PENENTUAN KADAR PARASETAMOL DALAM SAMPEL DENGAN MENGGUNAKAN METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI (HPLC) LAPORAN PRAKTIKUM KIMIA INSTRUMEN Tanggal Praktikum : 12 November 2010 Disusun Oleh : Kelompok 7 Risa Nurkomarasari (0800530) Ersan Yudhapratama (08013 57) Redi Ahmad Fauzi (0805450) JURUSAN PENDIDIKAN KIMIA FAKULTAS PENDIDIKAN MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALA M UNIVERSITAS PENDIDIDKAN INDONESIA 2010Tanggal Praktikum : 12 November 2010 PENENTUAN KADAR PARASETAMOL DALAM SAMPEL DENGAN MENGGUNAKAN METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI (HPLC) A. Tujuan 1. 2. Mahasiswa memahami cara kerja instrument HPLC untuk analisis kua ntitatif. Mahasiswa dapat melakukan preparasi dengan tepat dan akurat, serta dap at mengikuti manual pengoperasian HPLC. 3. Mahasiswa dapat menentukan/menghitung kadar parasetamol dalam sampel. B. Tinjauan Pustaka Kromatografi cairan kinerja tinggi atau dalam bahasa inggris nya dikenal dengan sebutan HPLC (High Performance Liquid Chromatography) merupak an salah satu teknik pemisahan campuran secara modern. Teknik HPLC ini merupakan salah satu teknik kromatografi cair-cair, yang dapat digunakan baik untuk keper luan pemisahan maupun analisis kuantitatif. Analisis kuantitatif dengan teknik H PLC didasarkan pada pengukuran luas/area puncak analit dalam kromatogram, diband ingkan dengan luas/area standar. Pada prakteknya, pembandingan kurang menghasilkan data yang akurat bila hanya melibatkan satu sta ndar. Oleh karena itu, maka pembandingan dilakukan dengan menggunakan teknik kur va kalibrasi. (Tim Kimia Analitik Instrumen. 2010:11) Kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) merupakan sistem pemisahan dengan kecepatan dan efisiensi yang tin ggi. Hal ini karena didukung oleh kemajuan dalam teknologi kolom, sistem pompa t ekanan tinggi, dan detektor yang sangat sensitif dan beragam. KCKT mampu mengana lisa berbagai cuplikan secara kualitatif maupun kuantitatif, baik dalam komponen tunggal maupun campuran. KCKT merupakan teknik pemisahan yang diterima secara l uas untuk analisis dan pemurnian senyawa tertentu dalam suatu sampel pada sejuml ah bidang antara lain; farmasi, lingkungan dan industri-industri makanan. Keguna an umumKCKT adalah untuk pemisahan sejumlah senyawa organik, anorganik, maupun senyawa biologis, analisis ketidakmurnian (impurities) dan analisis senyawasenyawa yang tidak mudah menguap (nonvolatil). KCKT paling sering digunakan untuk: menetapkan kadar senyawa-senyawa tertentu seperti asam-asam amino, asam-asam nukleat dan p rotein-protein dalam cairan fisiologis, menentukan kadar senyawa-senyawa aktif o bat dan lain-lain. Beberapa senyawa organik yang mudah terurai (labil) pada pema nasan dapat dianalisis dengan cara kromatografi cairan kinerja tinggi atau HPLC karena HPLC dilakukan pada suhu kamar. Selain senyawa organic teknik HPLC juga d apat menganalisis senyawa anorganik, cuplikan yang mempunyai berat molekul tingg i atau titik didihnya tinggi seperti polimer. Kelebihan KCKT antara lain: memisahkan molekul-molekul dari suatu campuran Resolusinya baik Mudah melaksanak annya Kecepatan analisis dan kepekaannya tinggi Dapat dihindari terjadinya dekom posisi/kerusakan bahan yang dianalisis Dapat digunakan bermacam-macam detektor K olom dapat digunakan kembali Mudah melakukan rekoveri cuplikan Tekniknya tidak b egitu tergantung pada keahlian operator dan reprodusibilitasnya lebih baik Instrumennya memungkinan untuk bekerja secara aut omatis dan kuantitatif Waktu analisis umumnya singkat Kromatografi cair preparat if memungkinkan dalam skala besar Ideal untuk molekul besar dan ion (Putra, Effe ndy De Lux. 2004 :8) Keterbatasan metode KCKT adalah untuk identifikasi senyawa, kecuali jika KCKT dihubungkan dengan spektrometer massa (MS). Keterbatasan lain nya adalah jika sampelnya sangat kompleks, maka resolusi yang baik sulit diperol eh. Prinsip kerja HPLC adalah sebagai berikut dengan bantuan pompa, fasa gerak c air dialirkan melalui kolom ke detektor, cuplikan dimasukkan ke dalam fasagerak dengan penyuntikan. Didalam kolom terjadi pemisahan kompenen-komponen camp uran karena perbedaan kekuatan interaksi antara solut-solut terhadap fasa diam. Solut-solut yang kurang kuat interaksinya dengan fasa diam akan keluar dari kolo m terlebih dahulu, sebaliknya solut-solut yang kuat interaksinya dengan fasa dia m akan keluar dari kolom lebih lama. Setiap komponen campuran yang keluar didete ksi oleh detector HPLC kemudian serupa direkam dalam bentuk gas. kromatogram. (H endayana, Kromatogram Sumar.2006:69) dengan kromatogram Gambar B.1 Diagram kromatografi Cairan Kinerja Tinggi atau HPLC Gambar B.2 Skema Alat HPLC Konsentrasi Solut dalam setiap fasa dinyatakan sebaga i koefisien partisi, K. Cs dan Cm adalah konsentrasi Solut dalam fasa diam dan f asa gerak.=Sebagai alternative, distribusi Solut-solut di antara dua fasa-fasa tersebut din yatakan dengan satuan massa atau waktu keluarnya solut atau volume fasa gerak: K adalah factor kapasitas, gs dan gm adalah masssa Solut dlam fasa diam dan fasa gerak dan Tr dan t 0 adalah waktu yang diperlukan untuk elusi solut yang berikat an dan solut yang tidak berikatan dengan fasa diam. Perkalian waktu-waktu ini de ngan kecepatan alir fasa gerak menghasilkan volume retensi, Vr dan volume hampa Vo. Walaupun K dan K merupakan kuantitas yang berbeda, tetapi keduanya berhubunga n secara linier. K=KF Ketika senyawa-senyawa dipisahkan dalam kolom maka masing-mas ing senyawa menyebar dan menjadi encer. Peristiwa ini dikenal dengan istilah band broadening yang terlihat dari puncak yang melebar. Diffusi Eddy merupakan salah satu penyebab pelebaran peak. Penyebab kedua berasal dari transfer massa, Solut selalu berpindah-pindah di antara fasa gerak dan fasa diam. Gambar B.3 Diffusi Eddy Efisiensi kolom biasanya dinyatakan secara matematika de ngan istilah plat teori. Penerapannya pada kromatografi, jumlah teori plat, N, u ntuk kolom ditentukan dari lebar peak dan waktu retensi. Suatu persamaan yang an alog dengan persamaan Van Deemter dari kromatografi gas telah dikembangkan untuk HPLC. Persamaan ini dikenal sebagai persamaan knox, yang menyatakan pengaruhpen garuh tiap proses band broadening terhadap efisiensi. =Resolusi pada HPLC dipengaruhi oleh tiga factor yaitu efisiensi (N), selektivita s(a), dan retensi (k). a adalah selektivitas, k1 dan k2 adalah masing0masing factor k apasitas senyawa 1 dan senyawa 2. 2 1 Jenis retensi Solut merupakan dasar dalam HPLC k arena pemisahan = senyawa bergantug pada jenis dan kekuatan interaksi Solut denga n fasa diam. Mekanisme retensi dapat dikelompokan menjadi lima, yaitu : a. Kroma tografi adsorpsi Kromatografi ini sangat cocok untuk pemisahan senyawa-senyawa y ang agak polar. Kromatografi yang menggunakan fasa gerak nonpolar dan fasa diam polar biasanya HPLC fasa normal. Partikel-partikel silika atau alumina digunakan sebagai adsorben. Untuk mengontrol retensi solut, biasanya ditambahkan sedikit senyawa polar kepada fasa gerak sebagai modifier. Modifier bersaing dengan molek ul-molekul solut untuk merebut tempat adsorpsi. b. Kromatografi partisi Kromatog rafi partisi merupakan kromatografi fasa terbalik dimana fasa gerak lebih polar daripada fasa diamnya. Fasa geraknya harus dijenuhkan dengan zat cair fasa diam untuk mengurangi erosi lapisan fasa diam. Pada kromatografi ini terdapat keterba tasan selektivitas sehingga ketidak campuran kedua fasa. Fasa gerak dan fasa dia m beberapa senyawa sangat kuat atau tidak tertahan sama sekali pada fasa diam. c . Kromatografi fasa terikat Kromatografi ini adalah krimatgrafi yang sering digu nakan, kromatografi fasa terikat memiliki persamaan dengan kromatografi partisi. Pada kromatografi ini, adsorben fasa terikat terdiri dari partikel silika yang dimodifikasi secara kimia dengan rantai alkil. Fasa terikat merupakan fasa yang stabil. Oleh karena itu, kolom akan bertahan dan keterulangan waktu retensi yang baik. d. Kromatografi penukar ion Karakteristik fasa gerak dalam kromatografi p enukaran ion seperti yang diperlukan oleh jenis kromatografi lain. Fasa gerak ha rus melarutkan cupllikan, mempunyai kekuatan pelarut yang memberikan waktu retan si yang cocok,berinteraksi dengan solut sehingga memberikan harga selektivitas yang tepat. Fas a gerak dalam kromatografi penukaran ion adalah larutan dalam air dapat mengandu ng sedikit metanol atau pelarut organik lain ynag bercampur dengan air. Pelarut ini juga mengandung senyawa-senyawa ionisasi dalam bentuk buffer. Kekuatan pelar ut dan selektivitas ditentukan oleh jenis dan konsentrasi bahan-bahan tambahan i ni. Umunya, ion-ion dari fasa gerak bersaing dengan ion analit untuk memperebutk an tempat paking panukaran ion. Fasa diam dalam kromatografi penukaran ion dapat berupa penukaran ion asam sulfonat untuk kation atau penukar ion amin untuk ani on. e. Kromatografi eksklusi ukuran Ukuran molekul merupakan criteria utama dala m pemisahan ini. pori-pori Pemisahan terjadi karena Solut-solut berdifusi masuk dan keluar material paking kolom.Molekul-molekul yang lebih besar dari diameter poripori ak an melewati kolom secara cepat, dan molekul kecil menempati volume pori dan tert ahan lebih lama. (Hendayana, Sumar.2006:71-77) Komponen-komponen atau instrument asi dari HPLC ialah sebagai berikut : 1. Fasa gerak Berupa zat cair yang disebut eluen (pelarut) dalam HPLC, fasa gerak selain bertugas membawa komponen-kompone n campuran menuju detektor, juga dapat berinteraksi dengan solut-solut. Zat cair yang akan digunakan sebagai fasa gerak HPLC harus memenuhi beberapa persyaratan berikut : 1). Zat cair harus bertindak sebagai pelarut yang baik untuk cuplikan yang akan dianalisis. 2). Zat cair harus murni sekali untuk menghindarkan masuk nya kotoran yang dapat mengganggu interpretasi kromatogram. 3). Zat cair harus j ernih sekali untuk menghindarkan penyumbata pada kolom. Biasanya pelarut disarin g dengan saringan nilon berukuran diameter 0,45 m. Pompa vakum biasanya digunakan untuk menyaring partikel kotoran sekaligus menghilangkan gas dari pelarut karen a gas dapat mengganggu base line.4). Zat cair harus mudah diperoleh, murah, tidak mudah terbakar dan tidak beracu n. 5). Zat cair tidak kental. Umumnya keketalan tidak melebihi 0,5 cP (centi Poi se). 6). Sesuai dengan detektor. Pemilihan zat cair sebagai fasa gerak ini merup akan hal yang kritis dalam keberhasilan pemisahan. Seyangnya, teori interaksi fa sa gerak dengan sejumlah solut kurang jelas sehingga para pakar hanya dapat memi lih sekelompok pelarut. Jadi, pada akhirnya, pemilihan fasa gerak didasarkan ata s eksperimen trial-and error dengan berbagai jenis dan krom posisi pelarut hingg a diperoleh kromatogram yang diharapkan. Dengan kata lain, fasa gerak yang baik memberikan faktor kapasitas k pada rentang yang seesuai. Untuk cuplikan dengan 23 komponen, sebaliknya dicari fasa gerak yang memberikan k antara 2-5. Sedangkan untuk campuran multikomponen, waktu cukup untuk pemisahan semua komponen. Biasan ya beberapa pelarut atau kombinasi pelarut dapat ditemukan untuk memberikan fakt or kapasitas yang cocok. Pemilihan pelarutpelarut juga bergantung pada faktor se lektifitas (a) untuk komponen cuplikan. Gelembung udara (degassing) yang ada harus dihilangkan dari pelarut, karena udara yang terlarut keluar melewati detektor d apat menghasilkan banyak noise sehingga data tidak dapat digunakan. Tabel 1. Pro perties of HPLC mobile phase (Harvey, David. 2000 : 581) 2. PompaPompa dalam HPLC berfungsi untuk mengalirkan fasa gerak cair malalui kolom yang berisi serbuk halus. Pompa yang dapat digunakan dalam HPLC harus memenuhi persya ratan : 1. Menghasilkan tekanan sampai 600psi. 2. Kelluara bebas pulsa 3. Kecepa tan alir berkisar antara 0,1-10 mL/menit. 4. Bahan tahan korosi. Dikenal tiga je nis pompa yang masing-masing memiliki keuntungan dan kerugian yaitu pompa recipr ocating, displacement dan pneumatic. Gambar B.4 Pompa Pompa reciprocating Jenis pompa ini sekarang paling banyak dipa kai. Popa ini terdiri dari ruangan kecil tempat pelarut yang dipompa dengan cara gerakan piston mundurmaju yang dijalankan oleh motor. Piston berupa batang gela s dan berkontak langsung dengan pelarut. Ketika piston mundur maka bola gelas ba wah terangkat dan pelarut masuk, sebaliknya ketika piston maju bola bawah menutu p saluran pelarut dan pelarut yang telah berada diruang pompa didorong masuk ke dalam kolom. Gerakan piston mundur dan maju terjadi secara terus menerus sehingg a memeberikan aliran eluen konstan. Pompa ini menghasilkan pulsa yang dapat meng ganggu base-line kromatogram, karena itu dipasang peredam pulsa untuk menghilang kan gangguan base-line sedangkan keuntungan pompa ini adalah memiliki volume int ernal yang kecil. Untu mengurangi bond broadening. Selainitu, pompa ini menghasilkan tekanan tinggi, kecepatan alir konstan yang tidak br gantung pada tekanan balik kolom dan viskositas pelarut. Pompa displacement Pomp a ini menyerupai syringe (alat suntik) terdiri dari tabung yang dilengkapi pendo rong yang digerakkan oleh motor. Pompa ini juga menghasilkan aliran yang cenderu ng tidakbergantung tekanan balik klom dan visikositas pelarut. Selain itu, kelua ran pompa ini bebas pulsa. Akan tetapi pompa ini keterbatasan kapasitas pelarit dan tidak mudah untu mealkukan pergantian pelarut. Pompa pneumatic Dalam pompa ini pelarut didorong oleh gas bertekanan tinggi. Pom pa jenis murah dan bebeas pulsa. Akan tetapi mempunyai keterbatasab kapasitas da n tekanan yang dihasilkan serta kecepatan alir bergantung pada viskositas pelaru t dan tekanan balik kolom. 3. Pemasukan cuplikan Kebanyakan pemasukan cuplikan k e dalam kolom dapat menyebabkan band broadening. Oleh karena itu, cuplikan yang dimasukan harus sekecil mungkin, beberapa puluh miroliter. Teknik pemasukan cupl ikan kedalam sistem HPLC melalui injeksi srynge, injeksi stop-flow, dan kran cupli kan. Gambar B.5 Syringe Injeksi syringe Alat yang paling dulu ada dan paling paling m udah untuk memasukkan cuplikan adalah syringe. Syringe disuntikkan melalui septu m (seal karet) dan untuk ini dirancang syringe yang tahan tekanan sampai 1500 ps i. Akan tetapi keterulangan injeksi syringe ini sedikit labih baik dari2-3% dan sering lebih jelek.SInjeksi `stop-flow' Injeksi stop-flow adalah jenis injeksi syringe kedua tapi di sin i aliran pelarut dihentikan sementara, asambungan pada ujung kolom dibuka dan cu plikan disuntikan langsung ke dalam ujung kolom. Setelah menyambungkan kembali k olom maka pelarut dialirkan kembali. Kran cuplikan Jenis pemasukan cuplikan ini disebut juga loop dan paling banyak digunakan. Untuk memasukan cuplikan ke dalam aliran fasa gerak perlu dua langkah : 1. Sejumlah volume cuplikan disuntikkan k e dalam loop dalam posisi load, cuplikan masih berada dalam loop. 2. Kran diputar untuk mengubah cuplikan load menjadi posisi injeksi dan fasa gerak membawa cuplikan ke dalam kolom. Loop dapat digantiganti dan tersedia berbagai ukuran volume dari 5 hingga 500 L. Dengan sistem pemasukan cuplikan ini memungkinkan memasukan cupl ikan pada tekanan 7000 psi denga ketelitian tinggi. Juga loop mikro tersedia den gan volume 0,5 hingga 5L. Gambar B.6 Tipe injector katup putaran 4. Kolom Kolom HPLC biasanya terbuat dari stainless steel walaupun ada juga yang terbuat dari gelas berdinding tebal. Kol om utma berisi fasa diam, tepat teradinya pemisahan camppuran menjadi komonen-ko mponennya. Bergantung keperluannya koom utama dapat digunkan untuk analisis atau preparatif. Untuk keperluan preparatif, setiap komponen yang keluar kolom ditam pung padatabung yang berbeda dan keluaran HPLC dihubungkan dengan fraction colector. Sela in kolom utama dikenal pula kolom pengaman (guard kolom). Kolom utama berisi fas a diam dan jenisnya bervariasi bergantung keperluan, misalnya dikenal kolom C-18 , C-8, cyanopropyl, penularan ion. Kolom jenis C-18 dan C-8 paling banyak dipaka i dalam HPLC. Fasa diam jenis terikat ini dapat dibuat dengan mereaksikan silika dengan alkilklorosilana yang dikenal dengan reaksi silanisasi. Fasa Diam Dalam kromatografi cair-cair, fasa diam adalah cairan film yang dilapiskan pada materi al kemasan yang terdiri dari partikel silica berpori 3-10 . fasa diam mungkin sebagian akan larut dalam fasa gerak. Untuk mencegah hilangnya fasa diam ini, maka fasa diam diikat secara kovalen pada partikel silica. Ikatan fasa dia m diperoleh dengan mereaksikan partikel silica dengan organochlorosilane dengan bentukumu Si (CH3)2 RCl dimana R adalah alkil atau alkil yang tersubstitusi. Untuk mencegah interaksi antara zat terlarut dengan gugus SiOH, silica sering dir eaksikan dengan Si(CH3)3Cl. Sifat dari fasa diam ditentukan oleh sifat organosil anes gugus alkil. Jika R adalah gugus fungsional polar, maka fasa diam akan polar . Contoh fasa diam polar, dimana R terdiri dari cyano (C2H4CN), diol (-C3H6OCH2CHOHCH2OH), atau amino (-C3H6NH2). Karena fasa diam pola r, fasa bergerak adalah nonpolar atau pelarut yang cukup polar. Kombinasi dari f asa diam polar dan fasa gerak non polar disebut kromatografi fasa normal. Dalam kromatografi fasa terbalik, sering ditemui dalam HPLC, fasa diam non-polar dan f asa gerak polar. Fasa diam non-polar paling umum menggunakan organochlorosilane dengan R adalah n-octyl (C8) atau octyldecyl (C18) rantai hidrokarbon. n-Kolom pengaman disebut juga pra-kolom karena diletakkan sebelum sisem pemasukan cuplikan. Kolom ini berukuran pendek, 5 cm dengan diameter 4,6 mm dan biasanya d ipaking dengan partikel silika berukuran lebih besar dari ukuran partikel kolom utama. Kolom pengaman mempunyai dua fungsi yaitu untuk menyaring kotoran yang te rbawa dalamfasa diam dan untuk menjenuhkan fasa diam dalam rangka menghindarkan terjadinya erosi fasa diam oleh aliran pelarut. Dengan demikian, kerusakan kolom utama yang mahal dapat dihindarkan. 5. Detektor Berbagai detektor untuk HPLC te lah tersedia, walaupun demikian detektor harus memenuhi persyaratan berikut : 1. Cukup sensitif 2. Stabilitas dan ketrulangan tiggi 3. Respon linear terhadap so lut 4. Waktu respon pendek sehingga tidak bergantung alir 5. Reliabilitas tinggi dan mudah digunakan 6. Tidak merusak cuplikan. Detektor HPLC dikelompokkan ke d alam tiga jenis detektor yaitu detektor umum memberi respon terhadap fasa gerak yang dimodulasi dengan adanya solut. Sebaliknya, detektor spesifik memberi respo n terhadap beberapa sifat solut yang tidak dimiliki oleh fasa gerak. Terakhir, d etektor yang brsifat umum terhadap solut setelah fasa gerak dihilangkan dengan p enguapan. Tabel 2 Karakteristik detector HPLC Dasar Pendeteksian Absorbsi UV Abs orbsi IR Flourometri Indek bias Konduktometri Spektometri massa Elektrokimia Jen is Spesifik Spesifik Spesifik Umum Spesifik Umum Spesifik Maksimum Sensitifitas 2 x 10-16 10-6 10-11 1 x 10-7 10-8 10-10 10-12 Peka terhadap Sensitivitas suhu R endah Rendah Rendah + 10-4 C 2% C Tidak ada 1,5 % C kecepatan alir ? Tidak Tidak Tidak Tidak Ya Tidak YaDetektor UV Detektor UV terutama digunakan untuk pendeteksian senyawa-senyawa or ganik. Detektor UV dilengkapi dengan pengatur panjang gelombang sehingga panjang gelombang UV yang digunakan dapat dipilih disesuaikan dengan jenis cuplikan yan g diukur. Walaupun demikian, biasanya panjang gelombang UV yang digunakan adalah pada 254 nm karena kebanyakan senyawa organik menyerap sinar UV pada sekitar pa njang gelombang tersebut. Gambar B.7 Diagram detector UV Detektor elektrokomia Detektor elektrokimia biasa nya didasarkan pada daya hantar listrik dan poligrafi. Detektor jenis konduktome tri biasanya digunakan untuk mendeteksi solut-solut yang dapat mengalami reaksi redoks baik senyawa organik maupun anorganik. (Hendayana, Sumar.2006:83-94) Dete ktor yang paling banyak digunakan dalam kromatografi cair modern kecepatan tingg i adalah detektor spektrofotometer UV 254 nm. Bermacammacam detektor dengan vari asi panjang gelombang UV-Vis sekarang menjadi populer karena mereka dapat diguna kan untuk mendeteksi senyawa-senyawa dalam rentang yang luas. Detektor indeks re fraksi juga secara luas digunakan, terutama dalam kromatografi eksklusi, tetapi umumnya kurang sensitif dari pada detektor spektrofotometer UV. Detektor lainnya , antara lain: detektor fluometer, detektor ionisasi nyala, detektor elektrokimi a dan lain-lain juga telah digunakan. (Putra, Effendy De Lux. 2004 :6) 6. Rekord erUntuk mencetak hasil percobaan pada lembaran kertas berupa kumpulan puncak (krom atogram). Komponen yang terelusi mengalir ke detektor dan dicatat sebagai puncak puncak yang secara keseluruhan disebut sebagai kromatogram.Gambar B.7 Beberapa Contoh Kromatogram Fungsi dari kromatogram antara lain: 1. K ualitatif Waktu retensi selalu konstan dalam setiap kondisi kromatografi yang sa ma dapat digunakan untuk identifikasi. 2. Kuantitatif Luas puncak proporsional d engan jumlah sampel yang diinjeksikan dan dapat digunakan untuk menghitung konse ntrasi. 3. Kromatogram dapat digunakan untuk mengevaluasi efisiensi pemisahan da n kinerja kolom (kapasitas k, selektifitas a, jumlah pelat teoritis N, jarak setara den an pelat teoritis HETP dan resolusi R). Penerapan kromatografi cairan kinerja tinggi dapat dilakukan dengan dua mode oprasional, yaitu :Mode isokratik Mode isokratik serupa dengan mode isotermal dalam kromatografi ga s, hanya dalam HPLC komposisi fasa geraknya yang sama selama pengukuran berlangs ung. Tidak perlu mengatur komposisi campuran fasa gerak.Mode gradien Komposisi fasa geraknya divariasikan selama pengukuran berlangsung. Elusi gradien didefinisikan sebagai penambahan kekuatan fase gerak selama suatu analisis kromatografi berlangsung. Digunakan untuk meningkatkan resolusi campur an yang kompleks terutama jika sampel mempunyai kisaran polaritas yang luas. Pen garuh yang menguntungkan dari elusi gradien adalah memperpendek waktu analisis s enyawa-senyawa yang secara kuat ditahan di dalam kolo. Elusi Gradien menawarkan beberapa keuntungan : a. Total waktu analisis dapat direduksi b. Resolusi persat uan waktu setiap senyawa dalam campuran bertambah c. Ketajaman Peak bertambah (m enghilangkan tailing) d. Efek sensitivitas bertambah karena sedikit variasi pada peak Gradien dapat dihentikan sejenak atau dilanjutkan. Optimasi Gradien dapat dipilih dengan cara trial and error. Tabel berikut ini menunjukkan kompatibilita s dari bermacam-macarn mode kromatografi cair dengan analisis gradien. Dalam pra ktek, gradien dapat diformasi sebelum dan sesudah pompa. Tabel 3. Mode Kompatibilitas dengan Gradien (Putra, Effendy De Lux. 2004 :7) Struktur parasetamol : ParasetamolParasetamol adalah senyawa yang memiliki sifat polar, dan gugus kromofor yang di milikinya menyebabkan senyawa ini dapat menyerap sinar UV. Karakteristik senyawa ini memungkinkan analisis dengan teknik HPLC menggunakan kolom non polar sepert i C-18 dan fasa gerak agak polar seperti methanol/air. (Tim Kimia Analitik Instr umen. 2010:11) C. Alat dan Bahan Praktikum 1. Alat an alu Spatula 1 set 1 buah 1 buah Labu ukur 25 mL dan 10 mL 6 buah Neraca analitik Corong pendek Pipet tetes Gelas kimia 100 mL Gelas ukur 500 mL Ultrasonik Vibrator 2. Bahan Parasetamol p.a Met anol Sampel obat oskadon KH2PO4 Isopropil alcohol Asetonitril Membran Kertas sar ing 6,2 mg 20 mL 1 strip 420 mL 30 mL 30 mL 2 buah Secukupnya 1 set 1 buah 3 bua h 1 buah 1 buah 1 setPerangD. Prosedur Kerja Praktikum 1. Pembuatan Fasa Gerak Dicampur KH2PO4 : Isopropil alcohol : methanol : asetonitril yang telah disaring dengan sel membran dengan p erbandingan masing-masing (420:30:20:30)mL. Setelah itu, dihomogenkan dengan ult rasonic vibrator selama 15 menit. 2. Pembuatan Larutan Induk Parasetamol Ditimba ng parasetamol sebanyak 6,25 mg, setelah itu dilarutkan dengan 10 mL fasa gerak (dilakukan secara kuantitatif dalam gelas kimia 20 mL). Kemudian dimasukan ke da lam labu ukur 10 mL dan dihomogenkan selama 5 menit menggunakan ultrasonic vibra tor, ditanda bataskan secara kuantitatif. 3. Pembuatan Deret Larutan Standar Dib uat deret standar 25,0; 50,0; 75,0; 100,0 dan 125,0 ppm dengan melakukan pengenc eran dari larutan induk yang telah dibuat kedalam labu ukur 10,0 mL, kemudian di degassing selama 5 menit. Semua larutan standar masing-masing disaringdengan men ggunakan membrane PTFE, filtrate ditempatkan ke dalam vial tertutup yang telah d iberi label. 4. Pembuatan Larutan Sampel Parasetamol Ditimbang satu per satu tab let parasetamol dalam 1 strip, kemudian digerus. Setelah halus ditimbang 12,5 mg , dilarutkan dalam labu ukur 25 mL, ditambah sedikit pelarut lalu dihomogenkan d engan ultrasonic vibrator selama 5 menit. Setelah 5 menit, sampel di tandabatask an kemudian dihomogenkan. Sampel yang sudah homogen dipipet sebanyak 1 mL dan di masukan ke dalam labu takar 10 mL, setelah itu disaring dengan kertas saring mil ipore, dan membrane PTFE, filtrate dimasukan ke dalam botol vial. sebelum diinje kkan, larutan didegassing terlebih dahulu selama 5 menit. 5. Prosedur Mengoperas ikan HPLC Instrumen HPLC dihidupkan kemudian dan kondisikan instrument HPLC sesu ai dengan: Fasa gerak : KH2PO4 : Isopropil alcohol : methanol : asetonitril (420 :30:20:30) Kolom : C-18 = 15 cmPanjang gelombang Laju alir Volume injeksi : 234 nm : 0,5 mL/menit : 20 L Pastikan kabel penghubung listrik telah tersambung dengan benar. Setelah itu tek an tombol ON pada sakelar listrik. Isi botol fasa gerak dengan volume memadai dan kosongkan botol penampung. Tekan tombol ON pada alat, berturut-turut untuk power, detektor dan pompa. Lakukan pemograman alat dengan computer. Ikuti langkahnya se suai dengan instruksi computer. Pilih mode yang digunakan sesuai dengan paramete r kondisi instrument. Apabila kromatogram telah menunjukkan base line mendatar, maka instrument siap digunakan. Injeksikan larutan standar secarea berurutan (mu lai dari konsentrasi terendah) dan larutan sampel. Cetak hasil pengukuran dan ca tat kondisi percobaannya. Stelah selesai digunakan, matikan pompa dengan menyoro ti tanda pompa pada computer. Tutup file sesuai petunjuk, lalu matikan computer. Untuk mematikan, tekan tombol OFF pada pompa, detektor dan power secara berurutan . Terakhir, putuskan sambungan listrik. E. Hasil dan Analisi Data Hasil Percobaan Data hasil analisis larutan standar I Tabel Data Pengukuran Larutan deret Standar I Konsentrasi (ppm) 24,8 49,6 74,4 9 9,2 124 Waktu Retensi 1,39 1,39 1,39 1,39 1,39 Luas Area 1007806 1895495 2667819 3316040 4099740Kurva kalibrasi larutan deret standar I Kurva konsentrasi standar terhadap luas area 4500000 4000000 Luas Area 3500000 3000000 2500000 2000000 1500000 1000000 500000 0 24,8 49,6 74,4 99,2 124 y = 30662,9556x + 316072,10000 R = 0.9974 Konsentrasi standar (ppm) Data hasil analisis larutan standar 2 Tabel Data Pengukuran Larutan deret Standa r 2 Konsentrasi 24,8 49,6 74,4 99,2 124 Waktu Retensi 1,39 1,39 1,39 1,39 1,39 L uas Area 813607 1351640 2036587 2638557 3227353Kurva kalibrasi larutan deret standar 2 Kurva konsentrasi Standar terhadap luas area 3500000 3000000 Luas Area 2500000 2000000 1500000 1000000 500000 0 y = 24654,8750x + 179226,1000 R = 0.999 24,8 49,6 74,4 99,2 124 Konsentrasi standar (ppm)Penentuan Kadar Paracetamol dalam sampel obat Berdasarkan kurva yang dihasilkan, maka persamaan garis yang digunakan adalah kurva dari larutan standar 2 karena memberikan regresi paling tinggi, persamaan garisnya yaitu : y = 24654,8750x + 1 79226,1000 R2 = 0,999 Karena pada data pengukuran luas area sampel I dan sampel II memiliki waktu retensi yang sama yaitu 1,39 sehingga luas area sampel dirataratakan. Larutan sampel I II Rata-rata Massa Sampel Luas Area 1246385 1307825 12 77105 12,5 mg Dari hasil perhitungan (terlampir), diperoleh kadar parasetamol dalam sampel %Pa rasetamol dalam sampel adalah 89,05% dan massa parasetamol dalam oskadon adalah 626,217 mg/tablet.Analisis Data Instrumen yang dipilih pada percobaan ini dalam penentuan kadar parasetamol dalam sampel obat adalah kromatografi cairan kinerja tinggi (HPLC). Teknik HPLC merupakan salah satu teknik kromatografi cair-cair, yaitu suatu meto de pemisahan dari suatu analit berdasarkan perbedaan interaksi antara fasa diam dengan fasa geraknya. Teknik HPLC ini dapat digunakan untuk analisis kuantitatif dan kualitatif. Analisis kuantitatif dapat dilihat dari pengukuran luas puncak/ area dari analit pada kromatogram yang dibandingkan dengan luas area standar den gan menggunakan kurva kalibrasi, pada percobaan kali ini digunakan dua deret lar utan standar. Analisis Kualitatif dapat dilihat dari waktu retensinya yang diban dingkan dengan standar. Instrumen HPLC ini dipilih untuk percobaan pertimbangan dan keefektifan pekerjaan yang ini karena ada beberapa dilakukan dilaboratorium. Pertimbangan itu antara lain dilihat dari sampel yang akan dianalisis nantinya. Sampel yang dianalisis adalah obat yang memiliki kandungan parasetamol, paraseta mol merupakan zat yang tidak mudah menguap. Parasetamol mudah larut ketika dilar utkan dalam air karena parasetamol merupakan senyawa yang bukan ionik. Parasetam ol memiliki berat molekul yang ringan. Dari beberapa data yang menginformasikan sifat sampel, maka instrumentasi yang tepat digunakan adalah HPLC dengan jenis k romatografi partisi (fasa terbalik). Penggunaan jenis kromatografi fasa terbalik ini karena sampel yang akan kita pisahkan bersifat polar, oleh karena itu dalam jenis kromatografi ini fasa gerak yang digunakan memiliki sifat yang polar yait u campuran antara KH2PO4 : Isopropil alcohol : methanol : asetonitril dengan perbandingan 420:30:20:30 dan fasa diamnya bersifat nonpolar biasanya fasa diam yang memiliki rantai alkil 8 ( C8) atau 18 (C-18). Pada perhitungan konsentrasi parasetamol,data yang terhitung adalah 248 ppm. Data seharusnya adalah 250 ppm,hal ini terjadi karena pada peni mbangan sampel adalah 6,2 mg yang seharusnya 6,25 mg, hal ini terjadi disebabkan Karena digit dibelakang koma hanya satu angka, bukan dua angka. Sehingga pada p enimbangan sampel yang terbaca adalah 6,2 mg.Jadi hal ini perlu menghitung lagi konsentrasi pada deret standar.Pada percobaan kali ini, dalam analisisnya perlu diperhatikan setiap tahapnya ag ar kesalahan yang terjadi menjadi seminimal mungkin. Sampel uji harus disaring d ahulu dengan membrane PTFE agar tidak terjadi penyumbatan dalam kolom dan menghi langkan udara atau gas dari pelarutnya. Karena jika sampel masih ada gas yang te rlarut dapat menyebabkan gangguan pada sistem pengatur gradient dari eluennya. D idalam Kolom itu komponen-komponen dipisahkan berdasarkan perbedaan kekuatan interaksi solute terhadap fasa diamnya. Solut yang berinterak si kurang kuat maka akan keluar lebih lambat dari kolom daripada solut yang lebi h kuat interaksinya. Komponen itu selanjutnya keluar dari kolom dengan kecepatan yang berbeda dan dideteksi oleh detector. Detektor yang digunakan adalah detect or UV. Read out dari hasil analisis dengan HPLC adalah suatu kromatogram. Kromat ogram adalah grafik yang menghubungkan antara intensitas komponen yang dibawa ol eh fasa gerak terhadap waktu retensi. Banyaknya puncak menunjukkan jumlah kompon en,sedangkan luas peak menyatakan konsentrasi. Dari data kromatogram larutan sta ndar, didapatkan waktu retensi 1,39. Waktu retensi tersebut merupakan jangka wak tu yang terukur saat sampel melewati kolom HPLC. Dari data kromtogram sampel did apatkan dua puncak yaitu puncak untuk paracetamol dan kafein. Puncak dari kafein lebih kecil dari pada puncak paracetamol, karena kadar dari kafein dalam sampel obat oskadon juga lebih sedikit. Pada percobaan kali ini,injeksi sampel dilakuk an dua kali untuk mendapatkan data yang akurat. Setelah sampel diukur, didapat k romatogram dari sampel.Luas area yang diperoleh dalam dua kali pengukuran yaitu 1246385 dan 1307825. Kemudian dibuat kurva kalibrasi dari larutan standar yang m enghasilkan persamaan y = 24654,8750x + 179226,1000 dengan regresi 0,999. Setela h dilakukan pengolahan data, maka didapatlah kadar parasetamol dalam obat oskado n adalah 89,05%. Dari berat rata-rata tablet oskadon sebesar 703,22 mg terkandun g parasetamol sebesar 626,21741 mg. Sedangkan dalam kemasan tertera bahwa kadar paracetamol dalam obat oskadon adalah 500 mg.F. Kesimpulan Berdasarkan percobaan penetuan kadar parasetamol dalam sampel obat oskadon menggunakan instrument HPLC didapatkan kadar parasetamol sebesar 89,05% ,sehingga massa parasetamol dalam oskadon sebesar 626,21741 mg. G. Daftar Pustak a Harvey, David. (2000). Modern Analytical Chemistry. USA: The McGraw-Hill Compa nies. Hendayana, Sumar. (1994). Kmia Instrumen Edisi Kesatu. Semarang : IKIP Sem arang Press. Hendayana, Sumar. (2006). KIMIA PEMISAHAN Metode Kromatografi dan E lektroforensis Modern. Bandung : PT. Remaja Rosdakarya. Clark, Jim. (2007). Kroma tografi Cair Kinerja Tinggi (HPLC). [Online]. Tersedia: http://www.chem-istry.org yang direkam pada 6-10-2007. [16 Desember 2010]. Putra, Effendy De Lux. (2004). Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Dalam Bidang Farmasi. Sumatera Utara : Jurusan Farmasi FMIPA USU. Suhanda, Hokcu. (2001). Handout Perkuliahan Kimia Analitik I nstrumen : KCKT/HPLC. Jurusan Pendidikan Kimia UPI : tidak diterbitkan. Tim Kimi a Analitik Instrumen. (2010). Penuntun Praktikum Kimia Analitik Instrumen (KI-43 1). Bandung : Jurusan Pendidikan Kimia FPMIPA UPI.LAMPIRAN 1. Perhitungan Pembuatan Larutan : a. Perhitungan massa parasetamol dari konsent rasi parasetamol 248 ppm. : Ppm = mg / L 248 ppm = mg / 2,5 x 10-3L Massa = 6,2 mg Jadi massa parasetamol adalah 6,2 mg. b. Perhitungan massa KH2PO4 Diketahui : V = 420 mL M = 0,01 M Mr = 137 Penyelesaian : g 1000 x Mr V g 1000 0,01 = x 137 420 g = 0,5754 M= c. Pembuatan larutan deret standar : V1 = 1 mL V1.M1 = V2.M2 1 mL x 248 ppm = 10 mL x M2 M2 = 24,8 ppm V1 = 2 mL V1.M1 = V2.M2 2 mL x 248 ppm = 10 mL x M2 M2 = 49,6 ppm V1 = 3 mL V1.M1 = V2.M2 3 mL x 248 ppm = 10 mL x M2 M2 = 74,4 ppm V1 = 4 mL V1.M1 = V2.M24 mL x 248 ppm = 10 mL x M2 M2 = 99,2 ppm = 10 mL x M2 M2 = 124 ppmV1 = 5 mL V1.M1 = V2.M2 5 mL x 248 ppm2. Prosedur Mengoperasikan HPLC Instrumen HPLC dihidupkan kemudian dan kondisika n instrument HPLC sesuai dengan: Fasa gerak : KH2PO4 : Isopropil alcohol : metha nol : asetonitril (420:30:20:30) Kolom Panjang gelombang Laju alir Volume injeks i Temperatur : C-18 = 15 cm : 234 nm : 0,5 mL/menit : 20 L : 33C Pastikan kabel penghubung listrik telah tersambung dengan benar. Setelah itu tek an tombol ON pada sakelar listrik. Isi botol fasa gerak dengan volume memadai dan kosongkan botol penampung. Tekan tombol ON pada alat, berturut-turut untuk power, detektor dan pompa. Lakukan pemograman alat dengan computer. Ikuti langkahnya se suai dengan instruksi computer. Pilih mode yang digunakan sesuai dengan paramete r kondisi instrument. Apabila kromatogram telah menunjukkan base line mendatar, maka instrument siap digunakan. Injeksikan larutan standar secarea berurutan (mu lai dari konsentrasi terendah) dan larutan sampel. Cetak hasil pengukuran dan ca tat kondisi percobaannya. Stelah selesai digunakan, matikan pompa dengan menyoro ti tanda pompa pada computer. Tutup file sesuai petunjuk, lalu matikan computer. Untuk mematikan, tekan tombol OFF pada pompa, detektor dan power secara berurutan . Terakhir, putuskan sambungan listrik.3. Data Pengamatan dan Pengolahan Data Larutan Deret Standar I Konsentrasi (ppm) 24,8 49,6 74,4 99,2 124 Waktu Retensi 1,39 1,39 1,39 1,39 1,39 Luas Area 100780 6 1895495 2667899 3316040 4099740 Kurva kalibrasi larutan deret standar I Kurva konsentrasi standar terhadap luas area 4500000 4000000 3500000 3000000 2500000 2000000 1500000 1000000 500000 y = 30662 ,9556x + 316072,10000 R = 0.9974 Luas Area 0 24,8 49,6 74,4 99,2 124 Konsentrasi standar (ppm) Larutan Deret Standar II Konsentrasi 24,8 49,6 74,4 99,2 124 Waktu Retensi 1,39 1,39 1,39 1,39 1,39 Luas Area 813607 1351640 2036587 2638557 3227353Kurva kalibrasi larutan deret standar II Kurva konsentrasi Standar terhadap luas area 3500000 3000000 Luas Area 2500000 2000000 1500000 1000000 500000 0 y = 24654,8750x + 179226,1000 R = 0.999 24,8 49,6 74,4 99,2 124 Konsentrasi standar (ppm) Data Pengukuran Sampel Larutan sampel I II Waktu Retensi 1,39 1,39 Luas Area 124 6385 1307825 Massa sampel obat oskadon Tablet 1 2 3 4 Jumlah Massa rata-rata Massa (mg) 711,1 705,2 702,4 694,2 2812,9 703,2Berdasarkan kurva yang dihasilkan, maka yang digunakan untuk penentuan kadar par asetamol dalam sampel adalah kurva dari larutan standar II mempunyai persamaan : y = 24654,8750x + 179226,1000 R2 = 0,999 Karena pada data pengukuran luas area sampel I dan sampel II memiliki waktu retensi yang sama yaitu 1,39 sehingga luas area sampel dirata-ratakan. Larutan sampel I II Rata-rata Massa Sampel Luas Are a 1246385 1307825 1277105 12,5 mg Berdasarkan persamaan dari larutan standar II yang dihasilkan : y = 24654,8750x + 179226,1000 1277105 = 24654,8750x + 179226,1000 24.654,8750X = 1.277.105 179.2 26,1 X = 44,52989 ppm Jadi konsentrasi parasetamol dalam 10 mL larutan adalah 44 ,52989 ppm. Konsentrasi parasetamol dalam 25 mL (sebelum pengenceran) : V1.M1 = V2.M2 1 mL x M1 = 10 mL x44,52989 ppm M1 = 445,2989 ppm Jadi konsentrasi paraset amol dalam 25 mL larutan (sebelum pengenceran) adalah 445,2989 ppm. Massa parase tamol dalam sampel : Mg = 445,2989 ppm x 2,5 x 10-3L Mg = 11,1324 mg Jadi massa parasetamol dalam sampel adalah 11,1324 mg. Kadar parasetamol dalam sampel : %Pa rasetamol = (Massa parasetamol / Massa sampel) x 100% %Parasetamol = (11,1324 mg / 12,5 mg) x 100%%Parasetamol = 89,05 % Jadi %Parasetamol dalam sampel adalah 89,05%. Massa paras etamol dalam obat oskadon : Massa rata-rata tablet oskadon = 703,22 mg Massa par asetamol = 89,05% x 703,22 mg Massa parasetamol = 626,21741 mg Jadi massa parase tamol dalam oskadon adalah 626,21741 mg. 4. Dokumentasi Foto Praktikum Kolom Komputer Cara memegang syringePenginjeksian Proses Injeksi Pompa Instrumen HPLC