Teknik Analisis Obat Dalam CairanBiologis Dengan GLC dan HPLC

Drs Mohammad Makin Ibnu Hadjar PhDJurusan Kimia Farmasi — Fakultas Farmasi

Universitas Gadfah Mada, Yogyakarta

Bagi beberapa kelompok peneliti, metode analisis obat da-lam cairan biologis mempunyai arti yang sangat penting.Masalah- masalah yang berhubungan dengan studi ketersediaanhayati obat, pengembangan obat baru, penyalahgunaan obat,farmakokinetika klinik dan riset obat -obatan, semuanya me-nuntut adanya metode analisis obat dalam sampel biologisdengan kepekaan, kespesifikan, kecepatan, ketepatan dan ke-telitian yang tinggi, tetapi dengan biaya yang tidak terlalumahal.

Kesulitan utama yang dihadapi ialah, selain kadar yangbiasanya sangat kecil, dalam cairan biologis obat ada bersama-sama dengan metabolit -metabolitnya dengan struktur kimiayang hampir mirip. Tercampurnya obat dengan zat-zat endoge-nous dalam sampel biologis (dalam jumlah yang jauh lebihbesar dari obatnya) menambah kesulitan tersebut. Metodeanalisis yang digunakan dengan sendirinya harus mampu men-deteksi dan menetapkan kadar obat dan metabolit-metabolit-nya, serta mempunyai prosedur clean-up yang singkat dansederhana, agar kehilangan obat dan metabolitnya dapat di-hindarkan.

Kromatografi cairan-gas (GLC) dan kromatografi cairantekanan tinggi (HPLC) telah membuktikan keunggulannyaterhadap metode-metode yang lain dalam analisis obat dalamcairan biologis.

PERANAN ANALISIS OBAT DALAM CAIRAN BIOLOGISDALAM BERBAGAI STUDI

Tidak sedikit obat yang mempunyai indeks terapeutik yangrendah, di mama rasio dosis toksis/dosis terapeutik < 10. Obat-obat tertentu, seperti teofilina, akan memberikan efek sampingyang toksis apabila konsentrasinya dalam darah mencapaidua kali konsentrasi terapeutiknya. Sering timbul kesulitan-kesulitan yang serius bagi penderita yang diberi obat jenis ini,karena adanya perbedaan konsentrasi terapeutik antar-individuyang besar. Untuk terapi yang optimal dan pengaturan dosissecara individu diperlukan adanya data kinetika obat-obat

tersebut. Kegiatan studi farmakokinetika klinik seperti ini ti-dak akan pernah dapat dilakukan tanpa melaksanakan analisisobat dalam cairan biologis.

Dalam pengembangan obat baru, pertanyaan tentang keter-sediaan hayatinya merupakan sesuatu yang sangat penting.Bisa saja suatu obat baru pada uji farmakologik menunjukkanadanya potensi, yang kemudian pada uji farmakokinetikamemberikan absorpsi yang kurang baik dan memberikan hargawaktu paruh yang rendah dalam tubuh. Tentunya agar tidakdiderita kerugian yang lebih lanjut, arah dari pengembanganobat baru tersebut harus ditinjau kembali. Keputusan yangcepat dan tepat itu mutlak memerlukan informasi atau datayang diperoleh dari percobaan analisis obat dalam cairan bio-logis.

Studi metabolisme suatu senyawa, yang juga melakukananalisisnya dalam cairan biologis, seringkali menjurus pada pe-nemuan obat baru. Oksifenbutazone dan desipramine merupa-kan contoh obat-obat baru yang ditemukan setelah studimetabolisme. Mereka masing -masing sebagai metabolit darifenilbutazone dan imipramine.

Selain dalam studi biofarmasetika dan farmakokinetikatersebut di atas, analisis obat dalam cairan biologis mem-punyai peranan yang penting pula dalam toksikologi, pusat-pusat rehabilitasi korban penyalahgunaan obat, deteksi bebe-rapa penyakit (meningkatnya kadar metilguanidina dalamserum penderita uremia), memperoleh informasi tentang se-berapa jauh penyebaran suatu tumor (meningkatnya kadar5-S-sisteinildopa, suatu asam amino baru, dalam cairan bio-logis), dan lain sebagainya.

PROBLEM ANALISIS OBAT DALAM CAIRAN BIOLOGISKadar obat dalam cairan biologis yang umumnya sangat

kecil (10-6 - 10- 12 g mr -1 ) membatasi metoda -metoda yang

dapat digunakan untuk menetapkan kadarnya; hanya metode-metode yang sangat sensitif saja yang dapat dipakai. Dalamcairan biologis, obat selalu ada bersama-sama dengan meta-

26 Cermin Dunia Kedokteran No. 37 1985

bolit -metabolitnya. Struktur kimia dari metabolit -metabolittersebut pada umumnya hampir mirip dengan struktur kimiaobat induknya, sehingga sukar mendeteksi mana yang obatmana yang metabolit. Mutlak perlu digunakannya metodeanalisis yang sangat selektif. Zat-zat endogenous (dalam jum-lah yangjauh lebih besar dari jumlah obatnya) dalam matrikssampel biologis sangat mengganggu pelaksanaan analisis,khususnya metode spektroskopi, karena zat-zat endogenoustersebut juga menyerap sinar ultraviolet/visibel. Prosedurclean-up sampel yang berbelit-belit akan memberikan risikohilang atau berkurangnya obat dan metabolit -metabolitnya.

GLC dan HPLC yang selain mampu mendeteksi dan mene-tapkan kadar, juga sekaligus mampu melakukan pemisahan,sehingga dapat mengatasi problem yang didiskusikan di atas.Berikut akan didiskusikan masalah kromatografi.

KROMATOGRAFIKromatografi dalam berbagai bentuknya telah digunakan

secara luas sebagai teknik pemisahan dan analisis. Pada tahun1941, Martin dan Synge, yangkemudian mendapat hadiahNobel, dalam makalahnya mengemukakan pengertian-pengerti-an dasar tentang kromatografi gas (GC) dan HPLC. Tidak ku-rang dari 10 tahun kemudian, yaitu pada tahun 1952, Jamesdan Martin untuk pertama kali mengintrodusir penggunaanGC. Sejak saat itu GC telah menjadi bentuk kromatografiyang paling baik dan berkembang dengan sangat cepat. Ben-tuk-bentuk kromatografi yang lain seperti kromatografi ker-tas, kromatografi lapis tipis (TLC), kromatografi penukar iondan kromatografi eksklusi (semuanya termasuk kromatograficairan), belum memperoleh sukses yang sama seperti yangtelah dicapai oleh GC. Hal ini disebabkan karena efisiensinyayang rendah serta waktu analisisnya yang panjang: Pada awaltahun 1960-an, Giddings menunjukkan bahwa kerangka kerjateoritis yang dikembangkan untuk GC berlaku sama baiknyauntuk kromatografi cairan, dan antara tahun 1967 - 1969Kirkland, Huber, dan kelompok Horvath, Preiss dan Lipskymengemukakan penggunaan HPLC yang pertama kali. Denganmenggunakan tekanan yang tinggi (sampai dengan 5000 psi),HPLC dapat mengatasi kelemahan -kelemahan dari kromato-grafi cairan pada umumnya, misalnya viskositas cairan yangrelatif lebih besar dibanding dengan viskositas gas, sehinggaHPLC mampu memberikan waktu analisis (5 - 30 menit)yang kurang lebih sama dengan waktu analisisnya GC.

Dalam beberapa hal, memang, baik teknik GC maupunHPLC dapat digunakan untuk memecahkan masalah yangsama. Keduanya mempunyai keunggulan yang berupa sensitivi-tas, selektivitas dan kecepatan analisis yang tinggi. Denganmenggunakan detektor ultraviolet mereka dapat memberikanpola spektrum ultraviolet darimasing -masing komponen sam-pel yang diperiksa. Keduanya dapat dihubungkan langsungdengan spektrometer massa, sehingga dapat diperoleh polaspektrum massa dari masing-masing komponen campuranyang sangat penting untuk elusidasi struktur kimianya. Keduateknik ini juga dapat digunakan untuk kromatografi prepara-tif, yaitu masing-masing komponen campuran dapat dikum-pulkan dalam keadaan yang sangat murni, sehingga dapat di-gunakan untuk percobaan -percobaan penelitian lebih lanjut.Kedua -duanya juga dapat dilengkapi dengan sistem micro-processor, sehingga analisis dapat dilaksanakan tanpa kehadir-

an sang operator.Akan tetapi, sejumlah besar obat -obatan tidak dapat di-

analisis dengan teknik GC, karena sifatnya yang sangat polar(konjugat sulfat dan glukuronat dari obat dan metabolit-metabolitnya), tidak mudah menguap dan tidak stabil terha-dap panas, kalau tanpa modifikasi struktur kimianya terlebihdahulu. Teknik HPLC merupakan pilihan utama untuk ana-lisis golongan obat-obat tersebut. Kemampuan HPLC untukmenangani secara langsung obat-obat dan metabolit -metabolityang sangat polar serta konjugat -konjugatnya dalam cairanbiologis sungguh merupakan suatu keunggulan. Pelaksanaananalisisnya yang pada suhu kamar akan mencegah peruraianobat selama proses analisis. Selain detektor, jumlah variabelyang dapat diatur dalam HPLC jauh lebih banyak dari padadalam GC. Kalau hanya fase diam saja yang dapat divariasipada analisis dengan GC, maka baik fase diam maupun fasegerak kedua-duanya dapat divariasi dalam teknik HPLC.Bukan itu saja, berbagai ragamnya mode kromatografi (mode-mode adsorpsi, partisi, penukar ion dan eksklusi) pada prosespemisahan dengan HPLC memungkinkan teknik ini dapat di-gunakan untuk analisis hampir semua jenis obat. Keunggulanlain yangdisumbangkan oleh HPLC dalam analisis obat dalamcairan biologis ialah prosedur ekstraksi, dan clean-up yangmendahului analisis relatif sangat berkurang dibandingkandengan teknik GC. Bahkan telah dilaporkan keberhasilananalisis obat dalam urin dengan menginjeksikan langsungsampel ke dalam kolom dan menggunakan sistem reversedphase, dimana fase gerak digunakan air yang dapat mengelusizat-zat endogenous yang menyerap ultraviolet itu bersamasolvent front. Jumlah jenis detektor yang dapat dipilih padateknik HPLC juga lebih banyak dibandingkan dengan GC.

Untuk pemahaman lebih lanjut, berikut akan didiskusikandasar-dasar GC dan HPLC.

KROMATOGRAFI GASPada GC, fase geraknya berupa gas yang inert, sedang fase

diamnya dapat berupa cairan (disebut kromatografi cairan-gasatau "gas-liquid chromatography", yangdisingkat GLC) atauberupa padatan (kromatografi padatan-gas, "gas-solid chroma-tography", GSC). Proses pemisahan pada GLC terjadi denganmekanisme partisi, sedang pada GSC nielalui mode adsorpsi.Untuk sampel yang berupa obat, GLC lebih populer daripadaGSC. Ini disebabkan karena hampir semua obat akan meng-alami peruraian dengan kondisi yang diperlukan agar terjadielusi pada GSC Oleh karena itu, istilah GC dalam literatur-literatur dimaksudkan untuk GLC.

Fase diam yang palingsering digunakan pada analisis obatdalam cairan biologis dengan teknik GLC ialah siloksan yangtersubstitusi (OV-1 dan OV-17) dan polietilen glikol yang di-salurkan (1 - 5%) pada solid support.

Bagian-bagianpokok suatu GLC ialah : silinder tempat gaspembawa, pengatur aliran dan tekanan gas, tempat injeksisampel, kolom, detektor, rekorder, dan thermostat untuktempat injeksi sampel, kolom dan detektor.

Setelah sampel diinjeksikan, komponen-komponen sampelyang ada dalam keadaan uap dibawa oleh gas pembawa ke da-lam kolom. Dalam kolom, komponen -komponen tersebut ber-partisipasi antara gas pembawa dan fase diam (cairan). Fasediam ini secara selektif menahan komponen -komponen sampel

Cermin Dunia Kedokteran No. 37 1985 27

sesuai dengan koefisien distribusinya, sehingga terbentuk pita-pita komponen yang terpisah dalam gas pembawa. Bersamaaliran gas pembawa, pita-pita komponen ini meninggalkan ko-lom dan dideteksi oleh detektor yang kemudian oleh rekorderdibuat kromatogramnya.

Macam detektor yang dikenal pada GC ialah detektor han-taran panas ("thermal conductivity detector", TCD), detektorionisasi nyala ("flame ionization detector " , FID), detektorpenangkap elektron ( "electron capture detector' , ECD) dandetektor yang hanya khusus mendeteksi senyawa yang me-ngandung unsur nitrogen dan fosfor.

TCD berdasar atas prinsip, suatu benda yang panas akankehilangan panasnya pada suatu kecepatan yang tergantungkepada komposisi gas di sekitarnya. Jadi, kecepatan hilangnyapanas itu dapat digunakan sebagai ukuran tentang komposisigas. Detektor ini kurang sensitif untuk analisis obat dalam cair-an biologis.

FID merupakan detektor yang paling luas penggunaannya,bahkan dianggap sebagai detektor yang universal untuk analisisobat dalam cairan biologis menggunakan GLC. Pada detektorini, komponen-komponen sampel yang keluar dari kolom di-bakar dalam nyala (campuran gas hidrogen dan udara atauoksigen). Sejurnlah besar ion yang terbentuk dalam nyalamasuk ke dalam celah elektrode dan menurunkan teganganlistrik dari celah elektrode mula-mula. Penurunan tegangan iniyang kemudian dicatat sebagai sinyal oleh rekorder. Intensitassinyal ini berbanding lurus dengan konsentrasi solute dalam gaspembawa.

Aliran elektron sebagai hasil ionisasi gas pembawa (nitrogenatau argon/methan) dalam ECD memberikan sinyal yang be-rupa baseline suatu kromatogram. Bila kemudian suatu se-nyawa masuk ke dalam detektor, sebagian dari elektron ter-sebut akan ditangkap oleh senyawa sebelum mereka mencapaiplat detektor. Ini mengakibatkan aliran arus listrik dalam de-tektor berkurang, yang oleh rekorder akan dicatat sebagaisuatu peak. Detektor ini hanya dapat digunakan untuk se-'wawa obat-obatan yang dapat mengabsorpsi elektron denganmudah, yaitu senyawa-senyawa yang mengandung gugus kar-bonil dan nitro yang terkonjugasi sertasenyawa-senyawa yangmengandung halogen-organik. Sensitivitas detektor ini padatingkat pikogram. Suatu psikotropik baru (1,2-benzisoxazole-3-acetamidoxime hydrochloride), analisisnya dalam plasmaberhasil dilakukan dengan GLC menggunakan detektor ini.

Spektrometer massa dapat juga digunakan sebagai detektorpada GLC. Kombinasi GLC dengan spektrometer massa (GC-MS) saat ini merupakan suatu alat yang ampuh dalam identifi-kasi obat dan metabolit-metabolitnya dalam cairan biologis.

Untuk obat-obat yang sukar menguap dan tidak stabilterhadap panas, agar dapat dianalisis secara GLC harus dideri-vatisasi secara kimia. Obat-obat dengan gugus fungsional yangsangat polar seperti hidroksil (OH), karboksil (COOH) danamino (NH2 ) diubah menjadi eter (OR), ester (COOR) danamida (NHCOR) yang merupakan gugus-gugus yang kurangpolar.

KROMATOGRAFI CAIRAN TEKANAN TINGGISeperti tampak dari namanya, fase gerak yang digunakan

pada HPLC berupa cairan yang dialirkan dengan tekanan

sangat tinggi. Fase diamnya dapat berbagai macam, tergantungmode kromatografi yang dipilih dalam proses pemisahan.

Proses pemisahan dalam HPLC dapat dilakukan denganberbagai mode kromatografi sebagai berikut :

• Mode kromatografi cairan-cairan (partisi) : fase diamberupa cairan yang disalutkan atau diikatkan secara kimiapada solid support. Komponen sampel yang dipisahkan ber-partisi di antara fase diam dan fase gerak. Pada mode ini di-kenal sistem normal phase (fase diam berupa senyawa yangpolar, sedang fase geraknya non-polar) dan sistem reversedphase (fase diam berupa senyawa yang non-polar, sedang fasegeraknya polar). Dengan sistem normal phase dapat dipisahkanpestisida, steroid, anilina, alkaloida, glikol, alkohol, fenol,aromatik dan komplek logam. Sistem reversed phase dapatmemisahkan alkohol, aromatik, antrakuinon, alkaloid, oligo-mer, antibiotika, barbiturat, steroid, pestisida-klor dan vita-min-vitamin.

• Mode kromatografi pasangan ion ('ion pair chromato-graphy'; IPC) : merupakan bentuk khusus dari kromatograficairan-cairan yang digunakan untuk pemisahan senyawa obat-obat yang ionik atau yang dapat terionisasi seperti aminobiogenik, sulfonamida, karboksilat dan sulfonat. Ada dua me-kanisme proses pemisahan pada IPC, yaitu mode partisi, dimana molekul sampel yang ionik atau yang mudah terionisasi,tetapi tidak bersifat lipofilik, membentuk suatu pasangan iondengan suatu counter-ion yang cocok yang ditambahkan padafase geraknya. Dengan terbentuknya pasangan ion ini akanmenambah sifat lipofilik sampel, sehingga memperbesar afini-tasnya terhadap fase diam. Mekanisme yang kedua ialah modepenukar ion, di mana counter-ion yang polar dianggap sebagaidiabsorpsi oleh fase diam hidrokarbon sehingga seperti mem-bentuk suatu titik penukar ion, pada mana molekul sampelyang polar akan dapat diabsorpsi seperti pada kromatografipenukar ion.

• Mode kromatografi padatan-cairan (adsorpsi) : fasediamnya berupa padatan yang dapat mengadsorpsi molekulsampel yang dipisahkan secara reversibel. Dalam sistem normalphase digunakan fase diam yang polar (silica gel, alumina)dan fase gerak non-polar (heksan, kloroform). Sebaliknya,pada sistem reversed phase digunakan fase diam yang non-polar (butiran polimer) dengan fase gerak yang polar (air,etanol). Dengan mode adsorpsi ini dapat dipisahkan anti-oksidan, vitamin, steroid, barbiturat, zat-zat warna, amina,hidrokarbon, fenol, alkaloida, amida, lipida, asam-asam aminodan alkohol-alkohol.

• Mode kromatografi penukar ion ("ion-exchange chroma-tography'; IEC) : fase diam terdiri dari suatu matriks yangtegar, yang permukaannya menyangga suatu muatan positifsehingga menyajikan suatu titik penukar ion (R+ ). Bila diguna-kan suatu fase gerak yang mengandung anion, titik penukarion tersebut akan menarik dan memegang suatu counter-ion negatif (Y-). Sampel yang berupa anion (X-) kemudiandapat bertukaran dengan counter-ion (Y-) :

R +Y - + X- '7= R +X- + Y - .

Karen prosesnya menyangkut penukaran anion, disebut kro-matografi penukar anion. Proses kromatografi penukar kationdapat digambarkan :

28 Cermin Dunia Kedokteran No. 37 1985

Fase diam penukar kation mengandung gugusan asam, dibeda-kan menjadi penukar kation kuat (—SO3

- ) dan penukar kationlemah (—COO ). Fase diam penukar anion mengandung gugus-an basa; dibedakan menjadi penukar anion kuat (—NR+ ) danpenukar anion lemah (—NH2). Mode kromatografi ini berhasildigunakan untuk memisahkan dan analisis asam amino, asamnukleat, protein, asam karboksilat, sulfonat aromatik, gula-gula, obat-obat analgetik, vitamin, purin dan glikosida.

• Mode kromatografi eksklusi ("exclusion chromatogra-phy"; EC, juga disebut "gel filtration chromatography", gelpermeation chromatography" atau "gel chromatography") :memisahkan campuran sesuai dengan ukuran dan bentuk mo-lekulnya. Molekul-molekul kecil yang dapat masuk secarabebas ke dalam pori-pori fase padat dikatakan sebagai mem-punyai koefisien distribusi K = 1, sedang molekul-molekulbesar dieksklusi secara sempurna dari seluruh pori-pori mem-punyai K = 0. Molekul-molekul ukuran sedang mempunyaiK antara 0 dan 1. Jadi, molekul-molekul besar akan bergerakjauh lebih cepat melalui kolom dibanding dengan molekul-molekul kecil. Molekul-molekul akan dielusi berturut-turutsesuai dengan penurunan ukurannya. Contoh fase diam padamode ialah suatu gel dekstran dalam bentuk butiran yang di-pasarkan dengan nama Sephadex. Mode kromatografi ini ber-hasil digunakan pada pemisahan senyawa-senyawa denganbobot molekul > 2000, termasuk polimer organik (poliole-fine, polistirene, polivinyl, poliamida), bipolimer (protein,asam nukleat, oligosakrida, peptida, gula-gula, glikol).

Selain beragamnya mode kromatografi, keunggulan HPLCjuga karena luasnya pilihan detektor yang dapat digunakan.Secara garis besar, detektor dalam HPLC dapat dibedakan :1 ). berdasar pengukuran diferensial suatu sifat yang dimilikibaik oleh molekul sampel maupun fase gerak (disebut bulkproperty detector, yang termasuk ini misalnya : detektorindeks bias, detektor konduktivitas dan detektor tetapandielektrika).2). berdasar pengukuran suatu sifat yang spesifik dari mole -

kul sampel (disebut solute property detector). Jenis yang ke-dua ini dibedakan lagi menjadi : yang tidak perlu adanyapemisahan fase gerak, termasuk ini ialah detektor-detektorfotometer (uv-vis dan fluoresen), polarografi dan radioaktif;dan yang fase feraknya harus dipisahkan dahulu, termasuk iniialah FID dan ECD.

Pada detektor ultraviolet/visibel, deteksi komponen sampeldidasarkan pada absorpsi sinar ultraviolet (untuk detektorultraviolet) dan sinar tampak (untuk detektor visibel). Detek-tor ultraviolet merupakan detektor yang paling luas digunakankarena sensitivitas dan reprodusibelitasnya yang tinggi sertamudah operasinya.

Obat-obat yang fluoresen dapat dipisahkan dan dianalisisdengan indikator fluorimeter, seperti aflatoksin, beberapaasam amino aromatik, fenol, kuinolin dan estrogen. Untukobat-obat yang tidak berfluoresensi dapat dibuat menjaditurunannya yang berfluoresensi dengan pereaksi sepertidansyl klorida (5-dimetilaminonaftalene-l-sulfonil klorida).Detektor ini lebih peka dari pada detektor ultraviolet.

Detektor fotometer inframerah juga dapat digunakan padaHPLC. Dengan detektor ini dapat dibuat pola spektrum infra-

merah dari komponen sampel sehingga gugus-gugus fungsional-nya dapat diketahui.

Detektor indeks bias merupakan detektor yang juga luaspenggunaannya setelah detektor ultraviolet. Dasarnya ialahpengukuran perbedaan indeks bias fase gerak murni denganindeks bias fase gerak yang berisi komponen sampel, sehinggadapat dianggap sebagai detektor yang universal pada HPLC.Detektor ini kurang sensitif dibanding dengan detektor ultra-violet dan sangat peka terhadap perubahan suhu.

Sekarang juga telah ada HPLC yang dikombinasi denganspektrometer massa. Dengan HPLC-MS, prospek studi yangberkaitan dengan analisis obat dalam cairan biologis menjadilebih cerah lagi.

Dari uraian di atas jelaslah bahwa bagian-bagian pokok darisuatu HPLC meliputi wadah penyuplai pelarut (fase gerak),pompa penakan, tempat injeksi sampel, kolom, detektor danrekorder.

Untuk memperoleh kondisi terbaik pada analisis obat da-lam cairan biologis menggunakan HPLC, perlu pendekatanyang akan diuraikan sebagai berikut.

PENDEKATAN DALAM ANALISIS DENGAN HPLCSifat Permasalahan

Macam dan sifat obat yang akan diperiksa harus diketahuidahulu, misalnya kelarutan, pola spektrum ultraviolet, polaspektrum inframerah (untuk gugus fungsional), struktur mo-lekul dan lain sebagainya. Perlu juga diketahui apakah yangperlu dianalisis itu, misalnya hanya obatnya saja atau obatdan metabolit-metabolitnya. Apakah sebagai hasil analisiscukup suatu kromatogram atau masing-masing komponensampel harus dipisahkan/dikompulkan untuk percobaan lebihlanjut? Juga apakah analisis yang akan dilakukan itu hanyadimaksudkan untuk memecahkan suatu masalah saja atau akandijadikan metode kontrol kualitas yang rutin ?Jawaban dari semua pertanyaan di atas akan mempengaruhidan menentukan pendekatan analisisnya.Pemilihan Mode Kromatografi

Setelah menentukan sampai seberapa jauh analisis itu di-perlukan dan sifat-sifat sampel, sang analis kemudian memilihmode kromatografi yang paling cocok untuk memberikanhasil yang dikehendaki. Pemilihan mode kromatografi (partisi,adsorpsi, penukar ion, pasangan ion atau eksklusi) yang di-dasarkan atas kriteria bobot molekul, kelarutan dan sifatgugus fungsional dapat dilihat pada transparansi.Seleksi Fase Diam dan Fase Gerak

Suatu pemisahan akan berhasil apabila tercapai suatu kese-timbangan yang tepat antara kekuatan-kekuatan intermoleku-lar yang melibatkan molekul sampel, fase gerak dan fase diam.Sebagai ukuran kekuatan-kekuatan intermolekular tersebutialah polaritas molekul. Hampir semua pemisahan-pemisahanyang baik diperoleh karena cocoknya polaritas molekul sampeldengan polaritas fase diam dan digunakannya fase gerak yangberbeda polaritasnya.

Pada kromatografi dengan sistem normal phase, komponensampel yang paling kurang polar akan dielusi terlebih dahulu;penambahan polaritas dari fase geraknya akan menurunkanwaktu elusinya.

Cermin Dunia Kedokteran No. 37 1985 29

-

3

Pada kromatografi dengan sistem reversed phase, komponensampel yang paling polar akan terelusi terlebih dahulu; penam-bahan polaritas dari gase gerak akan menaikkan waktu elusi-nya. Diagram pada transparansi akan menggambarkan hal ini.Pemilian Detektor

Detektor index bias merupakan satu-satunya detektor padaHPLC yang universal, tetapi kurang sensitif dan sangat pekaterhadap perubahan suhu. Detektor ultraviolet dengan panjanggelombang yang variabel merupakan pilihan yang paling baikbagi sekelompok besar obat-obatan. Dalam hal-hal yang sangatspesifik dapat digunakan detektor-detektor fluorometer danelektrokimia.Pemisahan Kromatografi

Untuk mempertimbangkan kondisi analisis yang optimalperlu difahami pengertian-pengertian pokok dalam kroma-tografi yang secara umum berlaku bagi semua mode. Dua para-meter kromatografi yang penting dalam optimasi hingga di-peroleh suatu pemisahan yang maksimum dan dalam waktuyang minimum:1).Persamaan yang menghubungkan waktu retensi (t R) danfaktor kapasitas (k'),

2).Persamaan yang menghubungkan resolusi (Rs) denganfaktor kapasitas (k '), retensi relatif ( a) dan jumlah theore-tical plates (N) :

Harga optimum untuk k' adalah antara 1 — 10. Harga k'yang lebih besar cenderung akan memperpanjang waktu re-tensi dan pita-pita kromatografi terelusi sebagai peaks yanglebar dan datar sehingga sukar untuk mendeteksinya. Apabilaharga k ' sudah terletak pada rentangan yang optimum, makaharga k' tidak sepantasnya diubah. Perubahan resolusi hanyaakan diperoleh dengan menaikkan N, atau a .

Faktor kapasitas (k ') merupakan parameter yang palingmudah dioptimasi, karena biasanya hanya menyangkut per-ubahan kekuatan fase gerak. Tetapi k ' sebetulnyajuga dapatdiatur dengan merubah fase diamnya, walaupun hal ini jelastidak menyenangkan.

Harga optimum untuk a terletak antara 1,05 — 10. Per-ubahan harga dapat diperoleh dengan merubah sifat fase diamdan/atau fase gerak. Perubahan fase gerak di sini lebih ber-makna kalau yang diubah komposisi fase gerak; bukan per-ubahan kekuatannya. Pengaruh perubahan a lebih sukar di-ramalkan dari pada perubahan k ' dan N, dan dalam suatusampel yang terdiri dari banyak komponen, perubahan a ha-nya akan merubah urut-urutan peaknya saja. Tetapi dalam halwaktu analisis, memang perubahan a merupakan cara yang ter-baik untuk memperbaiki Rs. Karena untuk memperbaiki Rslebih mudah dicapai dengan menaikkan N, cara ini nampak-nya lebih baik. Tetapi perbaikan Rs dengan cara ini umumnyaakan mengakibatkan bertambahnya waktu retensi, karena pe-nambahan N biasanya diperoleh dengan penambahan panjangkolom atau pengurangan kecepatan alir fase gerak. Secara

umum dapat dikatakan bahwa optimasi pemisahan dapat di-lakukan, dengan menentukan fast diam yang sesuai denganmode kromatogtafi yang akan digunakan, kemudian meng-ubah-ubah fase gerak hingga dicapai pemisahan yang sebaik-baiknya.

Setelah diperoleh suatu kromatogram yang baik, tentunyayang terakhir ialah bagaimana mengevaluasi data kromato-gram itu.

• Analisis KualitatifIdentifikasi suatu komponen sampel dapat dilakukan de-

ngan membandingkan harga tR dari peak yang muncul dalamkromatogram dengan harga t R suatu reference standard. Apa-bila harga tR tersebut sama dalam dua atau lebih sistem yangdicoba, maka dikatakan bahwa kedua senyawa tersebutidentik. Untuk lebih menegaskan kesimpulan tersebut, dapatdilakukan percobaan spiking, yaitu kepada sampel ditambah-kan obat standard reference kemudian dibuat kromatogram-nya. Apabila kedua senyawa tersebut identik maka standardreference akan menaikkan tinggi peak dari obat yang dianalisis.Untuk HPLC yang dilengkapi dengan spektrometer massa,identifikasi obat yang dianalisis dapat dilakukan denganmencocokkan pola spektrum massa yang diperoleh denganyang ada dalam literatur-literatur. Untuk obat yang baru,identifikasinya dilakukan dengan mencoba mengelusidasistrukturnya tidak saja dengan spektrum massanya tetapijuga dengan spektra NMR, IR dan UV dari obat yang dipisah-kan dan dikumpulkan dari eluat yang keluar dari HPLC.• Analisis Kuantitatif

Detektor yang ideal pada HPLC ialah yang mampu meng-hasilkan sinyal yang mempunyai korelasi linier dengan konsen-trasi komponen sampel. Dengan asumsi seperti tersebut,konsentrasi komponen sampel dapat diturunkan dari intensitassinyal yang ditunjukkan dalam kromatogram.

Dikenal dua cara pengukuran secara kuantitatif, yaitudengan mengukur peak height dan peak area.

Dikenal beberapa metode untuk merubah data peak heightatau peak area dari suatu kromatogram menjadi konsentrasidari komponen sampel yang sesuai, yaitu dengan membuatkurva baku dengan cara-cara external standard, internal stan-dard dan standard addition.

Sebelum sampai kepada bagian aplikasi GLC dan HPLCdalam analisis obat dalam cairan biologis, berikut akan disaji-kan preparasi sampel dalam GLC dan HPLC.

PREPARASI SAMPELSeperti telah dikemukakan di muka, prosedur ekstraksi

dan clean-up dalam HPLC lebih sederhana dari teknik-teknikyang lain. Telah banyak dilaporkan bahwa beberapa sampelbiologis dapat dianalisis dengan HPLC dengan langsung meng-injeksikan ke dalam kolom (pra-kolom). Namun adanya pro-tein, lipid, garam-garam dalam jumlah yang relatif banyakdalam sampel biologis, perlu diperhatikan untuk menghindariadanya gangguan pada efisiensi kolom. Protein dapat dihilang-kan dengan cara pengendapan, ultrafiltrasi dan penggunaanpra-kolom. Pereaksi-pereaksi asam seperti asam trikloroasetat,asam perklorat dan asam tungstat dapat digunakan untukmengendapkan protein dalam cairan biologis untuk analisis

30 Cennin Dunia Kedokteran No. 37 1985

obat-obat yang tahan asam. Untuk yang tidak tahan asam,pengendapan dilakukan dengan etanol atau metanol. Peng-gunaan pra-kolom untuk menghilangkan protein telah dila-porkan pada analisis frusemide, dengan langsung menginjeksi-kan plasma ke dalam pra-kolom yang mempunyai susunansama dengan kolom analisis. Dengan menggunakan bufferfosfat (pH 2,5) sebagai fase gerak, protein tertimbun pada pra-kolom ini.

Fase gerak metilenklorida atau dietil eter dapat mengelusilipid netral dengan menggunakan mode kromatografi adsorpsi.Dengan mode yang sama fase gerak campuran metilenklorida/metanol atau metanol dapat mengelusi fosfolipid. Lipid yangterelusi ini tidak akan mengganggu bila digunakan detektorultraviolet karena absorpsi molar senyawa-senyawa tersebutrendah.

Pada sistem reversed phase, lipid dapat tertahan pada fasediam hingga dapat menyebabkan terganggunya efisiensi ko-lom. Ini dapat diatasi dengan mengaliri kloroform setiap se-telah 100 kali injeksi plasma yang sari dengan eter.Kalau problem utama pada sampel plasma adalah penghilang-an protein dan lipid, maka pada sampel urin masalah yangdihadapi adalah, bagaimana menghilangkan garam-garamanorganik atau komponen-komponen dengan bobot molekulrendah yang memiliki sifat-sifat kromatografik yang miripdengan obat yang dianalisis. Konsentrasi obat dalam sampelurin juga perlu mendapat perhatian. Garam-garam anorganikdapat dipisahkan dari sampel urin dengan melewatkan sampelmelalui suatu kolom yang berisi resin Amberlite XAD-2 yangdapat menahan senyawa-senyawa organik dan meneruskangaram-garam anorganik dan dengan mengelusinya denganmetanol, dapat diperoleh senyawa organik yang dikehendaki.

Akhirnya akan diberikan beberapa aplikasi GLC dan HPLCdalam analisis obat dalam cairan biologis.

APLIKASI GLC DAN HPLC DALAM ANALISIS OBATDALAM CAIRAN BIOLOGIS

Teknik GLC dan HPLC telah membuktikan kemampuan-nya untuk menganalisis sejumlah besar golongan obat-obatandalam cairan biologis.

Analisis dibenzepine dan metabolit-metabolitnya serta pe-netapan fenobarbital, primidone dan fenitoin, semuanya dalamcairan biologis, secara GLC, akan dibahas sebagai contoh.

Contoh analisis menggunakan teknik HPLC yang akan di-diskusikan meliputi penetapan propranolol dan 4-dehidroksi-propranolol dalam plasma secara simultan dan penetapan para-setamol dan metabolit-metabilitnya.

KEPUSTAKAAN

1. Pryde A, and Gilbert MT. "Aplications of high performance liquidchromatography." New York: Chapman and Hall Ltd., 1979.

2. Hamilton RJ, and Sewell PA. "Introduction to high performanceliquid chromatography". New York: Chapman and Hall Ltd., 1977.

3. Smith RV, and Stewart IT. "Textbook of biopharmaceutic analy-sis". Philadelphia: Lea & Febiger, 1981.

4. McNair HM, and Bonelli EJ. "Basic gas chromatography", 5 th ed.,California: Varian Aerograph, 1969.

5. Dell D. in "Assay of drugs and other trace compounds in biologicalfluids" (E. Reid, ed.), Amsterdam: North-Holland PublishingCompany, 1976; p. 131 — 134.

6. Done JN, Knox JH, and Loheac J. "Applications of highspeedliquid chromatography". London: John Wiley & Sons, 1974.

7. Nation RL, Peng GW, and Chiou WL. Journal of Chromatography,1978; 145 : 429.

8. Rutherford DM, and Flanagan RJ. Journal of Chromatography,1978; 157 : 311.

9. Schlicht HJ, and Gelbke HP. Journal of Chromatography, 1978;166: 599.

Disajilcan pada Seminar Berkala I Ikatan Ahli Farmakologi dan Simpo-sium Farmakokinetllca Klinik - Yogyakarta, 3 - 4 Desember 1984.

Cermin Dunia Kedokteran No. 37 1985 31