

dari organisme asalnya (#a$at, %11!, sedangkan "ell line ialah kultur yang

diperoleh dari subkultur pertama dari kultur primer (#a$at, %11!. Kultur sel

primer memiliki beberapa kelemahan di antaranya kebutuhan hean per"obaan

sebagai bahan baku kultur yang besar dan kemungkinan besar adanya kontaminasi

virus atau mikroba yang dapat menginfeksi hean per"obaan yang akan

digunakan sebagai stok kultur (#a$at, %11!.

B1 Tu3uan


3/13

ujuan dari praktikum disosiasi jaringan, penentuan kepadatan dan viabilitas

sel adalah membekali mahasisa dengan keterampilan untuk mempersiapkan

kultur primer.

II1 "ATERI DAN "ETODE

A1 "a2e4

lat-alat yang digunakan dalam praktikum disosiasi jaringan, penentuan

kepadatan dan viabilitas sel adalah alat bedah,petridish,waterbath,pinset, tabung

centrifuge, pipet ukur, centrifugator, mikroskop, cover glass, haemocytometer,

pocket scale, erlenmeyer, mikropipet dan tip,pembakar bunsen, etanol sprayer,

tube, counter, masker dangloves.

/ahan-bahan yang digunakan dalam praktikum disosiasi jaringan,

penentuan kepadatan dan viabilitas sel adalah hepar atau hepatopankreas ikan,

handling medium (medium 0#*# antibiotik!, disociating medium (medium

dasar antibiotik tripsin-*0!, washing medium (medium dasar serum!,

dan pearnatrypan blue.

B1 "e2(de

#etode yang dilakukan dalam praktikum ini adalah2

1. 3kan dibedah, dilumpuhkan dengan merusak syarafnya menggunakan

gunting. angan kemudian di"u"i dengan sabun hingga bersih.

. /agian abdomen dibersihkan dengan tissue yang sudah dibasahi alkohol

+%4.

). 0inding abdomen dibedah dengan alat bedah steril, hepar atau

hepatopankreas ikan kemudian diangkat dan diukur masanya denganpocket

scale. 5epatopankreas ikan yang telah ditimbang diletakkan dalampetridish

steril, kemudian ditambahkan handling medium agar hepar tidak alami

dehidrasi.

6. 5epar kemudian di"in"ang halus dan disentrifuse dengan ke"epatan %%%

rpm selama ) menit.

7. abung berisi jaringan dalam tripsin dimasukkan dalam waterbash dengan


4/13

temperatur )+o8. abung diagitasi setiap 7 menit agar suspensi homogen.

. :etelah diangkat dari waterbath tabung kemudian ditambahkan disociating

mediumdan kemudian disentrifugasi dengan ke"epatan %%% rpm selama )

menit.

+. :etelah disentrifugasi supernatan dalam tabung dibuang, kemudian pellet

dalam tabung ditambahkan washing medium dan disentrifugasi dengan

ke"epatan %%% rpm selama ) menit. ahap ini diulangi dua kali agar sisa

tripsin hilang.

;. :ebagian ke"il suspensi (9 bagian! diambil dan supernatan dibuang.

:uspensi yang diambil kemudian ditambahkan pearna trypan blue (1

bagian! dan dihomogenkan.

9. :uspensi yang telah diarnai diletakkan pada haemocytometerdan diamati

di mikroskop. &roporsi sel yang hidup dihitung dengan haemocytometer

untuk ditentukan viabilitas selnya. :el hidup tidak menyerap arna biru,

sedangkan sel mati akan menyerap arna biru.

1%. :isa suspensi sel dalam tabung steril dilabel dengan nama spesimen, nama

organ'sel, viabilitas, kepadatan, tanggal penyimpanan, dan nama kelompok.

:el hasil disosiasi kemudian disimpan dalamrefrigerator.


5/13

III1 HASIL DAN PE"BAHASAN

A1 Has4l

abel ).1. 5asil pengamatan disosiasi jaringan, penentuan kepadatan dan

viabilitas sel rombongan 3.

Kel

.

1% 774 1;,7 > 1%+

. 5epar %,%+ 1 , > 1%7 )9,+64 ;;,7 > 1%+

). 5epar %,%; 1 > 1%7 6),74 +,7 > 1%

6. 5epar %,%+ 1 1; > 1%7 71,1+4 1;,; > 1%+

&erhitungan

Kelompok 62 - 1%7

? 71, > ,7 > 1%7

? 1; > 1%7

=iabilitas sel ? @ :el hidup > 1%%4

@ :el total

? 1)1 > 1%%4

7

? 71,+4

1%7

%,%+

? 1;,; > 1%+


6/13

ambar ).1. Langkah-langkah kerja disosiasi jaringan, penentuan kepadatan dan

viabilitas sel.

Ao. ambar Keterangan

1. &ersiapan alat, medium, serta pengambilan

bagian dari organ hepatopankreas ikan yang

sebelumnya telah dimatikan dengan gunting.

. /agian hepatopankreas ikan yang telah

diperoleh dan ditimbang kemudian di"in"ang

halus dengan pisau bedah steril.

). 5epatopankreas dimasukkan dalam tabung

centrifuge dan ditambahkan 1ml handling

medium (#edium 0#*# antibiotik! agar

jaringan tetap segar, kemudian dihomogenkan.

6. 5epatopankreas dimasukan dalam aterbash

selama 17 menit dengan suhu )+o8, setiap 7

menit diagitasi untuk menghomogenkan

suspensi.

7. abung disentrifugasi %%% rpm selama ) menit

untuk memisahkan suspensi pellet dan

supernatan, supernatan kemudian dibuang.

. 0itambahkan 1ml disociating medium(medium

dasar antibiotik tripsin-*0!, kemudian

dihomogenkan dengan "arapipeting.


7/13

+. abung disentrifugasi %%% rpm selama )

menit.

;. :upernatan dibuang, kemudian ditambahkan

1ml washing medium (medium dasar serum!.

9. abung disentrifugasi dan diresuspensi

sebanyak B. 5al ini bertujuan untuk

menghilangkan sisa dari tripsin-*0.

1%. :etelah resuspensi dan sentrifugasi yang ke dua

supernatan kemudian dibuang kembali.

11. 0iambil sedikit, 9 bagian dari pellet, kemudian

ditambahkan 1 bagian pearna trypan blue.

1. :el diamati di mikroskop kemudian dihitung

sel yang hidup (tidak terarnai!, sel yang mati

(terarnai biru! pada haemocytometer,

kemudian dilakukan penghitungan kepadatan

sel dan viabilitas selnya. 5asil disosiasi

kemudian disimpan untuk persiapan kultur

monolayer.


8/13

B1 Pem)ahasan

5asil praktikum disosiasi jaringan, penentuan kepadatan dan viabilitas sel

diperoleh dataperhitungan dari rombongan 3 kelompok 1, yaitu jumlah kepadatan

sel yang diperoleh 1) > 1%sel'ml dan viabilitas sel yang diperoleh adalah 774

dari total sel 1;,7 > 1%+sel'ml dalam %,%+g hepar ikan. kelompok , yaitu jumlah

kepadatan sel yang diperoleh , > 1%7sel'ml dan viabilitas sel yang diperoleh

adalah )9,+64 dari total sel ;;,7 > 1%+sel'ml dalam %,%+g hepar ikan. kelompok

), yaitu jumlah kepadatan sel yang diperoleh > 1%7sel'ml dan viabilitas sel

yang diperoleh adalah 6),74 dari total sel +,7 > 1%sel'ml dalam %,%+g hepar

ikan.kelompok 6, yaitu jumlah kepadatan sel yang diperoleh 1; > 1% 7sel'ml dan

viabilitas sel yang diperoleh adalah 71,1+4 dari total sel 1;,; > 1%+sel'ml dalam

%,%+g hepar ikan. 5asil yang diperoleh masing-masing kelompok menunjukkan

hasil kepadatan sel, viabilitas sel, dan total sel yang berbeda-beda dari proses

disosiasi jaringan hepatopankreas ikan, hal ini dapat disebabkan oleh pengaruh

beberapa faktor. Faktor-faktor yang dapat mempengaruhi hasil praktikum

diantaranya adalah konsentrasi masing-masing larutan medium harus tepat, usia

organisme yang digunakan untuk disosiasi umumnya semakin tua suatu organisme

maka viabilitas selnya akan semakin berkurang, aseptivitas di sepanjang jalannya

praktikum harus selalu dijaga agar terhindar dari resiko kontaminan yang dapat

mempengaruhi hasil dari praktikum, ketepatan dan ketelitian saat melakukan

penghitungan menggunakan haemo"ytometer juga mempengaruhi hasil yang

didapat, selain itu faktor lain seperti kondisi suhu yang sesuai ()+4! dan aktu

yang tepat juga dapat menentukan efektifitas hasil praktikum. eknik kultur sel

digunakan untuk mempelajari ekspresi gen dan uji sitotoksik. Kultur sel primer

saat ini banyak diaplikasikan untuk penelitian di bidang biologi, termasuk

diantaranya studi mengenai proses diferensiasi, efek obat-obatan, serta analisa

kromosomal. 0ua teknik yang dipakai untuk mengkultivasi jaringan adalah teknik

enCimatis dan teknik eksplan se"ara langsung (Wanichpakorn, 2010!.

ahap pertama yang dilakukan untuk mendapatkan sel donor adalah

disosiasi jaringan dengan tujuan memisahkan sel-sel bagian atau jaringan pengikat

tempatnya melekat, dan menghilangkan bagian-bagian yang nekrotik, pembuluh

darah dan lemak yang menempel.


9/13

melalui proses pen"a"ahan dan pemipetan se"ara perlahan-lahan. 8ara lain adalah

se"ara enCimatik, yaitu dengan menggunakan enCim-enCim tertentu seperti tripsin,

kolagenase, elastase, hyaluronidase, 0Aase, pronase atau variasi dari beberapa

jenis enCim dalam larutan dapar atau medium tertentu sampai diperoleh suspensi

sel tunggal (Dorthington, %%)!. :elain bertujuan untuk mendapatkan suspensi sel

yang tunggal, teknik disosiasi yang efektif seharusnya menghasilkan suspensi sel

yang memiliki viabilitas tinggi dan dapat meminimumkan terjadinya proses

agregasi sel kembali pas"a disosiasi (Freshney, %%7!.

&raktikum kali ini menggunakan ) ma"am medium, yaitu handling

medium, diso"iating medium dan ashing medium. Handling mediummerupakan

salah satu medium yang memiliki fungsi untuk menjaga dan mempertahankan sel

agar tidak mengalami dehidrasi. :etiap 1 ml handling medium terdiri atas 97% ml

medium 0#*# ditambah 7% ml antibiotik. :etiap 1 ml diso"iating medium

terdiri atas ;7% ml medium dasar ditambah 7% ml antibiotik dan 1%% ml tripsin-

*0. :etiap 1 ml ashing medium terdiri atas 9%4 medium dasar ditambah

1%4 suplemen serum. :alah satu variasi dari media Eagles yaitu Dulbeccos

modified Eagles medium(0#*#! yang mengandung vitamin dan asam amino 6

kali lebih besar dan mengandung -6 kali lebih banyak glukosa dari medium

Eagles(#a$at, %11!.

ntibiotik digunakan untuk menghindari adanya resiko kontaminasi dari

patogen atau mikroba lain yang tidak diharapkan. ripsin dikenal sebagai enCim

pengurai yang kuat (Dorthington, %%)!. ripsin dapat meme"ah *8# sehingga

sel dengan jaringan terpisah. ripsin bertugas melepaskan matriks ekstraseluler

glikoprotein dari sel sekaligus menguraikan sisa-sisa matriks yang terdapat dalam

larutan disosiasi (


10/13

disosiasi tinggi disebabkan oleh kedua enCim yang berperan dalam proses

disosiasi tetapi viabilitas sel pada larutan disosiasi tetap tinggi. :erum juga

bermanfaat untuk melindungi medium dari efek toksisitas senyaa-senyaa

tertentu pada media yang digunakan (#ather E oberts, 199;!.

Grgan yang digunakan dalam praktikum disosiasi kali ini adalah bagian

dari hepatopankreas ikan, bagian ini dipilih karena memiliki struktur jaringan

yang lunak dan mudah untuk dilakukan proses disosiasi jaringan, menentukan

kepadatan sel dan viabilitas sel. =iabilitas didefinisikan sebagai jumlah sel-sel

yang mampu berkembang dalam medium kultur. 8ara untuk mengukur viabilitas

sel dan kepadatan sel dimulai dengan mengambil sebagian ke"il (9 bagian! dari

suspensi sel hasil disosiasi kemudian supernatan dibuang dan pellet diberi

pearna dengan pearna trypan blue dan kemudian dihomogenkan. &ellet

kemudian diletakkan pada haemo"ytometer dan diamati menggunakan mikroskop

"ahaya. 3nterpretasi yang tampak pada mikroskop adalah sel yang mati akan

menyerap arna trypan blue, sedangkan sel yang hidup tidak akan menyerap

arna. &roporsi sel yang hidup kemudian dihitung menggunakan

haemo"ytometer.Kepadatan sel dapat diperoleh dengan menghitung jumlah rata-

rata 7 kotak sedang dkalikan ,7 dikalikan lagi dengan 1%7.

=iabilitas sel dapat

dihitung dengan rumus jumlah total sel yang hidup dibagi dengan jumlah total sel

yang dihitung dikalikan dengan 1%%4(0oyle E riffiths, 199;!.


11/13

IV1 KESI"PULAN DAN SARAN

A1 Kes4m*ulan

/erdasarkan hasil dan pembahasan dapat diambil kesimpulan baha 2

1. Langkah aal yang perlu dilakukan untuk memperoleh kultur primer adalah

dengan melakukan disosiasi jaringan atau organ yang akan dikultur dan

kemudian menghitung kepadatan dan viabilitas sel yang akan dikultur.

B1 Saan

:ebaiknya dalam melakukan disosiasi jaringan ketika menentukan

kepadatan dan perhitungan viabilitas sel diperlukan ketelitian dalam menghitung

jumlah sel yang terlihat pada haemocytometer agar diperoleh hasil data yang

akurat.


12/13

DA.TAR RE.ERENSI

/ron, 8., F.


13/13

Acara2 (Disosiasi Jaringan, penentuan kepadatan dan viabilitas sel)NEW.docx

Documents

Transcript of Acara2 (Disosiasi Jaringan, penentuan kepadatan dan viabilitas sel)NEW.docx