Post on 28-Jan-2023
UNESP - Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”
Faculdade de Odontologia de Araraquara
LUANA CARLA PIRES
MATRIZES TRIDIMENSIONAIS A BASE DE POLI (3-
HIDROXIBUTIRATO) PRODUZIDAS POR SINTERIZAÇÃO
SELETIVA A LASER E FUNCIONALIZADAS COM FIBROÍNA DA
SEDA, HIDROXIAPATITA E PEPTÍDEO OSTEOGÊNICO.
AVALIAÇÕES FÍSICO-QUÍMICA E BIOLÓGICA
Araraquara
2015
UNESP - Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”
Faculdade de Odontologia de Araraquara
LUANA CARLA PIRES
MATRIZES TRIDIMENSIONAIS A BASE DE POLI (3-
HIDROXIBUTIRATO) PRODUZIDAS POR SINTERIZAÇÃO
SELETIVA A LASER E FUNCIONALIZADAS COM FIBROÍNA DA
SEDA, HIDROXIAPATITA E PEPTÍDEO OSTEOGÊNICO.
AVALIAÇÕES FÍSICO-QUÍMICA E BIOLÓGICA
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Odontologia, Área de Implantodontia, da Faculdade de Odontologia de Araraquara, Universidade Estadual Paulista, para título de Doutor em Odontologia.
Orientador: Prof. Dr. Joni Augusto Cirelli
Co-orientadora: Dra. Sybele Saska
Specian
Araraquara
2015
Pires, Luana Carla Matrizes tridimensionais a base de poli (3-hidroxibutirato)
produzidas por sinterização seletiva a laser e funcionalizadas com fibroína da seda, hidroxiapatita e peptídeo osteogênico. Avaliações físico-química e biológica / Luana Carla Pires .-- Araraquara: [s.n.], 2015.
167 f. ; 30 cm. Tese (Doutorado) – Universidade Estadual Paulista,
Faculdade de Odontologia Orientador: Prof. Dr. Joni Augusto Cirelli Co-orientadora: Dra. Sybele Saska Specian
1. Engenharia tecidual 2. Bioimpressão 3. Polímeros 4. Fibroína 5. Apatitas I. Título
Ficha catalográfica elaborada pela Bibliotecária Marley C. Chiusoli Montagnoli, CRB-8/5646
Serviço Técnico de Biblioteca e Documentação da Faculdade de Odontologia de Araraquara / UNESP
LUANA CARLA PIRES
MATRIZES TRIDIMENSIONAIS A BASE DE POLI (3-
HIDROXIBUTIRATO) PRODUZIDAS POR SINTERIZAÇÃO
SELETIVA A LASER E FUNCIONALIZADAS COM FIBROÍNA DA
SEDA, HIDROXIAPATITA E PEPTÍDEO OSTEOGÊNICO.
AVALIAÇÕES FÍSICO-QUÍMICA E BIOLÓGICA
COMISSÃO JULGADORA
TESE PARA OBTENÇÃO DO GRAU DE DOUTOR
Presidente e Orientador: Prof. Dr. Joni Augusto Cirelli
2º Examinador: Profa. Dra. Ana Paula Faloni de Souza
3º Examinador: Prof. Dr. Paulo Tambasco de Oliveira
4º Examinador; Prof. Dr. Roberto Henrique Barbeiro
5º Examinador: Prof. Dr. Elcio Marcantonio Junior
Araraquara, 06 de março de 2015.
DADOS CURRICULARES
LUANA CARLA PIRES
NASCIMENTO: 25/03/1985 - Ubiratã - Paraná
FILIAÇÃO: Maria Sueli do Nascimento Pires e José Vicente Pires
2003 / 2007: Graduação em Odontologia Universidade Estadual de Maringá - UEM
2009 / 2011: Especialização em Periodontia Faculdade de Odontologia de Araraquara – FOAr – UNESP
2011 / 2013: Especialização em Implantodontia Faculdade de Odontologia de Araraquara – FOAr – UNESP
2011 / 2015: Curso de pós-graduação em Odontologia, área de
concentração Implantodontia, nível Doutorado. Faculdade de Odontologia de Araraquara – FOAr – UNESP
AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente a Deus, por me proporcionar esse momento,
tendo me abençoado com uma família maravilhosa que sempre me apoiou e
incentivou profissionalmente.
Aos meus pais, os quais eu amo incondicionalmente, que sempre
estiveram ao meu lado nessa jornada, me apoiando nos bons e maus
momentos. Agradeço pelos pais maravilhosos que são. Tudo que sou e tudo
que conquistei com toda certeza devo a vocês. Muito obrigada!
A minha irmã Luara, minha companheira e melhor amiga, minha
confidente, obrigada por compartilhar e ter contribuído com esse momento.
Ao meu amor Mario, com certeza o que de melhor me aconteceu nesse
doutorado. Agradeço por toda cumplicidade, amizade e amor. Agradeço pela
força nos momentos difíceis, pela conversa, por abrir meus olhos quando
necessário, por ser meu porto seguro, minha calma... Hoje sou uma pessoa
melhor e devo isso a você.
Aos meus familiares, avós, tios e primos, pelo apoio, por terem me
ensinados tantos valores, por me ensinarem o amor à família e ao próximo, e
por entenderem a minha ausência em tantos momentos. É um prazer imenso
conviver com vocês.
Ao meu orientador, Prof. Joni Cirelli, por todo ensinamento e paciência.
Mas principalmente, por ser um exemplo de como ser um educador, um
pesquisador e um ser humano melhor. A minha co-orientadora Dra Sybele
Saska por todo trabalho e ensinamento.
A família do meu noivo, meus sogros, cunhados e sobrinhos, um
presente que ganhei ao longo dos últimos anos. Agradeço tê-los por perto,
sempre com muito carinho. Muito obrigada pela amizade e carinho.
A todos que colaboraram com esse trabalho, muito obrigada, sem vocês
esse trabalho não seria possível. Em especial ao meu grupo de convivência,
Mariana Cominotte, Fernanda Florian, Profa Ana Paula Faloni, Profa Silvana
Orrico, Leslie Fiori, Tamara Beraldo, Andressa Vilas Boas e Guilherme Oliveira,
obrigada pelo trabalho e companheirismo, foi maravilhoso trabalhar com vocês.
Aos colegas dos biotérios da FOAr e da Faculdade de Ciências
Farmacêuticas, muito obrigada por toda ajuda e colaboração. Em especial
Celso, responsável por cuidar dos nossos coelhos, muito obrigada por toda
dedicação e colaboração.
Aos amigos que conheci em Araraquara, muito obrigada pelo
companheirismo desses últimos anos. Espero poder conviver com vocês
durante muito tempo ainda. Em especial quero agradecer a Andressa, Giovana
Marcell, Fabiana e Suzane, vocês são pessoas mais que especiais e não tenho
palavras para agradecer tudo que fizeram por mim. Espero tê-los para sempre
em minha vida.
Aos meus amigos de sempre, agradeço a Deus todos os dias ter me
concedido a honra de conhecer pessoas tão maravilhosas e de ter tido a
possibilidade de criar laços tão fortes de amizade verdadeira. Em especial
minhas amadas Vanessa, Deisy, Simone, Alessandra e Fernanda obrigada por
tudo. São caminhos tão diferentes os percorridos por cada uma de nós,
entretanto uma coisa nunca mudou, nossa amizade.
Aos professores da FOAr-Unesp, por todo ensinamento e exemplo. Em
especial Prof. Elcio Marcantonio Jr, Profa Adriana Marcantonio, Prof. José
Eduardo Sampaio, Profa Silvana Orrico e Prof. Roberto Barbeiro, muito
obrigada por tudo, e principalmente por todo carinho que sempre tiveram
comigo.
Aos funcionários da FOAr-Unesp, sem vocês nada disso seria possível.
Obrigada por fazerem parte de nossas vidas. Em especial Isa, Leandro,
Claudinha, Zezé, D. Maria, Regina Lúcia, Mara, Neuza, Nilton e Luana,
pessoas maravilhosas que conheci nesse caminho e as quais sou grata por
toda ajuda.
Aos professores da minha graduação na Universidade Estadual de
Maringá, pessoas que me inspiraram muito a ser a profissional que sou hoje.
Em especial Prof. Roberto Hayacibara que me ensinou a amar a Periodontia e
em quem sempre me inspirarei como professor e profissional, Profa Evelyn
Gonçalves, com que eu dei meus primeiros passos em direção a área
acadêmica e Prof. Liogi Iwaki Filho, meu orientador de iniciação científica com
quem tive a honra de conviver.
Aos membros da banca examinadora Prof. Dr. Paulo Tambasco de
Oliveira, Profa. Dra. Roberta Okamoto, Prof. Dr. Elcio Marcantonio Jr, Prof. Dr.
Roberto Barbeiro, Profa. Dra. Daniela Zandim, Prof. Dr. Roberto Hayacibara e
Prof. Dr. Sérgio Scombatti Souza, agradeço a disponibilidade e contribuições
ao nosso trabalho.
Pires LC. Matrizes tridimensionais a base de poli (3-hidroxibutirato) produzidas
por sinterização seletiva a laser e funcionalizadas com fibroína da seda,
hidroxiapatita e peptídeo osteogênico. Avaliações físico-química e biológica
[Tese de Doutorado]. Araraquara: Faculdade de Odontologia da UNESP; 2015.
RESUMO Estruturas tridimensionais (scaffolds) construídas por técnicas de
impressão tridimensional vêm ganhando espaço em reconstrução e
regeneração de tecidos, pois permitem a fabricação de scaffolds com formas
complexas. O objetivo deste trabalho foi caracterizar físico-química e
biologicamente matrizes de poli (3-hidroxibutirato) (PHB), confeccionadas por
impressão tridimensional via sinterização seletiva a laser (selective laser sinterization - SLS), funcionalizadas com fibroína da seda (FB), apatitas (HA)
e/ou peptídeo de crescimento osteogênico (osteogenic growth peptide - OGP),
com finalidade de regeneração óssea. Os resultados de caracterização
demonstraram que a impressão via SLS produziu scaffolds de PHB com
percentual de porosidade de 55,8±0,7% e com poros regulares de 500-700 µm.
A adição de FB e HA mantiveram resultados de porosidade semelhantes e
aumentaram a taxa de absorção de água do PHB no período inicial de 2 h. A
incorporação de FB melhorou a resistência à compressão e o módulo de
elasticidade, sendo este também melhorado por FB-HA. Nos ensaios in vitro
observou-se uma boa adesão, espraiamento e proliferação celular em todos os
grupos. Na avaliação indireta da precipitação de cálcio sobre as amostras,
observou-se um melhor resultado no grupo FB-HA, principalmente em 3 dias.
In vivo, os grupos experimentais falharam em estimular a osteogênese de
contato, entretanto mantiveram a espessura da área de implantação, o que não
ocorreu no grupo controle coágulo. Conclui-se que os scaffolds avaliados
possuem algumas propriedades favoráveis a aplicação em regeneração óssea,
entretanto alguns mecanismos de funcionamento dos mesmos in vivo,
principalmente em longo prazo, ainda precisam ser entendidos e melhorados.
Palavras-chave: Engenharia tecidual, Bioimpressão, Polímeros, Fibroína,
Apatitas
Pires LC. Three-dimensinal poli (3-hydroxybutirate) scaffolds manufactured by
selective laser sintering and functionalized with silk fibroin, hydroxyapatite and
osteogenic peptide. Physicochemical and biological evaluation [Tese de
Doutorado]. Araraquara: Faculdade de Odontologia da UNESP; 2015.
ABSTRACT Three-dimensional structures (scaffolds) fabricated by three-dimensional
printing techniques (3DP), have been widely used in tissues reconstruction and
regeneration. The main advantage of that technique is the possibility of
manufacturing scaffolds with complex shapes. The aim of this study was to
perform physicochemical and biological characterization of three-dimensional
matrices of poly (3-hydroxybutyrate) (PHB), made by 3DP via selective laser
sintering (SLS), functionalized with silk fibroin (FB), apatites (HA) and / or
osteogenic growth peptide (OGP), to favor bone regeneration. The results
demonstrated that SLS 3DP produced PHB scaffolds with porosity percentage
of 55.8 ± 0.7% with regular pores of 500-700 µm. The addition of HA and FB
results in similar porosity and enhanced PHB water absorption rate, at the 2h
timepoint. The incorporation of FB improved compressive strength and elastic
modulus, which was also improved by FB-HA. In vitro tests showed good cell
adhesion, spreading and proliferation in all. In the indirect evaluation of calcium
precipitation a better result was observed in FB-HA group mainly in 3 days. In vivo experimental groups failed to stimulate contact osteogenesis. However, the
scaffolds preserved the thickness of implantation area, which did not occur in
the control clot group. It was concluded that the scaffolds evaluated in this study
have some favorable properties for bone regeneration. However some of their
action mechanisms in vivo, especially in long-term periods, still have to be
better understood.
Keywords: tissue engineering, bioprinting, polymers, fibroin, apatites
SUMÁRIO
INTRODUÇÃO...................................................................................................11
OBJETIVOS.......................................................................................................21
MATERIAL E MÉTODO.....................................................................................23
CAPÍTULO 1......................................................................................................44
CAPÍTULO 2......................................................................................................71
CAPÍTULO 3....................................................................................................114
RESULTADOS COMPLEMENTARES............................................................150
CONCLUSÃO..................................................................................................154
REFERÊNCIAS...............................................................................................156
ANEXO 1.........................................................................................................164
ANEXO 2.........................................................................................................166
12 INTRODUÇÃO O aumento de expectativa de vida tem estimulado o desenvolvimento de
novos biomateriais para diversas aplicações clínicas. Neste sentido, a
engenharia tecidual tem proporcionado grandes avanços no desenvolvimento
de biomateriais tridimensionais (3D) para reconstrução de tecidos, como o
tecido ósseo, com destaque para sua associação com células-tronco61.
Contudo, os autoenxertos ósseos ainda são considerados “padrão ouro” para
reconstrução de defeitos ósseos relacionados a enfermidades congênitas,
traumas ou lesões oncológicas. Isso se deve ao fato de possuírem
propriedades biológicas favoráveis como: osteocondução, osteogênese e
osteoindução12. Além disso, este tipo de enxerto não induz rejeição
imunológica. Entretanto a utilização de autoenxertos resulta em algumas
desvantagens como: 1) quantidade óssea e áreas doadoras limitadas; 2) o
potencial de morbidade da área doadora; 3) considerável reabsorção; 4)
viabilidade limitada por causa da escassez de vascularização em caso de
enxertos não vascularizados; 5) tempo cirúrgico adicional12.
Uma alternativa aos autoenxertos é a utilização dos homo e aloenxertos.
Porém, os mesmos necessitam de cuidados especiais para que haja a redução
dos riscos de transmissão de infecção e de ativação do sistema imunológico do
hospedeiro e, consequentemente, a rejeição do enxerto devido à
incompatibilidade biológica23.
Os materiais sintéticos podem interagir fracamente com o hospedeiro e
falhar ao longo do tempo devido a desgaste e fadiga, além de poderem
promover reação de corpo estranho31. Além disso, as desvantagens dos
autoenxertos, homoenxertos e aloenxertos tem levado a engenharia tecidual e
a biotecnologia a desenvolverem novos biomateriais e métodos promissores
para reparação dos tecidos. Tratando-se do tecido ósseo, para a obtenção de
um processo cirúrgico e regenerador com menor morbidade, os substitutos
ósseos sintéticos e/ou processados biotecnologicamente tornaram-se
biomateriais potenciais para aplicações clínicas em regeneração óssea.
13 Matrizes tridimensionais para Engenharia Tecidual
A engenharia tecidual combina princípios de engenharia e biologia, e se
baseia em três pilares: a terapia celular, materiais porosos bioativos e
sinalização molecular, física ou mecânica38.
As matrizes tridimensionais, também denominadas “scaffolds”, na engenharia tecidual podem ser classificadas como sintética ou natural em sua
origem. Independentemente da origem, tais scaffolds destinam-se a apoiar a
fixação, manutenção, proliferação, e, em algumas situações, a diferenciação de
populações celulares selecionadas. Além disso, o scaffold deve possuir forma
adequada e funcionar como um suporte estrutural para a região anatômica a
ser reconstruída. Quando reabsorvível, o mesmo deve ser substituído pela
neoformação tecidual38.
Os scaffolds utilizados para a formação óssea servem como um
arcabouço para a interação celular e formação da matriz extracelular, provendo
suporte estrutural para o novo tecido formado, ou seja, agindo como um
osteocondutor40. Além disso, essas matrizes devem atender a alguns critérios
para desempenhar esta função, incluindo propriedades mecânicas
semelhantes às do tecido a ser reparado, biocompatibilidade e reabsorção em
um ritmo compatível com a remodelação28.
Além da osteocondutividade, os scaffolds podem servir como veículos
para a administração de moléculas bioativas, tais como as proteínas
morfogenéticas ósseas (BMPs), fatores de crescimento semelhantes à insulina
(IGFs) e fatores de crescimento transformantes (TGFs) que estimulam células
precursoras do hospedeiro a se diferenciarem em células produtoras de matriz
óssea28, proporcionando assim, osteoindução. Finalmente, a osteogênese pode
ser obtida semeando nos scaffolds células que irão estabelecer novos centros
de formação óssea, como osteoblastos e células mesenquimais com o
potencial de se diferenciar em uma linhagem osteoblástica33.
Alguns fatores inerentes às características dos scaffolds também são
determinantes na regeneração óssea. Segundo Karageorgiou, Kaplan34, a
formação óssea no interior dos scaffolds tanto in vitro quanto in vivo é
influenciada por duas características: porosidade e tamanho dos poros. Nas
análises in vitro se consegue simular a osteogênese com uma superfície
14 menos porosa. Em contraste, para análises in vivo existe a necessidade de se
ter uma superfície com grande quantidade de poros, implicando numa
porosidade uniforme, e com tamanho de poros maiores interconectados para
ocorrer o crescimento ósseo. Portanto, o conhecimento da porosidade e
tamanho dos poros do scaffold utilizado é de suma importância para que haja
uma boa vascularização e neoformação óssea, evitando-se condições de
hipóxia e indução de formação osteocondral antes da osteogênese.
Especificamente para formação óssea, a literatura relata um tamanho mínimo
de cerca de 100 μm dos poros, recomendando-se também poros maiores que
300 μm para aumento da formação de novo osso e formação de capilares34.
Muitos métodos têm sido desenvolvidos para a fabricação de matrizes
porosas tridimensionais a partir de polímeros bioabsorvíveis. Em geral, espera-
se desenvolver um método de fabricação prático e capaz de formar,
simultaneamente, uma estrutura interna de poros interligados e uma externa,
que dê forma anatômica às matrizes61. Suprindo essas expectativas, a
impressão tridimensional (3D), encontra-se como uma opção promissora na
produção de scaffolds31.
Impressão tridimensional (3D)
A tecnologia de impressão 3D é baseada na construção de um modelo
virtual por um sistema de desenho auxiliado por computador (computer-aided
design - CAD), fatiado em seções transversais digitais que são transformadas
em arquivos STL (Stereolithography). Estas fatias são reproduzidas fisicamente
por um processo físico-químico, controlado por um computador e um material,
que pode estar na forma de pó, folha, líquido ou fio, conforme a tecnologia de
impressão 3D empregada9.
A impressão 3D é um processo de produção que utiliza um grande
número de processos aditivos como sinterização seletiva a laser (SLS),
estereolitografia (SLA) e modelagem por deposição de material fundido (FDM)
para transformar um modelo virtual em uma forma física. Essas técnicas se
diferenciam entre si no tipo de material que pode ser utilizado e em como as
camadas são depositadas para reproduzirem o modelo39.
15 A tecnologia SLS é umas das principais utilizadas na impressão 3D. Ela
utiliza um laser de CO2 associado à matéria prima em pó para impressão das
camadas. A interação do laser com o pó aumenta sua temperatura, levando o
pó ao ponto de fusão, permitindo a sinterização de um agregado de partículas
para formar uma forma sólida39. As técnicas que utilizam pó como matéria
prima possuem a vantagem de poderem produzir scaffolds com alto grau de
porosidade45.
Uma característica distintiva do processo de construção camada por
camada é que podem ser construídas peças de alta complexidade, não
possíveis de serem construídas por qualquer outro método convencional de
fabricação. Outra característica importante é que essas peças complexas
podem ser construídas de forma relativamente rápida44. Os scaffolds podem
então, ter a forma anatômica do órgão/estrutura a ser reconstruída/substituída,
o que faz com que a impressão 3D contribua com o diferencial tecnológico na
engenharia tecidual. Além disso, na regeneração do tecido ósseo
especificamente, a técnica permite a produção de scaffolds com alto controle
na geometria dos poros e permite que os mesmos sejam interconectados, fator
importante para a utilização em tecido ósseo34, 47.
Os scaffolds basicamente são fabricados a partir de duas classes de
materiais, os polímeros e as cerâmicas. Dentre os materiais poliméricos
estudados e utilizados pela engenharia tecidual estão: colágeno, poli (ácido
láctico-co-ácido glicólico) (PLGA), poli (ε-caprolactona) (PCL), poli (3-
hidroxibutirato) (PHB) e a fibroína da seda, bem como a associação desses
materiais18.
Poli (3-hidroxibutirato) - PHB
O PHB é um biopolímero termoplástico da família dos poli
(hidroxialcanoatos) (PHA), poliésteres naturais e biodegradáveis, os quais
podem sofrer degradação hidrolítica ou enzimática1. O PHB é produzido por
meio de fermentação bacteriana, com predominância de utilização da bactéria
Ralstonia eutropha. É um polímero biocompatível e reabsorvível com inúmeras
aplicações médicas30.
16 A biossíntese deste polímero permite um processo cíclico sustentável
por meio de fontes renováveis, substituindo tecnologias de ponta ligadas à
produção e ao uso de materiais poliméricos sintéticos de fonte petroquímica.
Além disso, vem para substituir materiais como o polipropileno, poliestireno,
polietileno e poli (cloreto de vinila) geradores de problemas ambientais devido
ao tempo necessário para que ocorra degradação e a utilização de recursos
não renováveis derivados do petróleo11.
Contudo, o PHB apresenta algumas desvantagens que limitam sua
aplicação como, alto grau de cristalinidade, baixa resistência mecânica e
propriedade hidrofóbica4, 8.
Muitos métodos têm sido desenvolvidos para modificar a superfície e as
propriedades físico-químicas dos scaffolds a base de PHB para melhorar suas
propriedades tanto mecânica quanto de biocompatibilidade, além do tempo de
reabsorção. Dentre estes métodos se destaca a adição de fases inorgânicas a
este polímero, a base de fosfatos de cálcio, como a hidroxiapatita13, 14, 20, 21, 62,
bem como também a incorporação de colágeno, celulose bacteriana e a
fibroína da seda (FB)2, 8, 14.
Fibroína da seda (FB)
A fibroína da seda é proveniente do casulo fabricado pelo bicho-da-seda,
principalmente pelo gênero Bombyx mori. As fibras de fibroína possuem
aproximadamente 10-25 μm e consiste em duas cadeias proteicas: uma cadeia
leve (26KDa) e a pesada (390 kDa) ligadas por uma simples ligação de
dissulfeto. Essas cadeias são revestidas por uma proteína hidrofílica chamada
sericina. A fibroína da seda pode ser purificada pelo aquecimento dos casulos
em uma solução alcalina. A cadeia primária da fibroína consiste praticamente
em glicina (43%), alanina (30%) e serina (12%)59.
A proteína da seda possui uma estabilidade conformacional maior em
condições fisiológicas em comparação com proteínas globulares, esta
característica é atribuída devido a um maior número de interações fracas como
as ligações de hidrogênio, a natureza hidrofóbica na maior parte da proteína, e
da significativa cristalinidade da estrutura proteica. A seda é insolúvel a maioria
17 dos solventes, incluindo água, ácido diluído e agentes alcalinos. Entretanto,
existe uma clara evidência na literatura de que a seda, como uma proteína, é
susceptível a degradação proteolítica in vivo e, durante períodos mais longos, é
lentamente absorvida2.
A fibroína extraída da seda possui propriedades desejáveis, como alta
resistência mecânica, biocompatibilidade com baixa resposta inflamatória e
imunogênica35, 36, 42. Sua estrutura única de conformação em folhas-β
(cristalina) confere elevada rigidez e resistência aos biomateriais, tornando-a
um biopolímero útil para aplicações em engenharia tecidual óssea3. A fibroína
tem obtido nos EUA a aprovação da agência Food and Drug Administration
(FDA) para alguns dispositivos médicos. Além disso, devido às características
anfifílicas pós-processamento da seda, é possível sintetizá-la com
propriedades absorvíveis para aplicações em engenharia tecidual obtendo
diversos formatos para materiais, incluindo filmes, scaffolds, fibras, hidrogéis e
esponjas46, 60.
Desta forma, a fibroína tem grande potencial para ser empregada no
revestimento das superfícies de estruturas 3D, dando-lhes funcionalidade
biológica inerente a esta proteína, bem como, podendo agregar um aumento na
resistência mecânica.
Apatitas
Durante a produção dos scaffolds para regeneração tecidual óssea, um
fator que pode auxiliar na melhora das respostas do tecido hospedeiro é a
incorporação de apatitas aos mesmos. A incorporação de íons Ca2+ e P 3- na
superfície dos scaffolds torna essa superfície bioativa, o que pode promover
um contato direto osso-material, com ausência de tecido conjuntivo nesta
interface, levando a uma adequada fixação biomecânica55.
As apatitas são compostos minerais a base de cálcio e fosfato,
presentes nos tecidos minerais do corpo. A hidroxiapatita, Ca10(PO4)6(OH)2, é
um dos materiais capazes de formar uma ligação direta e forte entre o material
e o tecido ósseo55. A forma sintética da hidroxiapatita tem sido amplamente
18 investigada, devido à composição química semelhante à da matriz mineral do
osso. Os recobrimentos com hidroxiapatita, ou fases de hidroxiapatitas não
estequiométricas, são considerados bioativos55.
As apatitas têm sido amplamente utilizadas em aplicações médicas,
ortopédicas e odontológicas, como recobrimentos ou materiais de
preenchimento e/ou reconstrução para a reparação do tecido ósseo. Uma
diversidade de métodos é utilizada na produção de revestimentos bioativos
sobre materiais como scaffolds e implantes, incluindo pulverização de íons,
ablação por laser, plasma spray, sol-gel, a deposição eletroforética, métodos
hidrotérmicos e métodos biomiméticos17.
Os recentes esforços das pesquisas concentram-se em combinar as
melhores características da hidroxiapatita e dos polímeros para criar um
material a ser utilizado para substituição de tecido ósseo18. Usando o método
biomimético, a hidroxiapatita pode ser adicionada aos polímeros sintéticos para
desenvolver compósitos biomiméticos para regeneração óssea.
Consequentemente, esses compósitos, híbridos ou não, podem atuar como um
osso artificial exibindo bioatividade e desempenho mecânico semelhante aos
dos ossos naturais17.
Peptídeo de crescimento osteogênico (Osteogenic growth peptide – OGP)
Outro atributo estudado para os scaffolds produzidos por impressão 3D
é a capacidade destes em liberar controladamente drogas e fatores de
crescimento. Dentre as vantagens da liberação local, destacam-se o uso de
doses reduzidas, o controle do padrão de liberação e significativa redução nos
efeitos colaterais quando comparado a vias sistêmicas de administração9, 61.
Dentre os fatores de crescimento importantes na engenharia de tecidos ósseos
que tem sido investigado para este propósito, destacam-se o fator de
crescimento do endotélio vascular (VEGF), fator de crescimento de fibroblastos
(FGF) e proteínas morfogenéticas ósseas (BMP) são importantes na
engenharia de tecidos ósseos9. Mais recentemente, o peptídeo de crescimento
osteogênico (OGP) tem atraído considerável interesse clínico por possuir
propriedades anabólicas para o tecido ósseo e estimuladora da hematopoiese5.
19 O peptídeo de crescimento osteogênico (OGP), NH2-
HALKRQGRTLYGFGG-OH, foi descoberto no início dos anos 90, e trata-se de
um peptídeo de ocorrência natural cuja estrutura primária é idêntica à
sequência C-terminal da histona H4. Está presente fisiologicamente no soro
humano, de ratos, e aparentemente de outras espécies de mamíferos em
concentração micromolar6. A maioria (cerca de 90%) do OGP sérico encontra-
se especialmente na forma de um complexo de proteínas OGPBP-OGP
(OGPBP=OGP binding protein)6. O OGP pode se ligar não covalentemente à
α2-macroglobulina (α2-M) do soro, na forma nativa da proteína ou quando se
encontra no estado instável.
A concentração do OGP sérico é aumentada transitoriamente durante
uma injúria local ao tecido ósseo, medula óssea ou em reações osteogênicas
sistêmicas, e também quando baixas doses de OGP exógeno são requeridas
para a estimulação da formação óssea, o que sugere uma função auto-
regulativa para os complexos OGPBPs6, 27, 29. Este mecanismo, aparentemente
está presente em muitas, se não em todas, as células, podendo desempenhar
uma função crucial no circuito de feedback positivo do OGP, controlando a
proliferação e diferenciação celular.
A clivagem proteolítica do OGP gera o pentapeptídeo OGP (10-14). As
principais funções tanto do OGP quanto deste seu derivado, são atuar na
proliferação e diferenciação de células progenitoras ósseas e hematopoiéticas,
favorecendo a regeneração de ambos os tecidos5, 15, 32.
In vitro os peptídeos, OGP e OGP(10-14), possuem excelente potencial
mitogênico para células de linhagem osteoblástica e fibroblásticas6, 7, 25,
favorecem o aumento da atividade da fosfatase alcalina (ALP) e da
mineralização da matriz óssea5, 50. Além disso, o OGP demonstrou ter uma
maior atividade da ALP quando comparado ao hormônio de crescimento (GH) e
ao FGF50. Tanto o OGP quanto o OGP(10-14) regulam diretamente a
diferenciação de células mesenquimais em osteoblastos favorecendo assim a
neoformação óssea16, 58.
In vivo, o OGP regula a expressão dos fatores de crescimento de
transformação TGF-β1, TGF-β2 e TGF-β3, fator de crescimento fibroblástico
FGF-2, fator de crescimento insulínico IGF-1 e do colágeno tipo I10. Outros
estudos in vivo demonstraram que a administração diária via sistêmica do OGP
20 estimulou a ossificação endocondral em locais de fratura tanto em ratos quanto
em coelhos, reduzindo o tempo de reparação óssea10, 24, 57. Além disso,
aumentou a densidade trabecular óssea e estimulou a remodelação óssea de
osso imaturo para osso lamelar6, 26.
Defeitos ósseos tratados com scaffolds de PLGA com OGP sintético
adsorvido foram reparados em um menor tempo em relação aos animais que
receberam o OGP por via sistêmica. Este estudo apontou um importante
resultado na via de administração deste peptídeo, revelando um efeito
terapêutico mais eficaz quando aplicado localmente54.
Desta forma, este peptídeo apresenta um grande potencial para ser
utilizado na medicina regenerativa, e por isso, foi escolhido para ser
empregado na funcionalização dos biomateriais a serem desenvolvidos neste
estudo.
Apesar dos avanços conquistados no desenvolvimento de novos
biomateriais para engenharia tecidual, ainda busca-se um biomaterial com
propriedades físico-químicas e mecânicas capazes de mimetizar estruturas
similares ao autoenxerto na engenharia tecidual óssea. É com base nesta
necessidade, que os materiais utilizados nesse trabalho foram desenvolvidos
no Centro de Tecnologia da Informação Renato Archer (Campinas, Brasil) 44, 45,
47 e funcionalizados no Instituto de Química de Araraquara (UNESP) sob a
orientação da pesquisadora Dra. Sybele Saska Specian. O desenvolvimento
dos scaffolds consiste na confecção de estruturas 3D a partir da impressão por
SLS, utilizando PHB, funcionalização das mesmas com fibroína e apatitas e
avaliação de seu potencial de liberação controlada de OGP, visando conferir
melhores propriedades mecânicas e biológicas ao polímero PHB.
22
OBJETIVOS OBJETIVO GERAL
x Avaliar físico-química e biologicamente matrizes tridimensionais de poli
(3-hidroxibutirato) produzidas com a tecnologia de impressão 3D por
SLS, funcionalizadas com fibroína da seda, apatitas e/ou peptídeo
osteogênico OGP.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS x Realizar caracterizações físico-químicas para melhor compreensão da
estrutura 3D à base de PHB confeccionada por impressão 3D via SLS,
bem como sua interação com a fibroína, apatitas e/ou OGP;
x Analisar in vitro os materiais PHB, PHB-OGP, PHB-OGP(10-14),
PHB/FB, PHB/(FB-HA)-OGP, e seus efeitos na morfologia, viabilidade e
proliferação de células mesenquimais de ossos longos, bem como
avaliar seu potencial para formação óssea;
x Analisar in vivo a biocompatibilidade e a eficiência das modificações com
FB, HA e OGP no processo de regeneração óssea.
24 MATERIAL E MÉTODO
Para realização desse estudo optou-se pela utilização de scaffolds a
base de PHB, modificados por FB, HA, e/ou OGP e OGP(10-14) pós-
processamento das peças 3D, divididos nos seguintes grupos: PHB (sem
modificações); PHB-OGP (PHB com incorporação de OGP); PHB-OGP(10-14)
(PHB com incorporação de OGP(10-14)); PHB/FB (PHB revestido com FB);
PHB/FB-OGP (PHB revestido com FB e incorporação de OGP); e PHB/(FB-
HA)-OGP (PHB revestido com FB e HA e incorporação de OGP). No ensaio de
resistência mecânica foram utilizadas amostras de PHB somente e associadas
à FB e HA.
1 OBTENÇÃO DAS AMOSTRAS
1.1 Confecção dos scaffolds de PHB
As amostras 3D foram confeccionadas pela tecnologia de impressão 3D
Selective Laser Sintering (SLS) empregando a máquina SinterStation 2000
(DTM Corporation) no Centro de Tecnologia da Informação – Renato Archer
(CTI, Campinas, SP). Primeiramente foram gerados modelos geométricos
virtuais com poros regulares e interconectados estabelecendo a melhor forma,
tamanho, espessura tanto para os estudos in vitro e in vivo. Para desenvolver
estes modelos geométricos virtuais foi empregado o programa SolidWorks CAD
3D (Dassault Systèmes SolidWorks Corp., França). A partir destes modelos
virtuais foram gerados os modelos físicos.
Para confecção das peças foi utilizado PHB com tamanho de partículas
entre 10-100 µm (Biocycle®, PHB Industrial S/A, Brasil). No processo de
fabricação dos scaffolds foi utilizado o equipamento de SLS com laser de CO2
nos seguintes parâmetros: potência = 8 W; velocidade de varredura = 2000
mm/s; ponto do feixe = 450 μm; espessura da camada = 0,18 mm e
espaçamento de varredura = 0,15 mm. A temperatura do alimentador de
matéria-prima foi utilizada a 50 °C e do leito de construção a 100 °C. Os
scaffolds foram produzidos nas dimensões de 10 mm de diâmetro, 2 mm de
25 espessura e poros de 700 µm (Figura 1A). Para os corpos de provas dos
ensaios de resistência mecânica, os scaffolds foram confeccionados nas
dimensões de 35 × 20 mm, com poros de 700 µm (Figura 1B).
Figura 1 - Modelos virtuais 3D dos scaffolds de PHB. A= Modelo de 10mm x
2mm; B= Modelo de 20mm x 35mm.
Após a confecção das amostras por manufatura aditiva as mesmas
foram limpas com ar de nitrogênio para remoção dos grânulos de PHB não
sinterizados no interior dos poros.
1.2 Confecção das amostras PHB/FB
Preparação da solução de fibroína da seda
A preparação da solução de fibroína foi baseada em metodologias
previamente descritas por Rockwood et al.51 e Nogueira et al.43. A fibroína foi
extraída a partir de casulos de bicho-da-seda fornecidos pela Fiação Bratac
(Bastos, São Paulo). Para a sua extração, os casulos foram cortados em
pedaços menores em formato de filetes. Esses pedaços foram então colocados
em uma solução de Na2CO3 a 0,02 mol.L-1 (5 g de casulos: 2 L de solução de
Na2CO3) a 100 °C por exatos 30 min para remoção da sericina das fibras de
fibroína. Após esse tempo, a fibroína foi retirada com auxílio de uma espátula,
e lavada em 1 L de água ultrapura por três vezes por 20 min cada lavagem. A
700 µm
2 mm700 µm
10 mm
700 µmhaste
haste
poro
20 m
m
Tamnho do poro: 700µmTamanho da haste: 700µm
A B
26 proteína foi colocada em uma folha de alumínio limpa e mantida por algumas
horas em estufa a 37 °C para secagem51.
Para a solubilização das fibras de fibroína da seda, a cada 10 g de
fibroína seca foram adicionados 100 mL de solução ternária de
CaCl2:CH3CH2OH:H2O em proporção molar de 1:2:8. A suspensão obtida foi
mantida aquecida em banho termostatizado, a aproximadamente 80 °C, até a
completa solubilização43.
A fibroína solubilizada foi dialisada contra água ultrapura a temperatura
ambiente (25 ± 2 °C), para remoção do CaCl2. Alíquotas de 15 mL da solução
de FB foram colocadas em membranas de diálise (Membrana de celulose 3000 Adrich – 25 mm) e deixadas em 1 L de água ultrapura sob agitação constante,
com trocas de água após 1 e 4 h, depois a cada 12 h, totalizando 48 h.
A solução resultante foi centrifugada duas vezes a 20.000 r.p.m., a 4 °C,
por 30 min, para remoção de impurezas51. Estes processos permitem a
produção de soluções de fibroína de seda em água a 4% (m/v). As soluções de
FB são armazenadas a 4 °C por pelo menos uma semana. Esta solução final
foi então utilizada para a funcionalização dos scaffolds de PHB.
O revestimento das estruturas 3D com FB foi realizado por meio de
imersão destas peças 3D em solução de fibroína a 4%, a 10 °C, por 72 h. Após
a incorporação de FB aos scaffolds, as amostras foram secas a 37 °C por 24 h.
1.3 Confecção das amostras PHB/(FB-HA)
A hidroxiapatita (HA) foi incorporada às peças 3D já revestidas com FB
segundo a metodologia de Saska et al.52. As peças foram imersas
primeiramente em solução de CaCl2 0,05 mol.L-1 por 24 h, e depois em solução
de Na2HPO4 0,1 mol.L-1 a temperatura ambiente (TA) por mais 24 h. Após o fim
da incorporação, as amostras foram retiradas da solução e secas a 37 °C
durante 24 h.
27 1.4 Incorporação dos peptídeos OGP e OGP(10-14) às amostras
Os peptídeos OGP e OGP(10-14) utilizados neste estudo foram
peptídeos sintetizados pela metodologia de síntese em fase sólida adquirido
pela Empresa AminoTech (São Paulo, Brasil). A incorporação dos peptídeos
OGP e OGP(10-14) aos scaffolds foi realizada por adsorção.
A partir do perfil de liberação obtido em um teste de liberação
controlada, realizado com base em artigos prévios52, 53, foi determinado para
ambos os peptídeos, OGP e OGP(10-14), a concentração ideal de 10-5 mol L-1
a ser incorporada aos scaffolds. Estudos prévios na literatura demonstraram
que concentrações maiores que 10-14 mol.L-1 acentuaram a proliferação celular,
e que a concentração de 10-9 mol.L-1 promoveu uma melhor atividade da
fosfatase alcalina e maior formação e mineralização de nódulos de osso
neoformado 6, 56.
As soluções peptídicas foram preparadas em solução aquosa contendo
10 % (v/v) de etanol absoluto (Synthes, Brasil), na respectiva concentração de
10-5 mol.L-1 para os peptídeos OGP e OGP(10-14). A incorporação do peptídeo
OGP por adsorção, foi realizada imergindo cada amostra, PHB, PHB/FB e
PHB/(FB-HA), em 2 mL da solução peptídica por 72 h, a 10 °C. Após a
incorporação, as amostras foram secas a 37 °C por 24 h. A incorporação do
OGP(10-14) foi somente nos scaffolds de PHB, realizada da mesma maneira
que o descrito acima.
1.5 Esterilização
Após a secagem, as peças para os ensaios in vitro e in vivo foram
acondicionadas em envelopes apropriados, e foram encaminhadas para serem
esterilizadas com radiação gama a 20 kGy pela Embrarad (Cotia, Brasil).
28 2 CARACTERIZAÇÃO FÍSICO-QUÍMICA 2.1 Caracterização das estruturas 3D
As caracterizações foram realizadas para os materiais
tridimensionalmente estruturados por impressão 3D e funcionalizados por
fibroína e pelo compósito FB-HA. A morfologia dos scaffolds foi analisada por
microscopia óptica e microscopia eletrônica de varredura (MEV).
Adicionalmente, foram avaliadas a resistência mecânica à compressão, a taxa
de intumescimento e a porosidade desses respectivos scaffolds.
2.1.1 Microscopia óptica (MO) As imagens de MO foram obtidas em um microscópio (Leica) acoplado a
uma câmera digital (Leica DFC425). A captura das imagens foi realizada
usando o programa Leica Application Suite. O programa ImageJ 1.48v foi
usado para mensurar o tamanho dos poros dos scaffolds sinterizados
2.1.2 Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) As micrografias das amostras foram realizadas para a análise
morfológica de superfície e verificação da estrutura fina dos scaffolds. As
amostras foram recobertas por uma camada de ouro de espessura de 6 nm
(20 s, tensão de 3 Kv e corrente de 15 mA). As micrografias foram obtidas em
um microscópio eletrônico da marca FEI, modelo Magellan 400L (Laboratório de Caracterização Estrutural da Universidade Federal de São Carlos, SP). O
tamanho das partículas de apatita precipitada na amostra PHB/(FB-HA) foi
mensurado pelo programa ImageJ 1.48v.
2.1.3 Ensaio mecânico de resistência à compressão
As propriedades mecânicas de limite de resistência à compressão e
módulo de elasticidade foram realizadas em uma máquina universal de ensaios
mecânicos modelo Instron 5569 (Laboratório de Ensaios Mecânicos do CCDM – DEMa/UFSCar) utilizando uma célula de carga de 500 N e uma velocidade
constante de 0,5 mm.min-1. Os testes foram realizados com os scaffolds de
29 PHB, PHB/FB e PHB/(FB-HA). Os corpos de prova foram confeccionados
segundo as normas da ASTM D1621:10 e F2150:07. Três amostras de cada
tipo de scaffold (n = 03) foram utilizadas para os ensaios mecânicos.
A resistência à compressão ou tensão à compressão (σc) foi calculada
de acordo com a Equação (1). Em que: F = força máxima de carregamento
aplicada (Newton); e A= área da secção transversal do corpo de prova antes
do ensaio (mm2).
A resistência mecânica também foi mensurada antes e após a imersão
das amostras em solução SBF37, por 30 min, a temperatura ambiente, para
simular a resistência à compressão das mesmas nas condições após
implantação cirúrgica. Decorrido os 30 min, o excesso de SBF foi rapidamente
removido com papel de filtro, e em seguida as amostras foram colocadas nos
dispositivos acoplados à máquina de ensaios.
2.1.4 Taxa de intumescimento
As amostras PHB, PHB/FB e PHB/(FB-HA) foram imersas
separadamente em água deionizada por 24 h à temperatura ambiente. Os
scaffolds foram removidos em tempos determinados, inicialmente 30 e 60 min,
seguida de medidas a cada 60 min até totalizarem 8 h, e depois medidas foram
realizadas após 24 h da medida inicial. O excesso de água superficial foi
rapidamente removido com papel de filtro levemente umedecido e em seguida
os scaffolds foram pesados. A taxa de intumescimento das amostras foi
realizada em triplicata.
O conteúdo de água nos scaffolds intumescidos foi calculado pela
Equação 2, onde Ms é o peso da amostra seca e Mi é o peso da amostra
intumescida:
(2)
(1)
30 2.1.5 Determinação da porcentagem de porosidade
A porosidade dos scaffolds foi determinada usando um aparato de
mensurar densidade e uma balança eletrônica baseado no Princípio de Arquimedes34. Nesta análise foi usados scaffolds com as dimensões de 11 mm
de diâmetro e 2 mm de espessura. Inicialmente foi aferido o valor da massa do
scaffold seco (m) e calculado seu volume. Posteriormente, o scaffold foi imerso
em 5 mL de água por 30 min a temperatura ambiente para que todos os poros
fossem preenchidos com água (conforme dados obtidos no teste de
intumescimento). A Equação (3) usada para calcular a porosidade (Φ) está
mostrada abaixo:
Φ
(3)
onde ρap e ρr são referentes a densidade aparente e a densidade real
do scaffold, respectivamente. Os valores de ρap e ρr foram calculados usando
as equações (4 e 5) após pesar os scaffolds em ar, imersos em água e
intumescidos, respectivamente.
(4)
(5)
onde ms , mim e mi são referentes ao peso dos scaffolds mensurados
secos, imersos em água e intumescidos, respectivamente. ρH2O é a densidade
da água na temperatura da hora do teste. Três amostras de cada scaffold
foram mensuradas para obtenção das médias e desvio padrão da porosidade.
A porosidade do modelo virtual foi calculado obtendo o valor do volume
total (Vtot) e do volume real (Vr) pelo programa Magics®18.2, Equação 6.
Φ (6)
31 3 ÁNALISES IN VITRO
Para a análise in vitro foram utilizadas células primárias mesenquimais
de ossos longos de ratos (Rat bone marrow stem cell - RBMSC), obtidas
através da técnica de extração do conteúdo interno da medula óssea de ossos
longos, tíbia e fêmur bilateral, seguindo uma adaptação da técnica descrita em
Maniatopoulos41 1988 (Processo CEUA - FOAr - UNESP nº 32/2014 - Anexo
1).
Foram utilizados ratos Rattus Norvegicus Holtzman, de 15 a 21 dias,
com peso inicial de aproximadamente 50 gramas. Após anestesia com
Ketamina (0,08 mL. 100 g-1) e Xilazina (0,04 mL. 100 g-1), os animais foram
eutanasiados por aprofundamento anestésico. Para extração das células,
inicialmente é feita a dissecção de fêmur e tíbia bilateral, seguido de um corte
das epífises e lavagem da parte medular dos ossos com meio de cultura celular
alfa-MEM (αMEM) com 10% de soro fetal bovino (FBS) e 100 U.mL-1 de
penicilina e 100 µg.mL-1 de estreptomicina (P/S). O conteúdo da medula óssea
é então centrifugado a 200 g por 5 min em temperatura ambiente. As células
são ressuspendidas em 10 ml do mesmo meio de cultura para cada osso
longo, semeadas em placas de cultura de 100 mm e cultivadas a 37°C, em
atmosfera umidificada contendo 5% de CO2 e 95% de ar atmosférico. Após 24
h é feita a troca do meio de cultura para remoção das células não aderidas
intercalando-se, após isso, a troca do meio de 3 em 3 dias, até que as células
cheguem a uma confluência em torno de 80%, onde são congeladas em FBS
com 10% de dimetilsulfóxido (DMSO).
Para as análises in vitro, as células foram utilizadas até a terceira
passagem e foram plaqueadas em uma concentração de 2×105 sobre os
scaffolds. cultivo foi feito em αMEM com 10% de FBS, 100 U.mL-1 de
penicilina e 100 µg.mL-1 de estreptomicina, suplementado com 50 µg.mL-1 de
ácido ascórbico e 10 mmol.L-1 de β-glicerofosfato, para estímulo da
diferenciação osteoblástica, em placas para cultura de células de 24 poços, a
37°C, em atmosfera umidificada contendo 5% de CO2 e 95% de ar atmosférico.
Antes de iniciar os experimentos com os materiais, com o intuito de
avaliar a eficácia da técnica utilizada em extrair células capazes de se
32 diferenciarem em osteoblastos após estímulo, uma avaliação de produção de
fosfatase alcalina, quantificação de cálcio e formação de nódulos minerais foi
realizada. 2×104 e 5×104 células foram plaqueadas para a avaliação de
produção de fosfatase alcalina e quantificação de cálcio no sobrenadante da
cultura em placas de 6 poços com um n=3. Para avaliação de produção de
nódulos minerais, foram utilizadas 5×104 células em placas de 35 mm com um
n=3.
A produção de fosfatase alcalina foi avaliada após 3, 7, 10 e 14 dias de
cultura. As proteínas foram extraídas inicialmente de cada poço adicionando-se
1 mL/poço de Triton-X 100 a 0,1% (Sigma®) e ciclos de congelamento e
aquecimento. Para mensuração da fosfatase alcalina foi utilizado o kit
Fosfatase Alcalina seguindo as orientações do fabricante (Labtest Diagnostica, Brasil). Para mensuração da quantidade de cálcio no sobrenadante da cultura
foi utilizado a metodologia descrita abaixo (ver em tópico 3.3 Quantificação de
cálcio, página 33) nos períodos de 3, 7, 11, 14 e 21 dias de cultura, utilizando o
meio sem células como controle negativo (C-).
A formação de nódulos minerais foi avaliada pela coloração vermelho de
Alizarina nos períodos de 7, 11, 14 e 21 dias. Primeiramente as células foram
fixadas com álcool a 70% e depois coradas com uma solução de vermelho de
Alizarina, ph 4,2 por 15 min. O excesso de corante foi então retirado e as
placas fotografadas para avaliação.
Os resultados obtidos são observados na Figura 2. Tendo em vista a
eficiência da técnica em isolar células capazes de se diferenciarem em
osteoblastos, como observado nos resultados deu-se segmento aos
experimentos com os scaffolds.
33 Figura 2 - Resultados da avaliação de diferenciação osteoblástica das células
RBMSC. A= Produção de fosfatase alcalina; B= Quantificação de cálcio; e C=
Formação de nódulos minerais por Vermelho de Alizarina. C-: controle
negativo.
Plaqueamento das células mesenquimais sobre os scaffolds Para todas as análises in vitro, foram utilizadas amostras dos grupos
PHB, PHB-OGP, PHB-OGP(10-14), PHB/FB, PHB/FB-OGP e PHB/(FB-HA)-
OGP. As amostras foram colocadas em placas para cultura de células de 24
poços, presas ao fundo da placa por vaselina estéril. As células foram então
semeadas sobre as estruturas 3D em 50 µL de meio de cultura e após 2 h esse
volume foi completado para 1 mL/poço. Os experimentos foram mantidos em
34 incubadoras a 37°C, em atmosfera umidificada contendo 5% de CO2 e 95% de
ar atmosférico.
Para avaliação da resposta das células mesenquimais aos scaffolds, foram realizados os seguintes testes: análise de morfologia celular por
microscopia eletrônica de varredura (MEV); viabilidade e proliferação por
alamarBlue (Molecular probes, EUA); e avaliação indireta da formação de
nódulos minerais por quantificação de cálcio no sobrenadante da cultura.
3.1 Morfologia Os efeitos dos diferentes materiais na morfologia e espraiamento celular
foram avaliados através da MEV nos períodos de 1 e 3 dias. Os estágios de
adesão e espraiamento foram determinados de acordo com o proposto por
Rajaraman et al.49, 1974.
Para a MEV, as células foram cultivadas sobre os scaffolds, e então
fixadas com as soluções de glutaraldeído a 2 % (Sigma, EUA) em αMEM puro (Gibco) e glutaraldeído a 2% (Sigma, EUA) em tampão cacodilato 0,1M (Sigma, EUA), lavadas em PBS (phosphate buffered saline) e desidratadas em
concentrações crescentes de álcool etílico. Após secagem em dissecador a
vácuo as amostras receberam deposição de uma camada de 6 nm ouro para
análise em MEV. Cinco micrografias de cada amostra foram utilizadas para a
análise.
3.2 Análise de viabilidade e proliferação celular A proliferação e viabilidade celular foram avaliadas após 3, 9, 15, 18 e
21 dias de incubação utilizando o teste alamarBlue (Molecular Probes, EUA).
Neste ensaio, uma reação de redução ocorre nas mitocôndrias celulares,
reação essa que converte o produto resazurina (de coloração azul) para sua
forma reduzida resofurina (de coloração rósea). Este então é transportado para
fora das células e já no sobrenadante é quantificado espectrofotometricamente.
Os scaffolds foram incubados em uma placa de 24 poços, contento 1 mL
da solução de trabalho do alamarBlue (α-MEM com 10% de FBS, 1% de P/S e
10% de alamarBlue). Foram utilizadas como controle negativo a solução de
trabalho do alamarBlue. Após o tempo de incubação de 4 h, alíquotas de 150
35 µL foram coletadas de cada amostra foram transferidas para uma placa de 96
poços e lidas em um espectrofotômetro em comprimentos de onda de 570 e
600 nm. O número de células viáveis está relacionado com o nível de redução
de corante e é expresso em percentual de redução do alamarBlue, de acordo
com o protocolo do fabricante.
3.3 Quantificação de cálcio
Para avaliação indireta da preciptação de cálcio sobre os scaffolds, foi
utilizado o teste para quantificação do cálcio presente no sobrenadante da
cultura com o uso do kit Cálcio (Labtest Diagnóstica, Brasil), segundo
orientação do fabricante, nos períodos de 3, 9, 15, 18 e 21 dias. Os
sobrenadantes coletados durante o experimento foram armazenados a -20° C e
após todas as coletas, a mensuração foi realizada com o kit.
Devido à possibilidade de alguns grupos de materiais liberarem cálcio,
utilizou-se como controle negativo o meio de cultura em contato com cada
material, para cada grupo. Como controle positivo, foram utilizadas células
cultivadas no plástico, e seu controle negativo somente o meio de cultura. Para
essa análise interpreta-se que quanto menor a quantidade de cálcio presente
no meio de cultura maior a precipitação do mesmo sobre as amostras.
4 ÁNALISES IN VIVO
O experimento foi realizado baseado nos padrões estabelecidos na
norma ASTM F981-0 “Standard Practice for Assessment of Compatibility of Biomaterials for Surgical Implants with Respect to Effect of Materials on Muscle and Bone”. Este trabalho foi submetido e aprovado pelo Comitê de Ética no
Uso de Animais (CEUA) da Faculdade de Odontologia de Araraquara - UNESP
(Processo nº 17/2013 - Anexo 2)
Os grupos avaliados in vivo foram: Coágulo, utilizado como controle;
PHB; PHB-OGP; PHB/FB; PHB/FB-OGP; e PHB/(FB-HA)-OGP. O protocolo
experimental foi composto por 90 coelhos (Grupo Genético Botucatu), machos,
36 na idade de 5 meses e com peso médio de 3 a 3,5 kg. Em um mesmo animal
foram realizados dois defeitos críticos no osso parietal. Portanto, cada animal
foi utilizado para dois grupos distintos. Para a análise histológica cada grupo
experimental possuiu 6 animais e os períodos de análise foram 15 e 60 dias.
Para a microtomografia computadorizada (µ-CT) foram utilizados 6 animais por
grupo, para os períodos de análise de 15, 60 e 120 dias, totalizando 54
animais. Para análise de expressão gênica cada grupo experimental possui 4
animais e os períodos de análise foram 07, 15 e 30 dias, num total de 36
animais.
Etapa cirúrgica
Os animais foram anestesiados por meio de administração intramuscular
de cloridrato de ketamina (35 mg.kg-1) e de cloridrato de xilazina (10 mg.kg-1),
dosagem esta suficiente para 30 minutos de anestesia. Uma dose de 5 mg/kg
do analgésico cloridrato de tramadol (Tramal) e uma dose de 1 mg.kg-1 de
pentabiótico foram administradas, via intramuscular, em dose única no pré-
operatório. Todos os procedimentos cirúrgicos foram realizados sob rigoroso
protocolo asséptico. Após a anestesia e tricotomia da região parietal, uma
assepsia foi realizada na área com iodopolvidine. Os animais foram
acomodados em posição dorsal e uma incisão em dois planos sobre a sutura
sagital foi realizada, seguida de descolamento e rebatimento dos tecidos
contendo epiderme, tecido muscular e periósteo, até a exposição do osso
parietal.
Os defeitos ósseos críticos foram realizados com o auxílio de uma trefina
de 11 mm de diâmetro e sob irrigação constante de soro fisiológico 0,9%. A
confecção dos defeitos se deu pela perfuração total do osso parietal mantendo-
se a integridade da dura-máter. Foram realizadas ostectomias bilaterais no
osso parietal. Após a confecção dos defeitos, uma marcação a 3 mm da borda
foi realizada com inserção de guta-percha em pequenos orifícios,
bilateralmente ao defeito, para orientação da remoção dos blocos e realização
das análises (Figura 3). Cada defeito recebeu tratamento distinto, seguido por
sutura dos planos por meio de pontos simples e contínuos com fio reabsorvível
de poliglactina Vicryl 4-0 (Ethicon, Johnson & Johnson, EUA).
37 Figura 3 - Desenho esquemático da disposição dos defeitos, marcações de
guta percha e área de remoção da peça (em vermelho).
A eutanásia dos animais foi realizada nos respectivos períodos de
análise descritos. Após anestesia geral com a administração intramuscular de
cloridrato de ketamina (35 mg.kg-1) e de cloridrato de xilazina (10 mg.kg-1) foi
realizada a remoção dos ossos parietais, seguida do aprofundamento
anestésico.
A progressão da reparação dos defeitos ósseos foi avaliada por µCT. A
avaliação da resposta biológica aos diferentes revestimentos do scaffolds de
PHB foi avaliada por análise histológica descritiva, e a expressão e produção
de proteínas envolvidas no processo de regeneração óssea por reação de
polimerase em cadeia - PCR em tempo real e imunohistoquímica,
respectivamente.
4.1 Análise histológica
Processamento Histológico Decorridos os períodos experimentais de 15 e 60 dias, as peças foram
removidas e imediatamente imersas em formaldeído 4% (preparado a partir do
paraformaldeído), tamponado com fosfato de sódio 0,1 mol.L-1, pH 7,2. Após 48
h de fixação, as peças foram transferidas para solução de álcool a 70% para
escaneamento em microtomógrafo. Em seguida, foram descalcificadas em
E.D.T.A. 7% (Ácido Etileno Diamino Tetracético), tamponado com fosfato de
38 sódio 0,1mol.L-1, pH 7,2, desidratadas em gradações crescentes de álcool
etílico (70O, 80O, 90O e 100O G), diafanizadas em xilol, infiltradas e incluídas em
parafina. Posteriormente, foram obtidos cortes sagitais medianos de 4 µm de
espessura.
4.1.1 Análises Morfológica e da Resposta Tecidual Os cortes semi-seriados das porções de calota craniana foram aderidos
a lâminas de vidro e corados com Hematoxilina & Eosina (H&E), sendo
utilizados para a descrição morfológica, bem como para análise da resposta
tecidual nas regiões adjacentes ao material implantado. Nestas análises, foi
avaliada a presença de células inflamatórias mononucleadas e células gigantes
multinucleadas, além de partículas dos biomateriais.
Para a avaliação semi-quantitativa da resposta tecidual dos diferentes
grupos e períodos, imagens das regiões de defeitos ósseos presentes em
cortes corados com H&E foram obtidas utilizando-se um microscópio de luz
Leica DM2500. Observando-se estas imagens, foram estabelecidos escores de
intensidade da reação inflamatória com base na ISO 10993-6: 2007 (Biological Evaluations for medical devices – Part 6: Tests for local effects after implantation), conforme ilustra a Tabela 1. Foram consideradas nesta análise
células mononucleadas (polimorfonucleares, linfócitos, plasmócitos e
macrófagos), bem como células multinucleadas contendo 3 ou mais núcleos
(células gigantes multinucleadas do tipo corpo estranho). Para cada animal
foram obtidas 4 diferentes imagens do mesmo defeito, considerando-se regiões
de centro e bordas do defeito. Foi avaliado um total de 6 animais por grupo,
considerando-se os períodos de 15 e 60 dias. Todas as análises foram
executadas por um examinador cego e previamente treinado.
39 Tabela 1 - Sistema de avaliação histológica considerando-se o tipo de resposta
ou o número de células inflamatórias por campo microscópico. Aumento incial:
400×. Adaptado de ISO 10993-6: 2007 (Biological Evaluations for medical devices – Part 6: Tests for local effects after implantation).
4.1.2 Análise imuno-histoquímica Para detecção e localização da expressão de Colágeno tipo I e
Osteocalcina foi utilizado o método do complexo avidina-biotina-peroxidase
(ABC) com a utilização do kit Immuno Cruz mouse ABC staining system
(Sc:2017, Santra Cruz Biotechnology) segundo as instruções do fabricante.
Previamente foi realizada a recuperação antigênica em tampão citrato 10
mmol.L-1/ pH 6,0, a 90°C, por 20 min. As lâminas foram resfriadas e então, a
atividade da peroxidase endógena foi bloqueada com solução de peróxido de
hidrogênio 1% em água destilada. Em seguida, as lâminas foram lavadas em
PBS três vezes e o bloqueio de ligações não específicas realizado com a
solução Blocking serum fornecida pelo kit. A incubação com o anticorpo
primário para as proteínas em análise (Anti-Collagen I antibody (ab6308,
Abcam) em diluição 1:800; e Anti-Osteocalcin antibody (ab13418, Abcam) em
diluição 1:400) foi feita overnight em câmara úmida à 4 °C. Como controle
negativo, o anticorpo primário foi omitido e substituído por PBS.
Após repetidas lavagens das peças em PBS, os cortes foram incubados
com anticorpo secundário biotinilado por 30 min, seguido de incubação por 30
Escores
Tipo de Célula/Resposta 0 1
(Raro/Leve) 2
(Moderado) 3
(Intenso) 4
(Muito intenso)
Infiltrado Inflamatório Mononuclear
Ausente 1-5 células/campo
11-20 células/campo
Muitas células
inflamatórias
Campo coberto por
células inflamatórias
Células Gigantes Ausente 1-2
células/campo 3-5
células/campo
Muitas células
gigantes
Campo coberto de
células gigantes
40 min com o reagente enzimático AB, e na sequência com o substrato de
peroxidase por 45 seg, à temperatura ambiente. Todas essas soluções fazem
parte do kit Immuno Cruz mouse ABC staining system. Os cortes por último
contra-corados com Hematoxilina de Carrazi por 45 seg. Posteriormente, as
lâminas foram lavadas em água corrente, desidratadas e montadas com
Permount.
Para a avaliação das imunomarcações também foram atribuídos escores
(análise qualitativa ordinal das imunomarcações). Foram empregados os
seguintes escores: negativo (-), positivo (+), superpositivo (++) ou hiperpositivo
(+++). Para realização da análise estática, os escores foram convertidos em
porcentagens: 0%, 20% (10 a 30%), 60% (50 a 70%) e 90% (80 a 100%)19, 22,
48. A intensidade da coloração foi registrada por um examinador cego.
4.2 Microtomografia computadorizada – µCT
As peças foram removidas após 15, 60 e 120 dias e imediatamente
imersas em formaldeído 4% (preparado a partir do paraformaldeído),
tamponado com fosfato de sódio 0,1mol.L-1, pH 7,2. Após de 48 h de fixação,
as mesmas foram lavadas em água corrente por 24 h e depois armazenadas
em uma solução de álcool 70% em temperatura ambiente. Os espécimes foram
escaneados utilizando o sistema de microtomografia computadorizada Skyscan
1176 (Aartselaar, Belgium). Essas peças posteriormente foram descalcificadas
e utilizadas nas análises histológicas.
Método de escaneamento: Os parâmetros utilizados na tomografia
computadorizada foram um gerador de RX operado a 50 kV com corrente do
feixe de 496 uA. Foi utilizado um filtro de 0,5 mm de alumínio e as imagens
obtidas numa resolução de 18 µm. As imagens tridimensionais foram
reconstruídas utilizando o software de reconstrução NRecon 1.6.1.5 (SkyScan N. V. Belgium).
Análise Volumétrica (3D): A mensuração volumétrica foi realizada
utilizando o software CT Analyser 1.10.1.0 - (SkyScan, Belgium), seguindo a
seleção de uma área de interesse (ROI – region of interest) tridimensional, no
formato cilíndrico com 1,2 mm de diâmetro e espessura envolvendo os 100
41 cortes radiográficos mais centrais (Figura 4). O examinador foi guiado pelas
marcações com guta-percha para o correto posicionamento da ROI. As
análises foram realizadas por um examinador treinado e cego para os grupos
experimentais.
Figura 4 - Ilustração do posicionamento utilizado da região de interesse (ROI)
para as análises de microtomografia computadorizada. A= imagem
radiográfica; B= imagem tomográfica; C= posicionamento da ROI de 1,2 mm de
diâmetro centralizada em relação à guta-percha (setas brancas).
4.3 Análise da expressão gênica - PCR tempo real Foram utilizados 4 animais por grupo para a análise da expressão
gênica nos períodos de 7, 15 e 30 dias. O tecido retirado do animal foi
rapidamente transferido para um tubo em nitrogênio líquido, e posteriormente
para um freezer a -80°C, para conservação da integridade do RNA.
O tecido coletado foi macerado em nitrogênio líquido, e em seguida o
RNA total dos tecidos coletados foi extraído com Trizol (Ambion, EUA). A
concentração do RNA extraído de cada amostra foi medida por densidade
óptica por meio do espectrofotômetro Nanovue (GE).
A síntese de cDNA foi realizada subsequentemente em termociclador
(MyCycler - Bio-Rad), utilizando o kit TaqMan Reverse Transcription Reagents
(Applied Biosystems), de acordo com as instruções do fabricante.
A B C
1,2 mm
42
Dois microlitros de cDNA foi utilizado num volume total de reação de
PCR de 25 μL. Este volume incluiu, além do cDNA, 9,25 μL água livre de
nucleases, 12,5 μL TaqMan Fast gene expression master mix e 1,25 μL TaqMan gene expression assays (Applied Biosystems, EUA) para os genes
alvo: Osterix (assay ID: Pn4331348AIFATAS), Colágeno tipo I (assay ID: Oc03396073_g1), Fosfatase alcalina (assay ID: Pn4331348AICSWYC) e
Osteocalcin (assay ID: Pn4331348AID1U4K). As condições de ciclagem
utilizadas foram: 50°C por 2 min, 95°C por 10 min e 40 ciclos de 95°C por 15
seg e 60°C por 1 min.
O PCR em tempo real foi realizado em um equipamento Step One Plus
(Applied Biosystems, EUA). Os resultados foram analisados usando o método
de comparação de cycle threshold (Ct), utilizando a GAPDH (Applied Biosystems, EUA, assay ID: Oc03823402_g1) como gene normalizador.
5 ANÁLISE ESTATÍSTICA
As análises estatísticas foram feitas no programa GraphPad Prism v.5. O
teste D’Agostino e Pearson foi aplicado para verificação da normalidade das
amostras e verificou-se que, para todos os experimentos desse estudo, as
amostras não tinham distribuição normal. Portanto, para comparações de três
ou mais grupos foi utilizado o teste para dados não paramétricos, Kruskal-
Wallis com pós-teste de Dunn; e para as comparações entre dois grupos foi
utilizado o teste para dados não paramétricos Mann-Whitney. O nível de
significância adotado foi de 5%.
A apresentação dos resultados e discussão foi dividida em três capítulos
em formato de artigos. O capítulo 1, aborda os resultados de caracterização
físico-química e a avaliação in vitro dos scaffolds PHB e PHB associado aos
peptídeos OGP e OGP(10-14). O capítulo 2, aborda os resultados de
caracterização físico-química e a avaliação in vitro dos scaffolds PHB, PHB/FB,
PHB/FB-OGP e PHB/(FB-HA)-OGP. Esses dois primeiros artigos foram
43 redigidos com os resultados obtidos nesta tese de doutorado e no projeto de
pós-doutoramento da co-orientadora Dra. Sybele Saska Specian. Portanto
algumas metodologias presente nos artigos (Espectroscopia de ressonância
magnética nuclear no estado sólido do núcleo 31P, Análise termogravimétrica,
Calorimetria exploratória diferencial, Deterimação da liberação do peptídeo
OGP e Avaliação da bioatividade dos scaffolds in vitro) não fazem parte desta
tese. O capítulo 3 aborda a resposta in vivo dos materiais supracitados.
44
capítulo 1
Artigo submetido para publicação na revista Biofabrication e aqui apresentado nas normas de submissão da revista.
45
Three-dimensional printing by selective laser sintering of poly(3-hydroxybutyrate) scaffolds associated to osteogenic growth peptide
Luana C. Pires1, Mariana A. Cominotte1, Larissa S. Mendes2, Marcelo F. de Oliveira3, Izaque A. Maia3, Jorge Vicente L. da Silva3, Sidney J. L. Ribeiro2, Joni A. Cirelli1, Sybele Saska2*
1Dental School, Univ. Estadual Paulista – UNESP, Department of Periodontology, Rua Humaitá, 1680, Zip Code 14.801-903 – Araraquara – São Paulo, Brazil. E-mail: luanacp@yahoo.com.br, marianaacominott@foar.unesp.br, cirelli@foar.unesp.br 2Institute of Chemistry, Univ. Estadual Paulista – UNESP, Postal Code 355, Araraquara – São Paulo, Brazil. E-mail: la_mendes@hotmail.com, sidney@iq.unesp.br, sybele_saska@yahoo.com.br 3Information Technology Center Renato Archer (CTI), Division of Three-dimensional Technologies, Rod. Dom Pedro I, Km 143.6, Campinas – SP, Brazil. E-mail:marcelo.oliveira@cti.gov.br, izaque.maia@cti.gov.br, jorge.silva@cti.gov.br
*Corresponding Author E-mail:sybele_saska@yahoo.com.br. Telephone: 55 16 3301-9631 Address: Institute of Chemistry, Univ. Estadual Paulista – UNESP, Postal Code 355, Araraquara – São Paulo, Brazil
46
Three-dimensional printing by selective laser sintering of poly(3-hydroxybutyrate) scaffolds associated to osteogenic growth peptide
Abstract
Three-dimensional printing (3DP) is a technology which allows
manufacturing scaffolds with complexes structures. Among the techniques
available to 3DP, the selective laser sintering (SLS) is used to construct
scaffolds with higher porosity and controlled-pore size. The aims of this study
were to develop and characterize poly(3-hydroxybutyrate) (PHB) scaffolds via
SLS and functionalized with osteogenic growth peptide (OGP) and its C-
terminal sequence, OGP(10-14). The results showed high porous scaffolds with
pore size range of 500-700 µm and porosity of 55,8±0,7%. Thermal properties
of PHB polymer were not changed by the SLS process. The compressive
strength and Young’s modulus for dry and wet scaffolds were 0,73±0,05 MPa/
4,98±0,37 MPa and 0,51±0,01 MPa/3,50±0,11 MPa, respectively. Furthermore,
the OGP release profile showed PHB scaffold promoted a controlled release
above 72h. In vitro assays using rat bone marrow stem cells showed similar
cellular proliferation in all the PHB scaffolds. . Scanning electronic microscopy
images showed an apparently better morphological differentiation in the groups
containing peptides. Thus, the SLS process promoted the sintering of a
hierarchical structure with interconnected pores and intrinsic porosity, which are
important factors for cell adhesion and proliferation. This was confirmed with
good proliferation and morphological differentiation of cells in all scaffolds.
Keywords: additive manufacturing, three-dimensional printing, polymer,
peptide, bone tissue engineering, in vitro.
47
1. Introduction
Additive manufacturing (AM) or three-dimensional printing (3DP) is a
current technology to construct three-dimensional physical objects, layer-by-
layer, from a digital model. This technology is a promising option for the
production of scaffolds particularly for bone substitutes. This technique consists
in constructing structures of different shapes by a tool for direct digital
fabrication that selectively prints a respective material (layer-by-layer) into/onto
a bed, whose shape is given by a computer aided design (CAD) file [1, 2].
Furthermore, 3DP allows a better control of porosity and pore size than in
traditional methods [1]. Because of this versatility, this technology has been
recently used in the biomedical area to manufacturing scaffolds for replacement
or reconstruction of complexes tissues or organs, including bone regeneration
[3, 4].
Nevertheless, the principles of 3D printing consist firstly in elaboration of
a virtual model, from a CAD or an animation modeling software, whose virtual
model is sliced into digital cross-sections and converted in STF files, to be used
as a guideline for printing. In this second step, the successive layers are printed
using liquid, powder, or some other material to build the physical model [5]. A
distinctive feature of this layer-by-layer printing process, is the printing of
structures with high geometric complexity and well-defined architecture as well
as patient-specific implant designs, which are not possible to be constructed by
any other manufacturing method [1]
Different additive processes may be used in 3D printing including
selective laser sintering (SLS), stereolithography (STA) and fused deposition
modeling (FDM). They differ from each other by the materials that can be used
and by the way the layers are deposited to create parts. In the SLS process the
slices are written by a CO2 laser beam layer-by-layer with powder addiction
over a powder bed and resolution depends on laser beam diameter. The
interaction of the laser beam with the powder increases the temperature to the
melting point and fuses the particles to form a solid mass. In the final stage the
printed object is removed from the powder environment and it is cleaned from
the remaining powder [5, 6].
48
The technologies that process powder, as SLS, have the advantage of
manufacturing scaffolds with greater controlled porosity and porous size in
regarding to the other processes [6]. These and other architectural features,
e.g. permeability, play a significant role in biological delivery and tissue
regeneration [7]. In bone tissue engineering, the advantage of this process is
given by providing the control of fine features including interconnected porosity
and no contamination issues related to any second material for support
structures [4].
In the SLS process, one of the printing materials used are thermoplastic
polymers. Among different polymers, poly(3-hydroxybutyrate) (PHB) has
attracted attention for application in biomedical areas as scaffolds due to its
biocompatibility and biodegradability [8]. PHB is a thermoplastic polyester
classified as biopolymer, which is produced by microorganisms, as the bacteria
Ralstonia eutropha, under imbalanced growth conditions [8]. This biopolymer
has been widely used for biomedical applications, such as bone plates, sutures,
rivets, staples, screws, orthopedic pins, bone marrow scaffolds and meniscus
regeneration devices [9]. Previous studies described the manufacture of PHB
scaffolds by SLS process, whose results showed 3D-printed scaffolds with high
porosity and controlled pore size, which are important factors for cell growth
support [2].
Indeed, an ideal bone substitute (BS) material should provide a variety of
shapes and sizes with suitable mechanical properties for being used in sites
where there are impact loading. Thus, 3D printing is an important technology
that provides all these features. Moreover, the materials used for bone tissue
engineering should be biocompatible, osteoconductive, preferably being
resorbable and replaced by new bone formation. In general, resorbable BS
materials are preferred, since these materials are expected to preserve the
increased bone volume during the reconstruction and simultaneously are
gradually replaced by newly formed bone [10].
Furthermore, numerous physicochemical features of scaffolds, such as
surface chemistry, surface roughness, topography, mechanical properties and
interfacial free energy (hydrophobic/hydrophilic balance) are important for cell
attachment, proliferation and differentiation. These factors are also critically
49
important to the overall biocompatibility and bioactivity of a particular material
[11-13].
3D printed scaffolds have also been used for incorporating of growth
factor and of drug delivery systems to stimulate bone growth in the area of
scaffold implantation. The advantages of localized delivery are reduced
therapeutic dose, controlled release pattern and negligible side effects
compared with systemic drug delivery [14]. Growth factors such as vascular
endothelial growth factor (VEGF), fibroblast growth factors (FGF) and bone
morphogenetic proteins (BMP) are important in bone tissue engineering [4]. The
osteogenic growth peptide (OGP) has attracted considerable clinical interest as
a bone anabolic agent and hematopoietic stimulator [15].
OGP peptide is an identical sequence to the C-terminus of histone H4,
which is physiologically present in the human and rodent serum in micromolar
concentration, mainly as an OGP-OGP binding protein complex (OGP-OGPBP)
and is highly and transiently increased during systemic osteogenic remodeling
and phase of post-ablation bone marrow regeneration [16]. The primary
sequence of this peptide contains a highly conserved 14-amino acid motif (H2N-
ALKRQGRTLYGFGG-OH). The endogenous OGP is proteolytically cleaved
after the dissociation of the OGP-OGPBP complexes, thus generating the C-
terminal pentapeptide (NH2-YGFGG-OH), named OGP(10-14). OGP(10-14) is
the proteolytic cleavage product from OGP [17, 18], whose sequence has been
suggested as the physiologically active form of OGP peptide [19-21], inasmuch
as this pentapeptide activates the signaling pathway of the cytoplasmic OGP
[19, 22].
Gabet et al. [23] demonstrated that the systemic administration of
synthetic OGP (10–14) in rats and mice increases bone formation, trabecular
bone density and stimulates fracture healing. Brager et al. [24] observed in vivo
the regulation in the expression of type I collagen, transforming growth factors
(TGF), FGF, insulin-like growth factor (IGF) and aggrecan. Furthermore, OGP
and OGP(10–14) enhance hematopoiesis, which increases engraftment of bone
marrow transplant and stimulate hematopoietic regeneration after ablative
chemotherapy [25, 26].
In this study, PHB scaffolds were manufactured by 3D printing via SLS
for bone tissue engineering. Based on previous results of our research group
50
[27, 28], OGP and OGP(10-14) peptides were incorporated to PHB scaffolds
and the release of the OGP peptide was evaluated. Characterization of the
scaffolds was conducted in terms of scaffold morphology, porosity, thermal
analysis and mechanical properties. Moreover, in vitro assays were performed
using mesenchymal rat bone marrow stem cells to evaluate the effect of those
scaffolds with or without peptides on cellular adhesion and proliferation stages.
2. Materials and Methods
2.1 Materials The poly(3-hydroxybutyrate) (PHB) was supplied by PHB Industrial S/A
(Biocycle®, São Paulo, Brazil) in powder form with particle size distribution in
the 10-100 μm range, an average molecular weight of 600,000 Da and density
of 1.22 g cm-3, data reported by the PHB’s supplier. The OGP and OGP(10-14)
peptides were purchased from AminoTech© (São Paulo, Brazil). The OGP-5,6-
carboxyfluorescein (OGP-CF) peptide was supplied by Synthesis, Structure,
Application Laboratory of Peptides and Proteins (Institute of Chemistry - UNESP, Araraquara, Brazil).
2.2 Design and fabrication of 3D scaffolds
Cylindrical scaffolds model with a 3D orthogonal-projection porous
architecture were designed using SolidWorks® software (Dassault Systèmes SolidWorks Corp., France). Therefore, CAD models for in vitro assays and
mechanical tests were designed in the dimensions: 1) 11 mm in diameter and 2
mm height; and 2) 20 mm in diameter and 35 mm height, respectively. Struts
and pores were designed in size of 700 µm, which provided a porous structure
with interconnected pores, as shown in Figure 1.
The CAD models were then exported into STL format and transferred to
a computer of the SLS machine. The 3D scaffolds were printed in a
Sinterstation® 2000 SLS machine (3D Systems, Valencia, CA), which
selectively sintered the PHB power into scaffolds using CO2 laser. SLS process
parameters for scaffold manufacturing were defined by: laser power = 8 W;
51
laser beam spot = 450 μm; laser beam speed = 2000 mm/s; part bed
temperature = 100 °C; scan spacing = 0.15 mm; layer thickness = 0.18 mm.
The removal of powder attached to the scaffolds was performed by blowing with
compressed air.
Figure 1: The scaffold models designed using SolidWorks®. A= 3D model for in vitro assays; B= 3D model for mechanical tests.
2.3 Incorporation of peptides Incorporation of the peptides, OGP and OGP(10–14), was performed by
adsorption. This methodology promotes the interaction between the peptide and
functional groups from PHB by hydrogen bonding, and the drug delivery occurs
by increasing the solution ion force (biological conditions). For release
evaluation of OGP peptide, this peptide was labeled with carboxyfluorescein
(OGP-CF, 10-5 mol.L-1) according to previous methodology described by Saska
et al. 2012 [27]. In the scaffolds prepared for in vitro assays, the concentration
of peptides OGP and OGP(10-14) was 10-9 mol.L-1, based on previous studies
that considered this concentration optimal to promote a better ALP activity, as
well as a higher formation and mineralization of bone nodules [16, 29]
Therefore, the peptide solutions were prepared containing absolute
ethanol/deionized water (1:9; v/v). The PHB scaffolds were immersed in 2 mL of
respective peptide solution, OGP or OGP(10–14), for 72 h at 10 °C. Each
sample was then dried at 37 °C. Afterwards, the PHB, PHB-OGP and PHB-
OGP(10–14) scaffolds were sterilized by gamma radiation (20 kGy) to in vitro
assays.
700 µm
2 mm700 µm
11 mm
700 µmstrut
strut
pore
20 m
m
Pore size: 700µmStrut size: 700µm
A B
52
2.4 Characterization of PHB scaffolds The morphology of the PHB scaffolds was analyzed using optical (OM)
and scanning electron microscopy (SEM). OM images were observed in a
microscope (Leica) coupled to a digital camera (Leica DFC425). The capture of
the images was performed using the Leica Application Suite software. ImageJ
1.48v software was used for measuring pores size. SEM images of the PHB
scaffolds were investigated using a field emission gun scanning electron
microscope (FEG-SEM; JEOL, model 7500F). The samples were previously
sputter coated with a 1 nm thick gold layer for 60 s (3 kV and 9.5 mA). The
morphology was observed at an accelerating voltage of 2 kV.
Thermogravimetric (TGA) measurements were performed to study the
thermal degradation of PHB. The equipment used was TA SDT 2960 from TA
Instruments Co. The samples were heated in open α-alumina pans from 25 to
600 °C under a nitrogen atmosphere (flow rate: 50 mL.min-1) at a heating rate of
10 °C.min-1. Differential scanning calorimetric (DSC) analysis of PHB powder
and scaffold was performed using a in a Q100 TA Instruments differential
scanning calorimeter, under nitrogen atmosphere (flow rate: 50 mL.min-1) at a
heating rate of 10 °C.min-1. Both first and second heating cycles were
performed in the same heating conditions, from -10 °C to 190 °C. The first cycle
was followed by a cooling at a rate of 10 °C.min-1 until -10 °C. This first cycle
was performed for thermal history of the polymer. The thermal transitions and
the enthalpy of fusion were obtained from DSC curves in the second heating
and temperatures were taken at the peak maximum. Thus, the crystallization
temperature (Tc), the melting temperatures (Tm) and degree of crystallinity (Xc)
of the samples were determined. The crystallinity was calculated according to
the Equation 1, where, ∆Hm is the melting enthalpy and ∆Hm0 is the theoretical
enthalpy of 100% crystalline PHB (∆Hm0 PHB = 146 J g-1) [30].
The porosity of PHB scaffolds was measured using a density kit and an
electronic balance based on Archimedes’ principle [31, 32] according to the
Equation 2, where, ρapp and ρtr are the apparent density and true density of the
(1)
53
(4)
(5)
scaffold, respectively. PHB scaffolds with a size of 11 mm in diameter and 2
mm in height were used for the measurement and distilled water was used as
liquid medium.
ρapp and ρtr were calculated using the following Equations 3 and 4 after
weighing the scaffold in air (dry weight, wd), suspended in water (ws) and in
saturated in water (wsat), respectively, and ρH2O is the density of water at the test
temperature.
First, the dry weight of PHB scaffold was measured and calculated the
respective volume. Then, PHB scaffold was previously immersed in 5 mL
distilled water for 30 min at room temperature. This time was required for filling
of all the pores of scaffold with water, and for obtaining 100% swelling in
relation to their dry weight. The measurements were performed in triplicate.
The porosity of the designed scaffold model was calculated by obtaining
the value of the total volume (Vtot) and the true volume (Vtr) through
Magics®18.2 software, Equation 5.
Compressive tests were performed using an Instron 5569 (Instron Inc., Carton, MA, USA) with a 500 N load cell and a crosshead speed of 0.5
mm.min−1. The cylindrical samples were manufactured and tested according to
ASTM F2150 and D1621, respectively. The scaffolds were tested in dry and wet
conditions, where the wet condition the scaffolds were immersed in SBF
solution (simulated body fluid, Kokubo’s solution) [33]. The samples were
soaked in SBF solution for 10 min at room temperature for simulating the
compressive strength of the scaffolds under conditions post surgical
(2)
(3)
54
implantation. Then, the samples were laid on filter paper for removal of excess
superficial water before performing the mechanical tests. At least three samples
for each condition were tested. Data were expressed as mean ± standard
deviation (SD).
2.5 OGP-CF peptide release in SBF solution The release of labeled peptide (OGP-CF) from PHB scaffolds was
monitored by fluorescence spectroscopy. The release profile was obtained by
immersion of these scaffolds in 30 mL of SBF solution (pH 7.4) at 37 °C under
stirring at 100 rpm and continuous flux maintained by a peristaltic pump for 72
h. Fluorescence measurements were performed on a Varian Cary Eclipse
fluorescence spectrophotometer coupled to the system using a 400-μL flow-
through cell with 10 × 4 mm light path employing λexc at 492 nm and λem at 520
nm; slit widths were set for a 5-nm band-pass for all measurements. The
concentration of peptide was obtained from the standard curve of free labeled
peptide in SBF solution. Triplicate experiments were carried out.
2.6 In vitro assays Primary mesenchymal cells from rat long bones (rat bone marrow stem
cell - RBMSC) were used for all in vitro assays. Cells were extracted from the
internal contents of the bone marrow of long bones, tibia and femur bilateral,
following an adaptation of the protocol described by Maniatopoulos 1988 [34].
All the procedures and experiments were submitted to Ethics Committee on the
use of animals of Araraquara´s Dental School (CEUA - FOAr - UNESP), and
approved with the process number 32/2014. 2×105 cells up to the third passage
were plated over the scaffolds and cultivated in alpha-mininum essential
medium (αMEM) supplemented with 10% of fetal bovine serum (FBS), 100
U.mL-1 of penicillin and 100 µg.mL-1 of streptomycin, 50 µg.mL-1 of ascorbic acid
and 10mmol.L-1 of β-glycerophosphate. The culture was maintained in
humidified atmosphere with 5% of CO2.
Cell morphology - Scanning Electron Microscopy (SEM)
Cell morphology and spreading were evaluated by SEM. After 1 and 3
days the medium was removed and the cells were fixed, dehydrated in gradual
55
(6)
series of alcohol and air vacuum dried. Five images were taken from a FEI
Magellan 400L microscope (FEI, USA). A descriptive analysis was made and
stages of cell adhesion and spread described by Rajaraman et al. [35] were
used in morphological analysis.
Cell proliferation assay
Cell proliferation was assessed using the alamarBlue kit (Life Technologies, USA). Briefly, at 3, 9, 15, 18 and 21 days after seeding, the
medium was aspirated and 1 ml of dye solution (10% alamarBlue and 90%
culture medium) was added to each well, and cells were incubated at 37 °C for
4 h. Subsequently, 100 μL of solubilization was added into 96-well plates (TPP, USA) and the absorbance of each well was measured at 570 nm and 600 nm
wavelengths with an automatic microplate (ELISA) reader (Molecular Devices, USA). The dye solution was used as negative control.
The percent reduction of alamarBlue was calculated using the formula
suggested by the kit manufacturer represented in equation 6, where: εox600 =
molar extinction coefficient of oxidized form of alamarBlue in 600 nm
wavelength = 117,216; εox570 = molar extinction coefficient of oxidized form of
alamarBlue in 570 nm wavelength = 80,586; εred600 = molar extinction
coefficient of reduced form of alamarBlue in 600 nm wavelength = 14,652;
εred570 = molar extinction coefficient of oxidized form of alamarBlue in 570 nm
wavelength = 155,677; AT600 = absorbance of test in 600 nm wavelength;
AT570 = absorbance of test in 570 nm wavelength; AC600 = absorbance of
negative control in 600 nm wavelength; and AC570 = absorbance of negative
control in 570 nm wavelength.
Indirect calcium preciptation assay
To assess the potential of the PHB scaffolds associated or not with OGP
or OGP(10-14) to favor bone regeneration, calcium precipitation over scaffolds
56
was indirectly evaluated by calcium quantification into culture supernatant with
Cálcio Kit (Labtest Diagnóstica, Brazil). Following the manufacturer’s guideline,
the supernatant was collected after 3, 9, 15, 18 and 21 days and the calcium
concentration was measured in a plate reader at a wavelength of 570 nm. Cells
cultured in plastic plates were used as positive control and culture media was
used as negative control. To interpret this assay, calcium precipitation in the
scaffolds was considered inversely proportional to the concentration of calcium
available in the supernatant.
2.7 Statistic analysis
Statistical analysis was performed using GraphPad Prism 5.0 software.
Non-parametric Kruskal-Wallis with Dunn’s post-hoc test was used in
comparisons among three or more groups, and Mann-Whitney was used to
compare two groups. Differences were considered statistically significant when
p<0.05.
3. Results and Discussion
3.1 Fabrication and characterization of the scaffolds Porous 3D scaffolds have been developed by variety of conventional
methods from alloplastic materials, such as particle/salt leaching, chemical/gas
foaming, fiber bonding, solvent casting, melting molding, phase separation and
freeze drying [4, 36]. However, these methods present some limitations due to
their lack of the controlled formation of pores and do not produce
interconnected structures for favoring cell growth inside the structure. For
overcome these disadvantages, additive manufacturing (AM), has become a
promising option for the production of scaffolds particularly for bone substitutes
[4].
Currently, 3D printed scaffolds have been widely used for bone tissue
engineering. Among them we can mainly highlight the use of this 3D printed
bone substitutes based on bioceramics for vertical bone augmentation as onlay
57
graft. The results shown by these studies are promising and efficient as bone
graft compared to autografts [37-39].
However, this study aimed to use a technology of AM for powder
processing, as SLS; since this technology can provide a higher intrinsic porosity
when compared with other AM technologies, such as fused deposition modeling
(FDM) and stereolitrography (SL) [1, 6]. Although, scaffolds manufactured via
SLS might have a lower mechanical strength compared with other AM
techniques.
The results of this study revealed PHB powder is an optimal polymer for
processing via SLS. Figure 2 shows PHB scaffold printed for mechanical tests
and OM image obtained of the PHB scaffold. OM image shows scaffold pores
decreased in size regarding to the CAD model, due to polymer concentration
after processing. Pores observed with irregular shapes and size in the 500 –
700 µm range.
The surface morphology of the PHB scaffolds is shown in Figure 3. SEM
images of this samples revealed that printing via SLS promoted the formation of
an ideal intrinsic porosity for cell adhesion and spreading. Moreover, the
morphology of struts were well preserved and the pores can be identified and
compared with the CAD model. Additionally, intact particles of polymer attached
to the struts were observed without complete fusion, as is shown Figure 3B.
This fact could be explained by the interaction of these particles to the struts
due to a small amount of melting promoted by the heat generated during the
SLS process [40].
Figure 2: A= 3D scaffold printed via SLS for mechanical tests. B= OM image
shows extrinsic pores produced by processing of the PHB scaffolds.
A B
58
Figure 3: SEM images of sintered PHB scaffolds. A= magnification 50×; B=
magnification 100×. White arrows indicate intact PHB particles after
sinterization.
The value measured to the apparent porosity of the sintered scaffolds
was 55.8±0.7%, which was higher than the theoretical value of 40.7%,
calculated by Magics®18.2 software from the designed scaffold model. This
higher apparent porosity value than the theoretical value is due to the presence
of micropores on the surface, and also interconnect micropores into scaffold.
The apparent porosity values have been reported from sintered scaffolds
via SLS process based on poly(hydroxybutyrate-co-hydroxyvalerate) (PHBV)
and Ca-P/PHBV of 64.6±2.0% and around 61.8-62.6±1.2%, respectively,
regarding to the its theoretical value, approximately 53% [32, 41]. The
difference of apparent porosity observed in this study was lower than the values
from the literature data. Nevertheless, this value is related to the designed CAD
model, since the proportion of the printed-scaffold porosity increased in relation
to the theoretical porosity, similarly to the literature data [32, 41, 42].
The literature has demonstrated that osteogenesis in vitro is not affected
by pore size, but can be enhanced by scaffolds with lower porosity. However, in vivo, higher porosity and pore size of at least 100 μm are required, due to cell
size, migration requirements and transport of nutrients. Pores > 300 μm are
recommended to promote the new bone formation and the formation of
capillaries [31]. Therefore, the PHB scaffolds obtained in this study by the SLS
process seems to provide optimal features of porosity and pore size for in vivo
application and bone regeneration.
B A
59
Thermal properties of polymers are important to be investigated, mainly
when polymers or even proteins are used to printing processes; whereas, some
additive manufacturing technologies require high temperatures for processing
the 3D models. Thus, the TGA curves for PHB powder and scaffold are shown
in Figure 4. Thermogravimetric analysis was carried out to estimate the thermal
stability and degradation profiles of the PHB powder and printed scaffold via
SLS. The respective TGA curves only revealed an important weight loss around
245 - 315 °C with decomposition temperature (Tonset) at 279 °C. Both the TGA
curves showed a similar degradation profile, i.e., PHB did not show difference in
the thermal stability before and after the SLS process.
Figure 4: Typical TG curves for the PHB powder and scaffold.
100 200 300 400 500 600
0
20
40
60
80
100
Wei
ght l
oss
(%)
Temperature (°C)
___ PHB powder___ PHB scaffold
Thermal properties and degree of crystallinity PHB powder and scaffold
were summarized in Table 1. The results showed no significant change in the
thermal properties, as well as, in the degree of crystallinity between PHB
powder and printed scaffold. These data showed the parameters used in the
SLS process maintained the thermal characteristics of PHB polymer, whose
results corroborate with other previous study of our research group [2]. Pereira
et al. 2012 [2] reported that the PHB powder has already been processed, until
32.5 hours, can be used in another printing processes by SLS; since, the
thermal properties of PHB polymer are not changed when is used controlled
parameters of printing during the SLS process.
60
Table 1: Thermal properties and degree of crystallinity of the PHB powder and
scaffold.
Tm (°C) Tc (°C) ΔHm (J/g) Xc (%) PHB powder 176.4 116.6 64.7 44.3
PHB scaffold 173.9 111.9 66.5 45.6
The mechanical properties as the compressive strength and Young's
modulus of the PHB scaffolds are shown in table 2. The compressive properties were considered because they are important for bone tissue engineered
scaffolds and should ideally match those of living bone. Although, the values
measured to the compressive strength of the PHB scaffolds were very lower
than human cancellous bone (~10 MPa) [43], these values were higher than the
values obtained from other printed scaffolds by the SLS process [40, 41]. The
scaffolds developed in this study even after in immersion in SBF solution
presented values higher than the literature data. Duan et al. [40] developed
PHBV and Ca-P/PHBV scaffolds via SLS process using a designed model with
1-mm pore size and 0.5-mm strut, whose values measured to the compressive
strength were 0.19±0.02 and 0.24±0.02 MPa, respectively.
Table 2: Mechanical properties of the PHB scaffolds in dry and wet conditions.
Compressive strenght Young's modulus
(MPa) (MPa) PHB 0.73±0.05 4.98±0.37 PHBim 0.51±0.01 3.50±0.11 The tests were obtained in dry and wet material condition. im: after immersion in SBF solution for 30 min. The values indicated represent mean±standard deviation, where n=3. No statistical differences (p>0.05, Mann-Whitney test).
Compressive strength of printed scaffolds via the SLS process is
determined by material and mainly 3D-model geometry. Strut thickness, pore
size and porosity percentage directly influences in compressive strength.
Therefore, designed 3D model for this study with 0.7-mm pore size and 0.7-mm
strut diameter, allowed to develop printed scaffolds with a high compressive
strength compared with the literature data [40, 41].
61
This designed model was based on limitation of SLS technique, whose
technique has limits in relation to the increase of strut size and the decrease of
pore size. Therefore, this relation strut/pore directly influences in the formation
of intrinsic porosity, without interconnected large pores in scaffolds.
Furthermore, pore size should be enough for migration/proliferation of
osteoblastic cells, in this case, minimum pore size might be 300 µm [31].
Thus, sintered scaffolds in this study could be potentially used for bone
regeneration in regions with low load incidence, such as calvaria or in regions
with high load incidence, but without function of load-bearing, such as bone
defects in femur and for spine implants; whereas, the cancellous bone
microstructure has a limit to compressive strength around 0.32 to 2.25 MPa
[44].
3.2 Determination of OGP-CF peptide release from PHB scaffolds Release measurement to the PHB/OGP-CF was performed without to
know the adsorption kinetic of OGP-CF peptide, i.e., adsorbed maximum
concentration was not determined. Therefore, the used parameter started from
the total theoretical value of incorporation of 10-5 mol.L-1. Although, the value of
adsorbed maximum concentration was not determined, the behavior of OGP-CF
release profile can be observed and can also estimate the necessary
concentration to be incorporated into scaffolds for a more efficient release.
The cumulative release profile versus time from the PHB/OGP-CF
scaffolds is shown in Figure 5. PHB/OGP-CF scaffolds exhibited a steady
continued release pattern with a certain amount of initial burst release and a
sustained release in the following time. This burst release observed in the first
hour of experiment can be attributed to the presence of OGP-CF on the surface
of the scaffolds, which can result in overestimated values in the first moments of
the release test, due to swelling of the PHB scaffold within of this period. At 10
h, the release was in the range of 3.45×10-6 g. After this period, a steady
continued release pattern was observed until 72 h and a release around
4.87×10-6 g; and a plateau phase was not observed in this release profile.
Therefore, this release profile suggests that the PHB scaffold promotes a
controlled release in a greater time, above 72 h. According to the literature, this
release behavior can be attributed to tridimensional structure [45].
62
This release behavior is typical of a controlled release system, in which
the peptide is homogeneously adsorbed on the porous surface of the material.
The release occurs by diffusion of the peptide through the pores of the matrix
and the diffusion rate is reduced since the diffusion distance becomes greater.
The faster initial release can be explained by the fact of the OGP-CF fraction to
interact with polymeric surface by weak interactions or by slight solubility of
peptide, which can readily favor the release of the superficial molecules [45,
46]. The initial behavior follow by a slow release is due to molecules that can
strongly interact with polymer or are incorporated into intrinsic pores of 3D
structure providing a sustained effect of release [45, 47]. Furthermore, this
release profile showed the OGP-CF incorporation to the PHB scaffold and
release were more efficient in relation to the incorporation and release of OGP-
CF from bacterial cellulose membranes, as observed in previous study [27];
however, this result was similar when compared with another study, where
OGP-CF was incorporated to the mesoporous silica nanoparticles [28].
Figure 5: OGP-CF release behavior from the PHB scaffold. Data are reported
as mean ± SD for triplicate experiment.
0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 45000.0
1.0x10-6
2.0x10-6
3.0x10-6
4.0x10-6
5.0x10-6
Rel
ease
d M
ass
(g)
Time (min)
63
3.3 In vitro assays Factors as chemical surface, porosity, pore size and mechanical
strength are critical to define scaffolds performance [4]. In this study, the SEM
images showed that osteoblasts are well spread and present filopodias in all
groups and periods. However, in the groups containing OGP and OGP(10-14),
the number of cells seems to be higher, mainly at 3 days, with some areas in
almost linear confluence (Figure 6).
Rajaraman et al [35] classified the stages of adhesion and spreading in:
stage 1 - round cells; 2 - round cells with filopodia, 3 - cells with cytoplasmic
webbing, and 4 - well flattened cells. Based on this classification, it is possible
to see at SEM in 1 day of culture, cells in stage 3 for all groups of scaffolds. At 3
days, cells in stage 3 and 4 were found in scaffolds with OGP and OGP(10-14),
but only in stage 3 for PHB scaffolds.
Figure 6: SEM of cells cultivated on the PHB scaffolds manufactured by SLS;
magnification 1000×.
The results of morphology analysis by SEM showed a good cell spread
under PHB scaffolds. Previous results demonstrated rounded osteoblast shape
due to reduced spreading under PHB films [48]. Our results suggest that the
scaffold morphology resulted from SLS 3D printing may have improved cellular
64
response and enhanced their shape differentiation. It is well recognized that
surface topography influences in cellular response, osteoblast specifically,
seem to adhere, proliferate and differentiate better in rougher surfaces [31].
The alamarBlue results represent the percentual of alamarBlue reduction
in the culture medium. In the inter-groups comparison, similar results were
found for all groups. A tendency to greater response was observed in the PHB-
OGP(10-14) compared with others groups at 21 days, but no statistical
significance was observed (Figure 7). These results corroborate with SEM
images demonstrating viability and good proliferation into PHB scaffolds.
Figure 7: Percentual reduction of alamarBlue at 3, 9, 15, 18 e 21 days of
RBMSC in PHB scaffolds with and without OGP and OGP(10-14).
alamarBlue
0
50
100
1503 days9 days15 days
21 days18 days
* **
*p<0,05
PHB PHB-OGP PHB-OGP(10-14)
% re
duct
ion
The indirect evaluation of calcium precipitation is presented in Figure 8.
The PHB scaffolds with or without OGPs revealed no differences compared to
positive control. This result suggests no interference of PHB in mineralization
process in vitro. The OGPs seems to fail in enhancing this process.
65
Figure 8: Indirect evaluation of calcium precipitation over different experimental
groups in 3, 9, 15, 18 e 21 days. Date normalized with negative control. No
statistical differences.
Calcium quantification
0.0
0.5
1.0
1.5
9 days3 days
15 days18 days21 days
PHB PHB-OGP PHB-OGP(10-14)
+C
Fold
cha
nge
The concentration of peptide incorporated to the PHB scaffolds seems
not to influence the cell proliferation and activity. Therefore, the quantity or time
of OGP release were not enough to change cell proliferation response. Further
experiments will be necessary to confirm these results and better understand
the OGP and OGP(10-14) incorporation and action, since our research group
showed that those peptides influenced osteogenic cell proliferation, and the
OGP peptide favored the mineralization process when they were incorporated
to bacterial cellulose [27].
Conclusions
PHB scaffolds with a controllable architecture and pore size were
successfully produced by SLS technology. The sintered 3D models showed
geometrical and dimensional features very close to the designed 3D model.
Additionally, this SLS process promoted the sintering of a hierarchical structure
with interconnected pores and intrinsic porosity, which are important factors for
cell adhesion and proliferation. Compression tests under dry and wet conditions
showed that the mechanical properties were higher than other sintered 3D
66
scaffolds containing PHB. The release of the labeled OGP peptide from the
PHB scaffolds occurred in a controlled manner, which indicates that these
printed 3D scaffolds via SLS process are potential structures for drug delivery.
Based on in vitro results, fabrication of PHB scaffolds by SLS technology is
successful in allow RBMSC growth and proliferation, observed by SEM and
alamarBlue tests. However, the incorporation of OGP and OGP(10-14) does not
seem to influence the cellular adhesion and proliferation stages.
Acknowledgements
This work was supported by grants from the Brazilian agencies FAPESP
(scholarship, process number: 2011/07947-8) and CNPq (grant no.
550414/2012-6). The authors would like to thank Prof. Dr. Reinaldo Marchetto
(Institute of Chemistry - UNESP, Brazil) by supplying of OGP-5,6-
carboxyfluorescein (OGP-CF) peptide; and the LMA-IQ for FEG-SEM facilities.
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72
Caracterização e avaliação in vitro de matrizes tridimensionais a base de poli (3-hidroxibutirato) produzidas por sinterização seletiva a laser, associadas à fibroína da seda, apatitas e peptídeo de crescimento osteogênico Sybele Saska*, Luana C. Pires*, Larissa S. Mendes, Silva H. Santagneli, Marcelo F. de
Oliveira, Izaque A. Maia, Jorge Vicente L. da Silva, Carlos Rossa Jr, Sidney J. L.
Ribeiro, Joni A. Cirelli
* Estas duas autoras contribuíram igualmente para este artigo.
Resumo O objetivo deste estudo foi desenvolver scaffolds produzidos por
sinterização seletiva a laser (SLS) a base de poli(hidroxibutirato) (PHB),
funcionalizá-los pós-processamento com fibroína (FB), apatita (HA) e peptídeo
osteogênico (OGP), e caracterizá-los físico-química e biologicamente. O
processo SLS permitiu desenvolver scaffolds de PHB com uma arquitetura
porosa com poros interconectados e de tamanho controlado. Os scaffolds
funcionalizados apresentaram-se mais hidrofílicos em relação ao PHB. As
propriedades térmicas do PHB não se alteraram durante o processo de
impressão por SLS e nem pela incorporação de fibroína ao scaffold de PHB.
No entanto, a incorporação de apatita reduziu a temperatura de decomposição
do PHB. As fases de apatita precipitadas nos scaffolds foram DCPD, OCP e β-
TCP. Além disso, os scaffolds PHB/(FB-HA) mostraram-se ser mais bioativos
em relação às outras amostras, PHB e PHB/FB. Os valores mensurados para
resistência à compressão para os scaffolds PHB, PHB/FB e PHB/(FB-HA)
foram 0,73±0,05; 0,86±0,03; e 0,66±0,06 MPa, respectivamente.O perfil de
liberação do peptídeo OGP dos respectivos scaffolds, PHB, PHB/FB e
PHB/(FB-HA) foi de modo controlado e permitiu uma liberação acima de 24 h.
Nos ensaios in vitro observou-se uma boa proliferação celular sobre os
diferentes scaffolds, sem diferença entre os grupos, com uma diferenciação
morfológica aparentemente mais avançada para os scaffolds de PHB e
PHB/FB-OGP. A adição de apatitas aos scaffolds aumentou o acúmulo de
cálcio na superfície dos scaffolds, principalmente em 3 dias (p<0,05). Os
resultados mostraram que os scaffolds de PHB associado ou não à fibroína e
apatitas tem um potencial para aplicação em regeneração óssea. Porém,
73
outros ensaios in vitro são necessários para avaliar, confirmar e melhor
entender os scaffolds de PHB e suas modificações.
Palavras-chave: manufatura aditiva, scaffold, polímero, peptídeo, regeneração
óssea
1 Introdução
Na regeneração tecidual óssea, as matrizes tridimensionais (scaffolds)
são utilizadas para ancorar a adesão, proliferação e diferenciação celular,
proporcionando a formação do tecido. Durante a fabricação dos scaffolds a
escolha da matéria-prima e o tipo de processamento são de suma importância
para o resultado esperado. O scaffold deve não somente servir de guia para a
formação óssea, mas também mimetizar ao máximo a matriz extracelular do
tecido a ser reconstruído39. Tendo isso em foco, a busca em desenvolver
materiais com resistência mecânica apropriada e superfície química específica
que se aproxime da matriz extracelular, inclusive tridimensionalmente, tem sido
o foco de muitas pesquisas em regeneração óssea8.
O processo de manufatura aditiva, também conhecido como impressão
tridimensional (3D) tem recebido destaque na confecção dos scaffolds. Esta
tecnologia permite a reprodução de modelos virtuais com alta complexidade
geométrica e arquitetura bem definida para a forma física ou modelo impresso.
Esta tecnologia permite a construção do modelo físico fatia-a-fatia a partir de
um modelo desenhado pelo sistema de desenho assistido por computador
(Computer-Aided Design - CAD) ou similar, o qual é “fatiado” em diversas
imagens, que são convertidas para a forma de arquivos STL (Standard
Template Library) e então, estes arquivos são carregados para a impressora
3D52.
Um dos sistemas mais utilizados para a impressão dos modelos 3D é o
de sinterização seletiva a laser (selective laser sintering - SLS). A tecnologia
SLS utiliza um laser de CO2 para sinterizar um material na forma de pó
transformando-o em uma forma física sólida. Dentre os materiais utilizados na
74
SLS estão polímeros, cerâmicas, metais e ligas. Além do controle de
reprodutibilidade das formas físicas, outra vantagem dos sistemas que utilizam
pó é o controle de porosidade e tamanho dos poros, essenciais na engenharia
de tecidos, incluindo a regeneração óssea8, 43, 52.
Dentre os polímeros de possível aplicação para impressão de scaffolds
está o PHB - poli(3-hidroxibutirato). O PHB é um poliéster natural encontrado
em muitas bactérias como recurso energético e é produzido em condições não
balanceadas de crescimento45. PHB é um polímero biocompatível e absorvível,
cujas propriedades biológicas o tornam cada vez mais atrativo para aplicações
biomédicas37. Em estudos prévios deste grupo de pesquisa53 e capítulo 1, a
utilização do PHB associado à técnica de impressão 3D por SLS para a
fabricação de scaffolds foi eficiente em reproduzir, com alta fidelidade, o
modelo virtual proposto. Além disso, proporcionou uma matriz com alta
porosidade e tamanho de poros controláveis, podendo ser aplicados para
regeneração óssea.
Na avaliação de respostas celulares aos scaffolds 3D de PHB
produzidos por SLS (capítulo 1), observou-se biocompatibilidade e boa
proliferação celular sobre os mesmos. Entretanto, no quesito resistência
mecânica, os scaffolds apresentaram baixa resistência à compressão (~0,73
MPa) tendo em vista a aplicação para regeneração óssea. Porém, resistência à
compressão mensurada foi superior quando comparado a outro trabalho na
literatura empregando poli(hidroxibutirato-co-valerato) (PHBV), cujo valor obtido
para scaffold de PHBV foi em torno de 0,19 MPa14.
Visando melhorar as propriedades mecânicas e biológicas desses
scaffolds, optou-se nesse estudo por incorporar fibroína da seda e apatita. A
fibroína (FB) extraída da seda possui propriedades desejáveis, como alta
resistência mecânica, biocompatibilidade com baixa resposta inflamatória e
imunogênica27, 29, 42. Sua estrutura única de conformação em folhas-β
(cristalina) confere elevada rigidez e resistência aos biomateriais, tornando-a
um biopolímero útil para aplicações em engenharia tecidual óssea2.
As apatitas (HA) são compostos minerais à base de cálcio e fosfato,
presentes nos tecidos minerais do corpo. A hidroxiapatita, Ca10(PO4)6(OH)2, é
um dos materiais capazes de formar uma ligação direta e forte entre os
biomateriais e o tecido ósseo61. A forma sintética da hidroxiapatita tem sido
75
amplamente investigada, devido à composição química semelhante à da matriz
mineral do osso. Os recobrimentos com hidroxiapatita, ou fases de
hidroxiapatitas não estequiométricas, são considerados bioativos, pois
promovem um contato direto osso-material com ausência de tecido conjuntivo
nesta interface, levando a uma adequada fixação biomecânica61.
Para que um scaffold mimetize a função da matriz extracelular na
regeneração tecidual óssea, é necessário ter em mente que, além de servir
como suporte para a mineralização, a matriz extracelular possui uma série de
fatores de crescimento que guiam o processo de formação óssea35, 64. Os
fatores de crescimento podem estimular atividades celulares como migração,
proliferação e diferenciação para reparar ou regenerar o tecido lesado35.
O peptídeo de crescimento osteogênico (osteogenic growth peptide -
OGP) vem atraindo interesse nas pesquisas por promover a neoformação
óssea. Esse peptídeo foi primeiramente isolado do sangue durante a
remodelação óssea e regeneração medular pós-ablação5. Estudos anteriores
demonstraram que o OGP estimulou em linhagem de células osteoblásticas
proliferação, diferenciação e um aumento na atividade da fosfatase alcalina e
na formação de nódulos minerais5, 11.
Portanto, o objetivo deste trabalho foi desenvolver e avaliar físico-
quimica e biologicamente scaffolds 3D de PHB produzidos por SLS e
modificados pós-processamento por fibroína da seda, apatita e peptídeo
osteogênico OGP.
2 Material e método 2.1 Materiais
O polímero poli(hidroxibutirato) (PHB) foi fornecido pela empresa PHB
Industrial S/A (Biocycle®, São Paulo, Brasil) na forma de pó com tamanho de
partículas na faixa de 10-100 μm, peso molecular de 600.000 Da e densidade
de 1,22 g.cm-3. Os peptídeos OGP e OGP(10-14) foram comprados da
empresa AminoTech© (São Paulo, Brasil). O peptídeo OGP-carboxifluoresceína
(OGP-CF) foi fornecido pelo laboratório da Unidade de Síntese, Estrutura e
76
Aplicações de Peptídeos e Proteínas do IQ-UNESP sob a responsabilidade do
Prof. Dr. Reinaldo Marchetto.
2.2 Design e fabricação dos scaffolds 3D Os scaffolds 3D foram produzidos pela tecnologia de impressão 3D
Selective Laser Sintering (SLS) empregando a máquina SinterStation 2000
(DTM Corporation) no Centro de Tecnologia da Informação – Renato Archer
(CTI, Campinas, SP). Primeiramente, os scaffolds 3D cilíndricos foram gerados
no programa SolidWorks® CAD 3D (Dassault Systèmes SolidWorks Corp., França). A partir destes modelos virtuais foram gerados os modelos físicos.
Assim, os modelos 3D virtuais tanto para os estudos in vitro quanto para os
ensaios de resistência à compressão foram desenhados nas dimensões: 1) 11
mm de diâmetro com 2 mm de altura; 2) 20 mm de diâmetro e 35 mm de altura,
respectivamente. O tamanho de hastes e de poros foi projetado com 700 µm,
cujas dimensões permitiram gerar uma estrutura porosa com poros
interconectados. No processo de fabricação dos scaffolds o pó de PHB foi
sinterizado empregando um laser de CO2. Os parâmetros do processo SLS
usados foram: potência do laser = 8 W; varredura do laser = 0,15 mm; ponto do
feixe do laser = 450 μm; velocidade do feixe do laser = 2000 mm/s; espessura
da camada = 0,18 mm; temperaturas do alimentador de matéria-prima a 50 °C
e do leito de construção a 100 °C.
2.3 Preparação dos scaffolds PHB-FB Primeiramente foi preparada uma solução de fibroína baseada em
metodologias previamente descritas por Rockwood et al.55 e Nogueira et al.50.
A fibroína foi extraída a partir de casulos de bicho-da-seda fornecidos pela
Fiação Bratac (Bastos, São Paulo). Para a sua extração, os casulos foram
cortados em pequenos pedaços. Estes foram então colocados em uma solução
de Na2CO3 a 0,02 mol.L-1. Após essa etapa,,a fibroína foi lavada em água
ultrapura por três vezes por 20 min cada lavagem. A proteína foi colocada em
uma folha de alumínio limpa e mantida por 12 h em estufa a 37 °C para
secagem55.
77
Para a solubilização das fibras de fibroína da seda foi adicionado a
solução ternária de CaCl2:CH3CH2OH:H2O. A suspensão obtida foi mantida a
80 °C, até a completa solubilização50. A fibroína solubilizada foi dialisada contra
água ultrapura a temperatura ambiente (25 ± 2 °C), para remoção do CaCl2.
Alíquotas da solução de FB foram colocadas em membranas de diálise
(Membrana de celulose 3000 Adrich – 25 mm) e deixadas em água ultrapura
sob agitação constante, com trocas de água periódicas. A solução resultante foi
centrifugada para remoção de impurezas55. Estes processos permitem a
produção de soluções de fibroína de seda em água a 4% (m/v), utilizada para a
funcionalização dos scaffolds de PHB.
O revestimento das estruturas 3D com FB foi realizado por meio de
imersão destes scaffolds 3D em solução de fibroína a 4%, a 10 °C, por 72 h.
Após a incorporação de FB aos scaffolds, as amostras foram secas a 37 °C por
24 h.
2.4 Preparação dos scaffolds PHB/(FB-HA) A hidroxiapatita (HA) foi incorporada in situ ao scaffolds PHB-FB
segundo a metodologia previamente descrita por Saska et al.59. Os scaffolds de
PHB-FB foram imersos primeiramente em solução de CaCl2 0,05 mol.L-1, e
depois em solução de Na2HPO4 0,1 mol.L-1 a temperatura ambiente por 24 h
cada imersão. Após o fim da incorporação, as amostras foram retiradas da
solução e secas a 37 °C por 24 h.
2.5 Incorporação dos peptídeos OGP e OGP-CF aos scaffolds Para a avaliação da liberação do peptídeo OGP, este peptídeo foi
marcada com 5,6 carboxifluoresceína (OGP-CF) de acordo com metodologia
prévia descrita por Saska et al.60 2012. A incorporação dos peptídeos OGP e
OGP-CF aos scaffolds foi realizada por adsorção. Portanto, a concentração de
OGP-CF incorporado aos scaffolds 3D foi de 10-5 mol.L-1, cuja concentração é
suficiente para realizar as medidas de liberação do respectivo peptídeo44, 60.
A partir do perfil de liberação do OGP-CF foi determinado para o
peptídeo OGP a concentração ideal de 10-5 mol.L-1 a ser incorporada aos
scaffolds. Uma vez que, estudos prévios na literatura demonstraram que
concentrações maiores que 10-14 mol.L-1 acentuaram a proliferação celular, e
78
que a concentração de 10-9 mol.L-1 promoveu uma melhor atividade da
fosfatase alcalina e maior formação e mineralização de nódulos de osso
neoformado5, 63, a concentração de 10-9 mol.L-1 foi utilizada para adsorção nos
scaffolds.
As soluções peptídicas foram preparadas em solução aquosa contendo
10 % (v/v) de etanol absoluto (Synthes, Brasil), nas respectivas concentrações
de 10-9 mol.L-1 e 10-5 mol.L-1 para os peptídeos OGP e OGP-CF. A
incorporação dos peptídeos por adsorção, tanto OGP quanto OGP-CF, foi
realizada colocando cada amostra, PHB, PHB/FB e PHB/(FB-HA), imersa em 2
mL da solução peptídica por 72 h, a 10 °C. Após a incorporação, as amostras
foram secas a 37 °C por 24 h. As amostras contendo OGP-CF foram somente
utilizadas para estudo da liberação controlada.
Todos os scaffolds produzidos para os ensaios in vitro foram
acondicionados em envelopes apropriados, e encaminhados para serem
esterilizados com radiação gama a 20 kGy pela Embrarad (Cotia, Brasil).
2.6 Caracterização dos scaffolds Os materiais impressos e funcionalizados com fibroína e pelo compósito
FB-HA, foram caracterizados por microscopia eletrônica de varredura (MEV),
análise termogravimétrica (TGA), calorimetria exploratória diferencial (DSC),
ressonância magnética nuclear (RMN) no estado sólido do 31P, e resistência
mecânica à compressão. Adicionalmente, a determinação da taxa de
intumescimento, de porosidade e da bioatividade desses respectivos scaffolds
foram avaliadas. A bioatividade foi caracterizada por MEV e TGA.
2.6.1 Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) As micrografias das amostras foram realizadas para a análise
morfológica de superfície e verificação da estrutura fina dos scaffolds. As
amostras foram recobertas por uma camada de ouro de espessura de 6 nm. As
micrografias foram obtidas em um microscópio eletrônico da marca FEI,
modelo Magellan 400L (Laboratório de Caracterização Estrutural da
79
Universidade Federal de São Carlos, SP). O tamanho das partículas de apatita
precipitada na amostra PHB/(FB-HA) foi mensurado pelo programa ImageJ
1.48v.
2.6.2 Análise termogravimétrica (TGA) As curvas de TGA foram obtidas utilizando-se um equipamento TA-
Instruments usando uma célula SDT. As amostras foram aquecidas em cadinho
de alumina de 25 °C a 600 °C sob atmosfera de nitrogênio com fluxo contínuo
de 70 mL.min-1 com razão de aquecimento de 10 °C.min-1.
2.6.3 Calorimetria exploratória diferencial (DSC) As curvas DSC das amostras foram obtidas utilizando-se um DSC
modelo Q100 TA Instruments. As medidas foram realizadas em recipientes de
alumínio herméticos, sob as seguintes condições: atmosfera de nitrogênio com
fluxo contínuo de 50 mL.min-1 e razão de aquecimento de 10 °C.min-1. Foram
realizadas 2 medidas para cada amostra separadamente. Uma medida com
aquecimento de um ciclo a partir de -10 a 350 °C, e outra de dois ciclos de
aquecimento, no qual as amostras foram primeiramente aquecidas a partir de -
10 °C a 190 °C e em seguida resfriadas à temperatura ambiente e
imediatamente aquecidas a 190 °C. Como referência utilizou-se recipientes de
alumínio vazios. Os valores do grau de cristalinidade das amostras foram
calculados utilizando a equação 1, onde ΔHf é a entalpia de fusão da amostra e
ΔHf0 é a entalpia de fusão do PHB 100% cristalino (∆Hf
0 PHB = 146,0 J/g)56.
(1)
2.6.4 Espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN) no estado sólido do núcleo 31P
Esta técnica foi empregada para elucidar a composição da fase
inorgânica do compósito obtido FB-HA nos scaffolds de PHB. Para esta
análise, foi utilizado a técnica MAS (rotação em torno do ângulo mágico) para o
monitoramento da formação e/ou interação das fases de HA nas amostras FB-
HA. Todas as medidas foram realizadas em temperatura ambiente no
80
espectrômetro de 500 MHz, Varian Unity INOVA. Para a realização das
medidas foi utilizado uma sonda de 4 mm MAS e para a deconvolução dos
espectros obtidos foi utilizado o programa DMFIT41.
2.6.5 Ensaio mecânico de resistência à compressão As propriedades mecânicas de limite de resistência à compressão e
módulo de elasticidade foram realizadas em uma máquina universal de ensaios
mecânicos modelo Instron 5569 (Laboratório de Ensaios Mecânicos do CCDM – DEMa/UFSCar) utilizando uma célula de carga de 500 N e uma velocidade
constante de 0,5 mm.min-1. Os testes foram realizados com os scaffolds de
PHB, PHB/FB e PHB/(FB-HA). Os corpos de prova e os testes mecânicos
foram feitos segundo as normas da ASTM D1621:10 e F2150:07. Três
amostras de cada tipo de scaffold (n = 03) foram utilizadas para os ensaios
mecânicos.
A resistência à compressão ou tensão à compressão (σc) foi calculada
de acordo com a equação (2). Em que: F = força máxima de carregamento
aplicada (Newton); e A= área da secção transversal do corpo de prova antes
do ensaio (mm2).
(2)
A resistência mecânica foi mensurada antes e após a imersão das
amostras em solução SBF (simulated body fluid: solução de Kokubo)32, por 30
min, a temperatura ambiente, para simular a resistência à compressão das
mesmas nas condições após implantação cirúrgica. Decorrido os 30 min, o
excesso de SBF foi rapidamente removido e as amostras colocadas nos
dispositivos acoplados à máquina de ensaios.
2.6.6 Taxa de intumescimento As amostras PHB, PHB/FB e PHB/(FB-HA) foram imersas e removidos
em tempos determinados, inicialmente 30 e 60 min, seguida de medidas a cada
60 min até totalizarem 8 h, e depois medidas foram realizadas após 24 h da
medida inicial. O excesso de água superficial foi rapidamente removido e em
seguida os scaffolds foram pesados. O teste foi realizado em triplicata e o
81
conteúdo de água nos scaffolds intumescidos foi calculado pela equação 3,
onde Ms é o peso da amostra seca e Mi é o peso da amostra intumescida.
(3)
2.6.7 Determinação da porcentagem de porosidade
A porosidade dos scaffolds foi determinada usando um aparato de
mensurar densidade e uma balança eletrônica baseado no Princípio de Arquimedes26. Nesta análise foi usados scaffolds com as dimensões de 11 mm
de diâmetro e 2 mm de espessura. Inicialmente foi aferido o valor da massa do
scaffold seco (m) e calculado seu volume. Posteriormente, o scaffold foi imerso
água por 30 min a temperatura ambiente para que todos os poros fossem
preenchidos com água. A equação (4) usada para calcular a porosidade (Φ)
está mostrada abaixo:
Φ
(4)
onde ρap e ρr são referentes a densidade aparente e a densidade real
do scaffold, respectivamente. Os valores de ρap e ρr foram calculados usando
as equações (5 e 6) após pesar os scaffolds em ar, imersos em água e
intumescidos, respectivamente.
(5)
(6)
onde ms , mim e mi são referentes ao peso dos scaffolds mensurados
secos, imersos em água e intumescidos, respectivamente. ρH2O é a densidade
da água na temperatura da hora do teste. O teste foi realizado em triplicata.
82
A porosidade do modelo virtual foi calculado obtendo o valor do volume
total (Vtot) e do volume real (Vr) pelo programa Magics®18.2, equação 7.
Φ (7)
2.6.8 Avaliação da bioatividade in vitro
A bioatividade das amostras PHB, PHB/FB e PHB/(FB-HA) foi avaliada
por meio da imersão dos scaffolds (11 mm x 2 mm) em solução de SBF a 37 °C
por 7, 14, 21 e 28 dias, onde a razão área de superfície/volume foi 0,1 cm-1 25, 33
e a solução foi renovada a cada 24 h. Após esses períodos, as amostras foram
secas a temperatura ambiente. A superfície das amostras foi analisada por
MEV e TGA.
2.7 Determinação da liberação do peptídeo OGP A mensuração da concentração liberada de peptídeo OGP-CF dos
scaffolds foi realizada por espectroscopia de fluorescência. Para análise de
liberação controlada, cada amostra dos grupos PHB-OGP-CF, PHB/FB-OGP-
CF e PHB/(FB-HA)-OGP-CF, foi imersa em solução de SBF (SBF – simulated body fluid, pH 7,4)32 a 37 °C sob agitação, usando um aparato de dissolução
modificado. As aquisições dos dados da concentração de peptídeo liberada
foram realizadas em um espectrofotômetro de fluorescência (Varian Cary Eclipse - Analysis Package Software). Os comprimentos de onda de excitação
e de emissão utilizados foram de 492 e 520 nm, respectivamente. O tempo de
aquisição dos dados foi até 72 h. As medidas foram realizadas em triplicata.
2.8 Estudo in vitro Para a análise in vitro foram utilizadas células primárias mesenquimais
de ossos longos de ratos (Rat bone marrow stem cell - RBMSC), obtidas
através da técnica de extração do conteúdo interno da medula óssea de ossos
longos, tíbia e fêmur bilateral, seguindo uma adaptação da técnica descrita em
Maniatopoulos 1988 (15) (Processo CEUA - FOAr - UNESP nº 32/2014). Foram
83
utilizados ratos Rattus Norvegicus Holtzman, de 15 a 21 dias, com peso inicial
de aproximadamente 50 gramas.
As células utilizadas nos experimentos, até a terceira passagem, foram
plaqueadas em uma concentração de 2×105 sobre os scaffolds. O cultivo foi
feito em α-MEM com 10% de soro fetal bovino (FBS), 100 U.mL-1 de penicilina
e 100 µg.mL-1 de estreptomicina (P/S), suplementado com 50 µg.mL-1 de
ácido ascórbico e 10 mmol.L-1 de β-glicerofosfato, para estímulo da
diferenciação osteoblástica, em placas para cultura de células de 24 poços, a
37°C, em atmosfera umidificada contendo 5% de CO2 e 95% de ar atmosférico.
O meio de cultura foi trocado a cada 3 dias.
2.8.1 Morfologia celular - Microscopia eletrônica de varredura (MEV) Aos 3 dias, a morfologia das células cultivadas sobre os scaffolds foi
avaliada por MEV. Após o período experimental as células foram fixadas,
lavadas em PBS (phosphate-buffered saline) e desidratadas em concentrações
crescentes de álcool etílico. Após secagem em dissecador a vácuo as
amostras foram divididas ao meio e receberam deposição de uma camada de 6
nm de ouro. As imagens foram obtidas das observações transversais em um
microscópio Inspec 350 (FEI, EUA) e uma análise descritiva foi realizada,
segundo a classificação dos estágios de adesão e proliferação proposto por
Rajamaram54. Cinco fotos por espécime foram utilizados para análise.
2.8.2 Proliferação celular - alamarBlue
A proliferação foi avaliada após 3, 9, 15, 18 e 21 dias de incubação
utilizando o teste alamarBlue (Molecular Probes, EUA). Neste ensaio, uma
reação de redução ocorre nas mitocôndrias celulares, cuja reação consiste na
redução do reagente resazurina (de coloração azul) em resofurina (de
coloração rósea). Os scaffolds foram incubados em uma placa de 24 poços,
contento 1 mL da solução de trabalho do alamarBlue (α-MEM com 10% de
FBS, 1% de P/S e 10% de alamarBlue). A solução de trabalho sem células foi
utilizada como controle negativo. Após o tempo de incubação de 4 h, alíquotas
de 150 µL foram coletadas de cada amostra e transferidas para uma placa de
96 poços e lidas em um espectrofotômetro utilizando comprimentos de onda de
84
570 e 600 nm. O número de células viáveis está relacionado ao nível de
redução de corante, o qual foi expresso em percentual de redução do
alamarBlue comparado ao controle negativo, de acordo com o protocolo do
fabricante.
2.8.3 Quantificação de cálcio
Para avaliação indireta do processo de mineralização in vitro, foi
utilizado o teste de quantificação do cálcio presente no sobrenadante da cultura
com o uso do kit Cálcio (Labtest Diagnóstica, Brasil), segundo orientação do
fabricante, nos períodos de 3, 9, 15 e 18 dias. Foram utilizados como controle
positivo células plaqueadas no plástico e, como controles negativos, o meio de
cultura com os diferentes scaffolds, porém sem células, para cada grupo, e
somente o meio de cultura, para o controle positivo. Os sobrenadantes
coletados durante o experimento foram armazenados e posteriormente a
mensuração do cálcio foi realizada com o kit, segundo orientação do fabricante.
Para essa análise interpretou-se que quanto menor a quantidade de cálcio
presente no meio de cultura maior a precipitação do mesmo sobre as amostras.
Os dados foram apresentados normalizados com os valores dos controles
negativos de cada grupo.
2.9 Análise estatística A análise estatística dos dados mensurados foi realizada empregando o
programa GraphPad Prism v.5. Para análise de dados com três ou mais grupos
foi utilizado o teste não paramétrico Kruskall-Wallis com pós-teste de Dunn.
Para dados provenientes de dois grupos foi utilizado o teste não paramétrico
Mann-Whitney. O nível de significância adotado foi de 5%.
85
3 Resultado e Discussão
3.1 Caracterizações dos scaffolds As tecnologias de manufatura aditiva que processam pó, como a SLS,
possuem uma vantagem intrínseca em relação às demais tecnologias de
manufatura aditiva na confecção de scaffolds que é a porosidade (Figura 1).
Entretanto, as peças produzidas por essas técnicas podem apresentar uma
menor resistência mecânica em relação às outras técnicas, como “Fused Deposition Modeling” (FDM), “stereolitrography” (SL) and “Three-dimensional Printing” (3DP)52, 70. Por esse motivo, busca-se desenvolver novas técnicas de
pós-processos para impressão 3D no intuito de melhorar tanto as propriedades
mecânicas quanto as propriedades biológicas dos modelos impressos
tridimensionalmente.
Figura 1 - A: Modelo 3D virtual dos corpos de prova dos respectivos scaffolds;
B: Scaffold de PHB produzido por SLS.
As micrografias de MEV referente à superfície dos scaffolds de PHB e
PHB/FB estão demonstradas na Figura 2. As micrografias de MEV da
superfície destes scaffolds revelaram que a fibroína recobre as partículas de
PHB e penetra nos poros intrínsecos do scaffolds preenchendo os, e
consequentemente diminuindo esta porosidade intrínseca, característica do
scaffold de PHB (Figura 2B). A presença de partículas intactas aderidas à
estrutura foi observada. Isto pode ser explicado pela interação destas
partículas à estrutura devido à pequena fusão promovida pelo calor gerado
durante o processo SLS14.
20 m
m
Poros: 700µmHaste: 700µm
A B
86
A formação do compósito de FB-HA no scaffold de PHB estão
demonstradas nas Figuras 2C e 2D. As micrografias de MEV desta amostra
revelaram cristais de HA recobrindo o filme de FB e grânulos de PHB de forma
heterogênea de ordem submicrométrica. Típicos cristais de apatita foram
observados de forma aglomerados. Estes aglomerados são compostos de
cristalitos de HA com morfologia tipo agulha ou globular, com tamanho médio
dos cristalitos de 202 nm ± 0,03 e 120 nm ± 0,04, respectivamente (Figura 2D).
Essa morfologia pode ser considerada característica da fase fosfato de
octacálcio (OCP) ou de fosfato de cálcio amorfo (ACP) ou carbonato-apatita22,
24, 49. Porém, nas respectivas amostras os cristais aparecem de forma mais
arredondada do que um cristal de OCP puro. Estes aspectos morfológicos
podem indicar que estes cristais de apatita estão fornecendo sítios para uma
nucleação secundária de formação de apatita adicional, formando assim
partículas interconectadas24.
Figura 2 - Micrografias de MEV de superfície dos scaffolds PHB, PHB/FB e
PHB/(FB-HA). A: scaffold de PHB; B: scaffold de PHB/FB e C-D: scaffold de
PHB/(FB-HA).
A B
C D
87
A substituição dos íons PO43- por íons CO3
2- no processo de deposição
resulta na diminuição do tamanho do cristal e também altera a morfologia do
cristal, de forma de agulha para “rods”. Nesta amostra PHB/(FB-HA) a
morfologia dos cristais observados correspondem tanto para um OCP quanto
para uma carbonato-apatita22, 24, 49.
Estudos prévios têm constatado que grupos funcionais, tais como,
hidroxilas, fosfatos e carboxílicos propiciam a nucleação de fases de apatitas21,
49, 72. Materiais com repetitivos padrões de grupos aniônicos e concentrados
catiônicos promovem a orientação de nucleação de cristais in vivo21. Desta
forma, a estrutura molecular da fibroína e do PHB pode ter contribuído para
deposição dos cristais de apatita. Os grupos hidroxilas promovem a ligação dos
cátions Ca2+ livres da solução de CaCl2, formando ligações coordenadas, e
assim os íons PO43- ligam-se ao cálcio formando o núcleo inicial para formar as
fases precursoras de apatita23, 24. Desta forma, observou-se que a composição
da superfície e estrutura dos scaffolds afetam diretamente o processo de
formação da apatita. Além disso, observou-se que a maioria dos cristais
formados pode ser a fase OCP ou sua fase precursora.
A Figura 3 mostra as curvas das análises termogravimétricas para as
PHB, PHB/FB e PHB/(FB-HA). Os valores de temperatura de decomposição
(Tonset) dos scaffolds PHB, PHB/FB e PHB/(FB-HA) foram 279, 279 e 234 °C,
respectivamente. As curvas TGA para as amostras de PHB em pó ou scaffold
sinterizado também revelaram apenas uma perda de massa, iniciando em torno
de 245 °C até 315 °C, Tonset em 279 °C. A porcentagem de massa residual
observada para as amostras foram 1 e 4%, respectivamente.
As curvas TGA para as amostras de PHB, PHB/FB e PHB/(FB-HA)
(Figura 3) mostram dois eventos de perda de massa. O primeiro evento
observado para as respectivas amostras PHB e PHB/FB ocorre entre 25 a 220
°C, devido a uma pequena perda de massa, em torno de 2%, relacionada à
perda de água superficial. Para a amostra PHB/(FB-HA) este primeiro evento
ocorre na faixa entre 25 a 175 °C, relacionado a uma perda de massa em torno
de 4%. O segundo evento de perda de massa para a amostra PHB/FB é
observado iniciando em torno de 245 °C até 315 °C, Tonset em 279 °C, perfil
similar ao do scaffold de PHB, ou seja, a incorporação de fibroína não alterou a
estabilidade térmica do scaffold de PHB. O conteúdo de massa residual
88
observada para as amostras de PHB e PHB/FB foi de 4 e 9%, respectivamente,
sugerindo que em torno de 5% de FB foi incorporada ao scaffold. Contudo, a
amostra PHB/(FB-HA) apresentou uma diminuição na estabilidade térmica
após a precipitação da fase inorgânica ao scaffold PHB/FB. A temperatura
Tonset mensurada foi de 234 °C, cujo segundo evento de perda de massa
observado para esta amostra foi na faixa de 190 a 265 °C.
Figura 3 - Curvas termogravimétricas para os scaffolds PHB e PHB/FB. A:
Comparação das curvas TGA para o PHB em pó e para o scaffold de PHB; B:
scaffolds PHB, PHB/FB e PHB/(FB-HA).
100 200 300 400 500 600
0
20
40
60
80
100
Per
da d
e m
assa
(%)
Temperatura (°C)
___ PHB em pó___ Scaffold de PHB
A
90 180 270 360 450 5400
20
40
60
80
100
Per
da d
e m
assa
(%)
Temperatura (oC)
___PHB___PHB/FB___PHB/(FB-HA)
B
A estabilidade térmica é um fator importante a ser investigado para o
processo de fabricação de scaffolds poliméricos e bioabsorvíveis,
principalmente para os processos de manufatura aditiva que empregam
elevadas temperaturas no processo de fabricação das peças 3D. Além disso,
89
outro fator importante é devido aos estudos de degradação e de cultura de
células que empregam uma temperatura constante aproximadamente 37 °C por
longos períodos. No entanto, durante o processamento ou manipulação do
material a quente, a degradação térmica pode gerar moléculas menores, bem
como produtos e subprodutos de degradação que podem interferir na
composição química do material e alterar a sua citotoxicidade e
biocompatibilidade6.
As curvas de DSC para as amostras PHB, PHB/FB, PHB/(FB-HA) estão
apresentadas na Figura 6. Estas curvas revelaram 2 eventos endotérmicos, os
quais se referem ao de ponto de fusão e à decomposição do polímero (Figura
4). O primeiro evento relacionado ao ponto de fusão ocorre em torno de 173
°C para as 3 amostras. O segundo evento endotérmico relacionado à
decomposição polimérica ocorre em 296, 292 e 257 °C, respectivamente para
as amostras de PHB, PHB/FB e PHB/(FB-HA). A incorporação de fibroína e
fase inorgânica ao scaffold de PHB não altera o seu ponto de fusão, porém
diminui ligeiramente a temperatura de decomposição do polímero para a
amostra PHB/FB e reduz acentuadamente para a amostra PHB/(FB-HA). A
Tabela 1 resume as propriedades térmicas e o grau de cristalinidade obtidos
destas amostras.
Figura 4 - Curvas de DSC para os scaffolds PHB, PHB/FB e PHB/(FB-HA).
0 50 100 150 200 250 300 350
-14
-12
-10
-8
-6
-4
-2
0
2
Flux
o de
cal
or (m
W/m
g)
Temperatura (°C)
___PHB___PHB/FB___PHB/(FB-HA)
endo
90
Os resultados mostram que não houve uma variação significativa nas
temperaturas de transições bem como no grau de cristalinidade entre o PHB
em pó e o scaffold de PHB impresso. Estes resultados sugerem que o PHB não
degrada durante o processo de impressão por SLS, cujos resultados obtidos
corroboram com os dados da literatura53.
Tabela 1 - Propriedades térmicas e grau de cristalinidade das amostras PHB
em pó e dos scaffolds de PHB, PHB/FB e PHB/(FB-HA).
Propriedades térmicas e grau de cristalinidade
PHB pó PHB PHB/FB PHB/
(FB-HA) Ponto de fusão, °C (Tf) 176.4 173.9 173.5 173.1
Temperatura de cristalização, °C (Tc) 116.6 111.9 104.4 97.2
Entalpia de fusão, J/g (ΔHf) 64.7 66.5 47.1 53.3
Grau de cristalinidade, % (Xc) 44.35 45.6 32.3 36.5
No entanto, estes resultados confirmam que a incorporação da apatita
ao PHB/FB altera a estabilidade térmica do PHB diminuindo a temperatura de
decomposição, como visto na curva TGA. Este comportamento pode estar
associado com a quebra de ligações de hidrogênio intermoleculares e com a
redução da cristalinidade do PHB pela incorporação da fibroína associada à
precipitação da apatita como observado na Tabela 1. Adicionalmente, a
incorporação de fibroína e apatita também promovem a redução da
temperatura de cristalização do PHB, cuja redução pode estar sendo afetada
pelo rompimento de forças intermoleculares10.
De acordo com a literatura, geralmente a estabilidade térmica é
aumentada com a adição de uma fase mineral à fase orgânica, e esse
comportamento pode ser analisado em função da temperatura de
decomposição, a qual caracteriza a estabilidade térmica dos materiais66. No
entanto, para amostra contendo apatita foi observado um efeito inverso, devido
a uma diminuição na cristalinidade da amostra e consequentemente uma
diminuição nos valores da temperatura de decomposição19.
91
Os dados de RMN-MAS do 31P do compósito PHB/(FB-HA) elucidaram
os tipos de fases de apatita foi precipitado no respectivo compósito. A Figura 5
mostra o espectro de RMN-MAS do 31P obtido para a amostra PHB/(FB-HA), o
qual se observou a presença de dois picos largos assimétricos indicando a
formação de mais de uma fase cristalina e com baixa cristalinidade e com
deposição da fase inorgânica de forma heterogênea como observado na MEV.
A partir dos dados obtidos da deconvolução observamos a presença de quatro
(4) sítios de fósforo, os quais são categorizados dentro de dois grupos PO43- e
HPO42- 67.
O primeiro sítio, centrado em 1,27 ppm (14,86%) pode ser atribuído a
fase fosfato de dicálcio dihidratado (DCPD-brushita)36, o segundo sítio em 3,63
ppm (12,03%) pode ser atribuído aos grupos fosfato do fosfato de octacálcio
(OCP), pois um OCP impuro ou amorfo revela um sinal em 3,4±0,3 ppm57.
Adicionalmente, o pico observado em 7,27 ppm (42,82%) também pode ser
atribuído a fase de OCP, devido ao tempo de contato usado em 1ms pode
promover um deslocamento químico desta fase nesta região57.
Figura 5 - Espectro do 31P-MAS da amostra PHB/(FB-HA), obtido @14kHz.
12 10 8 6 4 2 0 -2 -4
G (31P)/ppm
Os cristais de fosfato de cálcio presentes tanto no OCP quanto na
brushita são semelhantes estruturalmente, e há especulações que a formação
de uma mistura intra-cristalina de OCP e brushita pode ocorrer pela
1.26
3.63
5.22 7,27
92
precipitação direta ou pela hidrólise do OCP. As reações de hidrólises dos íons
PO43- e HPO4
2- são o ponto chave para reação química da fase OCP para
HA67.
Além disso, a presença de fibroína pode favorecer a transformação de
OCP em HA, ou então, pode mudar a cinética da reação e ocorrer o processo
de precipitação de fase OCP pela presença de aminoácidos aniônicos68. Outras
hipóteses estudadas, na literatura, são que tanto resíduos de aminoácidos
ácidos quanto básicos são igualmente importantes na interação com os
componentes catiônicos ou aniônicos, respectivamente, da fase inorgânica do
tecido ósseo18. Essas hipóteses podem justificar a presença de OCP neste
compósito.
O pico observado em 5,22 ppm (30,29%) pode ser atribuído a fase β-
fosfato de tricálcio (β-TCP), de acordo com dados da literatura espectros de
RMN-MAS de 31P para β-TCP contêm múltiplos picos numa faixa de 0 a 6 ppm,
revelando um pico característico em 4,8 ppm36, 51, 69.
Estes resultados podem confirmar as hipóteses estudadas previamente
que mostraram que o OCP é a fase precursora tanto de apatita biológica
quanto de hidroxipatitas (HA) sintéticas4, 7, 9. Esta transição de fases se dá
primeiro pela precipitação de fosfato de cálcio amorfo (ACP) e posteriormente
se transforma em OCP, cuja fase é subsequentemente hidrolisada em apatita.
As fases de ACP também podem servir como intermediárias durante o
envelhecimento do fosfato de cálcio precipitado em temperatura ambiente,
levando a formação de nanocristais de β-TCP ou correspondente do OCP
amorfo13.
Os resultados de resistência à compressão e módulo de elasticidade dos
scaffolds PHB, PHB/FB e PHB/(FB-HA) estão representados na Tabela 2. Os
valores mensurados para estes scaffolds foram 0,73±0,05, 0,86±0,03 e
0,66±0,06 MPa, respectivamente, antes da imersão em solução de SBF. Estes
resultados mostram que incorporação da fibroína ao scaffold de PHB, formando
o compósito PHB/FB foi eficiente, promovendo um aumento de 18% da
resistência à compressão em relação ao scaffold de PHB somente e aumento
consideravelmente o módulo de elasticidade (Tabela 2). Adicionalmente, a
incorporação de apatita ao scaffold PHB/FB promoveu uma redução na
resistência à compressão de 23% em relação a esta mesma amostra sem
93
precipitação de apatita e, de 10% comparando ao scaffold PHB. Esta
diminuição da resistência mecânica era esperada, visto que a incorporação de
biocerâmica aos polímeros promove uma diminuição da resistência mecânica,
devido a estas fases inorgânicas apresentarem baixo módulo de elasticidade12,
38.
No entanto, quando estas amostras foram imersas em solução de SBF,
todas apresentaram uma redução na resistência à compressão, minimizando
as diferenças entre as mesmas. Porém, é importante salientar que todos os
valores mensurados tanto para tensão à compressão quanto para o módulo de
elasticidade para corpos de prova, PHB, PHB/FB e PHB/(FB-HA), antes e após
imersão não apresentaram diferença estatisticamente significante entre eles,
pelos testes estatísticos realizados (p>0,05) (Tabela 2).
Tabela 2 - Valores mensurados para tensão à compressão e módulo de
elasticidade para as amostras PHB, PHB/FB e PHB/(FB-HA) antes e após
imersão em solução de SBF.
Tensão à
compressão (MPa)
Módulo de Elasticidade
(MPa)
PHB 0,73±0,05 4,98±0,37
PHBim 0,51±0,01 3,50±0,11
PHB/FB 0,86±0,03 7,74±0,59
PHB/FBim 0,42±0,04 3,87±0,25
PHB(FB-HA) 0,66±0,06 7,13±0,85
PHB(FB-HA)im 0,44±0,03 3,96±0,21 im: após imersão em SBF por 30 min. Sem diferenças estatísticas (p<0,05).
Comparações inter grupos: Kruskal-Wallis com pós-teste Dunn; Comparações intra-
grupos; Mann-Whitey.
Apesar dos resultados obtidos para resistência à compressão serem
muito aquém quando comparados ao osso trabecular humano (~10 MPa)40,
esses valores foram superiores quando comparado aos dados da literatura em
relação a outros tipos de scaffolds impressos pela técnica SLS. Duan et al.14
em 2011, desenvolveram scaffolds de Ca-P/PHBV e de PHBV por meio da
técnica SLS com modelos de dimensões de 1 mm de tamanho de poros e de
94
0,5 mm de haste, onde obtiveram valores para resistência a compressão
0,24±0,02 e 0,19±0,02 MPa, respectivamente.
Os valores de resistência à compressão dos scaffolds confeccionados
pela técnica SLS são influenciados pela geometria do modelo 3D, ou seja,
espessura de haste, tamanho dos poros e porcentagem de porosidade
intrínseca (arquitetura/estrutura do scaffold). Desta forma, observa-se que a
forma do modelo gerado para os corpos de prova, espessura de haste e
tamanho dos poros de 0,7 mm, deste estudo permitiu desenvolver scaffolds
com uma resistência mecânica superior comparada com dados da literatura, os
quais desenvolveram scaffolds com haste menos espessas de 0,5 mm e com
os poros maiores de 0,8 mm a 1 mm14, 17.
As dimensões dos scaffolds deste estudo basearam-se na limitação da
técnica por SLS. Esta técnica tem limites para aumentar o tamanho da haste e
reduzir o tamanho dos poros, pois esta relação haste/poros influencia
diretamente na formação de somente porosidade intrínseca, sem poros
maiores interconectados nos scaffolds. Além disso, o tamanho do poro deve
ser suficiente para promover a migração de células osteoblásticas, neste caso,
no mínimo de 300 µm26.
Desta forma, os scaffolds sinterizados neste estudo, com as respectivas
propriedades mecânicas poderão ser potencialmente usados para regeneração
de osso cortical e esponjoso em áreas com baixa incidência de carga, como
reconstrução de calvária ou em áreas com alta incidência de carga, neste caso
somente sem a função de suporte de carga, tais como defeitos ósseos críticos
no fêmur; ou ainda, região da coluna vertebral, pois dependendo da
microestrutura do osso trabecular a resistência mecânica deste tipo de osso
possui um limite de resistência à compressão entre 0,32 a 2,25 MPa48.
A avaliação se a modificação dos scaffolds de PHB tanto com fibroína
quanto fibroína/apatita alterou o caráter hidrofóbico dos scaffolds de PHB foi
realizada pelo experimento de taxa de intumescimento. Esta é uma
propriedade fundamental a ser estudada quando se objetiva desenvolver
materiais a serem empregados para engenharia tecidual/ medicina
regenerativa, pois superfícies ou materiais com hidrofilicidade intermediária
favorecem a absorção de fluídos biológicos e a adesão e espraiamento
celular58.
95
Os resultados de porcentagem de água absorvida para as amostras
PHB, PHB/FB e PHB/(FB-HA) estão representados na Figura 6. Após de 24 h,
a taxa de intumescimento mensurado para as amostras PHB, PHB/FB e
PHB/(FB-HA) foi 203±9%, 195±6,3% e 185±2,4%, respectivamente. Os
resultados mostraram que a incorporação de fibroína e de apatita aos scaffolds
de PHB alterou o caráter hidrofóbico do polímero, favorecendo uma maior taxa
de absorção de água nas primeiras 2 h de experimento em relação os scaffolds
de PHB. A porcentagem de intumescimento para as amostras modificadas
aumentou consideravelmente, cujos valores mensurados nos primeiros 30 min
para as amostras PHB/FB e PHB/(FB-HA) foram de 209 e 182%,
respectivamente, sendo que para os scaffolds de PHB foi mensurado um valor
de 100% em relação ao seu peso seco neste mesmo período. A redução da
hidrofobicidade do polímero PHB, nos scaffolds com modificação da superfície
por fibroína ou fibroína/apatita, pode ser aferido pelo aumento de cargas
relacionadas aos grupos aminos livres e carboxílicos da fibroína e dos grupos
hidroxilas da apatita na amostra PHB/(FB-HA). Adicionalmente, observou-se
que a amostra PHB/(FB-HA) atingiu seu máximo de absorção de água em 30
min mantendo-se com algumas variações ao longo da medida, porém após 24
h apresentou a mesma porcentagem de intumescimento.
96
Figura 6 - A: Curvas de taxa de intumescimento PHB, PHB/FB e PHB/(FB-HA)
durante um período de 24 h. B: Porcentagem de intumescimento dos scaffolds
em 24 h representado em gráfico de colunas. Barras verticais mostram desvio
padrão.
0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
220
240
A
bsor
ção
de á
gua
(%)
Tempo (min)
PHB PHB/FB PHB/(FB-HA)
A
PHB PHB/FB PHB/(FB-HA)0
50
100
150
200
250
Intu
mes
cim
ento
(%)
B
A porosidade aberta mensurada para os scaffolds PHB, PHB/FB e
PHB/(FB-HA) foi de 55,8±0,7%, 48,9±6.2% e 54,7±1.1%, cujo valor aumentou
em relação ao valor teórico determinado pelo programa Magics®18.2 de 40,7%
para o scaffold PHB. Os valores mensurados para os scaffolds modificados
com FB revelam que a fibroína diminui a porosidade pela sua deposição em
forma de filme como observado nas imagens de MEV, porém apresentam um
97
desvio padrão elevado revelando que há uma deposição fibroína não
homogênea. No entanto, os valores obtidos para os scaffolds PHB/(FB-HA)
revelam que a porosidade dos scaffolds aumentam em relação ao scaffold
PHB/FB devido a presença dos cristais de apatita e possível reorganização do
filme de fibroína na estrutura dos scaffolds.
Os valores de porosidade obtidos na literatura empregando a técnica
SLS e como matéria prima poli(hidroxibutirato-co-valerato) (PHBV) (64,6±2,0%;
porosidade teórica 53%) ou Ca-P/PHBV (62,6±1,2%) ou PLLA (69,5±1,3%),
estão acima dos valores obtidos neste trabalho. Esta diferença na porosidade
encontrada pode ser sugerida ao desenho do scaffold projetado, uma vez que
a proporção entre a porosidade do scaffold impresso e a porosidade teórica
aumentou similarmente aos dados encontrados na literatura15-17.
A bioatividade das superfícies de materiais aloplásticos é um importante
fator a ser determinado, principalmente quando estes materiais são
desenvolvidos para reparação/reconstrução de tecido ósseo. Pois, a reação
natural do organismo frente a um corpo estranho, no caso material implantado,
é de encapsulá-lo por tecido conjuntivo fibroso. Entretanto, quando estes
materiais são bioativos esta cápsula de tecido conjuntivo fibroso não se forma75
Materiais bioativos são materiais a base de biocerâmicas, como por
exemplo, cerâmicas a base de fosfato de cálcio (hidroxiapatita, β-fosfato
tricálcico, entre outros), vitro-cerâmicas e vidros bioativos, os quais são
capazes de se ligarem ao tecido ósseo por meio de uma camada de apatita
formada na interface do material e tecido adjacente ao implante. Esta formação
de apatita in vivo na interface material/tecido inicialmente ocorre por reações
iônicas principalmente entre íons Ca2+ e PO presentes tanto na superfície
dos materiais quanto no plasma sanguíneo31; concomitante a formação desta
camada de apatita, os osteoblastos regulam a expressão gênica das proteínas
da matriz óssea neoformada (matriz osteóide) na interface material/tecido,
promovendo um equilíbrio dinâmico de trocas iônicas principalmente de íons
Ca2+ e PO-, iniciando uma nucleação secundária dos cristais de apatita
tanto na interface material/tecido quanto na matriz osteóide3.
Para determinar a bioatividade in vitro de superfícies de materiais
aloplásticos bioativos usualmente é empregada a solução de SBF, cuja
concentração iônica desta solução é próxima ou igual ao plasma sanguíneo
98
humano 30. Adicionalmente, esta solução foi padronizada pela International Organization for Standardization (ISO) para avaliação da habilidade de
precipitação de apatita em materiais implantáveis25, 30.
Nas imagens de MEV das amostras PHB, PHB/FB e PHB/(FB-HA) pôde-
se observar que somente após 21 dias de imersão em SBF foi possível
observar a formação de cristais de apatita sobre as superfícies dos scaffolds
PHB e PHB/FB e de nucleação secundária mais efetiva dos cristais de apatita
da amostra PHB/(FB-HA) (Figura 7). De acordo com as imagens de MEV
observadas para as superfícies das amostras, PHB, PHB/FB, PHB/(FB-HA),
sugere-se que os materiais possuem bioatividade após 21 e 28 dias de
avaliação na seguinte ordem: PHB/FB<PHB<PHB/(FB-HA) (Figura 7).
A superfície da amostra PHB/(FB-HA) mostrou-se ser mais bioativa em
relação as outras amostras, PHB e PHB/FB. Este resultado era esperado
devido ao fato da amostra conter os precursores, como DPCD, OCP e β-TCP,
necessários para nucleação secundária de fases de apatita, como confirmado
por MEV e RMN do núcleo 31P. Desta forma, a camada de apatita precipitada
na superfície do scaffold PHB/(FB-HA) revelou cristais com uma morfologia de
agregados globulares formado microestruturalmente por nanocristais lamelares
apresentando certa porosidade (Figura 7E); estrutura similar a observada para
scaffolds a base de CDHA/OCP/β-TCP após 14 dias de imersão em SBF47.
Com o aumento tempo de imersão (28 dias), as lamelas cresceram em
tamanho e uma nova formação de cristais, em forma de agulhas aglomeradas
em pequenas esferas, foi observada sobre estas lamelas (Figura 7F). Estas
imagens revelam a transformação in vitro tanto das fases precursoras de HA
(DPCD e OCP) do scaffold quanto da camada de apatita precipitada em HA ou
em CDHA47, 65.
O scaffold de PHB, apesar de não ser um material bioativo, após 21 dias
de imersão em SBF apresentaram capacidade de promover a precipitação de
uma camada de apatita sobre a superfície do polímero. No entanto, esta
camada de apatita apresentou morfologias heterogêneas desde bastonetes a
grânulos esféricos sem porosidade em sua microestrutura (Figura 7A). Após 28
dias, em algumas regiões pôde-se observar o crescimento desses cristais em
formas agulha ou lamelares, morfologia típica para cristais de HA (Figura 7B).
Contudo, o scaffold PHB/FB não apresentou deposição de apatita após 21 dias
99
de experimento. Somente após 28 dias, grânulos esféricos de ordem
nanométrica (90±10 nm) precipitados homogeneamente foram observados
sobre a superfície do scaffold (Figuras 7C e 7D).
Figura 7 - Imagens de MEV para bioatividade superficial in vitro após 21 e 28
dias. Imagens de 21 dias: A. PHB; C.PHB/FB; e E. PHB/(FB-HA); imagens de
28 dias: B. PHB; D. PHB/FB; e F. PHB/(FB-HA).
3.2 Determinação da liberação do peptídeo OGP-CF dos scaffolds Embora, a concentração máxima de peptídeo adsorvida nos scaffolds
não tem sido determinada, foi possível observar o comportamento das curvas
A
C
E
B
D
F
100
de liberação e estimar a concentração necessária a ser incorporado nos
scaffolds para uma liberação mais eficaz e controlada.
A liberação do peptídeo OGP-CF dos scaffolds PHB, PHB/FB e
PHB/(FB-HA) está mostrada na Figura 8. O perfil de liberação observado pode
ser atribuído ao intumescimento dos respectivos scaffolds, ou seja, pela difusão
do meio aquoso pela rede do scaffold e consequentemente relaxamento das
cadeias. Estes resultados podem ser comprovados, pois não houve liberação
nos primeiros 30 min de ensaio ou a liberação começou a acontecer após os
primeiros 30 min paras todas as amostras, menos o scaffold PHB/(FB-HA). A
funcionalização FB-HA pode estar funcionando como uma barreira para que o
peptídeo não adsorvesse nos poros mais internos da rede polimérica, ficando
mais a superfície e liberado mais rapidamente.
Para os scaffolds de PHB, o peptídeo foi liberado de forma crescente de
maneira linear até 24 h, cuja liberação foi constante após este período. Nos
scaffolds PHB/(FB-HA) a liberação foi mais intensa nos primeiros 300 min e
isso pode estar associado a interação superficial da moléculas de fibroína e
apatita. Após esse período a taxa de liberação é menor, cuja taxa de liberação
é dependente da difusão do meio aquoso pela rede do polímero e ficando
constante após 48 h. Entretanto, o perfil de liberação observado para o scaffold PHB/FB sugere que o recobrimento com FB promove uma liberação mais
prolongada do peptídeo acima de 72 h chegando numa constante após 5 dias
de ensaio.
Esse comportamento é típico de um sistema de liberação controlada
podendo a liberação inicial, mais acelerada, ser explicada pelo fato do
intumescimento do scaffold favorecer a liberação de uma fração do OGP-CF
que interage mais superficialmente com o polímero por interações mais fracas,
ou então, pela ligeira solubilidade do peptídeo, que faz as moléculas mais
superficiais sejam rapidamente liberadas28, 62. O comportamento inicial seguido
por uma liberação lenta corresponde às moléculas do peptídeo que interagem
mais fortemente à estrutura do polímero ou que estão incorporados dentro dos
poros intrínsecos da estrutura 3D, proporcionando um efeito prolongado à
liberação28, 34.
Este perfil da curva de liberação mostra que a incorporação do OGP-CF
livre ao scaffold de PHB foi mais eficaz com relação à membrana de CB
101
observado em estudo prévio60, e similar, quando o peptídeo OGP-CF foi
incorporado a nanopartículas de sílica mesoporosas 44.
Saska et al.60 demonstraram que mesmo uma concentração menor de
peptídeo livre incorporado à celulose bacteriana, no valor de 10-6 mol.L-1, pela
mesma metodologia aqui descrita, foi capaz de desenvolver uma ação
osteoindutiva considerável in vitro. Isso mostra que o aumento da concentração
de OGP carreado pelos sistemas de liberação e o prolongamento da sua
liberação decorrente desses sistemas pode aumentar ainda mais a capacidade
osteoindutiva tanto in vitro quanto in vivo, levando a avanços benéficos na
terapia de regeneração óssea.
Figura 8 - Perfil de liberação cumulativa do OGP-CF a partir dos scaffolds de
PHB, PHB/FB e PHB/(PHB-HA).
0 2000 4000 6000 8000 100000.0
2.0x10-6
4.0x10-6
6.0x10-6
8.0x10-6
1.0x10-5
1.2x10-5
Libe
raça
o A
cum
ulat
iva
- OG
P (g
)
Tempo (min)
0 100 200 300 400 500 6000.00
2.50x10-6
5.00x10-6
7.50x10-6
1.00x10-5
PHB PHB-FB PHB-HA
3.3 Estudo in vitro Nas fases iniciais de desenvolvimento dos materiais, a avaliação da
resposta celular aos mesmos é de suma importância. Na avaliação da
morfologia celular, aos 3 dias pode-se observar na MEV um espraiamento
celular em todos os materiais avaliados (Figura 9). Rajaraman et al.54, em
1974, dividiu os estágios de adesão e proliferação em quatro: 1. Adesão das
células no ponto de contato com o substrato - células arredondadas; 2.
102
Crescimento centrífugo das filopodias - células arredondadas com filopodias; 3.
Cinto citoplasmático - células em início de expansão lateral do citoplasma; e 4.
Achatamento da massa central - células bem planas com aumento na
espessura das filopodias. Avaliando a morfologia das células em cada material
baseando-se nesses estágios, observam-se células nos estágios 3 e 4
principalmente nos scaffolds de PHB (Figura 9A) e PHB/FB-OGP (Figura 9C), e
no estágio 3 nos scaffolds de PHB/FB (Figura 9B) e PHB/(FB-HA)-OGP (Figura
9D). Esse resultado sugere um estágio de diferenciação morfológica mais
avançada para as células nos grupos PHB e PHB/FB-OGP.
Figura 9 - MEV dos scaffolds de PHB (A); PHB/FB (B); PHB/FB-OGP(C); e
PHB/(FB-HA)-OGP. Aumento de 500×. Setas brancas = filopodias; Setas
amarelas = espraiamento linear das células.
A B
D C
103
Ao se avaliar materiais para regeneração de tecido ósseo in vitro, é
necessário que as células ósseas ou progenitoras adiram e se proliferem sobre
o material para que ele possa exercer a função de osteocondução ou
osteoindução. No caso específico das células ósseas as características de
rugosidade do material, são de suma importância para que isso ocorra26.
A técnica de produção de scaffolds de PHB por SLS conferiu rugosidade
ao material, o que proporcionou a proliferação das células RBMSC (Capítulo 1).
Com adição da fibroína, apesar da mesma se apresentar microscopicamente
como um revestimento das estruturas de PHB (Figura 2B), essa característica
não interferiu na proliferação celular sobre os scaffolds.
Avaliando a proliferação celular, pode-se observar para todos os grupos
uma proliferação crescente ao longo dos períodos, o que demonstra a
capacidade do material em permitir o crescimento celular, ou seja, o material
não se apresentou citotóxico (Figura 10). Com esse resultado pode-se concluir
que a adição da fibroína aos scaffolds permitiu um aumento na resistência
mecânica sem prejudicar a resposta biológica aos mesmos, já que os
resultados de proliferação obtidos foram semelhantes ao grupo dos scaffolds
de PHB puro. É claro na literatura que a fibroína da seda, desde que
corretamente isolada, é biologicamente compatível1. Diversos estudos tem
avaliado a aplicação da fibroína na fabricação de scaffolds para regeneração
tecidual1, 2, 71, 73, inclusive para aplicação em regeneração óssea46, 74. A adição
de apatitas e do OGP as amostras pareceu não interferir na proliferação
celular.
104
Figura 10 - Avaliação do efeito de adição de fibroína da seda (FB), apatitas
(HA) e peptídeo de crescimento osteogênico (OGP), associados a scaffolds de
poli (3-hidroxibutirato) na proliferação celular, por percentual de redução do
reagente alamarBlue nos períodos de 3, 9, 15, 18 e 21 dias. *p<0,05 Kruskall-
Wallis pós-teste Dunn.
alamarBlue
0
20
40
60
80
1003 dias9 dias15 dias18 dias21 dias
PHB PHBFB
PHBFB
OGP
PHBFBHA
OGP
**
*p<0,05
**
% re
duçã
o
Para avaliar o potencial em acelerar a precipitação de cálcio sobre os
scaffolds in vitro das modificações propostas aos scaffolds de PHB, com
fibroína, apatitas e OGP, utilizou-se a metodologia indireta de quantificação de
cálcio do sobrenadante das células em cultura sobre os scaffolds. As células
RBMSC cultivadas sobre esses scaffolds, quando diferenciadas em
osteoblastos, tem a capacidade de formar matrizes minerais in vitro com a
utilização do cálcio presente no meio de cultura. Além disso, a própria
composição química dos materiais avaliados, como por exemplo, do grupo das
apatitas, podem liberar ou captar cálcio do meio através de reações químicas20.
Nesta análise considerou-se que, quanto menor a quantidade de cálcio
no sobrenadante, maior a precipitação sobre as amostras. Como observado na
Figura 11, o grupo PHB/FB teve uma diminuição da quantidade de cálcio no
sobrenadante ao longo dos períodos avaliados, o que sugere uma precipitação
de cálcio aumentando gradativamente sobre as amostras. Esse aumento pode
ser atribuído a um possível aumento na diferenciação celular neste grupo,
105
porém essa hipótese deve ser confirmada em estudos complementares de
avaliação de outros marcadores de mineralização óssea.
Figura 11 - Quantificação de cálcio no sobrenadante do meio de cultura, nos
diferentes grupos, nos períodos de 3, 9, 15 e 18 dias. Controle positivo: Células
cultivadas no plástico; Controle negativo (C-): meio de cultura em contato com
os materiais. Resultados de concentração normalizados pelos resultados dos
controles negativos. *p<0,05 Kruskall-Wallis pós-teste Dunn.
Quantificação de Cálcio
0.0
0.5
1.0
1.5
15 dias18 dias
3 dias9 dias
PHB PHBFB
PHBFB
OGP
PHBFBHA
OGP
C+
*
*
*p<0,05
C-Fold
cha
nge
Além disso, pode-se observar que, mesmo com o cálcio presente na
composição das amostras de HA, o mesmo não foi encontrado diluído no
sobrenadante desse grupo. Ao contrário, a presença dele nas amostras parece
ter estimulado a precipitação sobre as amostras, já que para esse grupo um
resultado menor de quantificação foi observado comparado ao grupo PHB aos
3 dias (p=0,0439). Esse resultado é compatível com o da avaliação de
bioatividade, na qual verificou-se que esta superfície foi mais bioativa que as
demais.
Os resultados in vitro demonstram a possibilidade de utilização para
regeneração óssea dos scaffolds estudados. Mais estudos precisam ser
realizados visando confirmar esses resultados in vitro e entender melhor o
mecanismo de atuação desses materiais.
106
4 Conclusão
O processo de manufatura aditiva empregado neste estudo, SLS,
permitiu desenvolver scaffolds de PHB com uma arquitetura e tamanho de
poros controlados, muito próximos ao modelo virtual projetado. Os scaffolds 3D
de PHB sinterizados e após a funcionalização com fibroína e apatita revelaram
uma porosidade intrínseca com poros interconectados. Além disso, os scaffolds
funcionalizados apresentaram-se mais hidrofílicos em relação ao PHB, cujas
características são primordiais para a adesão e proliferação celular. As
propriedades térmicas do PHB não se alteraram com os parâmetros
empregados durante o processo de impressão por SLS e nem pela
incorporação de fibroína ao scaffold de PHB. No entanto, a incorporação de
apatita altera a estabilidade térmica do PHB diminuindo a sua temperatura de
decomposição. A metodologia usada para incorporação in situ da apatita
proporcionou a precipitação das fases DCPD, OCP e β-TCP nos scaffolds.
Além disso, os scaffolds PHB/(FB-HA) mostraram-se ser mais bioativos
em relação as outras amostras, PHB e PHB/FB. Esta maior bioatividade para o
scaffold PHB/(FB-HA) era esperada devido ao fato da amostra conter os
precursores de hidroxiapatita, como DPCD, OCP e β-TCP. Os ensaios de
resistência à compressão mostraram que os scaffolds sinterizados neste
estudo poderão ser usados para regeneração de osso cortical e esponjoso em
áreas com baixa incidência de carga. O perfil de liberação do peptídeo OGP
dos respectivos scaffolds, PHB, PHB/FB e PHB/(FB-HA) foi de modo
controlado, o que indica que estes scaffolds impressos e modificados pós-
processamento são estruturas em potencial para serem empregadas em
liberação de drogas.
Nos ensaios in vitro observou-se uma boa proliferação celular sobre os
diferentes scaffolds com uma aparente diferenciação morfológica mais
avançada para os scaffolds de PHB e PHB/FB-OGP no período de 3 dias. A
adição de apatitas aos scaffolds aumentou o acúmulo de cálcio na superfície
dos scaffolds, principalmente em 3 dias (p<0,05) corroborando aos resultados
de bioatividade para este scaffold. Entretanto, a incorporação do OGP não
favoreceu uma maior proliferação celular, porém outros ensaios in vitro são
necessários para avaliar o efeito deste peptídeo nos scaffolds. Contudo,os
107
resultados mostraram que os scaffolds de PHB e associado a FB e apatitas
tem um potencial para aplicação em regeneração óssea.
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Elsevier; 2014. p. 441-73.
115
Resposta in vivo a matrizes tridimensionais de poli(3-hidroxibutirato) produzidas por sinterização seletiva a laser e modificadas por fibroína, apatitas e/ou peptídeo de crescimento osteogênico Luana C. Pires, Mario H. A. Verzola, Ana Paula de S. Faloni, Mariana A. Cominotte,
Silvana R. P. Orrico, Marcelo F. de Oliveira, Izaque A. Maia, Jorge Vicente L. da Silva,
Sidney J. L. Ribeiro, Sybele S. Saska, Joni A. Cirelli
Resumo A impressão tridimensional (3DP) vem ganhando espaço na produção
de matrizes tridimensionais (scaffolds) para regeneração óssea. Dentre as
técnicas utilizadas, está a sinterização seletiva a laser (SLS), capaz de produzir
scaffolds de formas complexas, com alto controle de porosidade e tamanho dos
poros. O objetivo desse estudo foi avaliar o potencial regenerador ósseo in vivo
de scaffolds produzidos por 3DP via SLS a base de poli(3-hidroxibutirato)
(PHB) e associado á fibroína da seda (FB), apatitas (HA) e/ou peptídeo de
crescimento osteogênico (OGP). Foram utilizados para avaliação defeitos de
11mm de diâmetro em calota de coelhos. O processo de formação óssea foi
avaliado por microtomografia computadorizada (µCT), análises morfológica e
imuno-histoquímica, em 15 e 60 dias e, a expressão de genes relacionados a
osteogênese por PCR tempo real em 7, 15 e 30 dias. Os resultados de µCT
demonstraram um percentual de volume ósseo semelhante entre os grupos
experimentais e o grupo controle coágulo. Na análise histológica um infiltrado
inflamatório de leve a moderado foi descrito para os grupos experimentais, com
ausência de formação óssea de contato. Entretanto, o material foi eficiente em
manter o volume da área do defeito. Na ánalise de imuno-histoquímica não se
verificou diferença expressiva na imuno-marcação de colágeno tipo 1a1 e
osteocalcina nos grupos experimentais. Resultado semelhante obteve-se na
análise de expressão gênica dos genes osterix, colágeno 1a1, fosfatase
alcalina e osteocalcina. Os scaffolds avaliados nesse estudo falharam em
estimular a osteogênese de contato, entretanto mantiveram a espessura do
defeito. Avaliações em longo prazo são necessárias para observar a total
degradação do material e o caminho de resolução na cicatrização do defeito.
116
Palavras-chave: impressão tridimensional, regeneração óssea, sinterização
seletiva a laser, poli(3-hidroxibutirato), fibroína, apatitas, in vivo.
1 Introdução
A capacidade do tecido ósseo de se auto-reparar ou regenerar é
bastante conhecida e envolve uma série de eventos complexos nos quais
diferentes células, proteínas e fatores sistêmicos, locais e ambientais
participam24. Entretanto, o organismo é incapaz de recuperar defeitos ósseos
extensos17 e, em grande parte destes casos, uma intervenção externa é
necessária para recuperação do tecido perdido6. Entre as diferentes opções de
tratamento estão os enxertos autógenos, alógenos e xenógenos, e a
engenharia tecidual óssea. Os bons resultados da engenharia de tecidos tem
permitido que essa especialidade ganhe espaço nessa área, já que evita os
transtornos e limitações das outras opções de tratamento6.
As matrizes tridimensionais (scaffolds) tem um envolvimento significativo
na regeneração tecidual óssea, pois, podem preservar o volume tecidual na
área a ser reparada, prover uma função mecânica temporária e, liberar
biofatores que favoreçam a formação óssea16. Além disso, é necessário que o
scaffold sirva como base para a migração e a adesão celular e permita a
neovascularização16. Especificamente em regeneração tecidual óssea,
algumas características como porosidade e tamanho de poros, são essenciais
nos scaffolds para permitir que isso ocorra18.
As técnicas de impressão tridimensional de scaffolds, principalmente as
que utilizam pó como matéria prima, permitem a confecção de matrizes com
alto grau de porosidade e alto controle na geometria dos poros26. Dentre essas
técnicas encontra-se a sinterização seletiva a laser (SLS - selective laser sintering) que utiliza um laser de CO2 para sinterizar um material em pó e
transformá-lo em uma forma física baseada em um modelo virtual pré-
confeccionado26. Essa técnica permite a construção de modelos virtuais
complexos que se encaixem perfeitamente ao local de implantação25.
117
Dentre os materiais disponíveis para utilização na técnica de SLS
encontra-se o poli (3-hidroxibutirato), um polímero membro na família dos
polihidroxialcatanos com alto potencial para aplicação como material
biodegradável para implantação12. O PHB é produto da fermentação de
algumas bactérias como a Ralstonia Eutropha, é biocompatível e reabsorvível,
permitindoinúmeras aplicações médicas15, como na regeneração óssea de
defeitos críticos7, 14, 21.
A produção de scaffolds à base de PHB pela técnica de SLS vem sendo
desenvolvida25, 26. Algumas modificações nesses scaffolds visando a aplicação
em regeneração óssea têm sido propostas por nosso grupo de estudo,
buscando a melhoria mecânica e biológica dessas matrizes (capítulos 1 e 2),
como a incorporação de fibroína da seda (FB), apatitas (HA) e fator de
crescimento osteogênico (OGP).aos scaffolds
A fibroína da seda é uma proteína extraída do casulo do bicho-da-seda,
o Bombyx mori, e possui propriedades desejáveis, como alta resistência
mecânica, biocompatibilidade com baixa resposta inflamatória e imunogênica19,
20, 22. Sua estrutura de conformação em folhas-β (cristalina) confere elevada
rigidez e resistência aos biomateriais, tornando-a um biopolímero útil para
aplicações em engenharia tecidual óssea1
As apatitas quando adicionadas aos scaffolds conferem aos mesmos a
característica de bioativação. Por estarem presentes naturalmente no tecido
ósseo, elas possibilitam a ligação direta osso-material29. Os recentes esforços
das pesquisas concentram-se em combinar as melhores características da
hidroxiapatita e dos polímeros para criar um material a ser utilizado para
substituição de tecido ósseo8.
Uma outra aplicação dos scaffolds é a liberação controlada de drogas e
fatores de crescimento. Durante o processo de formação óssea uma série de
fatores de crescimento estão envolvidos, tais como as proteínas
morfogenéticas ósseas (BMPs), o fator de crescimento endotelial vascular
(VEGF), entre outros6. Dentre esses fatores, recentemente o peptídeo de
crescimento osteogênico (OGP) foi descrito integrante desse mecanismo
atuando como agente anabólico ósseo e estimulador da hematopoiese4.
O objetivo desse estudo foi avaliar in vivo a resposta tecidual e a
regeneração óssea em defeitos ósseos críticos de calvária de coelhos tratados
118
com scaffolds de PHB produzidos por SLS e modificados por FB, HAe/ou pelo
peptídeo OGP.
2 Material e método
Foram utilizados para avaliação da resposta in vivo scaffolds de PHB
produzidos por SLS de 11 mm de diâmetro e 2 mm de espessura associado a
modificações com FB, HA e/ou OGP e divididos nos seguinte grupos PHB;
PHB-OGP; PHB/FB; PHB/FB-OGP; e PHB/(FB-HA)-OGP. O coágulo foi
utilizado como controle. A metodologia usada na produção desses scaffolds
seguiu o descrito no capitulo 2. Todos os scaffolds produzidos foram
acondicionados em envelopes apropriados, e encaminhados para serem
esterilizados com radiação gama a 20 kGy pela Embrarad (Cotia, Brasil).
2.1 Estudo in vivo Para análise de respostas dos materiais estudados foram utilizados
coelhos (Grupo Genético Botucatu) machos, de 5 meses de vida e com peso
médio de 3 a 3,5 kg no momento da cirurgia. A metodologia foi aprovada pelo
Comitê de Ética no Uso de Animais (CEUA) da Faculdade de Odontologia de
Araraquara - UNESP (Processo nº 17/2013 - Anexo 2).
Para a cirurgia os animais foram anestesiados por meio de
administração intramuscular de cloridrato de ketamina (35 mg.kg-1) e de
cloridrato de xilazina (10 mg.kg-1). Em cada animal dois defeitos de 11 mm de
diâmetro foram confeccionados nos ossos parietais com uma trefina, sob
irrigação constante. Os defeitos foram delimitados nas regiões anterior e
posterior com um ponto de guta percha posicionado a 3 mm de cada uma das
margens. Cada defeito recebeu biomaterial de um grupo experimental distinto.
Os animais foram sacrificados após 7, 15 e 30 dias para análise de expressão
gênica de marcadores relacionados à formação óssea e, após 15 e 60 dias
para análises de microtomografia computadorizada (μCT), morfologia, resposta
tecidual e imuno-histoquímica.
119
2.1.1 PCR em tempo real Taqman Para a análise de expressão gênica, após o sacrifício, as peças foram
removidas e armazenadas primeiramente em nitrogênio líquido e depois
mantidas a -80° C. No procedimento de extração de RNA, as amostras ósseas
foram trituradas em nitrogênio líquido e homogeneizadas com Trizol (Ambion,
EUA). O RNA total foi isolado seguindo protocolo do fabricante. Um total de 1
μg de RNA foi transcrito utilizando o kit High capacity cDNA reverse
transcriptional kit (Applied Biosystems, EUA). Os genes de escolha para
avaliação quantitativa de expressão foram Osterix (OSX - assay ID: Pn4331348AIFATAS), Colágeno tipo 1a1 (COL I - assay ID: Oc03396073_g1),
Fosfatase alcalina (ALP - assay ID: Pn4331348AICSWYC) e Osteocalcin (OSC
- assay ID: Pn4331348AID1U4K). Foram utilizados primers do sistema Taqman
e a cicladora de PCR tempo real Step One plus (Applied Biosystems, EUA). Os
níveis relativos da expressão dos genes foram calculados de acordo com as
instruções da Applied Biosystems, utilizando a GAPDH (assay ID: Oc03823402_g1) como gene normalizador.
2.1.2 Microtomografia computadorizada (μCT) As peças foram removidas após 15 e 60 dias e imediatamente imersas
em formaldeído 4% tamponado com fosfato de sódio 0,1 mol.L-1, pH 7,2. Após
48 horas de fixação, as mesmas foram lavadas em água corrente por 24 horas
e depois armazenadas em uma solução de álcool 70% em temperatura
ambiente. Os espécimes foram escaneados utilizando o sistema de
microtomografia computadorizada Skyscan 1176 (Aartselaar, Belgium).
x Método de escaneamento: gerador de RX operado a 50 kV com corrente
do feixe de 496 uA, filtro de 0,5 mm de alumínio, e imagens obtidas
numa resolução de 18 µm. As imagens tridimensionais foram
reconstruídas utilizando o software de reconstrução NRecon 1.6.1.5
(SkyScan N. V. Belgium).
x Análise Volumétrica (3D): A mensuração volumétrica foi realizada
utilizando o software CT Analyser 1.10.1.0 - (SkyScan, Belgium),
seguindo a seleção de uma área de interesse (ROI – region of interest) tridimensional, no formato cilíndrico com 1,2 mm de diâmetro e
120
espessura envolvendo os 100 cortes radiográficos mais centrais). O
examinador foi guiado pelas marcações com guta-percha para o correto
posicionamento da ROI. As análises foram realizadas por um
examinador cego e treinado.
2.1.3 Análises morfológica e de resposta tecidual As peças, previamente armazenadas em álcool 70°, foram
descalcificadas em E.D.T.A. 7% (Ácido Etileno Diamino Tetracético e
processadas para inclusão em parafina e obtenção de cortes sagitais medianos
de 4 µm de espessura.
Os cortes semi-seriados foram corados com Hematoxilina & Eosina
(H&E) e utilizados para a descrição morfológica, bem como para análise da
resposta tecidual nas regiões adjacentes ao material implantado. Para a
avaliação semi-quantitativa da resposta tecidual aos diferentes tipos de
biomateriais, imagens das regiões de defeitos ósseos foram obtidas utilizando-
se um microscópio de luz com câmera acoplada (Leica DM2500). Observando-
se essas imagens, foram estabelecidos escores de intensidade da reação
inflamatória com base na ISO 10993-6: 2007 (Biological Evaluations for medical devices – Part 6: Tests for local effects after implantation), conforme ilustra o
Quadro 1. Foram consideradas nessa análise células mononucleadas
(polimorfonucleares, linfócitos, plasmócitos e macrófagos), bem como células
multinucleadas contendo 3 ou mais núcleos (células gigantes multinucleadas
do tipo corpo estranho). Todas as análises foram executadas por um
examinador cego e treinado.
121
Quadro 1 - Sistema de avaliação histológica considerando-se o tipo de
resposta ou o número de células inflamatórias por campo microscópico.
Aumento inicial: 400x. Adaptado de ISO 10993-6: 2007 (Biological Evaluations for medical devices – Part 6: Tests for local effects after implantation).
2.1.4 Análise imuno-histoquímica
Para detecção e localização da expressão de Colágeno tipo I e de
Osteocalcina foi utilizado o método do complexo avidina-biotina-peroxidase
(ABC) com a utilização do kit Immuno Cruz mouse ABC staining system
(Sc:2017, Santra Cruz Biotechnology) segundo as instruções do fabricante.
Previamente foi realizada a recuperação antigênica em Tampão citrato 10mM,
pH 6,0. Os anticorpos primários para as proteínas em análise foram Anti-Collagen I antibody (ab6308, Abcam) em diluição 1:800; e Anti-Osteocalcin antibody (ab13418, Abcam) em diluição 1:400. Como controle negativo, o
anticorpo primário foi omitido e substituído por PBS (phosphate-buffered saline).
Para a avaliação das imuno-marcações também foram atribuídos
escores (análise qualitativa ordinal das imuno-marcações). Foram empregados
os seguintes escores: negativo (-), positivo (+), superpositivo (++) ou
hiperpositivo (+++). Para realização da análise estática, os escores foram
convertidos em porcentagens: 0%, 20% (10 a 30%), 60% (50 a 70%) e 90% (80
Escores
Tipo de Célula/Resposta 0 1
(Raro/Leve) 2
(Moderado) 3
(Intenso) 4
(Muito intenso)
Infiltrado Inflamatório Mononuclear
Ausente 1-5 células/campo
11-20 células/campo
Muitas células
inflamatórias
Campo coberto por
células inflamatórias
Células Gigantes Ausente 1-2
células/campo 3-5
células/campo
Muitas células
gigantes
Campo coberto de
células gigantes
122
a 100%)9, 11, 27. A intensidade de imuno-marcação foi registrada por um
examinador cego e treinado.
2.2 Análise estatística
As análises estatísticas foram feitas no programa GraphPad Prism v.5.
Para comparações dos resultados foram utilizados os testes não paramétricos
Kruskal-Wallis seguido do pós-teste de Dunn para as comparações inter-grupo
e, para as comparações intra-grupo Mann-Whitney. O nível de significância
adotado foi de 5%.
3 Resultado e Discussão
Microtomografia computadorizada (μCT) Avaliando-se o percentual de formação óssea por microtomografia
computadorizada observou-se um aumento significativo na formação de 15
para 60 dias nos grupos PHB e PHB/FB. Nos períodos de 15 e 60 dias não
houve diferença no percentual de formação óssea comparando-se os
diferentes grupos avaliados, incluindo o controle (Figura 1). A representação
tridimensional dos grupos avaliados por μCT encontram-se na Figura 2.
123
Figura 1 - Percentual de volume ósseo formado no interior dos defeitos tratados
com os diferentes scaffolds mensurado por microtomografia computadorizada
em 15 e 60 dias. *p<0,05.
Percentual de volume ósseo
0
5
10
15
2015 dias60 dias
Coágulo PHB PHBOGP
PHBFB
PHBFB
OGP
PHBFBHA
OGP
*p<0,05
*
*
%
Figura 2 - Vista coronal da reconstrução tridimensional dos defeitos avaliados
no diferentes grupos no período de 15 e 60 dias por microtomografia
computadorizada.
124
Análises morfológica e da resposta tecidual
Por meio de análise morfológica, em menor aumento foi possível
observar menor volume tecidual na região do defeito ósseo preenchido apenas
com coágulo, aos 15 (Figura 3A) e 60 dias (Figura 4A) em comparação a
grupos em que o defeito foi preenchido com diferentes variações do PHB como
ilustram as figuras 3B (PHB/FB-OGP) e 4B [PHB/(FB-HA)-OGP], referentes aos
períodos de 15 e 60 dias, respectivamente. Além disso, aspectos associados à
resposta tecidual aos diferentes materiais investigados em comparação ao
grupo coágulo, foram observados [Figuras 3C-H (15 dias) e 4C-H (60 dias)].
No período de 15 dias, no grupo Coágulo, a inflamação apresentava-se
praticamente ausente, observando-se tecido conjuntivo contendo fibroblastos e
fibras colágenas. Porções de tecido ósseo neoformado foram encontradas em
algumas regiões do defeito (Figura 3C). Porém, apesar da ausência de
inflamação na região do defeito ósseo, o volume tecidual não se encontrava
preservado, apresentando-se bastante reduzido em relação ao volume do osso
do leito receptor e em comparação aos grupos experimentais (Figuras 3A e
3B).
Aos 60 dias, no grupo Coágulo, células inflamatórias estavam ausentes,
observando-se formação de tecido ósseo aparentemente a partir do leito
receptor. O tecido conjuntivo exibia diversos fibroblastos entre feixes de fibras
colágenas exibindo distribuição ainda mais ordenada (Figura 4C). Porções de
tecido ósseo neoformado foram encontradas nas regiões mais centrais do
defeito (Figuras 4A).
Em maiores aumentos, nos grupos experimentais, em que diferentes
variações de biomaterial foram empregadas, foram observadas imagens
sugestivas de diapedese e moderado infiltrado inflamatório mono
(polimorfonucleares, linfócitos, plasmócitos e macrófagos) (Figuras 5A-C) e
multinuclear (células gigantes do tipo corpo estranho), principalmente nas
proximidades do material (Figuras 5B-H). Muitas células mononucleadas com
morfologia indicativa de macrófago encontravam-se próximas entre si (Figura
5C), sugerindo uma tendência à fusão. Fibroblastos e fibras colágenas também
foram observados, porém, em quantidades mais abundantes nas regiões mais
distantes dos materiais (Figuras 5B, 5C, 5E-H). Aos 60 dias, houve uma
125
tendência à redução do infiltrado inflamatório de moderado para leve, nos
grupos experimentais, Porém, uma inflamação crônica intensa parecia persistir,
com aumento do número de núcleos e volume das células gigantes de corpo
estranho (Figuras 5E e 5H).
Por meio da análise estatística foi observada tendência de redução da
intensidade do infiltrado inflamatório mononuclear do período de 15 para 60
dias, em todos os grupos investigados, observados na distribuição de
frequência apresentada na Figura 6. Aos 15 dias, o grupo Coágulo apresentou
menos infiltrado inflamatório (inflamação praticamente ausente) que os demais
grupos, observando-se diferenças estatísticas quando comparado aos grupos
PHB/FB, PHB/FB-OGP e PHB/(FB-HA)-OGP (p<0,01). Aos 60 dias, o grupo
Coágulo também apresentou menos infiltrado inflamatório que PHB-FB
(p<0,01). Na avaliação da inflamação baseada na contagem de células
gigantes, em todos os períodos, os grupos experimentais exibiram grande
quantidade de células, atribuindo-se às regiões analisadas o escore intenso,
enquanto no grupo Coágulo, essas células estavam ausentes.
126
Figura 3 - Fotomicrografias de defeitos ósseos confeccionados em calota
craniana de coelhos, preenchidos apenas com coágulo (A e C) ou com
diferentes tipos de biomateriais (B, D-H), após 15 dias. Coloração:
Hematoxilina e Eosina.
A e B: Em menor aumento, é possível observar reduzido volume
tecidual (colchete) na região do defeito ósseo preenchido com coágulo (Fig. A)
em comparação a grupos em que o defeito foi preenchido com biomaterial (B),
como ilustra a figura B (PHB/FB-OGP). CO: Cortical óssea. Asterisco (*):
Tecido ósseo neoformado. Barras: 4000 µm.
C: No detalhe (retângulo), em maior aumento, observa-se uma célula
inflamatória (seta), que exibe morfologia arredondada, fibroblastos (F-círculo),
com formato fusiforme, além de inúmeras estruturas acidófilas (cor rósea) do
tecido conjuntivo (TC).
D-H: aspectos associados à resposta tecidual aos biomateriais (B)
investigados, no que diz respeito à presença e intensidade de infiltrado
inflamatório em comparação ao grupo Coágulo. Nos grupos em que foram
empregados os biomateriais (B), observa-se maior quantidade de células
inflamatórias em comparação ao coágulo, além de algumas células gigantes
(CG). Barras: 100 µm.
127
B
C
PHB
PHB-OGP PHB/FB
PHB/FB-OGP PHB/(FB-HA)-OGP
Coágulo
PHB/FB-OGP
A
B
D
E F
G H
Coágulo
CO
CO
CO
CO
B
B
B
B
B
B
B
B B
TC
F
F
B
CG
CG
CG
* *
128
Figura 4 - Fotomicrografias de defeitos ósseos confeccionados em calota
craniana de coelhos, preenchidos apenas com coágulo (A e C) ou com
diferentes tipos de biomateriais (B, D-H), após 60 dias. Coloração:
Hematoxilina e Eosina.
A e B: Em menor aumento, também é possível observar reduzido
volume tecidual (colchete) na região do defeito ósseo preenchido apenas com
coágulo (Fig. A) em comparação a grupos em que o defeito foi preenchido com
biomaterial (B), como ilustra a figura B [PHB/(FB-HA)-OGP]. CO: Cortical
óssea. Asterisco (*): Tecido ósseo neoformado. Barras: 4000 µm. D-H: aspectos associados à resposta tecidual aos materiais investigados em
comparação ao grupo Coágulo (figura C). Em todos os grupos, aparentemente
há redução do infiltrado inflamatório em comparação ao período de 15 dias.
Nos grupos em que foram empregados os biomateriais (B), observa-se maior
quantidade de células inflamatórias em comparação ao coágulo. No grupo
coágulo, as células inflamatórias parecem estar ausentes. Nos grupos que
receberam biomateriais, destacam-se células gigantes (CG) exibindo inúmeros
núcleos e citoplasma bastante volumoso. Barras: 100 µm.
129
B
PHB/(FB-HA)-OGP
CO PHB
PHB-OGP PHB/FB
PHB/FB-OGP PHB/(FB-HA)-OGP
C
F E
D
G H
Coágulo
A
B
B
B
B
B
B
B
B
B B
CG
CG
CG
CG
* * *
130
Figura 5 - Fotomicrografias de porções de defeitos ósseos confeccionados em
calota craniana de coelhos e preenchidos com coágulo ou com diferentes tipos
de biomateriais, após 15 (A-D) e 60 dias (E-H). Coloração: Hematoxilina e
Eosina.
A: Ao redor do biomaterial (B), observa-se infiltrado inflamatório moderado, que
exibe células mononucleadas (seta vazada branca).
B: Células mononucleadas apresentam-se em íntimo contato com a parede de
vasos sanguíneos (VS), bem como, nas proximidades dos mesmos (seta
branca vazada) – imagens indicativas de diapedese (setas pretas). Células
gigantes de corpo estranho (CG) parecem estar tentando envolver porções de
biomaterial (B). Infiltrado inflamatório leve é observado.
C: Inúmeras células mononucleadas encontram-se justapostas (seta vazada
branca) e em contato com células gigantes (CG) que parecem envolver o
biomaterial (B).
D: Infiltrado inflamatório moderado tendendo à leve, está envolvendo células
gigantes (CG). Apesar de apenas alguns núcleos serem visualizados no interior
destas células (CG), elas parecem englobar (setas pretas) todas as porções
remanescentes de biomaterial (B).
E e F: Em regiões em que o infiltrado inflamatório encontra-se bastante
reduzido ou ausente, observa-se maior quantidade de tecido conjuntivo (TC)
constituído por fibras colágenas acidófilas com disposição ordenada,
entremeadas por fibroblastos exibindo morfologia fusiforme característica (seta
preta). Células gigantes (CG) exibindo diversos núcleos estão englobando o
biomaterial (B).
G-H: Células gigantes de corpo estranho (CG) com volume e número de
núcleos aumentados envolvem o biomaterial (B) remanescente, que apresenta
superfície irregular. Barras: 100µm. No detalhe da figura H (retângulo), em
maior aumento, é possível observar que o citoplasma da célula gigante (CG)
exibe estruturas com aparência vesicular/vacuolar. Barra: 50 µm.
131
B
CG
B B
B
TC
CG
TC
CG
B
B
B
B B
B
TC CG
CG CG
B
B
TC
CG CG
C D
E F
G H
B B
B
A
PHB-OGP - 15d
VS
VS
B
CG
CG
TC
B
PHB-OGP - 60d
PHB/FB - 15d PHB - 15d
PHB/FB - 60d
PHB/FB - 60d
CG
CG
PHB-OGP - 15d
PHB/FB - 60d
132
Figura 6 - Representação da frequência dos escores de inflamação baseado no
infiltrado de células mononucleares nos diferentes grupos avaliados em 15 e 60
dias. Escores de intensidade de inflamação: 0: ausente; 1: raro/ leve; 2:
moderado; 3: intenso; e 4: muito intenso
Inflamação
Coágulo
PHB
PHB-OGP
PHB/FB
PHB/FB-OGP
PHB/(FB-H
A)-OGP
Coágulo
PHB
PHB-OGP
PHB/FB
PHB/FB-OGP
PHB/(FB-H
A)-OGP
0
1
2
3
4
5
6
01234
15 dias 60 dias
Escores:
Freq
uênc
ia
Após a implantação de um biomaterial na maioria dos casos um
processo inflamatório ocorre. A resposta pode variar de uma inflamação aguda
ou crônica, formação de tecido de granulação, reação de corpo estranho e
desenvolvimento de cápsula fibrosa3. A duração e intensidade do processo
inflamatório, previamente ao encapsulamento, dependem da extensão da
injúria no local de implantação do material, composição química do material,
energia livre de superfície, carga da superfície, porosidade, rugosidade e seu
tamanho e forma2.
Nos scaffolds avaliados nesse estudo, a formação de células gigantes é
esperada, já que é a ação desse tipo celular que propicia a degradação do
material. A fusão de macrófagos a fim de formar células gigantes é influenciada
pelo tamanho das partículas a serem fagocitadas/ degradadas3, 23. Ao serem
observados microscopicamente, os materiais apresentavam-se com alto grau
de rugosidade, com estruturas que variam muito em tamanho, podendo ter
133
mais de 100 μm (capítulos 1 e 2), induzindo portanto a formação de células
gigantes.
A observação de fibroblastos nos grupos experimentais sugere a
formação de um tecido de granulação. Entretanto a evolução desta cicatrização
não é possível de ser determinada com os resultados obtidos até 60 dias. Uma
observação mais a longo prazo seria necessária. Doyle et al10 demonstraram
que materiais à base de PHB produziram uma resposta favorável de adaptação
no tecido ósseo sem evidencias de uma inflamação crônica indesejável após
períodos de implantação superiores a 12 meses. Entretanto, não podemos
extrapolar esses resultados para todos os materiais a base de PHB já que as
características individuais geradas do processo de fabricação de cada scaffold
podem modificar essa resposta.
Um dos requisitos necessários dos scaffolds é a capacidade de
manterem o volume do tecido a ser regenerado durante este processo16. Tendo
em vista os resultados observados na análise morfológica percebe-se que os
grupos experimentais foram eficientes nesse quesito. Apesar das modificações
nos scaffolds não terem sido eficientes em induzir a formação óssea à
distância, observa-se que, por não haver diferença no percentual de formação
óssea avaliada por μCT, esses materiais parecem permitir a neoformação
óssea oriunda das bordas e do periósteo mantendo o volume na área a ser
reparada, enquanto que no grupo coágulo, a formação óssea avança para o
centro do defeito com uma maior velocidade, porém, à custa de uma
significativa perda de espessura na área.
PCR em tempo real Durante o processo de osteogênese e mineralização óssea uma série de
biosinalizadores são produzidos para que isso aconteça. Nesse estudo
optamos por avaliar a influência dos materiais estudados na expressão gênica
de Osterix (OSX), fator de transcrição osteoblástica; Colágeno tipo 1a1 (COL I),
proteína mais abundante da matriz orgânica óssea; fosfatase alcalina (ALP),
marcador do início da mineralização; e a osteocalcina (OSC), marcador de
osteoblastos maduros.
Na avaliação da expressão gênica dos marcadores relacionados a
osteogênese e mineralização óssea OSX, COL I, ALP e OSC (Figura 7),
134
observou-se que para a maioria deles, a expressão foi maior no período de 7
dias comparados aos demais períodos, e comparando-se os diferentes grupos
não houve diferenças estatísticas nos genes avaliados nesse período. No
período de 15 dias a expressão de OSC nos grupos coágulo e PHB foram
estatisticamente maiores comparadas ao grupo PHB/FB-OGP. Para o grupo
coágulo, no período de 30 dias, a expressão de OSX e COL I foi maior
comparado ao grupo PHB-OGP, e a expressão de OSC maior comparado ao
grupo PHB/FB. Esses resultados demonstram que a utilização do PHB, bem
como de suas modificações, parece não ter interferido na expressão gênica
dos fatores relacionados à formação óssea.
Figura 7 - Expressão gênica avaliada por PCR em tempo real - Sistema
Taqman - dos genes: A: Fosfatase Alcalina (ALP); B: Colágeno tipo 1a1 (COL
I); C: Osteocalcina (OSC); e D: Osterix (OSX). *p<0,05.
135
Análise imuno-histoquímica Imuno-marcações para a proteína colágeno do tipo I foram encontradas
em todos os grupos e em toda a extensão dos defeitos, ou seja, tanto nas
regiões de paredes ósseas, onde se observa a cortical óssea e pequenas
porções de tecido conjuntivo (TC) (Figuras 8A, D, G, J, M e P; e 9A, D, G, J, M
e P), quanto nas regiões centrais, em que se observa tecido conjuntivo (TC) e
biomaterial (B) (Figuras 8B, E, H, K, M, N e Q e 9C, F, I, L, O e R). O colágeno
do tipo I é componente da matriz extracelular do tecido ósseo e também do
tecido conjuntivo. As imuno-marcações variaram de positivas à hiperpositivas
(Figuras 8A-R e 9A-R). Exceto nos grupos PHB (3D) e PHB-OGP (3E), que
apresentaram maior intensidade de imuno-marcação aos 15 dias, nos demais
grupos houve uma tendência de aumento da imuno-positividade de 15 (Figuras
8A-R) para 60 dias (Figuras 9A-R). Este resultado reforça os achados da
análise morfológica que mostraram fibras mais regulares e ordenadas aos 60
dias. Além disso, na maioria dos grupos, de 15 para 60 dias há aumento tanto
da imuno-marcação para colágeno, quanto do volume ósseo, o que demonstra
coerência dos resultados obtidos por meio de diferentes análises.
Na análise estatística, o grupo PHB-OGP apresentou as imuno-
marcações mais intensas para o colágeno I, principalmente aos 15 dias,
período em que estas marcações foram significativamente maiores que as dos
grupos PHB/FB-OGP (p<0,05) e PHB/(FB-HA)-OGP (p<0,01) (Figura 12).
Os resultados obtidos para a expressão do colágeno I no grupo PHB-
OGP são compatíveis com o resultado de expressão gênica. A incorporação do
peptídeo OGP nessas amostras pode ter contribuído para uma aceleração na
expressão e produção dessa proteína nos períodos iniciais. A diminuição de
influência ao longo do período nesse grupo pode ser atribuído a uma liberação
muito precoce do peptídeo no ambiente de implantação como observado no
perfil de liberação do peptídeo OGP no capítulo 2. As curvas de liberação do
peptídeo OGP observadas no capítulo 2, dos respectivos scaffolds, revelaram
que tanto a funcionalização com FB e/ou apatita promovem uma liberação do
peptídeo mais prolongada, porém menos acentuada nas primeiras horas em
relação ao scaffold PHB. Entretanto, esta liberação mais prolongada pode não
ter revertido num efeito benéfico para uma estimulação de uma neoformação
óssea mais precoce, uma vez que, o OGP endógeno é requerido nos primeiros
136
momentos da injúria e no decorrer da reparação óssea este peptídeo deixa de
ser requerido5, o que pode justificar os resultados encontrados obtidos neste
estudo.
Em relação à osteocalcina (OSC), foram observadas imuno-marcações
em osteoblastos, osteócitos e nas regiões de matriz óssea presentes nas
bordas dos defeitos. Em geral, as marcações foram ausentes, positivas ou
superpositivas (Figuras 10A-R e 11A-R). Apesar de não terem sido
encontradas diferenças estatisticamente significantes na expressão da OSC, as
imuno-marcações foram mais intensas no grupo coágulo tanto aos 15 (Figuras
10A e 10B), quanto aos 60 dias (Figuras 11A e 11B). Aos 60 dias, em alguns
animais, as raras porções de tecido ósseo presentes nas regiões mais centrais
de defeito exibiam imuno-positividade. Com exceção do grupo PHB/FB-OGP,
nos demais grupos experimentais, houve pequena tendência de aumento da
imuno-positividade de 15 (Figuras 10M-O) para 60 dias (Figuras 11M-O).
137
Figura 8 - Fotomicrografias de porções de defeitos ósseos confeccionados em
calota craniana de coelhos e preenchidos apenas com coágulo ou com
diferentes tipos de biomateriais, após 15 dias. Imuno-histoquímica para
detecção de colágeno tipo I e contra-coloração com Hematoxilina de Carazzi.
Barras: 100 µm.
La: parede do defeito ósseo (A, D, G, J, M e P). Ce: centro do defeito (B, E, H, K, M, N e Q). C-: controle negativo (C, F, I, L, O e R). As imuno-marcações para colágeno I foram encontradas em todos os grupos e
em toda a extensão dos defeitos, ou seja, tanto nas regiões de paredes
ósseas, onde se observa a cortical óssea (CO) e pequenas porções de tecido
conjuntivo (TC), quanto nas regiões centrais, em que se observa tecido
conjuntivo (TC) e biomaterial (B). A intensidade das marcações varia de
positiva (cor amarela) à hiperpositiva (cor marrom). Nos grupos PHB (D e E) e
PHB-OGP (G e H), foi observada tendência de maior intensidade de imuno-
marcação. Asterisco (*): fibras colágenas imuno-positivas.
139
Figura 9 - Fotomicrografias de porções de defeitos ósseos confeccionados em
calota craniana de coelhos e preenchidos apenas com coágulo ou com
diferentes tipos de biomateriais, após 60 dias. Imuno-histoquímica para
detecção de colágeno tipo I + contra-coloração com Hematoxilina de Carazzi.
Barras: 100 µm.
La: parede do defeito ósseo (A, D, G, J, M e P). Ce: centro do defeito (B, E, H, K, M, N e Q). C-: controle negativo (C, F, I, L, O e R). As imuno-marcações para colágeno I foram encontradas em todos os grupos e
em toda a extensão dos defeitos, ou seja, tanto nas regiões de paredes
ósseas, onde se observar a cortical óssea (CO) e pequenas porções de tecido
conjuntivo (TC), quanto nas regiões centrais, em que se observa tecido
conjuntivo (TC) e biomaterial (B). Embora a intensidade das marcações
também varie de positiva (cor amarela) à hiperpositiva (cor dourado-marrom),
exceto para os grupos PHB (D e E) e PHB-OGP (G e H), observa-se maior
intensidade de marcação neste período, em comparação ao período de 15
dias. Asterisco (*): fibras colágenas imuno-positivas.
141
Figura 10 - Fotomicrografias de porções de defeitos ósseos confeccionados em
calota craniana de coelhos e preenchidos apenas com coágulo ou com
diferentes tipos de biomateriais, após 15 dias. Imuno-histoquímica para
detecção de osteocalcina + contra-coloração com Hematoxilina de Carazzi.
Barras: 100 µm.
La: parede do defeito ósseo (A, D, G, J, M e P). Ce: região central do defeito (B, E, H, K, M, N e Q). C-: controle negativo (C, F, I, L, O e R). As imuno-marcações para osteocalcina variam entre ausentes, positivas
(amarelo) e superpositivas (amarelo intenso-dourado), sendo mais intensas no
grupo coágulo. O: Tecido ósseo neoformado. B: Biomaterial.
143
Figura 11 - Fotomicrografias de porções de defeitos ósseos confeccionados em
calota craniana de coelhos e preenchidos apenas com coágulo ou com
diferentes tipos de biomateriais, após 60 dias. Imuno-histoquímica para
detecção de osteocalcina + contra-coloração com Hematoxilina de Carazzi.
Barras: 100 µm.
La: parede do defeito ósseo (A, D, G, J, M e P). Ce: região central do defeito (B, E, H, K, M, N e Q). C-: controle negativo (C, F, I, L, O e R). As imuno-marcações para osteocalcina variam entre ausentes, positivas
(amarelo) e superpositivas (amarelo intenso-dourado), sendo mais intensas no
grupo coágulo. Com exceção do grupo PHB/FB-OGP (M e N), nos demais
grupos experimentais, houve pequena tendência de aumento da imuno-
positividade de 15 para 60 dias. B: Biomaterial.
145
Figura 12 - Percentual de imuno-marcação nos diferentes grupos avaliados em
15 e 60 dias. A: Colágeno 1a1 (COL I); e B: Osteocalcina (OSC). *p<0,05.
A resolução ou reparo da injuria na área de implantação do material
pode ocorrer por duas vias distintas: 1) regeneração com a restituição da
estrutura normal do tecido; ou 2) reorganização e substituição do tecido lesado
por um tecido conjuntivo fibrovascular neoformado. Esses processos são
ambos controlados pela capacidade proliferativa das células presente no tecido
receptor do material23, frente a presença do biomaterial.
Tendo isso em mente, associado à resposta celular favorável de
fibroblastos28 e osteoblastos (capítulos 1 e 2) ao PHB, o uso em regeneração
óssea dos scaffolds de PHB com ou sem modificações, que necessitam de
degradação, talvez tenham um melhor resultado in vivo em longo prazo se
associados a algum tipo de barreira que permita a diferenciação e/ou seleção
de células osteoblásticas sobre os mesmos.
O tempo de degradação das matrizes também interfere nos resultados
finais de formação dos tecidos3. O PHB possui um tempo de degradação in
vivo bastante controverso na literatura. Isso porque as amostras utilizadas são
fabricadas por diversas tecnologias, com diferentes formas e descritas em
modelos animais e de implantação diversos12. Ensaios de degradação in vivo
em ratos demonstraram uma perda de 57% do total inicial de PHB após 6
meses de implantação13. No presente estudo após 60 dias ainda foi possível
observar uma grande quantidade de material nos grupos experimentais.
146
Os resultados das diferentes avaliações realizadas demonstram que o
scaffold de PHB, bem como suas modificações, não foram eficientes em
estimular a formação óssea de contato, nos períodos avaliados. As
funcionalizações utilizadas neste estudo com fibroína e apatita não
promoveram uma superfície mais osteocondutiva para os scaffolds de PHB
para este modelo experimental, inferindo que simplesmente o scaffold de PHB
contendo ou não peptídeo podem ser um material a ser mais explorado e
investigado em estudo futuros com intuito de melhorar o controle e
concentração de peptídeos incorporados a ele.
Para tanto, novos estudos são necessários, em períodos mais longos
para que se possa explorar melhor os possíveis benefícios destes materiais.
Estudos complementares in vitro com cultura celular que avaliem expressão de
proteínas relacionada à osteogênese e mineralização também são importantes
para melhor entender se a incorporação destes produtos interferem nos
mecanismos moleculares envolvidos nestes processos.
4 Conclusão A utilização dos scaffolds tridimensionais de PHB foram eficientes em
manter a espessura do defeito tratado. Entretanto, as modificações com FB,
HA e/ou OGP utilizadas não foram eficazes em estimular a formação óssea de
contato. Estudos posteriores são necessário para compreensão do mecanismo
de ação dos materiais utilizados, principalmente em longo prazo, com a total
reabsorção do material.
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151
RESULTADOS COMPLEMENTARES
Avaliação in vivo dos scaffolds de PHB, PHB-OGP, PHB/FB, PHB/FB-OGP, e PHB/(FB-HA)-OGP por microtomografia computadorizada em 120 dias
Figura 5 - Percentual de volume ósseo neoformado no interior dos defeitos
crítico em calotas cranianas de coelhos, avaliado por microtomografia
computadorizada para os diferentes grupos, nos períodos de15, 60 e 120 dias.
(p>0.05 para análise intra e inter-grupos, colocar o nome do teste).
Percentual de volume ósseo
0
5
10
15
20
60 dias120 dias
15 dias
Coágulo PHB PHBOGP
PHBFB
PHBFB
OGP
PHBFBHA
OGP
%
152
Figura 6 - Vista coronal das reconstruções tridimensionais obtidas por
Microtomografia computadorizada, dos defeitos ósseos dos diferentes grupos
avaliados em 15, 60 e 120 dias.
153
Os resultados de percentual de formação óssea avaliados por
microtomografia computadorizada demonstram uma crescente formação ao
longo dos períodos em todos os grupos. Entretanto quando comparados os
diferentes grupos nos diferentes períodos não há diferença estatística (Teste
Kruskal-Wallis com pós-teste de Dunn, p<0,05) (Figura 5). As imagens obtidas
na reconstrução tridimensional dos defeitos nos diferentes grupos avaliados
(Figura 6) sugerem um maior fechamento do defeito no grupo coágulo.
Entretanto, quantitativamente essa diferença também não é significativa
comparada aos demais grupos (Figura 5).
Baseado nos resultados histológicos apresentados no capítulo 3, essa
aparente diferença visual pode-se dever ao fato de que no grupo coágulo
ocorrer uma formação óssea mais rápida em direção ao centro do defeito,
porém com uma espessura diminuída em relação às bordas. Isso justificaria o
fato das taxas de formação terem sido numericamente semelhantes nos
diferentes grupos, sugerindo que nos grupos experimentais a formação óssea
esteja ocorrendo de forma diferenciada do controle, mantendo a espessura
tecidual original. Esses resultados só poderão ser confirmados após análise
histológica dos espécimes de 120 dias.
155
CONCLUSÃO
Baseado nos estudos in vitro e in vivo realizados e apresentados nesta
tese podemos concluir que:
1) A utilização da sinterização seletiva a laser no presente estudo foi eficaz
em produzir matrizes tridimensionais (scaffolds) de poli(3-hidroxibutirato)
porosas com alto controle de tamanho de poros.
2) As associações dos scaffolds de PHB com FB, HA e/ou OGP conferiram
aos mesmos características físico-químicas favoráveis ao reparo ósseo,
com boa adesão e proliferação celular. Nas avaliações in vivo esses
materiais falharam em estimular a formação óssea de contato.
Entretanto, foi eficiente em manter a espessura do defeito.
3) Para melhor entendimento da ação desses scaffolds, mais avaliações,
principalmente em logo prazo, são necessárias, tendo em vista que a
total degradação desse material não foi observada no período de 120
dias. Essas avaliações possibilitarão a proposição de mudanças na
fabricação desses materiais, se necessário for.
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