BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Ciri Umum Kelompok Bacillus

Secara umum, Kelompok Bacillus merupakan bakteri berbentuk batang (basil), dan

tergolong dalam bakteri gram positif yang umumnya tumbuh pada medium yang

mengandung oksigen (bersifat aerobik) sehingga dikenal pula dengan istilah aerobic

sporeformers. Kebanyakan anggota genus Bacillus dapat membentuk endospora yang

dibentuk secara intraseluler sebagai respon terhadap kondisi lingkungan yang kurang

menguntungkan, oleh karena itu anggota genus Bacillus memiliki toleransi yang tinggi

terhadap kondisi lingkungan yang berubah-ubah.

Beberapa anggota Bacillus memiliki S-layer yang merupakan lapisan crystalline

dipermukaan subunit protein atau glikoprotein. Bagian kapsul kebanyakan anggota

Bacillus mengandung D atau L-glutamic acid, sedangkan beberapa lainnya memiliki

kapsul yang mengandung karbohidrat. Variasi struktur dinding sel seperti pada

kebanyakan bakteri gram negatif tidak ditemukan pada genus Bacillus. Dinding sel

vegetatif kebanyakan anggota Bacillus terbuat dari peptidoglikan yang mengandung

Meso-Diaminopimelic acid (DAP) dengan tipe Glyserol Teichoic Acid sangat bervariasi

diantara spesies. Kebanyakan anggota genus Bacillus merupakan bakteri yang bersifat

motil dan memiliki flagela tipe peritrik.

 Bakteri Bacillus sp. biasanya banyak ditemukan di tanah. Cara untuk mendapatkan

bakteri Bacillus sp. yaitu dengan mengambil sampel tanah menggunakan sendok yang

telah disterilisasikan terlebih dahulu kemudian ambil tanah sekitar kedalaman 3 cm dari

permukaan tanah. Bacillus sp. merupakan bakteri gram positif dengan sel batang

berukuran 0,3-22x1,27-7 πm, sebagian bersifat motil (mampu bergerak) mobilitasnya ini

disebabkan oleh flagel, jika dipanaskan akan membentuk endospora, yaitu bentuk dorman

sel vegetatif sebagai bentuk pertahanan diri yang muncul saat kondisi ekstrim yang tidak

menguntungkan bagi bakteri. Kandungan air endospora sangat rendah bila dibandingkan

dengan sel vegetatifnya, maka endospora berbentuk sangat padat dan sangat refraktil bila

dilihat di bawah mikroskop. Endospora dibentuk dalam sporangium di dalam sel dan

dibentuk saat sel masak. Endospora memiliki dinding tebal, reaktif, dan sangat resisten.

Letak endospora dalam sel ukuran selama pembentukannya tidak sama antara spesies satu

1

dengan lainnya. Beberapa spesies memiliki spora sentral, terminal, atau letal. Endospora

dapat berbentuk oval, silindris, bulat, atau lainnya.

Bacillus sp. bersifat aerob sampai anaerob fakultatif, metabolisme dengan

fermentasi dan respirasi. Isolat-isolat murni tersebut dipelihara dalam medium agar

miring. Untuk memastikan bahwa koloni-koloni tersebut adalah Bacillus, maka dilakukan

serangkaian pengujian yang bersifat spesifik yaitu pengecetan gram, pengecetan negatif

dan motilitasnya. Bacillus dibedakan dari anggota familia Bacillaceae lainnya

berdasarkan sifat-sifatnya yaitu: keseluruhannya merupakan pembentuk spora, hidup pada

kondisi aerob baik sebagai jasad yang sepenuhnya aerob maupun aerob fakultatif, selnya

berbentuk batang, dan memproduksi katalase. 

1.2 Jenis-jenis Bacillus

Kebanyakan anggota genus Bacillus adalah organisme saprofit yang lazim terdapat

dalam tanah, air, udara, dan tumbuh-tumbuhan, seperti Bacillus cereus dan Bacillus

subtilis. Beberapa di antaranya patogen bagi insekta Bacillus cereus dapat tumbuh pada

makanan dan menghasilkan enterotoksin yang menyebabkan keracunan makanan.

Organisme ini kadang-kadang dapat menimbulkan penyakit pada orang fungsi imun yang

terganggu (misalnya meningitis, endokarditis, endoftalmitis, konjungtivitis, atau gastro

enteritis akut). Bacillus anthracis, penyebab antraks adalah bakteri patogen utama genus

ini.

1. Bacillus anthracis

Kuman antraks banyak ditemukan pada penyakit zoonosis, infeksi pada ternak lembu,

kambing, domba dan babi. Kuman dikelurakan melalui feses, urin dan saliva binatang

yang terinfeksi dan bertahan hidup di ladang dalam bentuk spora untuk waktu yang lama

sekali.

Morfologi

Batang dengan ukuran 1 x 3-4 µm, dapat tersusun dengan seperti bamboo, bentuk

batangnya persegi atau cekung ujungnya, sendiri-sendiri, berpasangan atau membentuk

rantai pendek, tidak bergerak, berspora oval yang letaknya sental, kadang-kadang

berkapsul.

2

Struktur Antigen

Bahan simpai B anthracis, yang terdiri atas polipeptida berbobot molekul tinggi yang

mengandung asam D-glutamat, adalah suatu hapten. Badan bakteri mengandung protein

dan suatu polisakarida somatic, keduanya bersifat antigenik.

Patogenesis

Antraks terutama merupakan penyakit pada biri-biri, sapi, kuda, dan hewan lainnya;

manusia jarang terserang. Infeksi biasanya didapat dengan masuknya spora melalui luka

pada kulit atau selaput lendir, jarang dengan inhalasi spora ke dalam paru-paru. Pada

hewan, pintu masuknya adalah mulut dan saluran pencernaan. Spora dari tanah yang

tercemar mudah masuk bila termakan bersama tumbuhan berduri atau yang merangsang.

Pada manusia, goresan pada kulit atau inhalasi menyebabkan timbulnya infeksi.

Spora tumbuh pada jaringan di tempat masuk, dan pertumbuhan organisme vegetative

mengakibatkan pembentukkan edema gelatinosa dan kongesti. Basil menyebar melalui

getah bening ke dalam aliran darah, bakteri berkembang biak dengan bebas dalam darah

dan jaringan segera sebelum dan setelah kematian hewan. Dalam plasma hewan yang

mati karena antraks, telah ditemukan suatu faktor toksik. Bila diinokulasikan, zat ini

mematikan mencit atau marmot dan secara spesifik dinetralisasi oleh antiserum antraks.

Eksudat antraks mengandung polipeptida yang identik dengan polipeptida pada

simpai Bacillus, dan dapat menimbulkan reaksi histologik yang sama seperti reaksi akibat

infeksi antraks. Protein lain yang diisolasi dari eksudat merangsang kekebalan yang kuat

terhadap antraks bila disutikkan pada hewan. Dari filtrat (“toksin antraks”), telah

dipisahkan tiga zat dengan filtrasi gelas dan kromatrografi: (1) antigen proktektif, (2)

faktor edema, dan (3) faktor letal. Campuran dari (1), (2), dan (3) lebih toksik pada

hewan, dan campuran seperti ini lebih imunogenik daripada masing-masing zat sendiri-

sendiri. Pembentukan toksik berada di bawah pengaruh suatu plasmid; bila plasmid ini

hilang, toksik tidak diproduksi.

Tipe antraks yang lain adalah antraks pernapasan (“penyakit tukang sortir wool”).

Spora atraks yang terhirup dari debu wool, bulu atau kulit mengakibatkan berkembangnya

spora dalam paru-paru atau dalam kelenjar getah bening trakebronkial dan menimbulkan

mediastinitis hemoragik, pneumonia, meningitis, dan sepsis yang biasa cepat

menimbulkan kematian jumlah organisme dalam darah melebihi 10⁷/ mL.

3

Patologi

Pada hewan yang peka, organisme berkembang biak di tempat masuk. Simpai tetap

utuh, dan organisme dikelilingi oleh sejumlah besar cairan seperti protein yang

mengandung sedikit leukosit, organisme kemudian dengan cepat menyebar dan mencapai

aliran darah.

Pada hewan yang resisten, organisme berkembang biak selama beberapa jam, setelah

itu terkumpul sejumlah besar leukosit. Simpai lambat laun mengalami disintegrasi dan

menghilang. Organisme tetap terlokalisasi.

Gambaran Klinik

Pada manusia, antraks menimbulkan infeksi kulit (pustula ganas). Mula-mula timbul

popula dalam 12-36 jam setelah masuknya organisme atau spora melalui goresan. Papula

ini dengan cepat berubah menjadi visikel, kemudian pustula, dan akhirnya menjadi ulkus

nekrotik; lalu infeksi dapat menyebar, menimbulkan septikemia.

Pada antraks pernapasan, gejala dini dapat berupa mediastinitis, sepsis, meningitis

atau edema paru-paru hemoragik. Pneumonia hemoragik dengan syok merupakan gejala

yang terakhir.

Hewan sering terkena antraks dengan memakan sporanya dan organisme menyebar

lewat saluran usus, tetapi pada manusia hal ini jarang terjadi. Karena itu, sakit perut,

muntah dan diare berdarah jarang merupakan tanda-tanda klinik.

Tes Diagnostik Laboratorium

A. Bahan: Cairan atau nanah dari lesi lokal, darah, dahak.

B. Pewarnaan Sediaan: Dari lesi lokal atau darah hewan yang mati; rantai bakteri

terbentuk batang besar Gram-positif sering terlihat. Antraks dapat diidentifikasi

pada sediaan kering dengan teknik pewarnaan imunofluoresensi.

C. Biakan: Bila dibiakkan pada lempeng agar darah, organisme ini membentuk

koloni kelabu nonhemolitik dengan morfologi mikroskopis yang khas. Peragian

karbohidrat tidak bermanfaat. Pada perbenihan setengah padat, basil antraks selalu

tidak bergerak, sedangkan organisme tidak patogen yang sejenis (misal B cereus)

menunjukkan pergerakkan dengan “menyebar”. Biakan antraks virulen mematikan

mencit atau marmot bila disutikkan secara intraperitoneal.

4

D. Tes Serologi: Antibodi penyebab presipitasi atau hemaglutinasi dapat

diperlihatkan dalam serum orang atau hewan yang telah divaksinasi atau

terinfeksi.

Resistensi dan Kekebalan

Beberapa hewan (marmot) sangat peka, sedangkan yang lain (tikus) sangat resisten

terhadap infeksi antraks. Kenyataan ini diperkirakan akibat sejumlah mekanisme

pertahanan: aktivitas leukosit, suhu badan, dan daya bakterisidal darah. Polipeptida

tertentu yang mematikan hasil antraks telah diisolasi dari jaringan hewan. Polilisin

sintetik mempunyai daya kerja yang mirip.

Kekebalan aktif terhadap antraks dapat diinduksi pada hewan yang peka oleh

vaksinasi dengan basil hidup yang telah dilemahkan, dengan suspensi spora, atau dengan

antigen proktektif dan filtrate biakan. Serum imun kadang-kadang disuntikkan bersama

dengan basil hidup pada hewan. Imunisasi antraks didasarkan pada percobaan klasik

Louis Pasteur, yang pada tahun 1881 membuktikkan bahwa biakan yang telah tumbuh

dalam kaldu pada 42-52°C selama beberapa bulan akan kehilangan sebagian besar

virulensinya dan dapat disuntikkan hidup-hidup pada biri-biri dan sapi tanpa

menyebabkan penyakit; selanjutnya hewan-hewan ini terbukti kebal. Terdapat banyak

variasi mengenai kemanjuran berbagai vaksin.

Pengobatan

Banyak antibiotika efektif terhadap antraks pada manusia, tetapi pengobatan harus

dimulai sedini mungkin. Penisilin cukup memuaskan, kecuali pada pengobatan antraks

pernapasan, dimana mortilitas tetap tinggi. Beberapa basil Gram-positif lainnya mungkin

resisten terhadap penisilin karena membentuk-β-laktamase. Tetrasiklin, eritromisin, atau

klidamisin mungkin efektif.

Epidemiologi, Pencegahan dan Pengendalian

Tanah tercemar oleh spora antraks dari bangkai hewan. Spora-spora ini dapat tetap

hidup selama puluhan tahun. Mungkin spora dapat tumbuh dalam tanah pada pH 6,5 pada

suhu yang cocok. Hewan merumput yang terinfeksi melalui luka pada selaput lendir

menjadi penyambung rantai infeksi terus-menerus. Kotak dengan hewan yang terinfeksi

atau dengan kulit, rambut dan bulunya merupakan sumber infeksi pada manusia.

Tindakan pengendalian meliputi (1) pembuangan bangkai hewan dengan membakar atau

5

mengubur pada sumur yang dalam disertai kapur, (2) dekontaminasi produk-produk

hewan (biasanya dengan autoklaf), (3) baju dan sarung tangan pelindung waktu mengenai

bahan-bahan yang mungkin tercemar dan (4) imunisasi aktif hewan peliharaan dengan

vaksin hidup yang dilemahkan. Orang yang mempunyai resiko besar karena pekerjaanya

harus diimunisasi dengan vaksin bebas-sel yang dapat diperoleh dari Centers for Disease

Control, Atlanta, GA 30333.

2. Bacillus cereus

Dapat menyebabkan keracuann makanan dan juga menyebabkan pneumonia,

bronkopneumonia dan luka.

Morfologi

Bacillus cereus merupakan salah satu anggota genus Bacillus yang pertama kali

diisolasi pada tahun 1969 dari darah dan cairan pleura pasien pneumonia. Bacillus cereus

memiliki beberapa karakter morfologi diantaranya: Gram positif dengan lebar sel 0,9 –

1,2 µm dan panjang 3 – 5 µm.  motilitas positif, spora elipsoidal, sentral atau parasentral,

spora jarang keluar dari sporangia. Tidak membentuk kapsul, biasanya muncul dalam

bentuk rantai panjang tipe R. Bentuk koloni irregular, opague terkadang waxy. Pada

medium cair membentuk turbiditas moderate .

Enterotoksin

Bacillus cereus memiliki karakter yang mirip dengan Bacillus thuringiensis dan

Bacillus anthracis, namun tetap dapat dibedakan berdasarkan determinasi motilitas

(kebanyakan Bacillus cereus bersifat motil) dan adanya kristal toxin (hanya dihasilkan

oleh B. thuringiensis), aktivitas hemolisis (B cereus memiliki sifat ini, sedangkan B.

anthracis bersifat non-hemolitik).

Bacillus cereus menghasilkan beberapa enterotoksin dapat dalam makanan atau

dibentuk dalam usus penyebab penting dari infeksi mata, keratitis berat, endoftalmitis dan

panoftalmitis (khasnya bakteri masuk ke dalam mata melalui benda asing yang berkaitan

dengan trauma). Enterotoksin penyebab diare bersifat keracunan lewat makan (diarrheal

type). Enterotoksin penyebab muntah berkaitan pada nasi panas tercemar (emetic type)

dengan gejala mual, kejang otot perut. Dalam pertumbuhan Bacillus cereus menghasilkan

toksin selama pertumbuhan atau selama sporulasi.

6

Beberapa strain dari Bacillus cereus bersifat patogen dan berbahaya bagi manusia

karena dapat menyebabkan foodborne illness, namun beberapa diantaranya yang bersifat

saprofitik dapat bermanfaat sebagai probiotik dan juga penghasil antibiotik yang

potensial. Bacillus cereus kebanyakan ditemukan terkandung dalam bahan pangan dan

menyebabkan 2 tipe keracunan makanan: 1) emetic yang merupakan keracunan yang

dimediasi oleh toksin yang sangat stabil yang dapat bertahan pada temperatur tinggi, pH

ekstrim serta tahan terhadap enzim pencernaan seperti: trypsin, pepsin. 2) diarrhoeal

yang dimediasi oleh enterotoksin yang labil terhadap panas dan asam. Bacillus cereus

merupakan mikroorganisme yang dapat tumbuh pada kisaran temperatur yang luas dan

terdapat strain yang tergolong psychrophilic hingga thermophilic. Karena kebanyakan

strain Bacillus cereus hidup dalam gastro-intestinal dan menyebabkan infeksi diarrhoeal,

maka temperatur 37oC merupakan temperatur pertumbuhan yang optimal.

Antibiotika

Beberapa species utama genus Bacillus yang dapat memproduksi peptida antibiotik

diantaranya: Bacillus brevis (contoh: Gramicidin, Tyrothricin), Bacillus cereus (Cerexin,

Zwitermicin), Bacillus circulans (contoh: Circulin) , Bacillus laterosporus (contoh:

Laterosporin). Bacillus licheniformis (contoh: Bacitracin), Bacillus polymyxa (Polymixin,

Colistin), Bacillus pumilus (contoh: Pumilin) dan Bacillus subtilis (Difficidin, Subtilin,

Mycobacillin).

Bacillus cereus merupakan salah satu anggota genus Bacillus yang memiliki potensi

antibiotik. Bacillus cereus memproduksi Biocercin yang efektif menghambat

Staphylococcus aureus dan Staphylococcus albus dengan menggunakan protease pepton

agar sebagai medium uji. Spesies ini diketahui bersifat antagonistik terhadap Fusarium

roseum var sambucinum yang merupakan agen penyebab Potato Dry Root dengan

menggunakan medium uji potato dextrose agar.

Bacillus cereus memproduksi Mycocercin yang merupakan antibiotik peptida yang

efektif terhadap beberapa jenis yeast maupun mold dengan rentang minimal inhibitory

concentration antara 19,5 – 78 mikrogram/mL. Cerexin B merupakan antibiotik yang

efektif terhadap bakteri gram positif yang diproduksi oleh Bacillus cereus Gp-3 dan

merupakan antibiotik amphoteric acylpeptide. Bacillus cereus BMG 366-UF5 melalui

fermentasi dengan menggunakan spora sebagai inokulum awal, dapat memproduksi

Prumycin yang merupakan antibiotik yang juga diproduksi oleh Streptomyces

kagawaensis dengan aktivitas yang tidak jauh berbeda.

7

Zwittermicin A merupakan salah satu antibiotik golongan aminopolylol yang

diketahui efektif dalam menghambat beberapa patogen yang menyerang tanaman dengan

spektrum luas meliputi bakteri (baik gram positif maupun gram negatif), beberapa fungi

(seperti: oomycetes) dan protista (contohnya: alga). Zwittermicin A diketahui diproduksi

oleh beberapa strain Bacillus cereus diantaranya: Bacillus cereus UW 11, UW 32, UW

52, UW 56, UW 64, UW 78, UW 89, UW 96,UW 119 dan UW 120. Beberapa strain

tersebut selain memproduksi Zwittermycin A, juga memproduksi Kanosamin yang

merupakan antibiotik dengan spektrum luas.

Gejala-gejala Penyakit

Keracunan makanan karena B. cereus merupakan penamaan secara umum, walaupun

ada dua tipe penyakit yang disebabkan oleh dua metabolit yang berbeda. Penyakit dengan

gejala diare (tipe diare) disebabkan oleh protein dengan berat molekul besar, sementara

penyakit dengan gejala muntah (tipe emetik) diyakini disebabkan oleh peptida tahan

panas dengan berat molekul rendah.

Gejala-gejala keracunan makanan tipe diare karena B. cereus mirip dengan gejala

keracunan makanan yang disebabkan oleh Clostridium perfringens . Diare berair, kram

perut, dan rasa sakit mulai terjadi 6-15 jam setelah konsumsi makanan yang

terkontaminasi. Rasa mual mungkin menyertai diare, tetapi jarang terjadi muntah

(emesis). Pada sebagian besar kasus, gejala-gejala ini tetap berlangsung selama 24 jam.

Keracunan makanan tipe emetik ditandai dengan mual dan muntah dalam waktu 0.5

sampai 6 jam setelah mengkonsumsi makanan yang terkontaminasi. Kadang-kadang kram

perut dan/atau diare dapat juga terjadi. Umumnya gejala terjadi selama kurang dari 24

jam. Gejala-gejala keracunan makanan tipe ini mirip dengan gejala keracunan makanan

yang disebabkan oleh Staphylococcus aureus . Beberapa strain B. subtilis dan B.

licheniformis telah diisolasi dari kambing dan ayam yang dicurigai menjadi penyebab

kasus keracunan makanan. Organisme-organisme ini menghasilkan racun yang sangat

tahan panas yang mungkin mirip dengan racun penyebab muntah yang diproduksi oleh B.

cereus .

Keberadaan B. cereus dalam jumlah besar (lebih dari 10 6 organisme/g) dalam

makanan merupakan indikasi adanya pertumbuhan dan pembelahan sel bakteri secara

aktif, dan berpotensi membahayakan kesehatan.

8

Diagnosis

Bacillus cereus dipastikan sebagai penyebab suatu kasus keracunan makanan, apabila

(1) hasil isolasi Bacillus cereus menunjukkan bahwa strain-strain dari serotip yang sama

ditemukan pada makanan yang dicurigai dan dari kotoran atau muntahan pasien, atau (2)

hasil isolasi bakteri dari makanan yang dicurigai, kotoran, atau muntahan pasien

menunjukkan adanya sejumlah besar Bacillus cereus dari serotip yang dikenal sebagai

penyebab keracunan makanan, atau (3) dengan cara mengisolasi Bacillus cereus dari

makanan yang dicurigai dan menentukan kemampuannya dalam menghasilkan

enterotoxin ( enterotoxigenicity ) dengan uji serologis (untuk toxin penyebab diare) atau

uji biologis (untuk tipe diare dan emetik). Pada tipe emetik, waktu yang cepat munculnya

gejala segera setelah infeksi, didukung dengan beberapa bukti pada makanan, seringkali

sudah cukup untuk mendiagnosis keracunan makanan tipe ini.

Tes Diagnostik Laboratorium

Bacillus cereus non pathogen menunjukkan pergerakan dengan penyebaran

(swarming) pada media kultur seengah padat. Sel vegetatif dari Bacillus cereus dapat

tumbuh pada rentang temperatur 5– 50 oC dengan temperatur optimal antara 35 - 40 oC,

resisten terhadap pH 4,5–9,3. Dapat tumbuh pada anaerobic agar dan nutrien broth dan

penambahan NaCl 7%, nutritive agar serta nutritive agar dengan 7 – 10 % darah domba.

Waktu generasi relatif singkat, antara 20 – 30 menit. Dalam medium GA, Bacillus cereus

telah mencapai fase eksponensial pada 6 jam inkubasi dan mencapai fase stasioner 20 jam

setelah inkubasi.

Patogenesis

Bacillus cereus bertanggung jawab untuk sebagian kecil penyakit bawaan makanan

(2-5%), menyebabkan mual muntah, parah dan diare penyakit bawaan makanan Bacillus.

Terjadi karena kelangsungan hidup endospora bakteri ketika makanan tidak benar

matang. Memasak suhu kurang dari atau sama dengan 100 ° C (212 ° F) memungkinkan

beberapa spora Bacillus cereus untuk bertahan hidup. Masalah ini diperparah ketika

makanan itu tidak benar didinginkan, yang memungkinkan endospores untuk

berkecambah. Makanan dimasak tidak dimaksudkan untuk dipakai sendiri atau

pendinginan yang cepat dan pendinginan harus disimpan pada suhu di atas 60 ° C (140 °

F). Perkecambahan dan pertumbuhan umumnya terjadi antara 10-50 ° C (50-122 ° F),

meskipun beberapa strain psychrotrophic hasil pertumbuhan bakteri dalam produksi

9

enterotoksin, salah satunya sangat tahan terhadap panas dan pH antara 2 dan 11;.

konsumsi menyebabkan dua jenis penyakit, diare dan muntah (muntah) sindrom .

Makanan yang Terkait

Berbagai jenis makanan, termasuk daging, susu, sayuran, dan ikan, berkaitan dengan

penyebab keracunan makanan tipe diare. Kasus-kasus tipe emetik umumnya berkaitan

dengan makanan dari beras. Walaupun demikian, makanan bertepung lainnya seperti

kentang, pasta, dan keju juga dapat menjadi penyebabnya. Campuran makanan seperti

saus, pudding, sup, casserole (sejenis makanan yang dimasak dalam wadah tertutup di

atas api kecil), pastry (sejenis kue), dan salad sering dicurigai sebagai penyebab dalam

kasus-kasus keracunan makanan.

Pencegahan

Pencegahan secara total mungkin tidak dapat dilakukan. Namun demikian, makanan

yang dimasak, dipanaskan, dan disimpan dengan benar umumnya aman dari racun yang

menyebabkan muntah. Resiko paling besar yaitu kontaminasi silang, yakni apabila

makanan yang sudah dimasak bersentuhan dengan bahan mentah atau peralatan yang

terkontaminasi (misalnya alas pemotong).

Tipe emetik umumnya berkaitan dengan makanan yang mengandung tepung, yang

disimpan dengan cara yang tidak benar (misalnya nasi, pasta). Penyimpanan dengan

benar (di bawah 7°C dan hanya untuk beberapa hari) akan mencegah pertumbuhan

mikroorganisme dan produksi racun.

Populasi Rentan

Semua orang diyakini rentan terhadap keracunan makanan oleh Bacillus cereus.

Epidemiologi

Bacillus sp termasuk kedalam family Bacillaceae. Untuk bakteri Bacillus cereus

sendiri merupakan bakteri gram positif, bersifat aerobik, dan mampu membentuk spora

yang dapat ditemukan di tanah, pada sayuran maupun produk pangan (Tay, et al., 1982).

Spora dari jenis bakteri ini tahan terhadap panas dan kondisi lingkungan yang tidak

menguntungkan dan mampu membentuk kecambah dalam larutan yang mengandung

NaOH dan HCL.

10

3. Bacillus subtilis

Dapat menyebabkan meningitis, endokarditis, infeksi mata dan lain-lainnya.

Morfologi

Bacillus subtilis termasuk jenis Bacillus. Bakteri ini termasuk bakteri gram positif,

katalase positif yang umum ditemukan di tanah. Bacillus subtilis mempunyai kemampuan

untuk membentuk endospora yang protektif yang memberi kemampuan bakteri tersebut

mentolerir keadaan yang ekstrim. Tidak seperti species lain seperti sejarah, Bacillus

subtilis diklasifikasikan sebagai obligat anaerob walau penelitian sekarang tidak benar.

Bacillus subtilis tidak dianggap sebagai patogen walaupun kontaminasi makanan tetapi

jarang menyebabkan keracunan makanan. Sporanya dapat tahan terhadap panas tinggi

yang sering digunakan pada makanan dan bertanggung jawab terhadap kerusakan pada

roti.

Bacillus subtilis selnya berbentuk basil, ada yang tebal dan yang tipis. Biasanya

bentuk rantai atau terpisah. Sebagian motil dan adapula yang non motil. Semua

membentuk endospora yang berbentuk bulat dan oval.  Bacillus subtilis merupakan jenis

kelompok bakteri termofilik yang dapat tumbuh pada kisaran suhu 45 °C – 55 °C dan

mempunyai pertumbuhan suhu optimum pada suhu 60 °C – 80 °.

Bacilus Subtilis ini awalnya bernama Vibro subtilis oleh Christian Gottfried

Ehrenberg pada tahun 1835. Kemudian nama Bacillus subtilis dikenalkan oleh Ferdinand

Cohn pada 1872. Bacillus subtilis telah digunakan sepanjang 1950 sebagai alternatif dari

obat karena efek immunostimulatory sel dari masalah, yang pada pencernaan telah

ditemukan secara signifikan untuk kekebalan aktivasi antibodi spesifik GM, IgG ,dan Iga

keluarnya. Bakteri ini dipasarkan di seluruh Amerika dan Eropa dari 1946 sebagai

immunostimulatory bantuan dalam usus dan perawatan dari penyakit urinary tract seperti

Rotavirus dan Shigella, tetapi ditolak popularitasnya setelah pengenalan konsumen

antibiotik murah walaupun kurang menyebabkan reaksi alergi kesempatan yang cukup

rendah dan racun normal flora usus.

Toksik

Bacillus subtilis tidak dianggap sebagai manusia pathogen; dapat mencemari makanan

tetapi jarang menyebabkan keracunan makanan. Bacillus subtilis produces the proteolytic

enzyme subtilisin . Bacillus subtilis menghasilkan enzim proteolytic yang subtilisin.

Bacillus subtilis spores dapat hidup yang ekstrim pemanasan yang sering digunakan

11

untuk memasak makanan, dan bertanggung jawab untuk menyebabkan kekentalan yang

lengket, membenang konsistensi yang disebabkan oleh bakteri produksi panjang rantai

polysaccharides dan manja dalam adonan roti.

Bacillus subtilis dapat membagi asymmetrically, memproduksi sebuah endospore

yang tahan terhadap faktor lingkungan seperti panas, asam, dan garam, yang dapat berada

di dalam lingkungan dalam jangka waktu yang lama. Endospore adalah yang dibentuk

pada saat gizi stres, memungkinkan organisme untuk terus berada di dalam lingkungan

sampai kondisi menjadi baik. Sebelum proses untuk menghasilkan spora bakteri melalui

proses produksi flagella dan mengambil DNA dari lingkungan.

Bacillus subtilis terbukti untuk manipulasi genetik, karena itu telah menjadi banyak

diadopsi sebagai model organisme untuk penelitian laboratorium, terutama dari

sporulation, yang merupakan contoh sederhana dari diferensiasi selular. Hal ini juga

sangat flagellated, yang memberikan B. subtilis kemampuan untuk bergerak sangat cepat.

Keguanaan lain bakteri ini cukup banyak sekarang dangan berkembangnya teknologi.

Bacillus subtilis strain QST 713 (dipasarkan sebagai QST 713 atau serenade) memiliki

alam berhubung dgn fungisida aktivitas, dan bekerja sebagai agen kontrol biologi.

populer di seluruh dunia sebelum pengenalan konsumen antibiotik immunostimulatory

sebagai agen untuk membantu perawatan gastrointestinal dan penyakit urinary tract. Hal

ini masih banyak digunakan di Eropa Barat dan Timur Tengah sebagai alternatif obat.

dapat dikonversi menjadi peledak berbahaya compounds dari nitrogen, karbon dioksida,

dan air. recombinants Bacillus subtilis str. pBE2C1 dan Bacillus subtilis str. pBE2C1AB

digunakan dalam produksi polyhydroxyalkanoates (PHA) dan agar mereka dapat

menggunakan gandum terendam air limbah sebagai sumber karbon untuk menurunkan

biaya produksi PHA.

12

BAB II

IDENTIFIKASI

2.1 Metode Penanaman Bakteri

Penanaman bakteri atau biasa disebut juga inokulasi adalah pekerjaan memindahkan

bakteri dari medium yang lama ke medium yang baru dengan tingkat ketelitian yang

sangat tinggi. Untuk melakukan penanaman bakteri (inokulasi) terlebih dahulu

diusahakan agar semua alat yang ada dalam hubungannya dengan medium agar tetap

steril, hal ini agar menghindari terjadi kontaminasi.

Berdasarkan wujud atau bentuk media dan sifat media, dimana dikenal beberpa cara

penanaman bakteri, yaitu:

A. Penanaman pada media padat bentuk plate

Tujuan:

- Untuk mengisolasi/ memisahkan pertumbuhan bakteri satu dengan lainnya (yang

ditanam specimen)

- Untuk memperbanyak bakteri (yang ditanam culture bakteri atau koloni bakteri)

- Untuk menghitung jumlah kuman (yang ditanam, suspensi sampel)

Cara penanaman:

1. Goresan sejajar : (isolasi)

a. Ose dibakar sampai steril, dinginkan

b. Dengan ose yang sudah steril diambil sampel atau bakteri culture, dipulaskan

di salah sisi/ tepi media jangan menyentuh dinding petridish

c. Dengan ose steril yang lain, pulasan itu digores-goreskan sejajar sampai

memenuhi permukaan media.

2. Goresan sejajar melingkar : (isolasi)

a. Ose dibakar sampai steril, dinginkan

b. Dengan ose yang sudah steril diambil sampel atau bakteri cultur, dipulaskan di

salah sisi/ tepi media jangan menyentuh dinding petridish

c. Dengan ose steril yang lain, pulasan itu digores-goreskan sejajar pada salah

satu tepi media, dengan salah satu sisinya

d. Ose dibalik dengan melanjutkan goresan-goresan sejajar pertama, setelah

medianya diputar 90°C

13

e. Dengan ose yang dimiringkan goresan-goresan sejajar kedua, digoreskan

sejajar lagi setelah medianya diputar 90°C

f. Media diputar 90°C, goresan-goresan sejajar yang ketiga digoreskan sejajar

lagi dengan ose yang sudah dibalik, sampai memenuhi permukaan media

plate.

3. Cara taburan : (isolasi dan memperbanyak)

a. Suspensi sampel, sampel cair atau cultur bakteri di dalam media cair diambil

dengan pipet steril sebanyak 0,1 ml diteteskan di permukaan media plate tepat

ditengah-tengahnya

b. Dengan menggunakan spatel yang terbuat dari kaca/kawat, yang sudah steril

dan dingin, tetesan itu diratakan pada seluh permukaan media plate.

4. Cara penuangan : (penghitungan)

a. Suspensi sampel/ sampel cair diteteskan ke dalam petridish steril ssebanyak

0,1 atau 1 ml secara steril

b. Dituangi media padat steril yang dicairkan, sebanyak sampai menutupi semua

permukaan dasar petridish

c. Campur baik-baik, tunggu sampai agar-agarnya membeku

d. Dibalik, masuk incubator 37°C 48 jam

Catatan: Media yang digunakan tergantung dari jenis bakteri yang dihitung.

Pembacaan:

- Pertumbuhan bakteri pada media padat disebut “koloni” yaitu kelompokan-

kelompokan bakteri yang tumbuh pada media tersebut

- Koloni bakteri pada media padat dengan tujuan isolasi dapat dibedakan

berdasarkan criteria sebagai berikut:

1. Ukuran : diukur berapa diameternya dengan satuan mm

2. Warna : putih, kuning, hitam, hijau, merah dan sebagainya

3. Bentuk : bulat, serabut, bergelombang, rhizoid dan sebagainya

4. Permukaan : datar, cembung, cekung, kasar (rough), halus (smooth)

5. Sifatnya : keruh, jernih, kering, berlendir, melekat pada perbenihan,

menjalar, haemolytis, anhaemolytis dan sebagainya.

- Koloni bakteri yang tumbuh pada media padat bentuk plate, dengan tujuan

“memperbanyak”, yang penting diperhatikan selain adanya pertumbuhan koloni

juga kemurniaan koloni itu

14

- Koloni bakteri yang tumbuh pada media padat bentuk plate, dengan tujuan

“penghitungan”, criteria koloni tidak perlu diperhatikan, tetapi tinggal dihitung

saja.

B. Penanaman pada media padat di dalam tabung bentuk miring

Tujuan:

- Untuk memperbanyak bakteri

- Untuk identifikasi

- Untuk menyimpan bakteri

Cara penanaman:

1. Goresan zig-zag:

a. Dengan ose yang sudah steril dan dingin, diambil koloni bakteri

b. Tutup tabung media dibuka dengan menjepit menggunakan jari kelingking

kanan, mulut tabung dibakar dengan nyala api tidak berjelaga

c. Ose yang sudah berisi koloni bakteri digoreskan zig-zag pada permukaan

media, betul-betul ditengah media tidak terlalu kebawah/ keatas dan juga tidak

terlalu kekiri/ kekanan

d. Mulut tabung dibakar lagi, segera ditutup dengan tutupnya

e. Ose dibakar lagi sampai steril

Contoh: Media nutrient agar

2. Goresan zig-zag dan ditusuk:

Pelaksanaan penanamannya seperti nomor 1 dengan perbedaan sebagai berikut:

Urutan c setelah digoreskan zig-zag kemudian ditusukkan ditengah-tengahnya 1

sampai 2 kali, Contoh: Media TSIA

Pembacaan:

Koloni yang tumbuh diperhatikan kemurniannya, kemudian dibaca perubahan-

perubahan yang terjadi pada media dengan atau tanpa penambahan reagensia.

C. Penanaman pada media semisolid di dalam tabung

Tujuan:

- Untuk identifikasi bakteri

- Untuk menyimpan bakteri

15

Cara penanaman:

a. Ose jarum penanam steril, dinginkan

b. Dengan ose itu diambil koloni bakteri

c. Tutup tabung dibuka dengan menggunakan jari kelingking kanan

d. Mulut tabung dibakar sebentar, ose yang sudah ada koloni bakterinya ditusukkan

tegak lurus di permukaan bagian tengah sampai dasar tabung

e. Mulut tabung dibakar lagi dan ditutup kembali. Begitu pula osenya dibakar/

disteril kembali.

Pembacaan:

Koloni yang tumbuh diperhatikan kemurniannya dahulu, kemudian dibaca perubahan-

perubahan yang terjadi pada media itu (warna, gerak, dan sebagainya) dengan atau

tanpa penambahan reagensia.

D. Penanaman pada media cair

Tujuan:

- Untuk memperbanyak cultur bakteri

- Untuk melihat gerak bakteri

- Untuk identifikasi

Cara penanaman:

a. Ose dibakar sampai steril, dinginkan

b. Dengan ose yang sudah steril dan dingin, diambil koloni bakteri

c. Tutup tabung media dibuka, mulutnya dibakar

d. Ose yang sudah berisi koloni bakteri digores-goreskan pada dinding tabung bagian

dalam sebelah atas yang tadinya tertutup oleh cairan media

e. Mulut tabung dibakar, tutup kembali. Ose bekas pakai juga dibakar sampai steril

f. Setelah tabung diletakkan pada raknya (ditegakkan), goresan bakteri akan

terendam cairan media.

Pembacaan:

Kalau bakteri yang ditanam dapat tumbuh didalam media cair itu, medianya menjadi

keruh. Kalau tidak tumbuh medianya tetap jernih.

Apabila bakterinya ditanam didalam media yang untuk identifikasi, disamping

kekeruhan dapat juga diikuti perubahan warna indikatornya yang merupakan pertanda

adanya perubahan/ pemecahan gula/bahan kimia yang terkandung dalam itu.

16

2.2 Identifikasi Bakteri

Tujuan identifikasi bakteri, yaitu:

1. Menentukan arti penting pengobatan

2. Pedoman perawatan klinis

3. Menentukan uji kepekaan terhadap antibiotika

4. Menentukan apakah jenis mikroorganisme berbahaya berpengaruh pada kesehatan

Adapun prinsip identifikasi, yaitu:

1. Identifikasi mikroorganisme menggunakan kriteria Genotip:

Identifikasi karakteristik bakteri menggunkan teknik molekuler untuk analisis DNA

dan RNA

2. Identifikasi mikroorganisme menggunakan kriteria Fenotif:

- Mikroskopis dengan pewarnaan Gram

- Isolasi : morfologi koloni dengan identifikasi

- Kebutuhan lingkungan untuk pertumbuhan

- Kepekaan terhadap antibiotika

- Kebutuhan nutrisi dan kemampuan metabolik

2.3 Isolasi dan Identifikasi Bacillus

A. Alat

- Jarum ose

- Object glass

- Mikroskop

- Mikrometer

- Kertas merang

- Tabung reaksi

- Pipet tetes

- Beaker glass

- Cawan petri

- Oven

- Pembakar spirtus

- Inkubator

- Wrapper

B. Bahan

- Aquades

- Alkohol 70%

- Alumunium foil

- Medium Nutrient Agar (NA)

- Nitrat Broth (NB)

- Malachite Green

- Sterch Agar (SA)

- SIMA Semisolid

17

- Skim Milk Agar (SMA)

- Simon Citrat

- MR-VP Broth

- KOH-Alfanafto

- Reagen A dan B,

- NB 0%

- NB +NaCl (6,5%, dan 10 %)

- Kristal Violet

- Lugol’s Iodine

- Safranin

- Etanol 96%

- Reagen H₂O₂

- Media Rafinosa

- Laktosa

- Reagen Oksidase

C. Metode

- Hari I :

Spesimen ditanam pada Blood agar plate dan Mac Conkey.

Masuk inkubator 37°C 24 jam. (hasil pada Hari II)

- Hari II :

Koloni yang tersangka dari Blood agar plate dicat Gram. Kalau ditemukan Gram

(+) batang kemudian ditanam pada media gula dan media lainnya.

Masuk inkubator 37°C 24 jam. (hasil pada Hari III)

- Hari III :

Dibaca dan dicatat pertumbuhan pada media gula dan media lainnya, dilakukan

test kimia.

D. Cara Kerja

a. Pengambilan Sampel

1. Tanah diambil secara aseptis

2. Alumunium foil disiapkan yang sebelumnya disterilkan terlebih dahulu dengan

alkohol 70%

3. Sampel diambil dengan cepat dan dengan hati-hati dimasukkan ke dalam

alumunium foil steril kemudian ditutup rapat.

b. Tahap Isolasi Bacillus

1. Preparasi suspensi dilakukan

2. Sampel tanah dimasukkan ke dalam tabung pengenceran pertama

3. Sampel tanah direbus pada suhu 80oC selama 10 menit

18

c. Tahap Pemurnian Dengan Metode Streak Kuadran

1. Dipilih satu koloni yang nampak terdiri dari satu tipe sel

2. Jarum ose dibakar, setelah dingin disentuhkan ke permukaan koloni bakteri

yang akan disteak pada plating NA

3. Streak ini dianggap sebagai sterak primer pada permukaan NA

4. Jarum ose dibakar, diangkat lalu didinginkan dan disteakan melewati streak

primer kesatu atau kedua dan kemudian dilanjutkan kestreak sekunder tanpa

kembali kestreak primer

5. Jarum ose dibakar, diangkat lalu didinginkan melewati streak sekunder dan

kemudian dilanjutkan kestreak tersier tanpa kembali kestreak primer dan

sekunder diinkubasi pada suhu 30oC selama 2 x 24 jam

d. Pengamatan Morfologi Koloni

1. Dibuat biakan pada media Nutrient Agar (NA) cawan

2. Diinkubasi 2 x 24 jam pada suhu 30oC

3. Diamati perbedaan bentuk koloni, ukuran, margin, elevasi, dan permukaan.

e. Pengukuran Panjang Dan Lebar Sel

1. Disiapkan mikroskop yang telah dipasang mikrometer okuler yang sudah

terkalibrasi

2. Dibuat preparat ulas bakteri uji dengan metode pewarnaan sederhana

mengggunakan pewarna Methylen Blue

3. Diukur panjang dan lebar sel, kemudian dihitung panjang dan lebar sel

sebenarnya

f. Uji Pewarnaan Gram

1. Dibuat ulasan bakteri pada object glass, kemudian difiksasi

2. Ditetesi dengan gram A (Kristal violet), dibiarkan selama 60 detik

3. Dicuci dengan air mengalir, lalu dikeringanginkan

4. Ditetesi dengan gram B (lugol’s iodine), dibiarkan selama 60 detik

5. Dicuci dengan air mengalir, lalu dikeringanginkan

6. Dicuci dengan gram C(ethanol 96%) setetes demi settee sampai etanol yang

jatuh berwarna bening

7. Ditetesi dengan gram D (safranin), dibiarkan selama 45 detik, dicuci dan

dikeringanginkan

8. Diamati dibawah mikroskop

19

g. Uji Pewarnaan Endospora

1. Dibuat ulasan bakteri pada object glass lalu ditutupi dengan kertas merang

2. Ditetesi dengan Malachite Green diatas kertas merang dan diletakkan di atas

air mendidih

3. Dibiarkan selama lim menit, jika pinggir mulai mongering, ditambahkan lagi

Malachite Green

h. Uji Motilitas

1. Diinokulasikan bakteri uji pada medium SIMA semisolid sebanyak 1 ose

2. Diinkubasi selama 2 x 24 jam pada temperatur 30oC

3. Dilihat pertumbuhan koloni bakterinya yang ada pada amedium SIMA

semisolid

i. Uji Hidrolisis Starch

1. Diinokulasikan bakteri uji pada medium padat Starch Agar sebanyak 1 ose.

2. Diinkubasi selama 2 x 24 jam pada temperature 30oC

3. Permukaan media ditetesi dengan larutan Lugol’s Iodine.

4. Diamati perubahan yang terjadi, jika terbentuk zona jernih di sekitar koloni

menandakan hasil uji positif, dan jika tidak terbentuk zona jernih (warna biru

reagen) menandakan hasil uji negatif

j. Uji Hidolisis kasein

1. Diinokulasikan bakteri uji pada medium padat SMA sebanyak 1 ose.

2. Diinkubasi selama 2 x 24 jam pada temperatur 30oC

3. Diamati perubahan yang terjadi, jika terbentuk zona jernih di sekitar koloni

menandakan hasil uji positif, dan jika warna media tetap menandakan hasil uji

negatif

k. Uji VP (Voges Proskauer)

1. Diinokulasikan bakteri uji pada medium cair MR-VP sebanyak 1 ose

2. Diinkubasi selama 2 x 24 jam pada temperatur 30oC

3. Bakteri ditetesi dengan alfanaftol 3 tetes dan KOH 40 % 2 tetes

4. Diamati perubahan yang terjadi, jika media berubah menjadi merah muda s.d

merah setelah penambahan alfanaftol dan KOH 40% menandakan hasil uji

positif, dan jika tidak terbentuk warna tersebut maka menandakan hasil uji

negatif

20

l. Uji Katalase

1. Dibuat preparat ulas bakteri pada objek glass

2. Ditetesi dengan larutan H2O2

3. Diamati perubahan yang terjadi

4. Jika terbentuk gelembung gas menunjukka bahwa hasil uji positif dan

sebaliknya

m. Uji Oksidase

1. Dibuat preparat ulas bakteri pada objek glass, tutup dengan potongan tissue

2. Ditetesi dengan reagen oksidase

3. Diamati perubahan yang terjadi

4. Hasil positif jika berwarna biru marun, hasil uji negatif yaitu tidak terbentuk

warna biru marun

n. Uji Penggunaan Sitrat

1. Diinokulasikan bakteri uji pada medium agar miring Simon’s Citrate sebanyak

1 ose

2. Diinkubasi selama 2 x 24 jam pada temperatur 30oC

3. Diamati perubhan yang tejadi, jika hasil positif media berwarna biru

sedangkan hasil negatif tetap berwarna hijau.

o. Uji Gula

1. Bakteri uji ditumbuhkan pada medium Rafinosa dan Laktosa

2. Diinkubasi selama 2 x 24 jam pada temperatur 30oC

3. Diamati perubahannya, hasil positif jika media berubah warna dari ungu

menjadi kuning dan hasil negatif jika media tetap berwarna ungu.

p. Uji Reduksi Nitrat

1. Diinokulasikan bakteri uji pada medium cair Nitrate Broth sebanyak 1 ose

2. Diinkubasi selama 2 x 24 jam pada temperatur 30oC

3. Diteteskan 1 ml nitrat reagen A dan dilanjutkan dengan nitrate reagen B

4. Hasil positif jika terbentuk warna merah tua/ merah gelap, jika belum

terbentuk warna merah, ditambahkan bubuk seng (sampai dengan 5 mg/ml

media) dan diamati jika terbentuk warna merah maka hasi pengujian positif

21

q. Uji Toleransi NaCl

Dibuat tiga buah tabung Nutrient Broth yang mengandung Nacl 0%, 6,5 %, dan 10 %

1. Isolat diinokulasikan dengan streak kontinyu

2. Diinkubasi selama 2 x 24 jam pada temperatur 30oC

3. Diamati hasilnya dengan melihat tingkat kekeruhan pada media

r. Penentuan Spesies Melalui Pendekatan Homologi

1. Data-data yang diperoleh dibandingkan dengan data karakter bakteri dari

sumber

2. Ditentukan persen homologinya dengan rumus

% Homologi = Jumlah karakter yang sama x 100% Jumlah karakter yang diujikan

E. Hasil Pengamatan dan Pembahasan

a. Hasil

Tabel 1. Pengamatan Morfologi Sel

No Pengamatan Hasil

1. Bentuk koloni Circular

2. Ukuran Moderate

3. Elevasi Convex

4. Margin Entire

5, Permukaan Halus mengkilap

Tabel 2. Perbandingan Isolat dan Spesies-spesies Bacillus

No Jenis Uji Isolat A B C D E

1. Gram + + + + + +

2. Endospora + + + + + +

3. Katalase +

4. Starch + + + + + +

5. Casein + + + + + +

6. Rafinossa - - - - d +

7. NaCl 10% - + d d - d

22

8. Sitrat - - d + + +

9. Motilitas - - + + + +

10. VP + + + + - +

11. Oksidase + d d d - -

Tabel3. Pada Media Gula-gula

No Spesies Glukosa Laktosa Mannitol Maltosa Sukrosa

1.

2.

3.

B. anthracis

B. cereus

B. subtilis

+

+

+

-

-

-

-

-

+

+

+

±

+

+/-

+

Tabel 4. Pengukuran Homologi

No Jenis Uji IA IB IC ID IE

1. Gram 1 1 1 1 1

2. Endospora 1 1 1 1 1

3. Starch 1 1 1 1 1

4. Casein 1 1 1 1 1

5. Rafinossa 1 1 1 0 0

6. NaCl 10% 0 0 0 1 0

7. Sitrat 0 0 0 0 0

8. Motilitas 1 0 0 0 0

9. VP 1 1 1 0 1

10. Oksidase 1 1 1 0 0Jumlah  karakter yang sama

8 7 7 5 5

% Homologi = Jumlah karakter yang sama x 100%Jumlah karakter yang diujikan

= 8 x 100 % = 80 % 10

Keterangan :

d    =    16-84% strain positifA   =    Bacillus anthracisB   =    Bacillus cereus

C   =    Bacillus thuringiensisD   =    Bacillus megateriumE    =    Bacillus subtilis

23

b. Pembahasan

Pengambilan sampel (tanah kandang) dilakukan dengan cara sterilisasi

sendok yang ingin dipakai terlebih dahulu dengan menggunakan autoklaf

kemudian ambil sampel tanah kedalaman 3cm dari permukaan, masukkan

kedalam alumunium foil yang sebelumnya disterilisasikan terlebih dahulu

dengan menggunakan alkohol 70% kemudian ditutup rapat. Pengambilan

sampel dilakukan dengan mensterilisasikan alat terlebih dahulu agar dapat

dilindungi dari kontaminasi. Dilakukan dengan prosedur kerja aseptik dengan

senyawa desinfektan yang sesuai. Menyesuaikan wadah sampel yang diambil

dan metode yang sesuai dengan jenis sampel.  Kemudian sampel yang

mengandung bakteri tersebut dijaga agar tetap menggambarkan kondisi yang

ada sebelum memasuki tahap analisa.

Isolasi Bacillus sp. dilakukan dengan cara sampel tanah yang telah

didapat dimasukkan kedalam tabung yang berisi akuades steril kemudian

direbus 10 menit dengan suhu 80°C diatas dandang, tanah rebusan

diinokulasikan kedalam cawan yang telah berisi medium NA kemudian

disreak sinambung, inkubasi selama 2x24 jam dengan suhu ruang. Proses

perebusan dilakukan agar bakteri yang diinginkan (Bacillus sp.) membentuk

endospora. Terbentuknya endospora bertujuan untuk melindungi bakteri dari

lingkungan yang kurang menguntungkan (Sudjadi, 2006).

Misalnya, lingkungan yang terlalu kering, banyak mengandung bahan

kimia, dan panas yang terlalu tinggi. Endospora memiliki dinding yang tebal,

oleh karena itu bakteri yang menghasilkan endospora dapat bertahan hidup

pada lingkungan yang ekstrim. Jika keadaan lingkungan membaik, maka

pembungkus spora segera pecah dan bakteri kembali memulai aktivitas

hidupnya sebagaimana biasanya. Contoh bakteri yang menghasilkan

endospora adalah Bacillus dan Clostridium (Sudjadi, 2006).

 Pemurnian sampel dari hasil yang telah diisolasi dilakukan dengan cara

pemilihan satu koloni (koloni tunggal) yang nampak terdiri dari satu tipe sel,

amati bakteri Bacillus sp. inokulasikan ke media NA disteak kuadran

kemudian diinkubasi selama 2x24 jam dengan suhu ruang 30oC. Hasil

pemurnian ambil koloni tunggal kemudian diamati bentuk, ukuran, elevasi,

permukaan, dan margin didapatkan hasil koloni berbentuk bulat atau circular,

24

berukuran sedang atau moderate, elevasi convex, permukaan halus mengkilap,

dan margin entre. Bacillus berbentuk bulat (coccus), memiliki permukaan

yang halus dan mengkilap.

Koloni tunggal yang terbentuk diperiksa menggunakan pewarnaan Gram

untuk melihat karakteristik dinding sel dan bentuk dari sel tersebut.

Pengamatan dengan mikroskop dilakukan dengan menggunakan mikroskop

jenis mikroskop cahaya. Untuk pengamatan dinding sel bakteri, digunakan

perbesaran sebesar 1000x dan menggunakan minyak imersi. Selain diamati

ciri-ciri morfologi koloninya hasil pemurnian juga digunakan untuk

pembuatan stok di media NA miring kemudian diinkubasi selama 2x24 jam

pada suhu ruang.  Pembuatan stok dilakukan dua kali, digunakan untuk

melakukan berbagai macam uji.

 Pengukuran panjang dan lebar sel dilakukan dengan menyiapkan

mikroskop yang telah dipasang micrometer okuler yang terkalibrasi, dibuat

preparat ulas bakteri uji dengan metode pewarnaan sederhana dengan

menggunakan pewarnaan metilen blue kemudian diukur panjang dan lebar sel

kemudian dihitung panjang dan lebar sel sebenarnya (µm). Pewarnaan

sederhana merupakan teknik pewarnaan yang paling banyak digunakan.

Disebut sederhana karena hanya menggunakan satu jenis zat warna untuk

mewarnai organisme tersebut.

Zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya

bersifat alkolin. Dengan pewarnaan sederhana dapat mengetahui bentuk dan

rangkaian sel-sel bakteri. Pewarna basa yang biasa digunakan untuk

pewarnaan sederhana ialah memilen biru, krisdal violet dan karbol fuehsin

(Sudjadi, 2006).

Hasil perhitungan kalibrasi dimana skala object dibagi dengan skala

okuler dikali 10 µm didapatkan hasil 2,5 µm, sehingga didapatkan panjang sel

sebenarnya, skala panjang dikali hasil kalibrasi yaitu 2,5 µm kemudian lebar

sel sebenarnya, skala lebar dikali hasil kalibrasi yaitu didapatkan 2,5 µm.

Bacillus thuringiensis atau biasa disebut Bt berbentuk batang dengan ukuran

panjang 3-5 μm dan lebar 1,0-1,2 μm. Bacillus antracis yaitu bakteri berbentuk

batang berukuran panjang 1-8 μm, lebar 1-1,5 μm (Sudjadi, 2006).

 Uji pewarnaan gram dilakukan dengan mengulas bakteri pada object

glass kemudian difiksasi selama 3-5 kali tujuan dari fiksasi adalah untuk

25

mematikan sel bakteri tanpa merubah bentuk dan strukturnya, membuka pori-

pori dari sel bakteri sehingga mudah terwarnai, dan merekatkan bakteri ke

object glass (Udin, 2001). Kemudian ditetesi dengan gram A yaitu Kristal

violet didiamkan selama 60 detik, pemberian Kristal violet bertujuan untuk

memberikan warna dasar atau pewarna primer yaitu pewarnaan dinding sel

bakteri.

Kemudian dicuci keringanginkan, ditetesi lugol’s iodine dibiarkan

selama 60 detik bertujuan sebagai pewarna kedua atau pewarna pengganti.

Setelah terwarnai dicuci keringanginkan kemudian dicuci dengan gram C

(ethanol 96%) setetes demi setetes sampai ethanol yang jatuh berwarana

bening, namun jangan sampai terlalu banyak. Berfungsi untuk melarutkan

pewarna (decolorizing agent) kemudian ditetesi dengan gram D (safranin)

dibiarkan 45 detik lalu cuci keringanginkan, pemberian safranin digunakan

sebagai pewarna pembanding (James, 2008). Setelah itu amati dibawah

mikroskop. Hasil yang didapat terlihat warna ungu muda. Bakteri gram positif

mempertahankan zat warna gentian violet dan bakteri gram negatif

mempertahankan warna merah (Udin, 2001).

Uji pewarnaan endospora dilakukan dengan mengulas bakteri pada

object glass kemudian ditutup dengan kertas merang lalu ditetesi dengan

malachite green diatas kertas merang kemudian diuapkan diatas dandang,

pemberian malachite green bertujuan untuk melumuri fiksasi panas. Jangan

sampai mengering jika kering ditetesi lagi malachite green. Pemanasan

bertujuan untuk membantu warna menembus dinding endospora. Kemudian

bilas dengan aquades lalu ditetesi dengan safranin sebagai counterstain yang

digunakan untuk melumuri bagian warna dari sel yang lain daripada endospora

(James, 2008). Didiamkan selama 45 detik, dicuci keringanginkan kemudian

diamati dibawah mikroskop didapatkan hasilkan endospora berwarna hijau

sedangkan sel vegetative berwarna merah.

Uji mortilitas bakteri yang diinokulasikan pada medium SIMA semisolid

sebanyak 1 ose kemudian diinkubasi selama 2x24 jam pada suhu ruang 30oC,

menunjukan tidak adanya pertumbuhan koloni pada medium tegak SIMA

yang telah ditusuk dengan jarum ose, hasilnya hanya tumbuh diatas

permukaan medium. Banyaknya koloni bakteri yang tumbuh pada suatu

substrat sangat dipengaruhi oleh tersedianya kondisi fisik, nutrisi, dan sifat

26

hudupnya (Priyani, 2006). Pertumbuhan dipermukaan medium ini

dikarenakan Bacillus merupakan bakteri yang bersifat aerob. Namun tidak

membuktikan mortilitas, hal ini disebabkan pada saat menginokulasikan

bakteri dengan menggunakan jarum ose, bakteri tersebut tidak masuk ke

dalam media hanya tertanam dipermukaan. Namun ada beberapa

spesies Bacillus yang tidak bersiat motil salah satunya adalah Bacillus

anthracis merupakan bakteri  berbentuk batang, berukuran 1,6 µm, tidak

mempunyai alat gerak atau motil (Akoso, 2009).

 Uji hidrolisis starch dengan menggunakan medium padat Starch Agar

sebanyak 1 ose yang diinkubasi selama 2x24 jam dalam suhu ruang kemudian

permukaan media digenangi dengan larutan Lugol’s iodine menghasilkan

positif karena terbentuknya zona jernih pada media hal ini disebabkan karena

enzim amilase yang bersifat eksoenzim akan memecah amilum menjadi

monomer-monomernya. Starch atau pati dipecah menjadi unit-unit yang lebih

kecil yaitu dengan memotong ikatan-ikatan glikosidiknya. Salah satu yang

dapat memotong ikatan glokosidik adalah enzim amilase (Anonim, 2011).

Uji hidrolisis kasein menggunakan medium padat Skim Milk Agar

(SMA) diinokulasikan bakteri sebanyak 1 ose kedalam medium tersebut

kemudian diinkubasi selama 2x24 jam suhu ruang. Hasil menunjukan positif

yaitu terdapatnya zona jernih pada media SMA. Kaseinase akan memecah

kasein menjadi parakaseinase yang dapat bereaksi dengan susu tersebut

sehingga menghasilkan kalsium parakaseinat.

Uji VP (Voges Proskaner) menggunakan medium cair MR-VP yang

telah diinokulasikan dengan 1 ose bakteri kemudian diinkubasi selama 2x24

jam pada temperature 30oC, bakteri ditetesi dengan alfanaftol sebanyak 3 tetes

dan KOH 40% 2 tetes menunjukan hasi positif karena warna media menjadi

orange muda mendekati merah. Penambahan alfanaftol akan bereaksi dengan

aseton sedangkan pemberian KOH 40% untuk mengoksidasi proses tersebut

sehingga terjadi warna orange sampai merah.

Prinsip dari uji ini adalah menentukan kemampuan beberapa

mikroorganisme untuk menghasilkan produk akhir yang netral (asetil-mythyil

karbinol) dari fermentasi glukosa. Uji ini digunakan untuk mengidentifikasi

mikroorganisme yang melaksanakan fermentasi 2,3-butanadiol. Bila bakteri

memfermentasikan karbohidrat menjadi 2,3-butanadiol sebagai produk utama,

27

akan terjadi penumpukan bahan tersebut dalam media pertumbuhan (Sudjadi,

2006).  

Penambahan 40% KOH dan 5% larutan alfanaphtol dalam etanol dapat

menentukan adanya asetolin (asetilmethylkarbinol), suatu senyawa pemuka

dalam sintetis 2,3-butanadiol. Penambahan KOH adanya asetolin ditunjukan

oleh perubahan warna kaldu menjadi merah muda. Perubahan warna ini

diperjelas dengan penambahan larutan alfanaphtol. Perubahan warna kaldu

biakan lebih jelas pada bagian yang berhubungan dengan udara, karena

sebagian 2,3-butanadiol dioksidasi kembali menjadi asetolin sehingga

memperjelas hasil reaksi (Sudjadi, 2006).

Uji katalase dilakukan dengan membuat preparat ulas bakteri pada object

glass, ditetesi dengan larutan H2O2 kemudian diamati perubahan yang terjadi

hasil menunjukan positif karena terbentuknya gelembung gas. Selama

respirasi aerobik (proses fosforilasi oksidatif), mikroorganisme menghasilkan

hydrogen peroksida, bahkan ada yang menghasilkan superoksida yang sangat

beracun. Senyawa ini dalam jumlah yang besar akan menyebabkan kematian

pada mikroorganisme. Senyawa ini dihasilkan oleh mikroorganisme aerobik,

fakultatif aerob maupun mikroaerofilik yang menggunakan jalur repirasi

aerobik.

Superoksida dismutase adalah enzim yang bertanggung jawab untuk

menguraikan khususnya superoksida pada organisme aerob yang bersifat

katalase negatif. Produksi katalase bisa diidentifikasikan dengan

menambahkan reagen H2O2 pada suspense bakteri. Jika dihasilkan gelembung

gas, berarti bakteri tersebut mampu memproduksi enzim katalase. Jika tidak

dihasilkan gelembung gas berarti uji katalase dinyatakan negative.

Uji oksidase dilakukan dengan membuat preparat ulas bakteri pada

object glass, ditutup dengan potongan tissue, ditetesi dengan reagen oksidase

kemudian diamati perubahan yang terjadi. Hasil yang didapat positif karena

hasil ulasan yang telah ditetesi reagen oksidase berwarna biru marun. Enzim

oksidase memegang peranan penting dalam transport electron selama respirasi

aerobik. Sitokrom oksidase mengkatalisis oksidasi dan reduksi sitokrom oleh

molekul oksigen. Enzim oksidase dihasilkan oleh bakteri aerob, fakultatif

anaerob, dan mikroaerofilik. Sifat kemoorganotrop dan fakultatif anaerob pada

28

Bacillus sp. Menyebabkan bakteri ini mampu memanfaatkan sumber karbon

tersedia (Priyani, 2006).

Mikroorganisme ini menggunakan oksigen, sebagai akseptor elektron

terakhir selama penguraian karbohidrat untuk menghasilkan energi.

Kemampuan bakteri memproduksi sitokrom oksidase dapat diketahui dari

reaksi yang ditimbulkan setelah pemberian reagen oksidase pada koloni

bakteri. Enzim ini merupakan bagian dari kompleks enzim yang berperan

dalam proses foforilasi oksidatiif. Reagen yang digunakan adalah tetramethyl-

D- phenylenediaminedihyrocloride. Reagen akan mendonorkan electron

terhadap enzim ini sehingga akan terosidasi membentuk senyawa yang

berwarna biru kehitaman. Positif tertunda (warna biru muncul antara 10-60

detik setelah ditetesi) menandakan bahwa bakteri uji memiliki sedikit enzim.

Tidak adanya perubahan warna mengindikasikan bahwa uji yang dilakukan

negatif (James, 2008).

Uji penggunaan sitrat dilakukan dengan menginokulasikan bakteri uji

pada medium agar miring Simon Citrate sebanyak 1 ose, inkubasi selama 2x24

jam pada temperature 30oC kemudian diamati  perubahan yang terjadi, hasil

yang didapat adalah negatif karena media tetap berwarna biru. Sumber karbon

asam sitrat akan dipecah menjadi oksalo asetat kemudian menjadi asam asetat.

Karena adanya proses peningkatan ph sehingga berwarna biru.

 Uji lactose dan raffinosa dilakukan dengan cara bakteri uji ditumbuhkan

pada medium lactosa dan raffinosa, diinkubasi selama 2x24 jam pada

temperature 30oC kemudian diamati perubahan warna pada media, hasil

menunjukan bahwa warna media tidak berubah tetap berwarna ungu.

Uji toleransi NaCl dibuat tiga buah tabung Nutrient broth yang

mengandung NaCl 0%, 6,5%, dan 10%, isolate diinokulasikan kedalam ketiga

tabung masing-masing 1 ose, diinkubasi selama 2x24 jam pada temperature

30oC kemudian diamati hasilnya dengan melihat tingkat kekeruhan media.

Hasil yang didapat tingkat kekeruhan yang paling tinggi adalah pada

konsentrasi NaCl 0%.

 Penentuan spesies melalui pendekatan homologi dilakukan dengan

mengumpulkan data-data yang diperoleh kemudian dibandingkan dengan data

karakter bakteri dari sumber.   Berdasarkan hasil perhitungan persen

homologi, jumlah terbesar adalah 80% yaitu antara isolat dengan spesies A

29

(Bacillus anthracis). Karena pengambilan sampel tanah disekitar  kandang

maka tanah tersebut mengandung banyak Bacillus anthracis. Bakteri ini

banyak menyerang hewan herbivora. Misalnya domba, lembu, unta, rusa,

sejenis campuran kuda-keledai, kuda, dan kambing. Bacillus anthracis

termasuk klasifikasi gram positif, nonmotile, yang menjadi cikal bakal bakteri

spora. Kuman ini berkembang dan bertahan tahunan dalam berbagai keadaan

di tanah, air, atau benda apa pun. Vegetasi sel berukuran panjang 8 mikron

dengan lebar 1-1,5 mikron ini mampu hidup selama bertahun-tahun di tanah

(Akoso, 2009).

30

BAB III

PENUTUP

3.1 Kesimpulan

Kelompok Bacillus merupakan bakteri berbentuk batang (basil), dan tergolong

dalam bakteri gram positif yang umumnya tumbuh pada medium yang mengandung

oksigen (bersifat aerobik) sehingga dikenal pula dengan istilah aerobic sporeformers.

Bacillus adalah organisme saprofit yang lazim terdapat dalam tanah, air, udara, dan

tumbuh-tumbuhan.

Penyebab antraks adalah bakteri Bacillus anthracis. Bakteri ini bersifat aerob,

memerlukan oksigen untuk hidup. Di alam bebas bakteri ini membentuk spora yang tahan

puluhan tahun dalam tanah dan bisa menjadi sumber penularan pada hewan dan manusia.

Hewan tertular akibat memakan spora yang menempel pada tanaman yang dimakan.

Hewan yang mati akibat antraks harus langsung dikubur atau dibakar, tidak boleh dilukai

supaya bakteri tidak menyebar. Penularan pada manusia bisa lewat kontak langsung spora

yang ada di tanah, tanaman, maupun bahan dari hewan sakit (kulit, daging, tulang atau

darah); mengonsumsi produk hewan yang kena antraks: atau melalui udara yang

mengandung spora, misalnya, pada pekerja di pabrik wool atau kulit binatang. Karenanya

ada empat tipe antraks yaitu antraks kulit, antraks usus (pencernaan), antraks paru

(pernapasan) dan antraks otak.Antraks otak terjadi jika bakteri terbawa darah masuk ke

otak.

Bacillus cereus dapat menyebabkan keracuann makanan oleh enterotoksin yang

terdapat pada makanan seperti nasi yang telah dimasak tetapi kemudian diletakkan

ditempatyang hangat sehingga terjadi sporulasi dan terbentuklah toksin itu. Dapat juga

menyebabkan pneumonia, bronkopeumonia dan luka.

Bakteri ini adalah jenis bakteri yang umum ditemukan di tanah, air, udara dan

materi tumbuhan yang terdekomposisi. Termasuk kelompok bakteri gram positif, aerobik,

mampu membentuk endospora. Bacillus subtilis memiliki kemampuan memproduksi

antibiotik dalam bentuk lipopeptida, salah satunya adalah iturin. Iturin membantu Bacillus

subtilis berkompetisi dengan mikroorganisme lain dengan cara membunuh

mikroorganisme lain atau menurunkan tingkat pertumbuhannya. Iturin juga memiliki

aktivitas fungisida terhadap pathogen. ada beberapa penelitian ditemukan bahwa

penambahan Bacillus subtilis perairan dapat meningkatkan kualitas perairan dengan

31

mengurangi konsentrasi CO2 perairan. Penggunaan Bacillus subtilis pada tambak udang

menunjukkan bahwa Bacillus subtilis mampu meningkatkan kesintasan larva udang

windu dan mencegah dari penyakit vibriosis akibat Vibrio harveyi. Selain itu Bacillus

subtilis secara alami bersimbiosis pada saluran pencernaan udang windu.

Bacillus sp. memiliki ciri-ciri morfologi sebagai berikut: koloni berbentuk bulat  

atau circular, berukuran sedang atau moderate, elevasi convex, permukaan halus

mengkilap, dan margin entre. Lebar sel Bacillus sebenarnya 2,5 sedangkan Panjang sel

sebenarnya 2,5 . Hasil uji positif yaitu uji pewarnaan gram, pewarnaan endospora, uji

hidrolisis starch, uji hidrolisis kasein, uji VP, uji katalase, dan uji oksidase. Hasil uji

negatif  yaitu uji lactose dan raffinosa, uji motilitas, uji penggunaan sitrat,  dan uji

toleransi NaCl. Berdasarkan hasil perhitungan persen homologi, jumlah terbesar adalah

80% yaitu isolat Bacillus anthracis karena sampel yang digunakan adalah tanah kandang.

32

DAFTAR PUSTAKA

Jawetz, Melnick dan Adelberg. 1996. Mikrobiologi Kedokteran. EGC: Jakarta.

Rahim, Abdul dkk. 1994. Buku Ajar Mikrobiologi Kedokteran Edisi Revisi. Binarupa Aksara:

Jakarta.

Dwidjoseputro, D. 1998. Dasar – dasar Mikrobiologi. Djambatan: Malang.

Soemarno. 2000. Isoalsi dan Identifikasi Bakteri Klinik. Akademi Analis Kesehatan:

Yogyakarta.

Akoso., B. 2009. Epidemiologi dan Pengendalian Anthrax Penyakit Menular pada  Hewan

dan Manusia. Penerbit Kanisius (Anggota IKAPI): Yogyakarta.

Barrow, G. I and Feltham, R.K.A.1993. Cowan and Steel’s Manual for The Identification of

Medical Bacteria Third Education. Cambridge: University    Press, Australia.

Dwipayana., Herto. D. 2010. Identification of Bacterial Diversity in Waste Recycling Paint

Sludge by Conventuonal Microbiological Technique. Environmental Engineering Study

Program. Bandung.

James. J., Colin. B. 2008. Prinsip-Prinsip Sains untuk Keperawatan. Penerbit Erlangga:

Jakarta.

Sudjadi. B., S. Laila. 2006. Biologi Sains dalam Kehidupan. Penerbit Yudhistira.

Priyani. N., Liliyanto., dan Kiki. N. 2006. Uji Potensi Bacillus sp. dan Escherichia coli

dalam Mendegradasi Alkil Berzen Sebagai Bahan Aktif   Detergen.Jurnal       Biologi

Sumatra. Vol. 1 (2). ISSN 1907-5537. Hal 35-37.

http://dede-bogel.blogspot.com/2011/07/karakteristik-dan-potensi-antibiotik.html

http://id.shvoong.com/exact-sciences/biochemistry/2174115-bakteri-bacillus-cereus/

#ixzz1raKQo3MA

http://lutfiblurry.blogspot.com/2011/02/bacillus-subtilis-dan-aplikasinya-dalam.html

http://yongkikastanyaluthana.wordpress.com/2008/11/22/4141

file:///F:/laporan-isolasi-dan-identifikasi.html

33

34