LAPORAN AKHIR PRAKTIKUM PEWARNAAN GRAM

NAMA : AYU APRILIANI

NPM : 260110140078

HARI/TANGGAL PRAKTIKUM : RABU, 23 SEPTEMBER 2015

ASISTEN :1. BETHARY K

2. HIMMATUL ULYA

LABORATORIUM FARMAKOTERAPI PENYAKIT INFEKSI

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS PADJADJARAN

JATINANGOR

2015

I. Tujuan

1. Mengamati dua kelompok bakteri yaitu bakteri Gram positif dan Gram

negatif dengan menggunakan prosedur pewarnaan Gram.

2. Memahami setiap langkah dan reaksi – reaksi kimia yang terjadi dalam

prosedur tersebut.

II. Prinsip

1. Teknik Pewarnaan Diferensial

Prosedur pewarnaan yang menampilkan perbedaan di antara sel-sel

mikroba atau bagian-bagian sel mikroba (Pelczar dan Chan, 2007).

2. Pewarnaan Gram

Pewarnaan gram atau metode gram adalah suatu metode empiris untuk

membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar gram-positif

dan gram-negatif berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel bakteri

(Karman, Oman, 2008).

3. Zat Warna

Zat pewarna adalah garam yang terdiri atas ion positif dan ion negatif,

salah satu di antaranya berwarna (Volk & Wheeler, 1993).

III. Teori Dasar

Pewarnaan gram adalah suatu metode empiris untuk membedakan spesies

bakteri menjadi dua kelompok besar, yaitu gram positif dan gram negatif,

berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka. Metode ini diberi nama

berdasarkan penemunya, ilmuan Denmark Hans Cristian Gram (1853-1938) yang

mengembangkan tehnik ini pada tahun 1884 untuk membedakan antara

pneumokokus dan bakteri klebsiella pneumoniae. Pewarnaan Gram adalah

pewarnaan diferensial yang sangat berguna dan paling banyak digunakan dalam

laboratorium mikrobiologi, karena merupakan tahapan penting dalam langkah

awal identifikasi. Pewarnaan ini didasarkan pada tebal atau tipisnya lapisan

peptidoglikan di dinding sel dan banyak sedikitnya lapisan lemak pada membran

sel bakteri. Jenis bakteri berdasarkan pewarnaan gram dibagi menjadi dua yaitu

gram positif dan gram negatif. Bakteri gram positif memiliki dinding sel yang

tebal dan membran sel selapis. Sedangkan baktri gram negatif mempunyai

dinding sel tipis yang berada di antara dua lapis membran sel (Iud,2008).

Bakteri hidup sukar untuk dilihat dengan mikroskop cahaya biasa karena

bakteri itu tampak tidak berwarna jika diamati secara sendiri-sendiri, walaupun

biakannya secara keseluruhan mungkin berwarna. Bakteri lebih sering diamati

dalam olesan terwarnai daripada dalam keadaan hidup. Yang dimaksud bakteri

terwarnai adalah organisme yang telah diwarnai dengan zat pewarna kimia agar

mudah dilihat dan dipelajari. Pada umumnya, olesan bakteri terwarnai

mengungkapkan ukuran, bentuk, susunan dan adanya struktur internal seperti

spora dan butiran (Schlegel, 1994).

Untuk mempelajari morfologi, struktur, sifat-sifat bakteri untuk membantu

identifikasinya bakteri perlu diwarnai.Jenis- jenis pewarnaan kuman yang dikenal

adalah :

1. Pewarnaan negatif (back grown staining)

Suspensi kuman dibuat dalam zat warna negrosin atau tinta bak dan disebar-

ratakan dengan gelas alas lain (sediaan hapus). Disini kuman tidak diwarnai

dan tampak sebagai benda-benda terang dengan latar belakang hitam.

Pewarnaan ini dipakai untuk kuman yang sukar diwarnai, misalkan

Spirochaeta (Treponema, Leptospora dan Borrelia).

2. Pewarnaan sederhana

Pewarnaan ini hanya menggunakan satu macam zat warna. Misalkan biru

metilen, air fukhsin atau ungu kristal selama 1-2 menit. Zat warna aniline

mudah diserap oleh kuman.

3. Pewarnaan differensial

Pewarnaan diferensial menggunakan lebih dari satu macam zat warna, terdiri

atas :

a. Pewarnaan Gram yang ditemukan oleh Christian Gram pada tahun 1884

untuk membedakan kuman-kuman yang bersifat Gram positif dan Gram

negatif.

b. Pewarnaan tahan asam (acid-fast staining), misalnya pewarnaan Ziehl

Neelsen dan Kinyoun-Gabbet untuk membedakan kuman-kuman yang tahan

asam dari yang tidak tahan asam.

c. Pewarnaan khusus, pewarnaan ini dipakai untuk mewarnai bagian-bagian

sel kuman atau kuman tertentu yang sulit diwarnai dengan pewarnaan biasa,

misalnya pewarnaan Gray untuk mewarnai flagel, pewarnaan Klein untuk

mewarnai spora dan pewarnaan Becker-Krantz untuk mewarnai Spirokhaeta

(Assani, 1994).

E. coli termasuk bakteri berbahaya karenadapat menyebabkan diare.

Salah satu syarat E. coli dalam SNI 01-6366-2000 harus negatif. Isolasi dan

identifikasi merupakan metode konvensional dalam pemeriksaan bakteri yang

didasarkan pada reaksi biokimia. Oleh karena itu, dalam isolasi dan identifikasi

bakteri diperlukan media yang selektif. Setelah dilakukan pewarnaan Gram

dilanjutkan dengan uji biokimia pada berbagai media seperti gula. Bakteri yang

sudah diisolasi dan diidentifikasi selanjutnya diuji secara serologis untuk

menentukan serotipenya (Cowan 1984).

Infeksi dapat disebabkan oleh bakteri. Contoh beberapa bakteri yang

dapat menyebabkan infeksi diantaranya S. aureus dan E. coli. Staphylococcus

merupakan penyebab infeksi piogenik (menghasilkan pus) pada manusia dan

paling sering. Staphylococcus dapat menyebabkan sepsis pada luka bedah,

abses payudara pada ibu-ibu, mata lengket dan lesi-lesi kulit pada bayi

(Donnelly, 1996).

Salah satu bakteri penyebab keracunan setelah minum susu adalah S.

aureus. Di beberapa negara di Eropa, seperti Norwegia, S. aureus merupakan

salah satu bakteri penyebab keracunan setelah minum susu (Jorgensen et al.

2005). Sumber-sumber S. aureus terdapat di sekitar kita, yaitu bagian

permukaan kulit, mukosa mulut, hidung, dan kulit kepala. Pemeriksaan S.

aureus dapat menggunakan metode isolasi dilanjutkan uji koaglutinasi plasma

kelinci (AOAC 1996).

IV. Alat, Bahan dan Gambar Alat

Alat

1. Bak pewarna

2. Botol semprot

3. Kaca obyek

4. Kapas

5. Kertas saring

6. Mikroskop majemuk

7. Ose

8. Pembakar spirtus

Bahan

1. Air fuksin.

2. Akohol 95 %

3. Alkohol 70%

4. Aquades

5. Karbol gentian violet

6. Lugol

7. Minyak emersi

8. Suspensi campuran bakteri E. coli dan S. aureus.

Gambar Alat

Bak Pewarna Botol Semprot Kaca Objek

Kapas Kertas Saring Mikroskop Majemuk

Ose Pembakar Spirtus

V. Prosedur

Disediakan kaca obyek yang bersih dan buat olesan dari masing-masing

campuran bakteri. Diletakkan kaca-kaca obyek di atas rak kawat di atas bak

pewarna. Digenangi olesan bakteri dengan pewarna karbol gentian violet

selama 1 menit, buangt zat warna yang berlebih, lalu bilas dengan air suling.

Digenangi olesan dengan lugol selama 2 menit, buang lugol yang berlebih lalu

bilas dengan air suling. Dicuci olesan dengan pemucat alkohol 95% tetes demi

tetes selama 30 detik atau sampai zat warna larut, lalu bilas dengan air suling.

Digenangi olesan dengan pewarna tandlingan air fuksin selama 30 detik,

buang warna yang berlebih bilas dengan air suling lalu keringkan dengan

kertas saring. Diteteskan sedikit minyak emersi pada preparat, lalü periksa di

bawah mikroskop. Dimulai dengan obyektif berkekuatan terendah 10X, Jalu

ganti dengan lensa obyektif berkekuatan 100X. Diamati dan digambarkan

hasilnya. Bakteri Gram positif akan benwarna ungu dan bakteri Gram negatif

akan berwarna merah.

VI. Data Pengamatan

No. Perlakuan Hasil

1. Kaca objek dibersihkan dan

dikeringkan dengan kapas

Kaca objek sudah bersih dan

kering

2. Ose difiksasi dengan membakar ose

diatas pembakar spirtus

Ose sudah difiksasi

3. Ose dimasukkan ke dalam tabung

reaksi berisi suspensi bakteri dan ose

dioleskan ke atas kaca objek agar

bakteri menempel pada kaca objek

Bakteri sudah menempel di kaca

objek

4. Kaca objek dikeringkan dengan

dilewati diatas pembakar spirtus

Kaca objek sudah kering

5. CGV diteteskan pada kaca objek

dimana bakteri berlokasi dan

diamkan selama 1 menit

Kaca objek berwarna biru tua

6. Kaca objek dibilas perlahan dengan

air suling

Kaca objek bersih dan tidak ada

CGV yang tersisa

7. Lugol diteteskan pada kaca objek

dimana bakteri berlokasi dan

didiamkan selama 2 menit

Kaca objek berwarna kuning

8. Kaca objek dibilas perlahan dengan Kaca objek bersih dan tidak ada

air suling lugol yang tersisa

9.

Kaca objek ditetesi alkohol 95 %

Kaca objek sudah ditetesi alkohol

90%

10. Kaca objek dibilas perlahan dengan

air suling

Kaca objek bersih dan tidak ada

alkohol yang tersisa

11.

Kaca objek ditetesi fuchsin dan

didiamkan selama 30 detik

Kaca objek berwarna merah muda

12. Kaca objek dibilas perlahan dengan

air suling

Kaca objek bersih dan tidak ada

fuchsin yang tersisa

13.

Kaca objek dikeringkan dengan

menggunakan kertas saring dan

ditetesi minyak emersi

Kaca objek sudah kering dan sudah

ditetesi minyak emersi, siap untuk

dilihat di bawah mikroskop

14. Kaca objek diletakkan dibawah

mikroskop dan dilihat pada

perbesaran 10, 40 dan 100

Bakteri terlihat berwarna

merah/biru

VII.

Foto Keterangan

1.

Bacilli

Perbesaran : 40 x

Bentuk : Bacilli

Warna : Merah

Pewarna : CGV, Lugol, Fuchsin

Bakteri : E. coli

2.

Coccus

Perbesaran : 10 x

Bentuk : Coccus

Warna : Biru

Pewarna : CGV, Lugol, Fuchsin

Bakteri : Staphylococcus

Aureus

VII. Pembahasan

Pada praktikum kali ini kami melakukan pewarnaan gram dengan tujuan

dari praktikum ini adalah mengamati dua kelompok bakteri yaitu bakteri Gram

positif dan Gram negatif dengan menggunakan prosedur pewarnaan Gram dan

memahami setiap langkah dan reaksi – reaksi kimia yang terjadi dalam prosedur

tersebut. Pewarnaan ini dapat menggunakan pewarnaan basa pada umumnya

antara lain karbol gentian violet , lugol , fuchsin .

Pewarnaan gram merupakan pewarnaan yang digunakan untuk

mengelompokan bakteri gram positif dan gram negatif. Bakteri gram positif akan

mempertahankan zat warna crystal violet dan akan tampak berwarna ungu tua di

bawah mikroskop. Adapun bakteri gram negatif akan kehilangan zat warna crystal

violet setelah dicuci dengan alkohol, dan sewaktu diberi zat pewarna air fucsin

akan tampak berwarna merah. Perbedaan zat warna ini disebabkan oleh

perbedaan dalam truktur kimiawi dinding selnya. Pewarna yang digunakan dalam

pewarnaan gram antara lain : crystal violet, alkohol, safranin, dan iodine

(Lay.1994).

Prinsip pewarnaan Gram adalah kemampuan dinding sel terhadap zat

warna dasar (Kristal violet) setelah pencucian alkohol 96%. Bakteri Gram positif

terlihat berwarna ungu karena dinding selnya mengikat Kristal violet lebih kuat,

sedangkan sel Gram negatif mengandung lebih banyak lipid sehingga pori-pori

mudah membesar dan Kristal violet mudah larut saat pencucian alkohol (Fardiaz,

1989)

Langkah pertama yang dilakukan adalah sterilisasi kaca objek dengan cara

di celupkan kedalam larutan desinfektan kemudian dicelupkan kedalam alkohol

70%. Sterilisasi bertujuan untuk memusnahkan atau mengeliminasi semua

mikroorganisme termasuk spora bakteri yang resisten dalam alat yang akan

digunakan. Setelah sterilisasi alat-alat, langkah selanjutnya adalah fiksasi adalah

suatu metode persiapan untuk menyiapkan suatu sampel agar tampak realistik

dengan menggunakan grutaldehid dengan proses pemabakaran. Fiksasi bertujuan

untuk mematikan bakteri dan melekatkan sel bakteri pada objek glass tanpa

merusak struktur selnya. Fiksasi harus dilakukan secara benar agar sel bakteri

dapat terlihat jelas ketika dilihat dengan mikroskop.

Setelah difiksasi selanjutnya pengolesan bakteri pada kaca objek. Pastikan

kaca objek harus bersih dari debu atau kotoran lainnya agar tidak mengganggu

pada saat pengamatan sel bakteri. Pengolesan bakteri dilakukan seharusnya tidak

terlalu tebal alau terlalu tipis dan tahan pencucian satu kali atau lebih, setelah

difiksasi dengan panas. Bakteri tidak hilang tercuci, dengan bentuk tetap dan tidak

menyusut. Olesan bakteri merupakan prasyarat bagi berhasilnya berbagai teknik

pewarnaan. Namun sebelum melakukan pengolesan bakteri pada kaca objek

terlebih dahulu tandai tempat yang akan diolesi bakteri dengan memberi tanda

lingkaran di bawah kaca objek sebagai tanda area untuk melakukan pengolesan sel

bakteri dari suspensi agar memudahkan saat melihat di mikroskop. Setelah kaca

objek diolesi bakteri difiksasi kembali di atas api dengan cara di lewat lewatkan

tidak terlalu dekat api supaya bakteri tidak mati. Fiksasi dalam tahap ini bertujuan

melekatkan sel bakteri pada objek glass tanpa merusak struktur selnya. Fiksasi

harus dilakukan secara hati-hati agar bakteri tidak menjadi mati karena proses

pemanasan yang terlalu lama.

Setelah diolesi bakteri dan difiksasi kemudian kaca objek di teteskan

pewarna karbol gentian violet di simpan di atas bak warna dan diamkan selama 1

menit. Karbol gentian violet merupakan campuaran fuchsin fenol, dan dasar yang

digunakan dalam prosedur pewarnaan bakteri. Umumnya digunakan dalam

pewarnaan mikrobkateria karena memiliki ketertarikan untuk asam mycolic yang

ditemukan di dinding sel mikroba. Setelah 1 menit lalu di bilas dengan aquades.

Kemudian di teteskan pewarna lugol dan diamkan selama 2 menit. Lugol

merupakan pewarna Mordan, yaitu pewarna yang berfungsi memfiksasi pewarna

primer yang diserap mikroorganisme target atau mengintensifkan warna utama.

Penambahan lugol pada pengecatan Gram dimaksudkan untuk memperkuat

pengikatan warna oleh bakteri. Kompleks zat lugol akan terperangkap antara

dinding sel dan membran sitoplasma organisme gram positif. Setelah 2 menit,

lugol di bilas dengan aquades. Pembilasan dengan aquadest harus dilakukan

secara hati-hati jangan terlalu kencang saat menyemprotkan aquadest kedalam

kaca objek agar bakteri tidak ikut terbilas.

Setelah itu olesan pada kaca objek dicuci dengan alkohol 95% sampai zat

warna larut. Alkohol 95% merupakan solven organik yang berfungsi untuk

membilas (mencuci) atau melunturkan kelebihan zat warna pada sel bakteri

(mikroorganisme). Tercuci atau tidaknya warna dasar tergantung pada komposisi

dinding sel, bila komponen dinding sel kuat mengikat warna, maka warna tidak

akan tercuci sedangkan bila komponen dinding sel tidak kuat menelan warna

dasar, maka warna akan tercuci. Pemberian alkohol pada pengecatan ini

mengakibatkan terjadinya dua kemungkinan yaitu mikroorganisme (bakteri) akan

tetap berwarna ungu atau bakteri menjadi tidak berwarna.

Setelah itu olesan diberikan atau di teteskan pewarna tandingan berupa

fuksin selama 30 detik. Fuksin ini berfungsi untuk mewarnai kembali sel-sel yang

telah kehilangan pewarna utama setelah perlakuan dengan alkohol. Pada bakteri

gram negatif akan menghasilkan warna merah sedangkan pada bakteri gram

positif dinding selnya terdehidrasi dengan perlakuan alkohol, pori pori

mengkerut, daya rembes dinding sel dan membran menurun sehingga pewarna

fuksin tidak dapat masuk sehingga sel berwarna ungu.

Kemudian bilas kembali dengan aquades dan keringkan dengan kertas

saring dengan hati-hati.Pembilasan ini bertujuan untuk mengurangi kelebihan

setiap zat warna yang sedang diberikan. Selanjutnya kaca objek dolesan di tetesi

emersi oil sebanyak satu tetes. Minyak emersi adalah minyak yang di pakai untuk

olesan pada mikroskop, yang fungsinya untuk memperjelas objek, dan melindungi

mikroskop. Penambahan minyak emersi bertujuan untuk memperjelas objek saat

diamati di mikroskop karena minya emersi memiliki indeks refraksi yang tinggi

dibandingkan dengan air.

Dari hasil pengamatan sampel suspensi campuran bakteri dapat diketahui

bakteri yang terdapat di dalamnya yaitu E. coli dan S. Aureus dapat teramati

dengan ciri S. Aureus berbentuk coccus dengan warna violet yang menandakan

bakteri tersebut bakteri gram positif, sedangkan E. coli berbentuk basil dengan

warna merah yang menandakan bakteri tersebut bakteri gram negatif. Bakteri

ini akan berwarna biru atau violet di bawah mikroskop, sedangkan bakteri gram

negatif akan berwarna merah atau merah muda. Bakteri gram positif memiliki

dinding sel yang tebal di banding bakteri gram negatif sehingga bakteri gram

positif dapat mempertahan warna ungu.

VIII. Simpulan

1. Dua kelompok bakteri yaitu bakteri Gram positif dan Gram negatif dapat

diamati menggunakan prosedur pewarnaan Gram. Bakteri Gram positif S.

aureus berwarna biru saat dilihat di bawah mikroskop, sedangkan bakteri

Gram negatif E. Coli berwarna merah.

2. Dapat memahami setiap langkah dan reaksi reaksi kimia yang terjadi

dalam proses tersebut yang dapat di lihat dari pewarna yang bereaksi

dengan sel bakteri

Daftar Pustaka

AOAC (Association of Official Analytical Chemist). 1996. Official Methods of

Analysis, 16th Ed. Association of Official Analytical Chemist, Washington,

DC.

Assani S, 1994, Mikrobiologi Kedokteran, Edisi Revisi,. Fakultas. Kedokteran.

Universitas. Indonesia,. Binarupa Aksara, Jakarta.

Cowan, S.T. 1984. Manual for the Identification of Medical Bacteria. Second Ed.

Cambridge University Press, Cambridge. p. 238.

Donnelly, Gibson. 1996. Organisasi, Prilaku, Struktur, Proses. Jakarta: Erlangga.

Fardiaz, S. 1989. Mikrobiologi Pangan. Bogor: IPB.

Iud, W. 2008. Teknik dan Metode Dasar Dalam Mikrobiologi. Malang: UMM

Pres.

Lay, Bibiana.W.1994.Analisis Mikroba di Laboratorium.Jakarta : Rajawali

Schlegel, Hans. 1994. Mikrobiologi Umum Edisi Keenam. Yogyakarta: Gajah

Mada University Press.